JP3921866B2

JP3921866B2 - L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid

Info

Publication number: JP3921866B2
Application number: JP06832499A
Authority: JP
Inventors: 美加守屋; 裕泉井; 栄治小野; 和彦松井; 久生伊藤; 吉彦原
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-15
Publication date: 2007-05-30
Anticipated expiration: 2019-03-15
Also published as: JP2000106869A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＬ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物であって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を広く検索、研究した結果、クレブシエラ属またはエルビニア属に属する微生物由来の誘導株が高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物。
（２）クレブシエラ・プランティコーラまたはパントエア・アグロメランスに属する（１）の微生物。
（３）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた（１）または（２）の微生物。
（４）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、クエン酸シンターゼ（以下「ＣＳ」と略す）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（以下「ＰＥＰＣ」と略す）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」と略す）から選ばれる（３）の微生物。
（５）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、ＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨのすべてである（４）の微生物。
（６）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した（１）〜（５）のいずれかの微生物。
（７）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下「αＫＧＤＨ」と略す）である（６）の微生物。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかの微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用されるクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
【０００８】
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）
クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現在は、パントエア・アグロメランスに分類されている）
エルビニア・アナナス（E. ananas）
エルビニア・カクティシダ（E. cacticida）
エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi）
エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora）
エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus）
エルビニア・プシディ（E. psidii）
エルビニア・ケルシナ（E. quercina）
エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici）
エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens）
エルビニア・サリシス（E. salicis）
エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）
パントエア・ディスペルサ（P. dispersa）
【０００９】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９
エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６）
【００１０】
クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＰ−１６６４６として寄託され、平成１１年１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６６１６が付与されている。また、エルビニア・ヘルビコーラに分類されていた微生物は現在パントエア・アグロメランスに分類されている。そのため、エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５は、パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６と名付けられ、平成１１年２月２５日にブタペスト条約に基づく国際寄託として、通産省工業技術院生命工学技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６６６０が付与されている。
【００１１】
クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株である。
以下に、ＡＪ１３３９９の生理的性質を記す。
【００１２】
（１）細胞の形：桿菌
（２）運動性：なし
（３）胞子：なし
（４）ＬａｂＭ栄養寒天培地でのコロニー形態：円形、表面は平滑、クリーム色、なめらか、隆起状、光沢有り。
（５）グルコースＯＦテスト：発酵能ポジティブ
（６）グラム染色性：陰性
（７）酸素に対する挙動：通性嫌気性
（８）カタラーゼ：ポジティブ
（９）オキシダーゼ：ネガティブ
（１０）ウレアーゼ：ポジティブ
【００１３】
（１１）チトクロームオキシダーゼ：ネガティブ
（１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ
（１３）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ
（１４）オルニチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１５）リジンデカルボキシラーゼ：ポジティブ
（１６）トリプトファンデアミナーゼ：ネガティブ
（１７）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ
（１８）インドール生成：ポジティブ
（１９）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：ネガティブ
（２０）クエン酸資化性：ポジティブ
【００１４】
（２１）Ｍ−ハイドロキシベンゼン酸資化性：ネガティブ
（２２）ゼラチン液化能：ネガティブ
（２３）糖からの酸の生成
グルコース：ポジティブ
マンニトール：ポジティブ
ラムノース：ポジティブ
アラビノース：ポジティブ
シュークロース：ポジティブ
ソルビトール：ポジティブ
イノシトール：ポジティブ
メリビオース：ポジティブ
アミグダリン：ポジティブ
アドニトール−ペプトン−水：ポジティブ
セロビオース−ペプトン−水：ポジティブ
デュルシトール−ペプトン−水：ネガティブ
ラフィノース−ペプトン−水：ポジティブ
（２４）生育温度３７℃生育良好、４５℃生育不可
【００１５】
これらの菌学的性質からＡＪ１３３９９は、クレブシエラ・プランティコーラと判定された。
【００１６】
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology第９版には、エルビニア・ハルビコーラは存在せず、従来エルビニア・ハルビコーラに分類されていた微生物はパントエア・アグロメランスに分類されている。このようにエルビニア属細菌とパントエア属細菌は非常に近縁であり、本発明においてはエルビニア属細菌とパントエア属細菌のいずれも用いることができる。
【００１７】
上記したようなクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する細菌による糖の代謝はエムデン−マイヤーホフ経路を経て行われ、同経路で生成するピルビン酸は好気的条件下ではトリカルボン酸サイクルにて酸化される。Ｌ−グルタミン酸は、トリカルボン酸サイクルの中間体であるα−ケトグルタル酸より、ＧＤＨあるいはグルタミンシンセターゼ／グルタミン酸シンターゼによって生合成される。このように、これらの微生物ではＬ−グルタミン酸生合成経路は共通のものであり、本発明においては、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物は単一の概念を形成する。従って、上記した種または菌株以外のクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物も本発明に含まれる。
【００１８】
本発明の微生物は、上記のようなクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物であって、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物である。ここで「Ｌ−グルタミン酸生産能を有する」とは、培養したときに培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有することをいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物においてＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物、またはＬ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物が挙げられる。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物も含まれる。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素としては、ＧＤＨ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ＣＳ、ＰＥＰＣ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、本発明の微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。細胞中の目的酵素の活性が増加していること、および活性の増加の程度は、微生物の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。
【００２０】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物は、例えば、前記の微生物を出発親株に用い、これらの酵素をコードする遺伝子に変異を生じた変異株として、または遺伝子組換え株として取得することができる。
【００２１】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて、宿主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００２２】
クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入される。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
【００２３】
上記プラスミドとしては、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２４】
形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００２５】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めることは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００２６】
コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００２７】
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いて、その栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属細菌のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００２８】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターをそれよりも強力な他のプロモーターに置換することによって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプロモーター、Ｐ_Lプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にクローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、またはトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に導入される。
【００２９】
また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモーターを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241参照）によっても達成することができる。具体的には、強力なプロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを起こさせればよい。
【００３０】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められたクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物として具体的には、クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９／ＲＳＦＣＰＧおよびエルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５／ＲＳＦＣＰＧが挙げられる。
【００３１】
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αＫＧＤＨ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３２】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００３３】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００３４】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠陥遺伝子）を作製する。次いで、この欠陥遺伝子をクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠陥遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
【００３５】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定することができる。
【００３６】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で生育できないか、または生育速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
【００３７】
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００３８】
その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)）等に詳述されている。
【００３９】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３４１０が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３４１０は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＰ−１６６４７として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６６１７が付与されている。
【００４０】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、上記のようにしてαＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められた株は、後記実施例に示すように、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する。
【００４１】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属と同じ腸内細菌群に含まれるエシェリヒア属に属する微生物に関しては、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株がＬ−グルタミン酸を生成しうること（特開平５−２４４９７０号）、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損し、かつＰＥＰＣ活性とＧＤＨ活性が高められた株が更に著量のＬ−グルタミン酸を生成しうること（特開平７−２０３９８０号）、および、バリン感受性を示しＣＳ活性とＧＤＨ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうること（ＷＯ９７／０８２９４号）が知られている。
【００４２】
また、同じく腸内細菌群に含まれるエンテロバクター属に属する微生物に関しては、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうることを発明者らは発見した（特願平１０−６９０６８号）。
【００４３】
さらに、セラチア属に属する微生物に関しても、ＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうることを発明者らは発見した（特願平１０−６９０６８号）。
【００４４】
これらの事実より、実施例に示した菌株に限られず、クレブシエラ属、エルビニア属、パントエア属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、またはセラチア属の他の微生物に関しても、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が増幅された株がＬ−グルタミン酸を生成しうることは、容易に推察される。また、実施例に示すように、αＫＧＤＨを欠損させることにより、クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株へＬ−グルタミン酸生産能を付与できることは、他のクレブシエラ属細菌、エルビニア属またはパントエア属の細菌にも適用できることが強く支持される。
【００４５】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することができる。前記培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００４６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００４７】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００４８】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００４９】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度２０ないし４２℃、ｐＨを４ないし８に制御しつつ通気培養を行う。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００５０】
培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【００５１】
【実施例】
次に、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
【００５２】
（１）ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成の手順を、図１、２及び３に基づいて説明する。
【００５３】
エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図１）。
【００５４】
また、ｐＢＲＧＤＨをＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ消化して得られたｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン（株）より購入）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＧを得た（図２）。さらに、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＴＷＶＣ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化して得られたｇｌｔＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＣを得た（図３）。
【００５５】
同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４１消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔを得た（図４）。
【００５６】
次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したものと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図５）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧが、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。同様に、ｐＭＷＧまたはｐＭＷＣが、ｇｄｈＡ遺伝子またはｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｄｈＡ遺伝子またはｇｌｔＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【００５７】
（２）クレブシエラ属細菌およびエルビニア属（パントエア属）細菌へのＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣ及びｐＭＷＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣ及びｐＭＷＧを用い、エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６）またはクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株を、エレクトロポレーション（Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換株を取得した。
【００５８】
得られた形質転換株あるいは各々の親株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌを含有する培地５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管に接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。形質転換体の培養については、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌを添加した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した結果を表１に示した。
【００５９】
【表１】

