JP3942431B2 - タンパク質−分子間相互作用解析法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、Ｃ末端がラベル化されたタンパク質と相互作用する分子を同定する方法に関する。本発明により、現在急速に蓄積されている遺伝子の塩基配列がコードするタンパク質の機能解析、例えばタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、タンパク質−低分子化合物相互作用等の解析を迅速化するための手段が提供される。また、本発明はタンパク質の機能解析において不可欠である大量のデータを迅速に解析する方法（ハイスループット化）において有力な手段を提供する。
背景技術
分子生物学の進歩により、個々の遺伝子産物の解析が容易となった結果、生命現象を分子レベルで解析することが可能となった。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用等の解析による生化学的機能解析を通して、遺伝子産物であるタンパク質の機能が解析される。
タンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ）法（Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８−９５８２（１９９１））、ファージディスプレー法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，ｐｐ．１３１５−１３１７（１９８５））、ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が知られている。ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、及び免疫共沈法では、試験管内で反応が行われるのに対し、イーストツーハイブリッド法では、細胞内での相互作用が検出される。
タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）法（Ｒｅｖｚｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３，１７２（１９８６））、ＤＮａｓｅＩフットプリント法（Ｃａｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，５，３１５７（１９７８））、メチル化緩衝法等が知られている。電気泳動シフトアッセイ法では、目的の核酸配列を有する断片を放射線同位元素等で標識してプローブとし、これとタンパク質ライブラリーを接触させ、次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出する。タンパク質−核酸相互作用が存在すると、プローブの元の移動度と異なるバンドが検出される。この方法によれば、タンパク質が認識し結合する核酸配列、及びタンパク質内のＤＮＡ結合ドメイン等を解析できる。
一方、遺伝子産物であるタンパク質を直接ラベルし、相互作用を検定する方法も知られている。この方法は、ラベル化されたタンパク質から発せられる信号が、該タンパク質が他分子との相互作用することにより変化することを用いて解析するため、上記した方法と比し、感度、正確性において優れた方法である。
タンパク質の直接ラベル化方法としては、無細胞翻訳系や生細胞で遺伝子を発現させる際、基質となるアミノ酸を^３５Ｓ、^３Ｈ、^１４Ｃ等の放射能性同位元素でラベルしたものを用いることによりタンパク質に取り込ませる放射能ラベル化法が一般的である。しかし、この場合放射能を利用するため安全管理上、特別な施設等が必要とされる。
放射性化合物を利用しない方法としてはラベル化ｔＲＮＡを用いる方法が知られている。この方法によれば、まず、アミノ酸のリジンのε−アミノ基にビオチン等のラベル物質を共有結合させ、これをリジン等のアンチコドンをもつｔＲＮＡにエステル結合させたもの（ビオチン−リジン−ｔＲＮＡ）を合成し、無細胞翻訳系に投入し、翻訳産物であるタンパク質をビオチン化する。この方法により作成されたタンパク質は、電気泳動後、メンブレンに移し、アルカリフォスファターゼとストレプトアビジンとの融合タンパク質によって化学発光させる。これを、Ｘ線フィルム等を使って、翻訳産物を同定する（Ｐｒｏｍｅｇａ社、（１９９３）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｎｏ．１８２，Ｐ．２）。この方法は、合成したビオチン−リジン−ｔＲＮＡが極めて不安定（−７０℃で６カ月）であり、高価であるという欠点を有する。さらに、翻訳されたタンパク質は、複数のリジン側鎖がビオチンで修飾され、しかも、その修飾される側鎖は各分子ごとに異なるため、同一の遺伝子から翻訳されたにも関わらず、機能及び構造が本来のものとは異なる複数の翻訳産物が得られる。そのため、タンパク質の機能解析を極めて難しいものにする。
また、タンパク質のアミノ酸のＮＨ_２、ＳＨ、ＯＨ基に、直接、化学的に蛍光物質を結合させる方法が複数知られている（ＰａｎＶｅｒａ社、（１９９８）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ Ｃｈａｐｔｅｒ ７）。しかし、これらの方法はどれもタンパク質を変性させる条件下で化学結合させるため、タンパク質の構造及び機能を著しく変化させる可能性が高い。しかも、蛍光物質がタンパク質の側鎖に部位特異的に結合することなく、複数の側鎖に非特異的に結合するため、本来のものとは構造及び機能が異なるタンパク質が複数存在することになり、タンパク質の機能解析において正確な情報が得られない。さらに、この化学修飾法においては、目的のタンパク質の精製操作が不可欠である。
本発明者等は、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中でタンパク質のＣ末端にラベル物質を直接結合させる方法を先に提案している（特願平１０−１３３１７０号明細書，特願平１０−３２００９３号明細書）。この方法により、構造及び機能を損なうことなくタンパク質をラベル化することが可能となった。しかし、この方法においてもＣ末端へのラベル分子の結合の効率に問題があった。
上記した公知のタンパク質のラベル化法には、これと相互作用する分子を同定する方法に用いるためには、ラベル化されたタンパク質が構造及び機能を保持できない、安全性に欠ける、ラベル化の効率が悪い等の問題点があった。また迅速に分子間相互作用を解析する方法として蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法等の手段が存在するにも関わらず、これを有効に利用するための技術については満足のいくものが得られていない。
発明の要約
そこで、本発明者等はＣ末端ラベル化タンパク質を用いてタンパク質と相互作用する分子を同定する方法を確立すべく鋭意検討した。その結果、Ｃ末端ラベル化タンパク質、Ｃ末端にスペーサーを介してラベル化物質が結合してなるタンパク質を固相化した固相化Ｃ末端ラベル化タンパク質、及びラベル化分子等を用いれば、タンパク質と相互作用する分子を効率的に同定し得ることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明によれば、
１．タンパク質−分子間相互作用の解析方法であって、下記の工程：
（１）Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程；及び
（２）該Ｃ末端ラベル化タンパク質又は標的分子が発する信号において、該Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子との相互作用に基づいて発せられる信号の変化を検出する工程
を含む方法；
２．標的分子がタンパク質、核酸、糖鎖、又は低分子化合物である上記１に記載の方法；
３．標的分子が標識物質によりラベル化されているラベル化分子である上記１又は２に記載の方法；
４．標識物質が蛍光標識試薬である上記３に記載の方法；
５．Ｃ末端ラベル化タンパク質が、標識物質を含むラベル部とタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物を含むアクセプター部とを含むラベル化試薬の存在下で、該タンパク質のコーディング領域を含む核酸を転写及び／又は翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製されたものである上記１ないし４のいずれかに記載の方法；
６．アクセプター部がピューロマイシン、３′−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３′−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体を含む上記５に記載の方法；
７．ラベル化試薬がラベル部とアクセプター部とがスペーサーを介して結合している化合物を含む上記５又は６に記載の方法；
８．Ｃ末端ラベル化タンパク質又は標的分子のいずれか一方が固相に結合している上記１ないし７のいずれかに記載の方法、及び上記方法において、固相への結合の態様が下記のａ又はｂ：
ａ：該Ｃ末端ラベル化タンパク質又は該標的分子のいずれか一方が基盤に１種類ずつ番地付けされて固定化されている；又は
ｂ：該Ｃ末端レベル化タンパク質又は該標的分子のいずれか一方が複数の穴を有するマイクロプレートの各穴底面に１種類ずつ固定化されている
のいずれかである方法；
９．Ｃ末端ラベル化タンパク質が、該タンパク質を構成するラベル部又はラベル部以外の部分により固相に結合している上記８に記載の方法；
１０．Ｃ末端ラベル化タンパク質を構成するラベル部が特定のポリペプチドと特異的に結合する能力を有する分子を含み、該分子が固相表面に結合している特定のポリペプチドとの連結を介して固相に結合する上記９に記載の方法；
１１．特定のポリペプチドとそれに特異的に結合する能力を有する分子の組み合わせが、ビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、及びエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールよりなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである上記１０項に記載の方法；
１２．信号の変化の測定を表面プラズモン共鳴法、エバネッセント場イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法よりなる群から選択される１以上の方法により行う上記１ないし１１のいずれかに記載の方法；
１３．Ｃ末端ラベル化タンパク質が該タンパク質を構成するラベル部により固相に結合されており、標的分子が非ラベル化分子又は標識物質によりラベル化されたラベル化分子であり、信号の変化の測定が表面プラズモン共鳴法、エバネッセント場イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、及び固相酵素免疫検定法よりなる群から選択される１以上の方法により行われる上記１、２、５ないし１１のいずれかに記載の方法；
