JP3943575B2

JP3943575B2 - 切迫分娩についての危険にある女性における膜の破裂を決定するための検定方法

Info

Publication number: JP3943575B2
Application number: JP2005175366A
Authority: JP
Inventors: ジョン・シー．リービット; デビッド・シー．カサル; マデュー・バルマ
Original assignee: アデザ・バイオメデイカル・コーポレイシヨン
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 2005-06-15
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: JP3742649B2; CA2152676A1; EP0680607A1; JP2004125807A; EP0680607A4; JP2005326427A; JPH08506658A; WO1994017405A1

Description

発明の背景
本発明の分野
本発明は、切迫分娩（impending delivery）を検出し、そしてその膜が破裂したかどうかをそのような危険にある女性において測定するための方法に関する。特に、本発明は、子宮頸部膣部（cervicovaginal）分泌サンプル中の切迫分娩のための生物化学的マーカーを検出し、そしてそのサンプル中のIGFBP-1の欠如を同定することによりその危険の原因である膜の破裂を決定することによる、切迫分娩の測定に向けられている。

従来技術の説明
切迫した早産（impending preterm births）の測定は、未熟児（preterm infants）の新生児期の生存を増加させるために不可欠である。特に、早期新生（preterm neonates）は、先天異常をもたない新生児の罹患率及び死亡率の1/2以上、そして恐らく3/4程の原因である。分娩を遅らせることができる早産防止剤（tocolytic agents）が、20〜30年前に導入されたけれども、早産の発生率において僅かの減少が在るだけである。早産の発生率における大きな減少を観察することの失敗は、早期分娩における診断の誤り及びその患者の症状が進行しすぎたために早産防止剤がその分娩を首尾よく遅らせることができないということによると推定される。早産の診断の伝統的な方法は、高く偽陰性及び偽陽性の誤差率（error rates）をもつ［Friedman et al，Am．J．Obstet．Gynecol．104：544（1969）］。さらに、特に臨床的に無傷の膜をもつ患者における切迫早産を測定する伝統的な方法は、複雑なトレーニング又は装置を必要とすることができ［Garl et al，Obatet．Gynecol．60：297（1982）］、又は侵襲性であることができる［Atlay et al，Am．J．Obatet．Gynecol．108：933（1970）］。早産の増加した危険を示す初期の他覚的生物化学的なマーカーが必要であった。

胎児フィブロネクチンは、栄養芽層（trophoblasts）が母体の脱落膜化された子宮（decidualized uterus）に侵入するとき絨毛外（extravillus）栄養芽層により合成される。不溶性の胎児フィブロネクチンは、胎盤床の細胞外マトリックス内にある。可溶性の胎児フィブロネクチンは、羊膜液（Amniotic fluid）中にある。産道下頸部分泌物中への胎児フィブロネクチンの分泌は、羊膜液がその産道下に放出されるときの膜の破裂によりか又は胎盤床内での細胞外マトリックスからの胎児フィブロネクチンの放出（可溶化）又は栄養芽層細胞からの胎児フィブロネクチンの放出によるかのいずれかにより生じることができる。頸部分泌物中の胎児フィブロネクチンの存在は、早産の予言者である。

インシュリン‐様成長因子結合性タンパク質１（Insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP-1；IGFBP-1についての他の名称は、妊娠‐関連子宮内膜（endometrial）α‐グロブリン（α-PEG）、及び胎盤タンパク質-12（pp-12）を含む［Waites et al，J．Clinical Endocrinology and Metab．67：1100 1986］）であって子宮壁内への胎児の着床に応答して後期分泌性前‐脱落膜期における子宮内膜ストロマにより及び妊娠‐誘導母体脱落膜により合成されるものは、胎児フィブロネクチンよりもさらに豊富な羊水のタンパク質である。IGFBP-1は、脱落膜からの羊膜サック内に効率よく運搬されるようである。羊水中のIGFBP-1のレベルは、妊娠期間（gestation）の長さと共に増加する。第三トリメスター（27週）まで、IGFBP-1レベルは、約20mg/mlまで増加し、そしてIGFBP-1は、羊水の最も豊富なタンパク質の中の１となる。

Lockwood et al［New Engl．J．Med.，325：669-674（1991）］は、頸部及び膣の分泌物中の胎児フィブロネクチンが切迫分娩の危険にある妊娠を示すということを報告した。この著者は、胎児膜へのダメージがその頸部及び膣へ胎児フィブロネクチンを放出させて生物化学的マーカーを生じさせることができると仮定した。胎児フィブロネクチンは、その切迫分娩が膜の破裂又は分娩の開始によるかのいずれかの分泌物中に存在する。

Rutanen et al（American Journal of Obsterics and Gynecology 164（Supplement，Part 2）：258，1991）は、IGFBP-1が、破裂した膜をもち、そしてそれ故に切迫分娩の危険にある女性において存在したことを報告した。胎児フィブロネクチンと同様に、IGFBP-1は、羊膜液中に最も豊富なタンパク質の中の１であり、そして脱落膜内にも存在し、それは、IGFBP-1が早産についての他のマーカーを構成することができるということを示唆している。

IGFBP-1又はいずれかの他の有効なマーカーが早産の経過における様々な点において放出される場合、そのマーカーは、その疾患の経過を評価するために使用されることができるであろう。

本発明の要約
本発明は、無傷の膜をもつ切迫分娩（impending imminent delivery）を伴う患者を、膜が破裂した患者から区別するための検定法を提供する。本法は、患者からの子宮頸部膣分泌サンプル中の切迫分娩についての生物化学的マーカーの検出により切迫分娩についての危険にあるものとして測定された妊娠患者からの子宮頸部膣部分泌サンプルを得て、そしてそのサンプル中のIGFBP-1のレベルを測定することを含んで成る。IGFBP-1のレベルが上昇した場合、その患者は、膜の破裂をもつ。IGFBP-1が存在しない場合、その患者は、無傷の膜をもつ。