【００６０】
エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５あるいはクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株はＬ−グルタミン酸を蓄積しなかったが、ＲＳＦＣＰＧを導入することによってＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、それぞれ５．０ｇ／Ｌ、３．１ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を蓄積した。また、ＡＪ１３３９９株のＣＳ活性のみを増幅することによって２．５ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、ＧＤＨ活性のみを増幅することによって０．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、それぞれ蓄積した。
【００６１】
（３）クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株のαＫＧＤＨ遺伝子の一部を有する断片のクローニング
クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株のαＫＧＤＨ遺伝子の一部を有する断片は、既にその塩基配列が報告されているアゾトバクター・ビネランディ、バチルス・ズブチリス、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ハエモフィラス・インフルエンザ、ヒト、及びサッカロマイセス・セレビシエの各生物のαＫＧＤＨ遺伝子（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１８７巻、２３５〜２３９頁、１９９０年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２３４巻、２８５〜２９６頁、１９９２年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３５９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４２巻、３３４７〜３３５４頁、１９９６年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、４９６〜５１２頁、１９９５年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８９巻、１９６３〜１９６７頁、１９９２年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、第９巻、２６９５〜２７０５頁、１９８９年）の相同部位の塩基配列及びＥｃｏＲＩサイトを有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによって、そのクローニングを実施した。
プライマーとしては、具体的には以下のものを使用した。
【００６２】
（プライマー１）
５’CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA３’（配列番号１）
（プライマー２）
５’GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC3’（配列番号２）
【００６３】
ＰＣＲのテンプレートとして用いたクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリにおいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。
【００６４】
ＰＣＲの条件は、９４℃１分、５０℃１分、７３℃３分、３０サイクルとし、得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ消化後、ＥｃｏＲＩ消化したベクタープラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに挿入し、組み換えプラスミドｐＴ７ＫＰを得た。ベクタープラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（アンピシリン耐性）はノバゲン社製の市販品を用いた。
【００６５】
クローニングされた断片のＤＮＡ塩基配列及びこの配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、同アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。同配列は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以下「ｓｕｃＡ遺伝子」という）と８２．３％の相同性を示しており、明らかにクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株のｓｕｃＡ遺伝子の一部と考えられる。尚、配列番号３に示される塩基配列において、塩基番号１８〜１６５９がｓｕｃＡ遺伝子に由来し、塩基番号０〜１７及び１６６０〜１６７９はプライマーに由来する。
【００６６】
（４）クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得
上記のようにして取得されたクレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子の一部を有する断片を用い、相同組換えによりクレブシエラ・プランティコーラのαＫＧＤＨ欠損株の取得を行った。
【００６７】
まず、ｐＴ７ＫＰをＢｓｔＥＩＩにて切断し、そこにプラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア社より購入）よりＰＣＲによりクローニングすると共に両端にＢｓｔＥＩＩサイトを導入したカナマイシン耐性遺伝子断片を導入し、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍを得た。
カナマイシン耐性遺伝子のクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【００６８】
（プライマー３）
５’TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT３’（配列番号５）
（プライマー４）
５’CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG３’（配列番号６）
【００６９】
次にｐＴ７ＫＰＫｍをＫｐｎＩにて切断し、そこにプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造（株）より購入）よりＰＣＲによりクローニングすると共に両端にＫｐｎＩサイトを導入したテトラサイクリン耐性遺伝子断片を導入し、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたと共にその隣にテトラサイクリン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍＴｃを得た。
テトラサイクリン耐性遺伝子のクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【００７０】
（プライマー５）
５’GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG３’（配列番号７）
（プライマー６）
５’GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG３’（配列番号８）
【００７１】
続いてプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍＴｃをＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化することによって、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたと共にその隣にテトラサイクリン耐性遺伝子を有するＤＮＡ断片を切り出し、これを、ＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化したグラム陰性細菌用染色体挿入プラスミドベクターｐＧＰ７０４（Marta Herrero et al., Journal of Bacteriology, 1990, 172, p.6557-6567）に挿入し、プラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫを得た。
【００７２】
こうしてできたプラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫを用いて、クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株を、エレクトロポレーションによって形質転換し、テトラサイクリン耐性かつカナマイシン耐性を指標として、プラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫがｓｕｃＡ遺伝子断片の相同組み換えによって染色体上に挿入された株を取得した。さらにこの株より、テトラサイクリン感受性かつカナマイシン耐性を指標として、染色体上のｓｕｃＡ遺伝子が中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に置換されたと考えられるｓｕｃＡ欠損株クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３４１０株を取得した。
【００７３】
以上のようにして得られたＡＪ１３４１０株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するためにReedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その結果、表２に示すようにＡＪ１３４１０株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
【００７４】
【表２】