１４．ラベル化分子が蛍光標識試薬によりラベル化された標的分子である上記１３に記載の方法；
１５．Ｃ末端ラベル化タンパク質が該タンパク質を構成するラベル部以外の部分により固相に結合されており、標的分子が非ラベル化分子又は標識物質によりラベル化されたラベル分子であり、信号の変化の測定が表面プラズモン共鴫法、エバネッセント場イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、及び固相酵素免疫検定法よりなる群から選択される１以上の方法により行われる上記１、２、５ないし１１のいずれかに記載の方法；
１６．ラベル化分子が蛍光標識試薬によりラベル化された標的分子である上記１５に記載の方法；
１７．標的分子が固相に結合されており、Ｃ末端ラベル化タンパク質のラベル部より発せられる信号の変化の測定が表面プラズモン共鳴法、エバネッセント場イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、及び固相酵素免疫検定法よりなる群から選択される１以上の方法により行われる上記１、２、５ないし１１のいずれかに記載の方法；
１８．Ｃ末端ラベル化タンパク質及び標的分子が固相に結合されずに溶液中に存在しており、標的分子が非ラベル化分子又は標識物質によりラベル化されたラベル化分子であり、信号の変化の測定が蛍光偏光解消法及び／又は蛍光相関分光法により行われる、上記１、２、５ないし１１のいずれかに記載の方法；
１９．ラベル部とアクセプター部とを含むタンパク質のラベル化試薬であって、該ラベル部が特定のポリペプチドと特異的に結合する能力を有する分子であり、該アクセプター部がタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物であるタンパク質のラベル化試薬。
２０．ラベル部がスペーサーを介してアクセプター部に共有結合している上記１９項に記載の試薬；
２１．スペーサーがポリエチレン又はポリエチレングリコールのいずれかである上記１９又は２０に記載の試薬；
２２．ラベル部がビオチン、マルトース、グアニンヌクレオチド、金属イオン、グルタチオン、タンパク質結合性ＤＮＡ、抗原分子、カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ、及びエストラジオールよりなる群より選ばれる１以上の分子を含む上記１９ないし２１のいずれかに記載の試薬；
２３．アクセプター部がピューロマイシン、３′−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は３′−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドのいずれかの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体を含む上記１９ないし２２のいずれかに記載の試薬；
２４．Ｃ末端ラベル化タンパク質が該タンパク質を構成するラベル部により固相に結合していることを特徴とする固定化タンパク質；
２５．Ｃ末端ラベル化タンパク質が、標識物質よりなるラベル部とタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物よりなるアクセプター部とから構成されるラベル化試薬の存在下で、該タンパク質のコーディング領域を含む核酸を転写及び／又は翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製されたものである上記２４に記載の固定化タンパク質；
２６．ラベル化試薬のラベル部がスペーサーを介してアクセプター部に共有結合している上記２４又は２５に記載の固定化タンパク質；
２７．ラベル部が特定のポリペプチドと特異的に結合する能力を有する分子であり、該分子が固相に結合された特定のポリペプチドと結合する上記２４ないし２６のいずれかに記載の固定化タンパク質；
２８．アクセプター部がピューロマイシン、３′−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は３′−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドのいずれかの化学構造骨格を有する化合物又はその類縁体を含む上記２４ないし２８のいずれかに記載の固定化タンパク質；
２９．ラベル部を構成する特定の分子と該分子と特異的に結合する能力を有する分子の組み合わせが、ビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、及びエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールよりなる群より選ばれるいずれかの組み合わせである上記２４ないし２８のいずれかに記載のタンパク質；
３０．上記２４ないし２９のいずれかに記載の固定化タンパク質の集合体を含むプロテインチップ；
３１．アダプタータンパク質が表面に結合した基盤を保持する手段、該基盤にＣ末端ラベル化タンパク質を導入する手段、及び該基盤を洗浄する手段を有する上記３０に記載のプロテインチップを作成するための装置；
３２．チップを保持する手段、該チップに標的分子を接着させる手段、該チップを洗浄する手段、及び該Ｃ末端ラベル化タンパク質からの信号を測定し、該Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子との相互作用に基づく信号の変化を検出するための手段を有する、上記１０、１１、１３、又は１４のいずれかに記載の方法において多数の検体の同時解析を行うための装置；
３３．タンパク質と相互作用する分子又は分子と相互作用するタンパク質の同定方法であって、
ａ．下記の工程：
（１）タンパク質のＣ末端をラベル化してＣ末端ラベル化タンパク質を製造する工程；
（２）Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程；及び
（３）Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させることにより生じた該Ｃ末端ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号の変化を検出した場合には該タンパク質と該標的分子とが相互作用すると判定する工程を含む方法；並びに
ｂ．上記工程（１）ないし（３）に続き、
（４）相互作用すると判定された該タンパク質及び該標的分子を特定する工程
を含む方法；
３４．特定のタンパク質と相互作用する分子又は特定の分子と相互作用するタンパク質の同定方法であって、
ａ．下記の工程：
（１）該タンパク質を含むＣ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程；及び
（２）Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させることにより生じた該Ｃ末端ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号の変化を検出した場合には該タンパク質と該標的分子とが相互作用すると判定する工程
を含む方法；並びに
ｂ．上記工程（１）及び（２）に続き、
（３）相互作用すると判定された該タンパク質及び該標的分子を特定する工程
を含む方法；
３５．タンパク質と相互作用する分子又は分子と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法であって、下記の工程：
（１）該タンパク質を含むＣ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程；及び
（２）Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させることにより生じた該Ｃ末端レベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号の変化を検出した場合には該タンパク質と該標的分子とが相互作用すると判定する工程
を含む方法。
３６．上記３５でスクリーニングされた上記タンパク質と相互作用する分子又は上記分子と相互作用するタンパク質；
３７．上記３３又は３４に記載のタンパク質に相互作用する分子の同定方法に使用するためのＣ末端ラベル化タンパク質；
３８．上記３５に記載のスクリーニング方法に使用するためのＣ末端ラベル化タンパク質
が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）Ｃ末端ラベル化タンパク質
（１−１）Ｃ末端ラベル化タンパク質の構成
本発明のタンパク質−分子間相互作用解析方法は、Ｃ末端ラベル化タンパク質を用いることに一つの特徴を有する方法である。Ｃ末端ラベル化タンパク質は、タンパク質部と該タンパク質のＣ末端がラベル化試薬により標識（ラベル）されているラベル部とにより構成される。
「タンパク質部」とは、その機能が既知又は未知である相互作用の解析対象として用いるタンパク質部を意味し、このタンパク質部と後述する標的分子との相互作用の有無の測定が行われる。
このタンパク質部は、天然タンパク質又はその変異体、及び人工タンパク質又はその変異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写、翻訳される多様性を有するタンパク質のライブラリーをも含むものである。人工タンパク質としては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むものである。
（１−２）ラベル化試薬
「ラベル化試薬」は、標識物質を含む「ラベル部」と、タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物を含む「アクセプター部」とを含む。ラベル部とアクセプター部とは化学結合で連結されている。ラベル部とアクセプター部とは直接化学結合していてもよく、またスペーサーを介して化学結合していてもよい。
標識物質は、通常は蛍光性物質などの非放射性標識物質から選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物などの上記核酸誘導体に連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるものであってもよい。その他、ラベル部としては後述する特定のポリペプチドと特異的に結合する能力を有する分子（以下、「リガンド」と称することがある）、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコールなどの非放射性標識物質、あるいはラベル化可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさを問わない。