好ましい態様においては、本法は、懐妊の約20週後の妊娠患者からの頸部膣部分泌サンプルを得て、そしてそのサンプル中の胎児フィブロネクチン及びIGFBP-1のレベルを測定することを含んで成る。そのサンプル中の上昇したフィブロネクチンの存在は、切迫分娩の増加した危険を示す。IGFBP-1のレベルが上昇している場合、その患者は、膜の破裂をもつ。IGFBP-1が存在しない場合、その患者は、無傷の膜をもつ。

最も好ましい態様においては、この胎児フィブロネクチン/IGFBP-1テストは、好ましくは、約20週の懐妊において女性に行われ、そしてそれぞれの出産前の通院（２〜４週間ごと）において繰り返される。胎児フィブロネクチン検定結果が早産の増加した危険を示すような患者については、その患者のIGFBP-1レベルのテストは、その膜が無傷であるかどうかを決定する。IGFBP-1についてのテストが陰性である場合、その患者は、その妊娠を遅延化するために治療されることができる。IGFBP-1レベルのテストは、その膜が無傷で残っていることを確認するために毎日の頻度で治療の経過の間繰り返されることができる。IGFBP-1の増加したレベルをもつ患者においては、そのテストは、分娩を遅らせることができないということを示している。

本発明の詳細な説明
本発明は、早産を伴う患者における膜の破裂を決定し、分娩を遅らせるための治療を受けることができる患者を同定するような検定法である。本法は、患者からの子宮頸部膣分泌サンプル中の切迫分娩についての生物化学的マーカーの検出により切迫分娩についての危険にあると測定された患者から子宮頸部膣部分泌サンプルを得て、そしてIGFBP-1についてその患者からの子宮頸部膣部分泌サンプルをテストすることを含んで成る。IGFBP-1のレベルが上昇する場合、その患者は、膜の破裂をもつ。IGFBP-1が検出されない場合、その患者は、無傷の膜をもつ。好ましい態様においては、妊娠患者からの子宮頸部膣部分泌サンプルを、IGFBP-1及びその分娩マーカーの両方についてテストする。最も好ましい態様においては、その分娩マーカーは、胎児フィブロネクチンである。

本発明は、抗‐インシュリン‐様成長因子結合性タンパク質１抗体及び切迫分娩マーカー、好ましくは胎児フィブロネクチンに特異的な抗体を含んで成るキットをも提供する。

テストされるべき患者
本法は、切迫分娩についての危険にあることができるいずれかの妊婦に対して使用されることができる。本法の１の態様においては、IGFBP-1の検定を、その膜が無傷であるかどうかを決定するために切迫分娩についての危険の生物化学的インジケーターの存在について陽性にテストされた患者からの子宮頸部膣部分泌物に対して行われる。両方のマーカーが同一サンプル中で検定されるような好ましい態様においては、本法は、その切迫分娩マーカーについての基準を満足させるいずれかの妊娠患者に対して行われることができる。例えば、子宮頸部膣部分泌サンプル中の胎児フィブロネクチンの存在は、分娩が早期又は期間経過後であるかどうかにかかわらず、分娩まで妊娠期間20週後の切迫分娩を示すものである。胎児フィブロネクチンについて適当な妊娠期間のレンジ内にある患者のみが、そのマーカーの組み合わせについてテストされるべきである。

分娩が切迫であるかどうかを決定するためのいずれかの女性をスクリーニングすることに加えて、分娩インジケーターについてテストされるべき患者は、早産についての高い危険のカテゴリー内の臨床的に無傷の膜をもつような患者であり、そして好ましくは、その妊娠が健康な胎児の分娩を確保するために十分に進行していないようなすべての女性である。早産に関連する胎児の罹患率の90%及び胎児の死亡率の100%が、32〜34週の妊娠期間の前の分娩された胎児についてのものである。それ故、32〜34週の妊娠期間は、胎児の健康のために重要なカットオフであり、そしてその妊娠が少なくとも約20週にあり、そして妊娠期間における34週の前にある女性は、テストされるべきである。

さらに、早産の危険に関連していることが知られている多数の要因が存在する。これらの要因は、多胎児妊娠期間（multiple fetusgestations）；機能不全の子宮頸部；子宮異常；羊水過多症（polyhydramnios）；未経産（nulliparity）；先の早産の膜破裂又は早産；子かん前症（preeclampsia）；第一トリメスター膣出血；ほとんど又は全く出産前ケアをしていないこと；及び徴候、例えば、腹痛、低背骨痛み、子宮粘液の通過及び収縮、を含む。臨床的に無傷の膜をもち、そして早産についての１以上の危険要因をもつ12週以上の妊娠期間における妊婦のいずれも、その危険期間の全体；すなわち、約37週まで、テストされるべきである。自然流産についての危険要因は、重量胎児異常、異常胎盤形成、子宮異常及び母体感染性疾患、内分泌失調、心血管腎性高血圧、自己免疫及び他の免疫学的疾患、並びに栄養障害を含む。

サンプル
本サンプルを、後部膣円蓋（posterior fornix）付近、子宮頸部（ectocervix）又は子宮外口（external cervical os）内で得られる。このサンプルは、一般的に液体及び粒状の固体を含んで成り、そして膣の又は子宮頸の粘液及び他の膣又は子宮頸の分泌物を含むことができる。このようなサンプルを、本明細書中及びクレーム中で子宮頸部膣部分泌サンプル（cervicovaginal secretion samples）という。サンプルは、好ましくは、ダクロン又は他の繊維先端をもつ綿棒により取り出される。あるいは、サンプルは、吸引又は洗浄（lavage）装置により得られることができる。液体を使用して採取されたサンプルのいずれかの追加の希釈を計算するための計算は、本検定手順の解釈の一部として行われることができる。

採取の後、サンプルを、保存及びテスト実験室への搬送に好適な容器に移す。サンプルを、タンパク質様分析物を保存する液体中に分散することが重要である。この保存及び転移培地は、保存及び搬送の間の分析物レベルにおける減少を最小化し、好ましくは、防止しなければならない。保存及び転移に好適な溶液は、0.05 M Tris-HCl、pH 7.4；0.15 M NaCl、0.02% NaN₃、1%ウシ血清アルブミン（BSA）、500 Kallikrein Units/mlのアプロチニン、1%フェニルメチルスルホニル・フルオリド（PMSF）及び5 mM EDTAから成り、そして1990年４月24日に付与された米国特許第4,919,889号中に記載されている。この溶液は、サンプル希釈溶液としても好適である。