これらの標識物質は、Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子との相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定に適したものが適宜用いられる。
ラベル化試薬を構成する「アクセプター部」としては、通常は核酸誘導体が用いられる。この核酸誘導体としては、無細胞タンパク質合成系又は生細胞中でタンパク質の合成（翻訳）が行われた時に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されないが、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。
また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本方法において用いられる核酸誘導体に含まれる。
アクセプター部としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン（第１図の（Ｉ））、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ：第１図のＩＩ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ：第１図のＩＩＩ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ：第１図のＩＶ）などのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
ラベル化試薬は、上記ラベル部とアクセプター部とを所望によりスペーサーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてスペーサーとしてスペーサーホスホアミダイト、ラベル部として蛍光物質などを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作成することができる。上記各部の種類、あるいは結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、ラベル部としてニッケル等の金属イオンを結合させるには、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬用いて行うことができる。
ラベル部とアクセプター部をつなぐスペーサーとしては、ポリエチレン、ポリエチレングリコールなどの高分子物質が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。
（１−３）Ｃ末端ラベル化タンパク質の調製
本発明で用いるＣ末端ラベル化タンパク質の調製法は特に制限されないが、例えば、上記ラベル化試薬の存在下で、前記タンパク質部をコードするコーディング領域をＴ７等のウイルスや細胞に由来するプロモーター領域の制御下に連結し、これを転写することによりｍＲＮＡを合成する。該コーディング領域ＤＮＡとしては、ラベル化の効率が数十倍よくするためにストップコドンを削除した配列が好ましく用いられる。また、それ自体既知の方法で生体から取得されたｍＲＮＡを用いることもできる。これらのｍＲＮＡは、翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製することができる。
用いられる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り制限されない。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。無細胞翻訳系を用いる場合、用いる核酸がＤＮＡである場合、それ自体既知のＲＮＡポリメラーゼなどを用いる方法により転写して合成したＲＮＡを鋳型として導入する。
この翻訳系において、ラベル化試薬を適当な濃度で存在させることにより合成されたタンパク質部のＣ末端にアクセプター部を介してラベル物質を結合させることができる。存在させるラベル化試薬の濃度としては、実際に用いるラベル化試薬、核酸、あるいは翻訳系によって異なるが、一般的には最終濃度が２００〜０．１μＭの範囲が好ましく用いられる。
好ましいラベル化試薬の濃度の選定は、種々の濃度のラベル化試薬を、用いる鋳型核酸とともに翻訳系に投入し、合成されたタンパク質を適当な方法で分離した後、タンパク質より発せられる信号の強度を測定し、最も高い値を示した系に投入したラベル化試薬の濃度を選択することによって行うことができる。
このようにして選定した、ラベル化試薬の濃度として具体的には、鋳型となる核酸が、Ｔ７プロモータとチオレドキシンのコーディング領域の全長ＤＮＡ、ラベル化試薬がピューロマイシンとフルオレセインの結合体で、翻訳系がウサギ網状赤血球抽出液を用いた場合には、０．１〜１μＭ、また翻訳系に小麦胚芽抽出液を用いた場合には１０〜５０μＭである。
本方法に用いるラベル物質が結合した核酸誘導体の濃度としては、実際に使用するＲＮＡ、ラベル物質、核酸誘導体、及び翻訳系等によって異なるが、下記の方法等により当業者は該濃度を適宜決定することができる。
上記したＣ末端ラベル化タンパク質を作成する系において、ラベル物質が結合した核酸誘導体、例えばフルオレセニルピューロマイシン（Ｆｌｕｏｒｐｕｒ：第２図のＩ）を濃度を違えて添加し、得られた翻訳産物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を用いる等して分離し、Ｃ末端に結合しているラベル物質より発せられる信号強度を測定し、最も信号強度の高い値を示した濃度を選択する。具体的には、Ｔ７プロモータの制御下にあるチオレドキシンのコーディング領域の全長を、Ｆｌｕｏｒｐｕｒ、もしくはＦｌｕｏｒｔｈｉｏｐｕｒ（第２図のＩＩ）の存在下で大腸菌の無細胞転写翻訳系においてタンパク質を合成する場合には、Ｆｌｕｏｒｐｕｒ、もしくはＦｌｕｏｒｔｈｉｏｐｕｒの最適濃度は、０．１〜１μＭである。またウサギ網状赤血球抽出液を用いた場合では０．３〜５０μＭ、小麦胚芽抽出液を用いた場合には１０〜５０μＭである。
このようにして合成されたＣ末端ラベル化タンパク質は、翻訳系に生細胞を用いた場合は細胞をそれ自体既知の方法で溶解後、ゲル濾過など（例えば、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６；ＢＩＯ−Ｒａｄ社製）によって未反応のラベル化試薬を除去し、取得することができる。また、無細胞翻訳系を用いた場合には、ゲル濾過によって未反応のラベル化試薬を除去すればよい。
また、本発明においてはＣ末端ラベル化タンパク質を固相に結合させる場合があるが、固相に結合させる方法としては、ラベル部を介して結合させる方法と、ラベル部以外の部分により結合させる方法が挙げられる。
ラベル部を介して結合させる場合に用いられるラベル部は特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプタータンパク質」と称することがある）を結合させる（第３図）。アダプタータンパク質としては、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体も含まれる。
アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
アダプタータンパク質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
ラベル部以外の部分により固相に結合させる場合は、通常はタンパク質を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、例えばタンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用して行うことができる。
（２）標的分子
「標的分子」とは、本発明においてＣ末端ラベル化タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、Ｃ末端ラベル化タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、Ｃ末端ラベル化タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、Ｃ末端タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、Ｃ末端タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
これら標的分子がＣ末端タンパク質と行う「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
用いられる標的分子は、態様に応じて標識物質により標識して用いることができる。標識物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性標識物質から選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）を持ち、タンパク質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるものであってもよい。その他、色素など標識化可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わない。
これらの標識物質は、標的分子とＣ末端ラベル化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。
上記標識物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、標的分子がタンパク質の場合、上記１．に記載したＣ末端を標識化する方法等を用いることができる。また標的分子が核酸の場合は、予め標識物質を共有結合などで結合させたオリゴＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲを行う方法などによって簡便に標識化することができる。
また、本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相に結合させる場合があるが、固相に結合させる方法としては、標識物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。
標識物質を介して結合させる場合に用いられる標識物質はリガンドであり、固相表面には該リガンドと結合するアダプタータンパク質を結合させる。
アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
アダプタータンパク質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
標識物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常タンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