あるいは、サンプルの迅速加工のための家庭及びオフィス使用装置を使用することができる。使用される場合、サンプルは、その装置内に直接に入れられ、そしてテストが、サンプル採取の数分以内に行われる。このような場合においては、その分析物を安定化する必要性が最小化され、そして検定を行うことを容易にし、そして分析物の安定性に有害でないいずれかの溶液を、使用することができる。

分娩マーカー
子宮頸部膣部分泌物中で検定される切迫分娩のいずれかの生物化学的マーカーを、本法において使用することができる。好適なマーカーは、例えば、エラスターゼ、全フィブロネクチン、及び胎児フィブロネクチンを含む。最も好ましいものは、胎児フィブロネクチンである。子宮頸部膣部分泌サンプル中の切迫分娩を予言する他のマーカーは、公知であり、そして本法において有用である。

エラスターゼは、約12週妊娠期間から分娩までの患者における切迫分娩の有効なインジケーターである。このマーカーは、一般的には、分娩前約２〜３週に始まり１リッター当たりの約30ユニットのエラスターゼのレベルにおいて子宮頸部膣部分泌サンプル中に存在する。１リッター当たり30ユニット未満の値は、陰性であると考えられる。

全フィブロネクチンは、約12週妊娠期間から分娩までの患者における切迫分娩の有効なインジケーターである。このマーカーは、一般的には、分娩前約２〜３週に始まり子宮頸部膣部分泌サンプル中に一般的に存在する。全フィブロネクチンの上昇したレベルの存在は、切迫分娩を示すものである。好ましくは、サンプル中の全フィブロネクチン濃度は、20週の妊娠期間の後少なくとも約600〜750ng/mlである。12〜20週の間、その閾値は変化する。この特殊な閾値未満の値は陰性であると考えられる。

胎児フィブロネクチンは、約20週の妊娠期間から分娩までの患者における切迫分娩の有効なインジケーターである。このマーカーは、一般的には、分娩前約１〜２週に始まり子宮頸部膣部分泌サンプル中約50ng/mlのレベルにおいて存在する。

検定手順
テストされるとき、分娩マーカーは、分娩の増加した危険を測定するいずれかの方法によりテストされる。例えば、閾値を上回る全フィブロネクチンのレベルは、切迫分娩を示すものである。しかしながら、バックグラウンドを上回る胎児フィブロネクチンのレベル（例えば、胎児フィブロネクチンの存在）は、切迫分娩を示すものである。

以下の討議は、分娩マーカーの例としての胎児フィブロネクチンに関するものであり、そして子宮頸部膣部分泌サンプル中のマーカーをどのように測定するかの例としてIGFBG-1に関するものである。IGFBP-1は、サンプル中のIGFBP-1の量を測定することができるか又はIGFBP-1の量が膜の破裂を示す閾量を上回るかのいずれかの定量的又は半‐定量的な手順により検定される。分娩マーカーについて、そのマーカーは、サンプル中のマーカーの量を測定することができるか又はそのマーカーの量が切迫分娩を示す閾値を上回るかのいずれかの手順により検定される。

イムノアッセイが好ましい。特定のイムノアッセイ法を使用しての分析物の検定に必要な抗体アフィニティーは、他のポリペプチド分析物を検定するのに必要なものと異ならないであろう。抗体組成物は、ポリクローナル又はモノクローナルであることができる。抗-IGFBP-1抗体は、多数の方法により産生されることができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物にヒトIGFBP-1を含んで成る免疫原性組成物を投与することにより誘導されることができる。あるいは、羊水又はIGFBP-1の高いレベルの源を、その免疫原として使用されることができ、そして所望の特異性の抗体が同定されることができる。

IGFBP-1の免疫原性組成物の調製は、宿主動物に依存して変化することができ、そしてよく知られている。例えば、IGFBP-1又はその抗原性タンパク質は、免疫原性物質、例えば、KLH又はBSAと結合され、そしてアジュバント等中で提供されることができる。誘導された抗体は、その組成物がIGFBP-1-特異的であるかどうかを決定するためにテストされることができる。ポリクローナル抗体組成物が所望の特異性を提供しない場合、その抗体は、様々な慣用の方法により特異性を強化するために精製されることができる。例えば、組成物は、固体支持体に固定されたIGFBP-1とその組成物を接触させることにより他の物質への結合を減少するように精製されることができる。その物質に結合するそれらの抗体が保持される。様々な固体支持体、例えば、Sephadex、Sepharose等を含むアフィニティー・クロマトグラフィー材料に固定された抗原を使用する精製技術は、よく知られている。

モノクローナルIGFBP-1-特異的抗体も、慣用の方法により調製されることができる。マウスに、IGFBP-1を含んで成る免疫原性組成物を注射し、そして脾臓細胞を得ることができる。これらの脾臓細胞を、ハイブリドーマを調製するために融合パートナーと融合させることができる。ハイブリドーマにより選択された抗体を、その抗体がIGFBP-1と反応し、そしてサンプル中に存在することができる他のタンパク質と実質的に全く反応しないことを示すようなハイブリドーマを選択するために、スクリーニングすることができる。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマを標準的な技術により培養する。ハイブリドーマ調製技術及び培養方法はよく知られており、そして本発明の一部を構成しない。

ポリクローナル及びモノクローナルの例示的な調製を、実施例中に記載する。抗体調製及び精製方法は、例えば、Tijssen，P．Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：Practice and Theories of Enzyme Immunoassays New York：Elsvier（1985）を含む多数の刊行物及び実施例中に記載されている。

様々なプロトコール及び標識を使用する多数の異なるタイプのイムノアッセイがよく知られている。その検定条件及び試薬は、いずれかの変化を有して従来技術にあることができる。検定は、異種又は同種の、便利にはサンドイッチ検定であることができる。

検定は、普通には、固相‐固定された抗-IGFBP-1抗体を使用する。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであることができる。固相‐固定抗体は、サンプルと併合される。抗体とサンプルとの間の結合は、多数の方法で測定されることができる。複合体形成は、IGFBP-1に特異的な可溶性抗体の使用により測定されることができる。抗体は、直接的に標識付けされることができるか又はその可溶性抗体の種に特異的な標識された第二抗体を使用して検出されることができる。様々な標識は、放射性核種、酵素、蛍光剤、コロイド状金属、等を含む。便利には、検定は、IGFBP-1に特異的な抗体が固相‐固定され且つ酵素標識された可溶性抗体として使用されるような定量的酵素-結合イムノソルベント検定（ELISA）であろう。あるいは、検定は、サンプル中のIGFBP-1が所定量の抗-IGFBP-1抗体について既知量のIGFBP-1と競合するような、拮抗阻害に基づくことができる。例えば、サンプル中に存在するIGFBP-1のいずれも、抗体結合性部位について既知量の標識されたIGFBP-1又はIGFBP-1アナログと競合することができる。固相に固定され又は溶液中に残った標識されたIGFBP-1の量は、測定されることができる。

上記結合体の適当な希釈は、陽性サンプルとしてその検定についてのバックグラウンド値を上回るIGFBP-1の選択された閾値レベルを検出するために行われることができる。

検定結果の解釈
20-50ng/mlを下回るIGFBP-1レベルがバックグラウンドと考えられ、そして陰性である。このバックグラウンドレベルについてのカット‐オフの選択は、高感度又は高特異性のテストが望ましいかどうかに依存する。例えば、実施例中に記載するように、切迫分娩について陽性の胎児フィブロネクチン・テスト（>50ng/ml）を示し、そして膜の破裂についてシダ状結晶形成（ferning）、プーリング（pooling）及びニトラジン（nitrazine）陰性である42の子宮頸部膣部分泌試料がIGFBP-1についてテストされたとき、これらの試料の中の１が42 ng/ml IGFBP-1を示した。20 ng/mlのカット-オフが使用されたとしたならば、破裂を決定する（rule out）ためのテストの提示された特異性は、97%であったであろう。他方において、50 ng/mlが使用されたとしたならば、そのテストの決定された特異性は、100%であったであろう。ほとんどの場合において、高い決定（rule-out）特異性が好ましい方法であろう、なぜなら、膜の破裂をもつ患者は、破裂をもたない患者よりも高い感染危険にあるからであり、それゆえ、好ましいカットオフは、20-50 ngである。

20-50 ng/mlのカットオフが、実施例中に記載した検定法のために決定された。よく知られているように、異なる試薬を使用する他の検定法は異なるカットオフ値をもつことができる。例えば、それらの抗原結合特性において異なるIGFBP-1抗体は、異なる最適カットオフ値をもつ検定結果を作り出すことができる。当業者は、異なる試薬が使用されるときバックグラウンド値が変化することができることを認識するであろうし、そして選択された検定について所望の特異性及び感度のための適当なバックグラウンドレベルをどのように決定するかを理解するであろう。

分娩の増加した危険を示すマーカーについて陽性である患者からの子宮頸部膣部分泌サンプル中のIGFBP-1の存在は、その膜が破裂したことを示している。IGFBP-1が20-50 ng/ml未満であり又は検出できない（その検定についてのバックグラウンドの）場合、その膜は、無傷である。IGFBP-1が陽性（>20-50 ng/ml）であり、そしてその分娩マーカーが陰性であるとき、羊膜が破裂しているかもしれない。但し、破裂した膜をもつ患者のほとんどは、同時に両方陽性な、IGFBP-1及び分娩マーカーを示すであろう。

先に述べたように、本テストを、分娩の増加した危険を示すマーカーについて陽性とテストされたいずれかの妊婦に、行うことができる。好ましい態様においては、この分娩マーカー及びIGFBP-1は、同一の子宮頸部膣部分泌サンプル中でテストされる。このようなテストは、その分娩マーカーが有効である妊娠期間のレンジ内のいずれかの妊娠患者に対して行われることができる。好ましくは、12週の妊娠期間後分娩までいずれかの既知の危険要因をもつすべての女性に行われることができる。

分娩マーカーが陰性である場合、その女性は、切迫分娩についての危険にはない。本テストは、規則的な出産前の訪問において妊娠期間の全体を通して又はその患者が高く危険である場合により高い頻度で繰り返されることができる。

分娩マーカー・テストが陽性（その閾値を上回る）場合、その患者は、彼女の子宮頸部膣部分泌物中のIGFBP-1の存在についてテストされる。IGFBP-1がその分泌物中に存在する場合、その患者は、膜が破裂している。IGFBP-1が陰性である場合、その膜は無傷である。

IGFBP-1が陰性であるとき、本IGFBP-1テストは、好ましくは毎日、そのサンプルがIGFBP-1について陽性であるまで、繰り返されることができる。さらに、マーカー、例えば、胎児フィブロネクチンよりも初期の週で陽性であることができるフィブロネクチンが使用された場合、分娩に最も近くで現れるマーカーが、使用されることができる。その分娩マーカーが陽性であり、そしてIGFBP-1がそのサンプル中に存在しない場合、胎児肺成熟を測定し又は強化するための手段が企てられることができる。例えば、羊水サンプルがリン脂質について分析されることができる。一般的には、早産について危険にある患者は、低い危険カテゴリー内の患者についての４週間毎よりもむしろ、約22〜36週の間２週間毎に検査される。すべての患者は、約36週から１週間毎に検査される。

本発明を、以下の特定のものであるが非限定的な実施例によりさらに説明する。別段の定めなき限り、温度は摂氏で、そして濃度は重量パーセントとして与えられる。実施まで構成的にまとめられる手順を、現在形で記載し、そして実験室内で行われた手順を、過去形で記述する。