（３）信号の変化の測定法
上記で得られたＣ末端ラベル化タンパク質と標的分子を、標識物質の種類又は固相化の方法により適宜組み合わせてＣ末端タンパク質と接触せしめ、該Ｃ末端ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定、検出することにより相互作用を解析する。
「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。用いられる測定法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法等が挙げられる。
（３−１）表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法とは、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））。この方法を用いてタンパク質−分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端ラベル化タンパク質は上記した方法により固相化されていることが必要であるが、標的分子の標識化は必要ない。
Ｃ末端ラベル化タンパク質を固相化するための基盤としては、ガラスの等の透明基盤上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。透明基盤としては、通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよく、レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガラス等からなるものであり、その厚さは０．１〜５ｍｍ程度のものが用いられる。また金属薄膜の膜厚は１００〜２０００Å程度が適当である。このような表面プラズモン共鳴装置用固基盤として市販されているものも用いることができる。Ｃ末端ラベル化タンパク質の上記基盤への固相化は前述した方法により行うことができる。
本方法において標的分子をＣ末端ラベル化タンパク質へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液に固相化されたＣ末端タンパク質を接触させる方法を用いることができる。
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）によってもよい。
両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、固相化されたＣ末端ラベル化タンパク質と標的分子の相互作用が解析できる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズモン共鳴装置に用いられる基盤に、複数のＣ末端ラベル化タンパク質を番地付けして固相化するか、あるいは１種類の固相化されたＣ末端ラベル化タンパク質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。
（３−２）エバネッセント場分子イメージング法
エバネッセント場分子イメージング法とは、Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固相化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解析する方法である。これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれか一方は上記した方法により固相化されていることが必要である。標的分子は固相化する場合は標識の必要はないが、固相化しないで用いる場合には上記した標識物質により標識化されていることが必要である。
Ｃ末端ラベル化タンパク質、あるいは標的分子を固相化するための基盤としては、ガラス等の材質の基盤が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。また、レーザー光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。
本方法において固相化していないＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を固相化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは固相化していないＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光をＣＣＤカメラ等の検出器を用いて測定することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基盤に、複数のＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を番地付けして固相化する方法等が用いられる。
（３−３）蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固相化された分子に、標識化分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固相化された分子上にとどまった標識化分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いてタンパク質−分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれか一方は上記した方法により固相化されていることが必要である。標的分子は固相化して用いる場合には標識されているものと、されていないもののどちらも利用可能である。また、固相化しないで用いる場合には上記した標識物質により標識化されていることが必要である。Ｃ末端ラベル化タンパク質は、ラベル部を介して固定化されているものも、ラベル部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。
Ｃ末端ラベル化タンパク質、あるいは標的分子を固相化するための基盤としては、通常タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、あるいはプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
本方法において標識化標的分子あるいはＣ末端ラベル化タンパク質を固相化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標識化標的分子あるいはＣ末端ラベル化タンパク質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に接触させる方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する標識化標的分子あるいはＣ末端ラベル化タンパク質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子あるいはＣ末端ラベル化タンパク質の標識物質から発せられる蛍光信号、又は固相化されている標識化分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった標識化分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定あるいは解析することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化又は非標識化標的分子を番地付けして固相化する方法、あるいは１種類のＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化又は非標識化標的分子に固相化されていない複数種のＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を接触させる方法等が用いられる。複数種のＣ末端ラベル化タンパク質あるいは標識化標的分子を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。
（３−４）固相酵素免疫検定法
固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））は、固相上に固定化した抗原に対し、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用（抗原抗体反応）により、固相化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する標識化分子（ＩｇＧ等）から発せられる蛍光、あるいは標識化分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出器（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いてタンパク質−分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、抗原となるＣ末端ラベル化タンパク質を上記した方法により固相化されていることが必要である。また抗体となる標的分子は上記した標識物質により標識化されていることが必要である。
抗原となるＣ末端ラベル化タンパク質を固相化するための基盤としては、通常ＥＬＩＳＡに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
本方法において抗体となる標識化標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標識化標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固相化分子に結合していない標識化分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標識分子から発せられる蛍光を、市販のＥＬＩＳＡリーダー等を用いて測定あるいは解析することにより、固相化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプレートの各穴にそれぞれ異なる複数の標識化標的分子を固相化する方法が用いられる。
（３−５）蛍光偏光解消法
蛍光偏光法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））は、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方法である。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性及びその存在状態に関する情報が得られるものである。この方法によれば、夾雑物があってもこれに影響されることなく、蛍光ラベル化された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。これは蛍光ラベル化された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、偏光度の変化として測定されるからである。