実施例１
膣綿棒サンプル中の胎児フィブロネクチンの定量
膣サンプル中の胎児フィブロネクチンを測定するためのイムノアッセイは、以下に記載する試薬及び手順を使用した。

モノクローナル抗‐胎児フィブロネクチン抗体の調製
American Type Culture Collectionに寄託され、そして付託番号ATCC HB 9018を与えられたハイブロドーマの調製は、1990年１月16日にMatsuura et alに付与された米国特許第4,894,326号（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。）中に詳細に記載されている。

このハイブリドーマを、10%ウシ胎児血清を補ったPRMI 1640組織培養基中での成長により培養した。さらに、このハイブリドーマを、Mishell and Shiigi（Selected Methids in Cellular Immunology，W．H．Freeman & Co，San Francisco p 368，1980）の手順に従ってそのハイブリッド細胞の注射によりマウス内で培養した。

FDC-6と名付けられ、そして上記ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を、以下の手順によりイムノアッセイにおける使用のために調製した。培養上清又は腹水のIgG画分を、硫酸アンモニウム分画により沈殿させた、抗体を、製造者の指示に従ってProtein-G Fast Flow（Pharmacia Fine Chemicals）上のアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製に適当なバッファー中に再溶解し、そして透析した。

抗‐胎児フィブロネクチン抗体‐コートされたマイクロタイター・プレートの調製
マイクロタイター・プレートを以下に記載する手順によりFDC-6モノクローナル抗体によりコートした。

先に記載したように調製したモノクローナル抗体FDC-6は、ホスフェート・バッファー、pH 7.2中10μg/mlに希釈し、そして100μl/ウェルを、ポリスチレン・マイクロタイター・プレート（Costar）内に分散させた。プレートを、室温において２時間又は４℃において一夜インキュベートした。ウェルの内容物を吸引し、そしてウェルを洗浄バッファー（0.02 M Tris HCl、0.15 M NaCl、0.05% TWEEN-20）により３〜４回洗浄した。次に200μl/ウェルのブロッキング/安定化溶液（4%スクロース、1%マンニトール、0.5%カゼイン、0.01 M PBS）をウェルに添加し、そして室温において30分間〜４時間にわたりインキュベートした。次にウェルを蒸発乾固し、そしてプレートを乾燥剤ポーチを備えた気密容器内に包装した。

上記手順を、Nunc and Dynatechからのマイクロタイター・プレートを使用して繰り返し、そして等価な結果を得た。

酵素標識抗‐（フィブロネクチン）抗体の調製
ヒト血漿フィブロネクチンを、Engvall and Ruoslahti，Int．J．Cancer 20：1-5（1977）により記載されたようなヒト血漿から精製した。この抗‐ヒト血漿フィブロネクチン抗体は、文献、例えば、Stollar，Meth．Enzym．70：70（1980）中に記載されている免疫感作技術及びスケジュールを使用してヤギ内で顕出され、このヒト血漿フィブロネクチン抗原によりそのヤギを免疫感作した。この抗血清を、例えば、Lange et al，Clin．Exp．Immunol．25：191（1976）及びPisetsky et al，J．Immun．Meth．41：187（1981）により記載されたように、モノクローナル抗体のために使用されたものに類似の固相検定においてスクリーニングした。

この抗血清のIgG画分を、製造者により推奨された方法（AFFINITY CHOROMATOGRAPHY，Pharmacia Fine Chemicals Catalogue 1990），15-18頁に従ってヒト血漿フィブロネクチンを結合されたCNBr-Sepharose 4B（Pharmacia Fine Chemicals）を使用したアフィニティー・クロマトグラフィーによりさらに精製した。

簡単に言えば、このカラムを、２〜３容量のバッファー（0.01 MPBS、pH 7.2）により平衡とし、そして抗‐ヒト・フィブロネクチン抗体‐含有溶液を次にそのカラムに適用した。この溶出液の吸収を、タンパク質がもはやそのカラムから通過しなくなるまで280nmにおいてモニターした。次にこのカラムを、280nmにおけるベースライン吸光度を得るまで平衡バッファーにより洗浄した。

免疫アフィニティー結合した抗‐ヒト血漿フィブロネクチン抗体は、0.1 Mグリシン・バッファー、pH 2.5により溶出された。ピーク・タンパク質画分を、集め、プールし、そして多数のバッファー変更により４℃において24-36時間にわたり、0.01 M PBS，pH 7.2に対して透析した。

先に手順を、ヒト血漿フィブロネクチンによりウサギを免疫感作し、そして得られたポリクローナル抗-ヒト・フィブロネクチン抗体を精製するために、繰り返した。

先に記載したように調製した抗‐ヒト血漿フィブロネクチンを、Avrameas，Immunochem．6：43（1969）の１段階グルタルアルデヒド手順に従ってアルカリ性ホスファターゼと結合させた。

検定試薬
検定を、以下の追加の試薬を使用して行った。保存抗体結合体を、結合体希釈剤（0.05 M Tris Buffer pH 7.2、2% D-ソルビトール、2% BSA、0.1%アジ化ナトリウム、0.01% Tween-20、1mM塩化マグネシウム、及び0.1%塩化亜鉛）中で適当に希釈し、そして10mlを、ポリエチレン・ドロッパー・ボトル容器内に入れた。

酵素基質（ポリエチレン・ドロッパー・ボトル容器内の10ｍｌ）は、0.1mM塩化マグネシウム及び0.2%アジ化ナトリウムを含む0.4 M アミノメチルプロパンジオール・バッファー、pH 10中に溶解されたフェノールフタレイン・モノホスフェート（1mg/ml）であった。

陽性対照（ポリエチレン・ドロッパー・ボトル容器内の2.5ml）は、サンプル希釈溶液（0.05 M Tris buffer pH 7.4、1% BSA、0.15 M塩化ナトリウム、0.02%アジ化ナトリウム、5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMフェニルメチルスルホニル・フルオリド（PMSF）、及び500 Kallikrein Units/アプロチニンml）中の50ng/mlの胎児フィブロネクチンの濃度に希釈された胎児フィブロネクチンを含む羊水であった。このサンプル希釈物は、1990年４月24日にJones et alに付与された米国特許第4,919,889号（この特許を全体として、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。