この方法を行うための装置としては例えばＢＥＣＯＮ（Ｐａｎｙｅｒａ社製）等が市販されており、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれも溶液として供する必要である。標的分子は標識の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端ラベル化タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端ラベル化タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法においてＣ末端ラベル化タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端ラベル化タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
本方法において測定するＣ末端ラベル化タンパク質及び標的分子との間の相互作用は、必ずしも抗原抗体方法ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合わせを検出するためには、相互作用の程度を数値化することが有効である。相互作用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度のＣ末端ラベル化タンパク質に対して、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光解消法測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端ラベル化タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定のＣ末端ラベル化タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
（３−６）蛍光相関分光法
蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、あるいは拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明においては、Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子間の相互作用により元のラベル化分子１分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する分子を測定することができる。
具体的には資料粒子が励起光により励起されて、資料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメターは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このＦＣＳを行う為の装置もカールツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端ラベル化タンパク質あるいは標的分子のいずれも溶液として供することが必要である。標的分子は標識の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端ラベル化タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端ラベル化タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法においてＣ末端ラベル化タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販のＦＣＳ用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端ラベル化タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端ラベル化タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定のＣ末端ラベル化タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
（４）相互作用する分子の同定方法
上記（３）のそれぞれの方法により測定されＣ末端ラベル化タンパク質との間に相互作用が認められた分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法により、その一次構造を解析することができる。具体的には、相互作用を認められた標的分子がタンパク質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構造を特定することができる。また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートＤＮＡシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。
（５）Ｃ末端ラベル化タンパク質の固相化のための装置
上記（１−３）に記載したＣ末端ラベル化タンパク質のラベル部を介した固相への固定化方法を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基盤の保持、Ｃ末端ラベル化タンパク質溶液の添加、洗浄等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。これらの操作を組み合わせ、全自動又は半自動の、Ｃ末端ラベル化タンパク質の固相化のための装置を構築することができる。
（６）タンパク質−分子間相互作用測定のための装置
上記（３）に記載したタンパク質−分子間相互作用測定を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基盤の保持、標的分子の添加、洗浄、信号検出等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。これらの操作を組み合わせ、全自動又は半自動の、タンパク質−分子間相互作用測定のための装置を構築することができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１ ストップコドンを削除した鋳型を用いたタンパク質のＣ末端ラベルの効率化の解析
（１）転写用ＤＮＡの構築とｍＲＮＡの作成
転写効率の高い大腸菌ウィルスＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボゾームによって認識されやすいＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）を持つ領域、及びその下流にβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡが連結したＤＮＡ断片を、次のようにして構築した。
まず、Ｔ７プロモーター配列（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５６，１２５−１３５（１９８７））とＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む１本鎖ＤＮＡ（配列番号１）を化学合成し、ＤＮＡプライマー（配列番号２）とＤＮＡ／ＲＮＡプライマー（配列番号３）によってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。一方、β−ラクタマーゼ遺伝子を、ＤＮＡ／ＲＮＡプライマー（配列番号４）とＤＮＡプライマー（配列番号５）でＰＣＲすることにより、β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡを増幅した。これらをＲＲＲ法（Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３１−１３２（１９９５））に従って、それぞれのＰＣＲ反応液にリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を加え、６０℃で３０分反応させることによってＤＮＡ／ＲＮＡプライマー（配列番号３，４）のＲＮＡの３’側のリン酸ジエステル結合を切断して突出末端を作った。これらをフェノール抽出後、プライマーリムーバー（Ｐｒｉｍｅｒ ｒｅｍｏｖｅｒ：Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によってプライマー及び切断されたＤＮＡ断片を除去し、エタノール沈殿を行った。沈殿を乾燥後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用バッファーに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：ＮＥＢ社製）を加えて４５℃、３０分反応後、さらに３０分かけて徐々に１６℃に温度を下げてからＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）を加え、上述の２つのＤＮＡ領域を結合させた。この反応液の一部を採取し、ＤＮＡプライマー（配列番号２及び５）を使って再度ＰＣＲで増幅し、転写用鋳型とした。ＰＣＲはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。
β−ラクタマーゼのストップコドンを除いたＤＮＡプライマー（配列番号６）を上記ＤＮＡプライマー（配列番号５）の代わりに用いて上記と同様の操作を行うことにより、ストップコドンを除いたβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡを含む転写用鋳型を作成した。
このようにして作成したストップコドンを有するβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ、及びストップコドンを除去したβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡは、ＲＮＡ合成キット（Ｒｉｂｏｍａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写し、ＲＮＡとした。合成効率を上げるためにキャップアナログ（ＲＮＡ ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇｕｅ：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を用い、ｍＲＮＡの５’末端を修飾した。キャップアナログ及び過剰の基質（ＮＴＰ）を除去するためにプライマーリムーバー（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使ってエタノール沈殿を行った。
（２）蛍光ラベル化試薬の調製
ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を３ｍｌの乾燥ピリジンに溶解し、減圧下で蒸発させ、脱水させた。この操作を３回繰り返した。これに５ｍｌの４％テトラゾール／アセトニニトリル溶液とフルオレダイト（６−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｈｅｘｙｌ−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ：日本パーセブティブ社製）を加え、室温で攪拌した。反応はシリカゲルの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、展開溶媒、クロロフォルム：メタノール＝９：１）でモニターした。通常、反応は２時間で終了する。反応後、溶媒を減圧下で追い出し、これに０．１Ｍのヨウ素をテトラヒドロフラン／ピリジン／水＝８０：４０：２に溶解した溶液２ｍｌを添加し、室温で攪拌しながら生成したフォスファイトトリエステルを酸化させた。９０分後、溶媒を減圧下で除去し、残部をクロロフォルムで抽出した。抽出液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥させた後、減圧下で溶媒を除去した。これをシリカゲルＴＬＣに供し、クロロフォルム／メタノール＝９０：１０で溶出させた。保護基のついたフルオレセニルピューロマイシン（Ｆｌｕｏｒｐｕｒ）はシリカゲルＴＬＣでクロロフォルム／メタノール＝９０：１０で溶出させた場合、Ｒｆ０．２６の分画に溶出された。
溶出された保護基のついたＦｌｕｏｒｐｕｒを濃アンモニア水／エタノール＝２：１の混合溶液１ｍｌに加え、β−シアノエチル基を除去した。この反応によりＦｌｕｏｒｐｕｒが７ｍｇ得られた。合成品がＦｌｕｏｒｐｕｒであることは、そのｐＨ９の溶液の紫外可視吸収スペクトルが２７２ｎｍ（ピューロマイシン部由来）と４９４ｎｍ（フルオレセイン部由来）に現れること、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ１０１０に現れることから同定された。
（３）Ｃ末端ラベル化タンパク質の作成
上記（１）で作成したｍＲＮＡはウサギ網状赤血球無細胞翻訳系（Ｒａｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｕｃｌｅｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、及び小麦胚芽無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、上記（２）で作成したＦｌｕｏｒｐｕｒを最終濃度１６μＭになるように加え、それぞれの至適反応温度（ウサギ網状赤血球無細胞翻訳系：３０℃、小麦胚芽無細胞翻訳系：２５℃）で６０分反応させた。
（４）タンパク質のラベル化の確認
上記（３）の各無細胞翻訳系反応液をＳＤＳポリアクリルアミド電気動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でＳｃｈａｇｇｅｒらの方法（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６，３６８−３７９（１９８７））により２０Ｖ定電圧にて９０分電気泳動したゲルを蛍光イメージングアナライザー（Ｆｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ５９５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で蛍光量を測定することにより行った。
最も効率よく蛍光ラベル化されたβ−ラクタマーゼタンパク質は、ストップコドンを削除したβ−ラクタマーゼｍＲＮＡを用いて小麦胚芽無細胞翻訳系により作成したものであった。同様の系でストップコドンのあるβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡから転写したＲＮＡを用いた場合に加え、ラベル化効率は１０倍以上であった。
またウサギ網状赤血球無細胞翻訳系においてもストップコドンを削除したβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡから転写したＲＮＡを用いた場合、ストップコドンのあるものよりもラベル化効率が３〜４倍高かった。
実施例２ 蛍光偏光解消法を用いたＣ末端ラベル化プロテインＡの一部ＢドメインとヒトＩｇＧとの相互作用の解析
（１）ＢドメインをコードするＤＮＡ断片の構築とそのｍＲＮＡの構築
転写効率の高い大腸菌ウイルスＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されやすい配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）と原核細胞のリボソームによって認識されやすい配列（シャイン・ダルガーノ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を有し、その下流にプロテインＡのＢドメインをコードしたＤＮＡ断片を、次のようにして構築した。
まず、Ｔ７プロモーター配列とＫｏｚａｋコンセンサス配列及びシャイン・ダルガーノ配列を有する領域とＢドメインをコードする配列を有する領域のＤＮＡを独立して作成した。Ｔ７プロモーター配列（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５６，１２５−１３５（１９８７））とＫｏｚａｋコンセンサス配列及びシャイン・ダルガーノ配列を含む１本鎖ＤＮＡ（配列番号７）を有機合成し、ＤＮＡプライマー（配列番号８）とＢドメインの一部をコードしたプライマー（配列番号９）によってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＤＮＡ合成酵素は、ＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いた。
一方、プロテインＡ遺伝子を載せたｐＲＩＴ２Ｔプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ．社製）を鋳型として配列番号８のアンチセンスプライマー（配列番号１０）とＤＮＡプライマー（配列番号１１）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＢドメインをコードするＤＮＡ領域を増幅した。これらの２つのＰＣＲ産物を重複伸長（Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法（Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，６１−６８（１９８９））に従って、結合させ、２つのＤＮＡプライマー（配列番号８及び配列番号１１）でＰＣＲすることによりＢドメインをコードするＤＮＡ断片を作成した。いずれのＰＣＲにおいてもＤＮＡ合成酵素は、ＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いた。
上記した方法で作成したＤＮＡを、反応液１００μｌ当たり１０μｇ加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率を上げるためにキャップアナログ（ＲＮＡ ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログ及び過剰のＮＴＰ（ヌクロオチド３リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ：Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使ってエタノール沈殿を行った。
（２）蛍光ラベル化試薬Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｆｌｕｏｒｐｕｒ）の調製
ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ：Ｓｉｇｍａ社製）、２６ｍｇ（４８μｍｏｌ）を３ｍｌの乾燥ピリジンに溶かし、減圧下で蒸発させ、脱水させた。この操作を３回繰り返した。これに５ｍｌの４％テトラゾール／アセトニトリル溶液とフルオレダイト（６−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｈｅｘｙｌ−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ：日本パーセブティブ社製）を加え、室温で攪拌させた。反応はシリカゲルの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、展開溶媒：クロロホルム：メタノール＝９：１）でモニターした。通常、反応は２時間で終了する。反応後、溶媒を減圧下で追い出し、これに０．１Ｍのヨウ素をテトラヒドロフラン／ピリジン／水＝８０：４０：２に溶かした溶液２ｍｌを加え、室温で攪拌させながら生成したホスファイトートリエステルを酸化させた。
１時間半後、溶媒を減圧下で除去し、残部をクロロフォルムで抽出した。抽出液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥させ、溶媒を除去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メルク社製）にかけ、クロロホルム／メタノール＝９０：１０で溶出させた。保護基のついたＦｌｕｏｒｐｕｒはシリカゲルＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム：メタノール＝９：１）でＲｆ０．２６のところに溶出された。次に保護基の脱保護を行なった。
保護基のついたＦｌｕｏｒｐｕｒを濃アンモニア水／エタノール＝２：１の混合溶液１ｍｌに加え、β−シアノエチル基を除去するとＦｌｕｏｒｐｕｒが７ｍｇ得られた。合成品がＦｌｕｏｒｐｕｒであることは、そのｐＨ９の溶液の紫外可視吸光スペクトルが２７２ｎｍ（ピューロマイシン部由来）と４９４ｎｍ（フルオレセイン部由来）に現れることならびに、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで、分子イオンがｍ／ｚ１０１０に現れることから同定された。
（３）Ｃ末端ラベル化タンパク質の作成
作成したｍＲＮＡは、無細胞翻訳キットＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた翻訳系において、フルオニルピューロマイシン（Ｆｌｕｏｒｐｕｒ）の最終濃度が１６ｍＭになるように加え、３７℃で６０分反応させた。未反応のＦｌｕｏｒｐｕｒを取り除くために、２５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で溶出した。最初の１．６ｍｌのフラクションにラベル化されたＢドメインが溶出した。電気泳動で確認するためには、さらにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３（アミコン社製）で遠心し、１３０μｌ程度まで濃縮した。