陰性対照（ポリエチレン・ドロッパー・ボトル容器内の2.5ml）は、胎児フィブロネクチンを含まない陽性対照のために使用したサンプル希釈溶液であった。

濯ぎバッファー（ポリエチレン・ドロッパー・ボトル容器内の10ml）は、1.0 M Tris buffer pH 7.4、4.0 M塩化ナトリウム、2.5%Tween-20、及び1％アジ化ナトリウムを含む50倍濃縮物であった。この濯ぎバッファーを、本検定における使用のために、0.02 M Tris、0.08 M塩化ナトリウム、0.05% Tween-20、及び0.02%アジ化ナトリウムの最終濃度まで水により希釈した。

さらに、５μ細孔サイズのポリエチレン・サンプル・フィルター（Porex Technologies，Fairburn，Georgia）を、検定に先立ってそのサンプルを濾過するために使用した。この検定を行うために使用されたドロッパー・ボトルの全ては、約50μl滴の試薬を小分けするように設計されたポリエチレン・ボトルであった。サンプル採取の後に行われた検定段階のすべては、先に記載した試薬及び材料を使用した。

検定手順
検定を以下のように行った。すべてのサンプルを、後部膣円蓋（posterior fornix）付近、子宮頸口（cervical os）内でダクロン綿棒を使用して採取した。綿棒サンプルを、採取バイアル内の1.0mlサンプル希釈物中に浸漬した。綿棒を、その溶液から取り出して、その採取管内に可能な限り上記液体を残した。サンプルを、濾過の前又は後のいずれかにおいて、その検定に先立って15分間対照と一緒に37℃においてインキュベートした。サンプル・フィルターを、それぞれのサンプル管の上の場所にスナップした。各サンプル並びに陽性及び陰性対照の２連100μlアリコットを、マイクロタイター・プレートの別々のウェル内に入れ、そして室温において１時間インキュベートした。

インキュベーション後、サンプル及び対照をウェルから吸引した。ウェルを、希釈洗浄バッファー（１倍）により３回洗浄した。洗浄後、100μlの酵素‐抗体結合体を、各ウェルに添加し、そして室温において30分間インキュベートした。ウェルを吸引し、そして先に記載したように洗浄した。洗浄後、100μlの酵素基質を各ウェルに添加し、そして室温において30分間インキュベートした。

インキュベーション後、プレートを手により又は楕円振とう機をにより穏やかに攪拌して、そのウェル内容物を混合した。ストリップのフレームを、ELISAプレート・リーダー内に置いた。550nmにおける各ウェルの吸光度を測定した。各サンプル及び対照についての２連ウェルの吸光度を計算した。サンプルについての胎児フィブロネクチン濃度を、標準曲線を調製し、そしてそのサンプルがそれらの元の濃度の約1/10（1.0mlの希釈物と併合された約0.1mlのサンプルの採取）に希釈されたことを推定することにより計算した。本研究について、約50 ng/mlのカットオフが、陽性サンプルとして使用された。50 ng/mlを下回るサンプルは、バックグラウンド及び陰性であると考えられた。

実施例２
膣綿棒サンプル中のIGFBP-1の検出
IGFBP-1を以下に記載する手順により検出した。

抗-IGFBP-1モノクローナル抗体の調製
１パネルのハイブリドーマを、ヒト羊水によるマウスの免疫感作により生成した。１モノクローナル抗体（AF127と命名）は、羊水の最も豊富なタンパク質の中の1であることが発見された31 kdタンパク質と反応した。２次元ゲル・ウェスタン・ブロットを、このポリペプチド抗原を同定するために使用した。このタンパク質は、ヒヒ羊水中に非常に豊富であるので、そのタンパク質を、タンパク質の配列を決定するのに好適な吸収体であるポリビニリデン・ジフルオリド膜に移した。

上記タンパク質のN-末端を、Applied Biosystems，Inc．Model 477Aアミノ酸配列決定装置を使用してエドマン分解アミノ酸配列決定装置により100ピコモルのタンパク質アミノ酸を含む慣用の紙孔パンチャーによりパンチされた単一のペーパー・ディスクを使用して配列決定した。このN-末端配列は、APWQCAPCSAEKLALCPPVPASCSEVTRSA（配列番号1）であると決定され、これは、GenBankを使用してIGFBP-1としてそのタンパク質を同定した。

AF127と命名され、そしてハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を、以下の手順によるイムノアッセイにおける使用のために調製した。培養上清又は腹水のIgG画分を製造者の指示（Bioprobe International，Inc．Tustin，CA）に従って、免疫グロブリンのためのAvid Alアフィニティー・ゲル精製を使用して精製した。

抗-IGFB0P-1-コート・マイクロタイター・プレートの調製
マイクロタイター・プレートを、以下に記載する手順によりIGFBP-1モノクローナル抗体によりコートした。

先に記載したように調製したモノクローナル抗体IGFBP-1を、PBS（0.01 Mホスフェート・バッファー、0.15 M NaCl，pH 7.4、0.02% NaN₃）中10μg/mlに希釈し、そして100μl/ウェルを、ポリスチレン・マイクロタイター・プレート（Costar）内に分散させた。プレートを、４℃において一夜インキュベートした。ウェルの内容物を吸引し、そして洗浄バッファー（0.02 M Tris HCl，pH 7.9、0.15 M NaCl）により１回洗浄した。250μl/ウェルのブロッキング溶液（PBS中の3% IGFBP-1-不含BSA）を次にウェルに添加し、そして室温において２時間インキュベートした。ウェルを吸引し、そして次に、先に記載したように１回洗浄し、そして保存した。

ポリクローナル抗-IGFBP-1抗体の調製
IGFBP-1を、ゲル電気泳動、その後の電気溶出/電気転移を使用してヒヒ羊水から精製した。抗-ヒヒIGFBP-1抗体は、（IGFBP-1を含んだヒヒ羊水によりヤギを免疫感作することにより、標準的な免疫感作技術及びスケジュールを使用してヤギ内で顕出された。

この抗血清を、例えば、Lange et al，Clin．Exp．Immunol．25：191（1976）及びPisetsky et al，J．Immmun．Meth．41：187（1981）により記載されたように、モノクローナル抗体のために使用されたものに類似した固相検定においてスクリーニングした。

検定試薬
検定を、以下の追加の試薬を使用して行った。

商業的に入手可能なブタ（swine）抗-ヤギ・アルカリ性ホスファターゼ抗体結合体（TAGO，Burlingame，California）を、結合体希釈物（0.02 M Trisバッファー，pH 7.9、1% BSA、0.1%アジ化ナトリウム、0.05% TWEEN-20）中で適当に希釈した。酵素基質は、0.1mM MgCl₂及び0.2%アジ化ナトリウムを含む0.4 Mアミノメチルプロパンジオール・バッファー，pH 10中に溶解されたフェノールフタレイン・モノホスフェート（1 mg/ml）であった。

陽性対照は、サンプル希釈溶液（0.02 M Trisバッファー，pH 7.9、0.5% BSA、0.15%塩化ナトリウム、0.02%アジ化ナトリウム）中の50 ng/mlのIGFBP-1の濃度に希釈されたヒト羊水であった。

陰性対照は、IGFBP-1を含まない陽性対照のために使用されたサンプル希釈溶液であった。

IGFBP-1検定手順
子宮頸部膣部分泌サンプルを実施例１中に記載したように調製した。各サンプル又はその希釈物、並びに陽性及び陰性対照の２連100μlアリコットを、マイクロタイター・プレートの別々のウェル内に入れ、そして室温において２時間インキュベートした。

インキュベーション後、ウェルを、濯ぎバッファー（0.02 M Tris，pH 7.0、0.15 M NaCl、0.05% TWEEN-20、及び0.02%アジ化ナトリウム）中で３回洗浄した。

濯ぎ後、100μlのヤギ抗-IGFBP-1抗体（1:200希釈）を各ウェルに添加し、そして室温において２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを濯ぎバッファー中で３回洗浄した。濯ぎ後、100μlのブタ抗-ヤギ結合体（1:4,000希釈）を各ウェルに添加し、そして室温において１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを濯ぎバッファー中で１回洗浄し、そして100μlの酵素基質をELISAプレート・リーダーを使用して404nmにおいて直ちに読んだ。プレートを30分後再び読んでその終点の読みを測定した。

各サンプル及び対照についての２連ウェルの平均吸光度を計算した。サンプルについてのIGFBP-1濃度を、既知濃度のIGFBP-1を含む羊水を使用して標準曲線を調製することにより計算した。

実施例３
患者のパネルの研究
第二及び第三トリメスター患者からの子宮頸部分泌試料のパネルを、実施例１中に記載したように胎児フィブロネクチンについてテストした。このパネルを、慣用の、シダ状結晶形成（ferning）、プーリング（pooling）、及びニトラジン（nitrazine）を使用して膜の破裂についてテストした。同一のパネルを次にIGFBP-1についてテストした。

IGFBP-1は、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによる膜の破裂について陰性であった試料中20〜40 ng/ml未満（<10 ng/ml）で検出されることができなかった。さらに、IGFBP-1は、胎児フィブロネクチン陽性（>50 ng/ml）、（シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによる）膜破裂陰性、並びに結果により決定されるような早産陽性又は陰性のいずれか（その患者が37週妊娠期間において又はその前に分娩したかどうか）である女性からの試料中陰性であった。シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによる膜破裂陽性であったほとんどの患者は、IGFBP-1についても陽性であった（レンジ30〜>5000 ng/ml）。

母体血漿中のIGFBP-1の循環レベルを、子宮頸部膣部分泌物の血液汚染がIGFBP-1についてのテストを妨害するかどうかを決定するために検査した。母体血漿中のIGFBP-1のレベルは、10 ng/ml未満〜250 ng/mlのレンジにあり、そして平均約150 ng/mlであった。膜破裂陽性子宮頸部膣部分泌試料のほとんどが、250 ng/mlよりも大きなIGFBP-1のレベルを記録した。従って、子宮頸部膣部分泌物中のIGFBP-1のレベルは、子宮頸部膣部分泌サンプル中の10%血液の存在又は血液の非存在中、膜の破裂（rupture of membrane（ROM））の信頼できるインジケーターである。その上、胎児フィブロネクチンが陽性（>50 ng/ml）であるとき、IGFBP-1の非存在は、膜の破裂がたとえ胎児フィブロネクチンが存在しても生じなかったということの信頼できるインジケーターである。膜の破裂を決定（rule-out）する能力は、妊娠の臨床的管理へのアプローチの決定において内科医を支援する。

実施例４
患者のパネルの研究
患者の第二パネルにおいて、妊婦の４群を、子宮頸部分泌物中の胎児フィブロネクチン及びIGFBP-1についてテストした。これらの群は：（1群）早産陽性（PTD+；37週前の分娩）及び胎児フィブロネクチン陽性（fFN+；>50 ng/ml）であるが、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによる膜破裂陰性（ROM-）である患者；（2群）PTD-（37週後の分娩）であるがfFN+（>50 ng/ml）を示し、そしてシダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによるR0M-である患者；（3群）PTD-（37週後の分娩）であり、そしてfFN-（<50 ng/ml）であり、そしてシダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによるR0M-である患者；及び（4群）妊娠期間にかかわらず、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによる膜破裂陽性（ROM+）である患者、であった。

１群においては、24の中か23の子宮頸部分泌試料は、20 ng/ml未満のIGFBP-1を示した、一方、27週妊娠期間においてサンプルされた患者からの１のサンプルは、ml当たり１マイクログラムを超える胎児フィブロネクチンをも示した試料において42 ng/ml IGFBP-1を示した。それ故、膜破裂（ROM）決定テストのカット‐オフがml当たり50 ng IGFBP-1であった場合、その決定特異性（ROM決定特異性が、IGFBP-1陰性の数を真のROM陰性の数により割ったものである。）は、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンによるROM診断に基づき100%となったであろう。そのカット-オフがml当たり40ng IGFBP-1未満であった場合、そのROM決定特異性は、96%であったであろう。