（４）タンパク質のラベル化の確認
上記（３）の各無細胞翻訳系反応液をＳＤＳポリアクリルアミド電気動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でＳｃｈａｇｇｅｒらの方法（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，３６８−３７９（１９８７））により２０Ｖ定電圧にて９０分電気泳動したゲルを蛍光イメージングアナライザー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で蛍光量を測定することにより行った。
さらに、ｐＨ．９の溶液中で４９４ｎｍの吸光度から求めたフルオレセインを指標として、蛍光分光光度計（ＲＦ−５０２：島津社製）を使用してラベル化されたＢドメインタンパク質の濃度を測定した。
（５）蛍光偏光解消測定装置によるＢドメインとヒトＩｇＧとの相互作用の解析 ラベル化されたＢドメインタンパク質濃度を０．１から１ｎＭ程度にして、ヒトＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０段階に希釈することで、０．０１ｎＭから１０μＭの濃度のサンプルを作成し、これに加えた。３０分、室温で静置した後、蛍光偏光解消測定装置（ＢＥＡＣＯＮ２０００，ＰａｎＶｅｒａ社）によって、その偏光度を測定した。各ヒトＩｇＧの濃度に対する偏光度の結果を第４図に示した。この測定値に基づき、解離定数をもとめた結果、ＫＤ＝６．４×１０^−８であった。これは、既知のデータと良く一致した。
実施例３ ビオチン化タンパク質のストレプトアビジンメンブレンへの固定化
（１）ＧＦＰｕｖ４をコードするＤＮＡ断片の構築とそのｍＲＮＡの構築
Ｔ７プロモーター配列とＫｏｚａｋコンセンサス配列及びシャイン・ダルガーノ配列を含む１本鎖ＤＮＡを鋳型として、プライマーＤＮＡ（配列番号８）とＧＦＰｕｖ４の一部をコードしたプライマー（配列番号１２）によってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＤＮＡ合成酵素は、ＫＯＤ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。
一方、ＧＦＰｕｖ４（Ｉｔｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２６４（２），５５６−６０（１９９９））をコードするＤＮＡを鋳型として配列番号１２のアンチセンスプライマー（配列番号１３）とＧＦＰ遺伝子の３’末端プライマー（配列番号１４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＧＦＰｕｖ４をコードしたＤＮＡ領域を増幅した。
これらの２つのＰＣＲ産物を重複伸長（Ｏｖｅｒａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法（Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７７，６１−６８（１９８９））に従って結合させ、２つのＤＮＡプライマー（配列番号８及び配列番号１４）を用いてＰＣＲを行うことによりＴ７プロモーターの下流にＧＦＰｕｖ４をコードするＤＮＡが結合したＤＮＡ鎖を作成した。いずれのＰＣＲにおいてもＤＮＡ合成酵素は、ＫＯＤ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。
上記した方法で作成したＤＮＡを、反応液１００μｌ当たり１０μｇ加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率を上げるためにキャップアナログ（ＲＮＡ ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログ及び過剰のＮＴＰ（ヌクロオチド３リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ：Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使ってエタノール沈殿を行った。
（２）ビオチンラベル化試薬Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｕｒｏ）の調製
アミノ基と５’水酸基をそれぞれトリフルオロアセチル基とジメトキシトリチル基で保護したピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を３’水酸基を介して固相担体（ＮｏｖａｓＹｎ ＴＧ ａｍｉｎｏ ｒｅｓｉｎ ＬＬ：Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）に結合させ、ホスホアミダイド法により、核酸合成機（ＡＢＩ ３４９８：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）上でＢｉｏｔｉｎ（Ｂｉｏｔｉｎ ＴＥＧ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｄｅ：グレンリサーチ社）、あるいはＰＥＧスペーサー（Ｓｐａｃｅｒ １８：グレンリサーチ社製）を結合させた後に脱保護を行った。
（３）タンパク質のラベル化
作成したｍＲＮＡ２μｇは、無細胞翻訳キット小麦胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた翻訳系において、５００μＭビオチンピューロマイシン（Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏ）２μｌ、又は５００μＭポリエチレングリコールピューロマイシン（ＰＥＧ−ｐｕｒｏ）２μｌをそれぞれ加え、２６℃で６０分反応させた。未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏ又はＰＥＧ−ｐｕｒｏを取り除くために、２５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で溶出した。
（４）タンパク質のラベル化の確認
ビオチンピューロマイシン（Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏ）でラベル化されたタンパク質の確認は、上記のサンプルを各１５μｌ取り、ＳＡＭ２ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にスポットし、１０分間静置した後、このメンブレンをＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で洗浄した。このＴＢＳ緩衝液の洗浄の前及び後に、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてメンブレン上の蛍光強度をイメージした。この結果を第５図に示す。ＴＢＳ緩衝液で洗浄する前は、Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏとＰＥＧ−ｐｕｒｏのそれぞれが同様の強度を示したが、洗浄後はＰＥＧ−ｐｕｒｏでラベルされたＧＦＰｕｖ４は洗い流されていた。一方Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏによってラベル化されたＧＦＰｕｖ４はメンブレンにビオチンにより固定化された。
実施例４ 蛍光イメージアナライザーを用いたビオチン化プロテインＡ、Ｂドメ インとヒトＩｇＧとの相互作用の解析
（１）プロテインＡ、Ｂドメイン及びＧＦＰｕｖ４をコードするＤＮＡ断片の構築とそのｍＲＮＡの構築
Ｔ７プロモーター配列とＫｏｚａｋコンセンサス配列及びシャイン・ダルガーノ配列を含む１本差ＤＮＡ（配列番号７）を鋳型としてプライマーＤＮＡ（配列番号８）とプロテインＡ、Ｂドメインの一部をコードした塩基配列及びリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする塩基配列）を含むプライマー（配列番号１５）によってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＤＮＡ合成酵素は、ＫＯＤ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。
一方、ＧＦＰｕｖ４（Ｉｔｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２６４（２），５５６−６０（１９９９））をコードするＤＮＡを鋳型として配列番号１５のリンカー配列のアンチセンス配列及びＧＦＰｕｖ４の一部をコードする塩基配列を含むプライマー（配列番号１６）とＧＦＰをコードするＤＮＡの３’末端プライマー（配列番号１４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、５’末端にリンカー配列が結合したＧＦＰｕｖ４をコードするＤＮＡ領域を増幅した。
これらの２つのＰＣＲ産物を重複伸長（Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法（Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，７７，６１−６８（１９８９））に従って、結合させ、２つのＤＮＡプライマー（配列番号８及び配列番号１４）を用いてＰＣＲを行うことによりＴ７プロモーターの下流にプロテインＡ、ＢドメインをコードするＤＮＡ、及びリンカー配列を介してＧＦＰｕｖ４をコードするＤＮＡが結合したＤＮＡ鎖を作成した。いずれのＰＣＲにおいてもＤＮＡ合成酵素は、ＫＯＤ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。
上記した方法で作成したＤＮＡを、反応液１００μｌ当たり１０μｇ加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率を上げるためにキャップアナログ（ＲＮＡ ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログ及び過剰のＮＴＰ（ヌクロオチド３リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ：Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使ってエタノール沈殿を行った。
（２）ビオチンラベル化試薬Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｕｒｏ）の調製