２群においては、27子宮頸部分泌試料の中からの27が、20 ng/ml未満のIGFBP-1を示した。従って、この群においては、ROMの決定は、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジン・テストによるROM診断に基づき100%特異性であった。

３群においては、23子宮頸部分泌試料の中からの23が、20 ng/ml未満のIGFBP-1を示した。従って、この群においては、ROMの決定は、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジン・テストによるROM診断に基づき、再び、100%特異性であった。

４群においては、30試料の中からの24が、20 ng/ml以上のIGFBP-1を示した。従って、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジン・テストに基いてROM+と診断された患者のこの群においては、そのIGFBP-1テストは、ROM診断において80%特異性であった。しかしながら、その６のIGFBP-1陰性患者の中の1は、陰性の胎児フィブロネクチン・テスト（<50 ng/ml）を示した。これは、羊水が存在する場合には陽性であったはずである。なぜなら、胎児フィブロネクチンは羊水中に存在するからである。

羊水中の２つの豊富なマーカー（IGFBP-1及び胎児フィブロネクチン）が、シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジン結果のより自覚的な（subjective）基準の結果と不一致である結果を与えたという発見は、破裂の正確な診断についてのシダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジン・テストの信頼性を問題としている。シダ状結晶形成、プーリング、及びニトラジンは、破裂の測定に不適当であるテストの組み合わせであることがよく知られている。特に、そのテスト結果が陽性であるとき、羊水は存在するようである。しかしながら、陰性結果は、羊水が存在しないということを示すことができない。なぜなら、そのテストの感度が低いからである。しかしながら、このテストは自覚的であるので、陽性及び陰性の両方の結果が正確であることができない。

Claims

切迫早産の危険性を有すると決定した妊娠患者における無傷の胎児膜と破裂した胎児膜とを識別するイムノアッセイ法であって：
a）妊娠１２週またはそれ以降の妊娠患者からの子宮頸部膣部分泌物中のエラスターゼ、全フィブロネクチン、及び胎児フィブロネクチンから成る群から選ばれた切迫分娩についての生物化学的マーカーの検出により、切迫早産の危険性のある妊娠患者を決定すること；そして
b）切迫早産の危険性があると診断された患者の中から、子宮頸部膣部サンプル中のインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１のレベルを測定し、そのサンプル中の閾値レベルを上回るインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の存在が、切迫早産の危険性を有すると決定した妊娠患者の胎児膜の破裂を示すこと、ここでインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の当該閾値レベルが当該イムノアッセイのバックグラウンド値を上回るレベルであること、を含んで成る、
イムノアッセイ法。
サンプルが、後方膣円蓋サンプルである、請求項１に記載の方法。
サンプルが、子宮頸口サンプルである、請求項１に記載の方法。
切迫分娩についての生物化学的マーカーが、胎児フィブロネクチンである、請求項１に記載の方法。
胎児フィブロネクチン及びインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１が同一サンプル上でテストされる、請求項１に記載の方法。
サンプルが、上昇したインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１のレベルを含まず、そして患者からの他のサンプルが、少なくとも1日後、インシュリン‐様成長因子結合タンパク質１について検定される、請求項１に記載の方法。
患者からのサンプルが、20週の妊娠期間後、その患者が期間に到達し又は上昇したインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１のレベルが測定されるまで、２週間間隔で、得られ、そして胎児フィブロネクチン及びインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の存在について検定される、請求項１に記載の方法。
20週の妊娠期間後に妊娠患者における切迫分娩及び膜の破裂を決定する方法であって：
a）切迫分娩の危険性のある妊娠患者を決定するために、20週の妊娠期間後の患者の膣腔又は子宮頸管からの分泌サンプルを試験して、そのサンプル中の閾値レベルを上回る胎児フィブロネクチンの存在を検出し；そして
b）切迫分娩の危険性があると決定された妊娠患者から得られたサンプルにおいて、そのサンプル中のインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の閾値レベルを上回るその存在を決定すること、を含んで成り、
そのサンプル中の当該閾値レベルを上回る胎児フィブロネクチンの存在が、切迫分娩を示し；
切迫分娩の患者において、そのサンプル中の閾値レベルを上回るインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の非存在が、無傷の胎児膜を示し；そして
当該閾値レベルが当該イムノアッセイのバックグラウンド値を上回るレベルである、
方法。
20週の妊娠期間後の妊娠患者が、切迫分娩及び無傷の膜をもつかどうかを決定するための方法であって：
a）切迫分娩の危険性のある妊娠患者を決定するために、20週の妊娠期間後の患者の膣腔又は子宮頸管からの分泌サンプルを試験して、そのサンプル中のエラスターゼ、全フィブロネクチン、及び胎児フィブロネクチンから成る群から選ばれた切迫分娩マーカーのレベルを測定し；
b）切迫分娩の危険性があると決定された妊娠患者から得られたサンプルにおいて、そのサンプル中のインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の閾値レベルを上回るその存在を決定すること、を含んで成り、
そのサンプル中の当該閾値レベルを上回る切迫分娩マーカーの存在が、切迫分娩を示し；
切迫分娩の患者において、そのサンプル中の閾値レベルを下回るインシュリン‐様成長因子結合タンパク質１の存在が、無傷の胎児膜を示し；そして
当該閾値レベルが当該イムノアッセイのバックグラウンド値を上回るレベルである、
方法。
抗インシュリン‐様成長因子結合タンパク質１抗体、並びにエラスターゼ、全フィブロネクチン、及び胎児フィブロネクチンから成る群から選ばれた切迫分娩マーカーに特異的な抗体を、含んで成るイムノアッセイ・キット。
切迫分娩マーカーが、胎児フィブロネクチンである、請求項１０に記載のイムノアッセイ・キット。