アミノ基と５’水酸基をそれぞれトリフルオロアセチル基とジメトキシトリチル基で保護したピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を３’水酸基を介して固相担体（ＮｏｖａｓＹｎ ＴＧ ａｍｉｎｏ ｒｅｓｉｎ ＬＬ：Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）に結合させ、ホスホアミダイド法により、核酸合成機（ＡＢＩ ３４９８：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）上でＰＥＧスペーサー（Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｄｅ １８：グレンリサーチ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ（Ｂｉｏｔｉｎ ＴＥＧ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｄｅ：グレンリサーチ社）、を順次結合させた後に脱保護を行った。
（３）タンパク質のラベル化
作成したｍＲＮＡ ２μｇは、無細胞翻訳キット小麦胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた翻訳系において、５００μＭビオチンピューロマイシン（Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｐｏ）２μｌを加え、２６℃で６０分反応させた。未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏを取り除くために、Ｂｉｏ−ｓｐｉｎカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）でゲル濾過を行った。
（４）Ｃ末端ビオチンラベル化Ｂドメイン−ＧＦＰｕｖ４結合タンパクの固定化 上記（３）で作成したＣ末端ビオチンラベル化Ｂドメイン−ＧＦＰｕｖ４結合タンパク（Ｂｉｏｔｉｎ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＧＦＰｕｖ４）をＳＡＭ２ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）各ウェルに５０μｌずつ加え、１５分間静置した後、各ウェルをＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で洗浄した。次にＢｉｏｔｉｎと結合しなかったプレートに接着したストレプトアビジンをコートするために、１ｍＭ Ｂｉｏｔｉｎ／ＰＢＳ １００μｌを加えた。その後２００μｌのＴＢＳ緩衝液で５回ウェルを洗浄した。次に１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）／ＰＢＳでブロッキングした。またコントロールとしてＢｉｏｔｉｎ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＧＦＰｕｖ４を固定化していないウェルも同様にブロッキングした。
（５）蛍光イメージングアナライザーによる固相化ＢドメインとヒトＩｇＧとの相互作用の解析
上記（４）で作成したＢｉｏｔｉｎ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＧＦＰｕｖ４を固定化した、又は固定化していないＳＡＭ２ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅの各ウェルに、Ｂドメインとａｆｆｉｎｉｔｙの高いＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｉ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ ｉｓｏｔｙｐｅ）（ＳＩＧＭＡ社製）あるいは、Ｂドメインとａｆｆｉｎｉｔｙの低いＢｉｏｔｉｎ−Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ Ｉ（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ）（ＳＩＧＭＡ社製）をＰＢＳ緩衝液で５万倍に希釈したものを加え、１時間静置した。この各ウェルをＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、１０分間静置後、ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。さらにＡｔｔｐｈｏｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を加え、室温で２０分反応させた。これを蛍光イメージングアナライザー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＦＸ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてイメージングした結果を第６図に示した。
Ｂｉｏｔｉｎ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＧＦＰｕｖ４を固定化していないウェルにはバックグラウンドの蛍光しか観察されず、Ｂｉｏｔｉｎ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＧＦＰｕｖ４を固定化した各ウェルにおいては、Ｂドメインとａｆｆｉｎｉｔｙの高いＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ ｉｓｏｔｙｐｅを投入したウェルにおける蛍光が、ａｆｆｉｎｉｔｙの低いｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅを投入したウェルにおける蛍光より強くなっており、相互作用の強度を測定、解析することができた。
産業上の利用可能性
本発明により、現在急速に蓄積されている遺伝子の塩基配列がコードするタンパク質の機能解析、例えばタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、タンパク質−低分子化合物相互作用等の解析を迅速化するための手段が提供される。また、本発明により、タンパク質の機能解析において不可欠である大量のデータを迅速に解析する方法（ハイスループット化）において有力な手段が提供される。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、ピューロマイシン及びその誘導体の化学構造である。ＩはＰｕｒｏｍｙｃｉｎ、ＩＩはｒＣｐＰｕｒ、ＩＩＩはｄＣｐＰｕｒ、ＩＶはｄＵｐＰｕｒである。
第２図は、蛍光物質と結合したピューロマイシンの化学構造である。ＩはＦｌｕｏｒｐｕｒ、ＩＩはＦｌｕｏｒｔｈｉｏｐｕｒである。
第３図は、ラベル部としてのリガンドが、固相に結合したアダプタータンパク質を介して結合した固相化Ｃ末端タンパク質をあらわした模式図である。
第４図は、蛍光偏光解消測定装置によりドメインＢとヒトＩｇＧとの相互作用を測定し、その結果を各ヒトＩｇＧの濃度に対する偏光度の変化として示した図である。
第５図は、ビオチンピューロマイシン（Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｕｒｏ）でラベル化されたタンパク質の蛍光強度を蛍光イメージングアナライザーのディスプレー上に表示した写真である。
第６図は、蛍光イメージングアナライザーによる固相化ＢドメインとヒトＩｇＧとの相互作用の強度を蛍光強度として蛍光イメージングアナライザーのディスプレー上に表示した写真である。

Claims (8)

1. タンパク質−分子間相互作用の解析方法であって、下記の工程：
   （１）Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子とを接触させる工程；及び
   （２）該Ｃ末端ラベル化タンパク質又は該標的分子が発する信号において、該Ｃ末端ラベル化タンパク質と標的分子との相互作用に基づいて発せられる信号の変化を検出する工程を含み、
   該Ｃ末端ラベル化タンパク質を構成するラベル部は、特定のポリペプチドと特異的に結合する能力を有する分子を含み、該分子が固相表面に結合している特定のポリペプチドとの連結を介して固相に結合し、かつ
   該Ｃ末端ラベル化タンパク質は、標識物質を含むラベル部とタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物を含むアクセプター部とを含むラベル化試薬の存在下で、該タンパク質のコーディング領域を含む核酸を転写及び／又は翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製されたものであり、該ラベル化試薬はラベル部とアクセプター部とがスペーサーを介して結合している化合物を含む
   解析方法。
2. 標的分子がタンパク質、核酸、糖鎖、又は低分子化合物である請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 標的分子が標識物質によりラベル化されているラベル化分子である請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
4. 標識物質が蛍光標識試薬である請求の範囲第３項に記載の方法。
5. アクセプター部がピューロマイシン、３′−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３′−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体を含む請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の方法。
6. 特定のポリペプチドとそれに特異的に結合する能力を有する分子の組み合わせが、ビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、及びエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールよりなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の方法。
7. 信号の変化の測定を表面プラズモン共鳴法、エバネッセント場イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法よりなる群から選択される１以上の方法により行う請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。
8. スペーサーがポリエチレン又はポリエチレングリコールのいずれかである請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。

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