【００７５】
（５）クレブシエラ・プランティコーラ αＫＧＤＨ欠損株のＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３３９９、ＡＪ１３４１０の両株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びα−ケトグルタール酸（以下「αＫＧ」と略す）を測定した結果を表３に示した。
【００７６】
【表３】

【００７７】
αＫＧＤＨ活性が欠損したＡＪ１３４１０株は、Ｌ−グルタミン酸を１２．８ｇ／Ｌ蓄積した。また同時に１．５ｇ／ＬのαＫＧを蓄積した。
【００７８】
（６）クレブシエラ・プランティコーラαＫＧＤＨ欠損株へのＲＳＦＣＰＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３４１０株をＲＳＦＣＰＧを用いて形質転換し、得られたＲＳＦＣＰＧ導入株ＡＪ１３４１０／ＲＳＦＣＰＧを、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ＤＡＰ２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びαＫＧを測定した結果を表４に示した。
【００７９】
【表４】

【００８０】
ＲＳＦＣＰＧを導入してＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、αＫＧ蓄積量が減少し、Ｌ−グルタミン酸蓄積が更に向上した。
【００８１】
【発明の効果】
本発明の微生物は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌で従来知られている育種手法等を用いてさらに高い生産能を付与できると考えられ、また培養条件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン酸製造法の開発につながるものと期待される。
【００８２】
【配列表】

【００８３】

【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【００８９】

【００９０】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す図。
【図２】ｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＧの構築を示す図。
【図３】ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣの構築を示す図。
【図４】広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔの構築を示す図。
【図５】広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧの構築を示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel L-glutamic acid-producing bacterium and a method for producing L-glutamic acid by fermentation using the same. L-glutamic acid is an important amino acid for foods, pharmaceuticals and the like.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, L-glutamic acid is mainly produced by fermentation using so-called coryneform L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, or mutants thereof (amino acid fermentation). Society Publishing Center, 195-215, 1986). As a method for producing L-glutamic acid by fermentation using other strains, methods using microorganisms such as Bacillus, Streptomyces, Penicillium (US Pat. No. 3,220,929), Pseudomonas, Arthro A method using microorganisms such as Bacter genus, Serratia genus, Candida genus (US Pat. No. 3,563,857), a method using a mutant of Escherichia coli (Japanese Patent Laid-Open No. 5-244970), and the like are known. .
[0003]
Although the productivity of L-glutamic acid has increased considerably due to the improvement of the breeding and production methods of microorganisms as described above, in order to meet the further increase in future demand, more inexpensive and efficient L-glutamic acid. Development of a manufacturing method is demanded.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to find a novel L-glutamic acid-producing bacterium having high L-glutamic acid-producing ability, and to develop an inexpensive and efficient method for producing L-glutamic acid.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have extensively searched for and studied microorganisms different from conventional microorganisms and having L-glutamic acid-producing ability. As a result, the present invention belongs to the genus Klebsiella or Erbinia. The inventors have found that a microorganism-derived derivative strain has a high L-glutamic acid-producing ability, and have completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention is as follows.
(1) A microorganism belonging to the genus Klebsiella, erbinia or Pantoea, and having an ability to produce L-glutamic acid.
(2) The microorganism of (1) belonging to Klebsiella planticola or Pantoea agglomerans.
(3) The microorganism according to (1) or (2), wherein the activity of an enzyme that catalyzes a biosynthesis reaction of L-glutamic acid is enhanced.
(4) Enzymes that catalyze the biosynthesis reaction of L-glutamic acid are citrate synthase (hereinafter abbreviated as “CS”), phosphoenolpyruvate carboxylase (hereinafter abbreviated as “PEPC”), and glutamate dehydrogenase (hereinafter referred to as “GDH”). (3) microorganisms selected from “abbreviated”).
(5) The microorganism according to (4), wherein the enzyme that catalyzes the biosynthesis reaction of L-glutamic acid is CS, PEPC, and GDH.
(6) The microorganism according to any one of (1) to (5), wherein the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce a compound other than L-glutamic acid is reduced or deleted.
(7) The microorganism according to (6), wherein an enzyme that catalyzes a reaction that branches off from a biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce a compound other than L-glutamic acid is α-ketoglutarate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as “αKGDH”).
(8) The microorganism of any one of (1) to (7) above is cultured in a liquid medium, L-glutamic acid is produced and accumulated in the medium, and this is collected from the medium. Manufacturing method.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Examples of microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erwinia or Pantoea used in the present invention include the following.
[0008]
Klebsiella planticola
Klebsiella terrigena (K. terrigena)
Erwinia herbicola (currently classified as Pantoea agglomerans)
E. ananas
E. cacticida
Ervinia Chrysanthemi
E. mallotivora
E. persicinus
Elvinia Psidi (E. psidii)
E. quercina
E. rhapontici
E. rubrifaciens
Elvinia Salicis
E. uredovora
Pantoea agglomerans
Pantair dispersa (P. dispersa)
[0009]
More preferably, the strain shown below is mentioned.
Klebsiella Planticola AJ13399
Elvinia Herbicola IAM1595 (Pantair Agglomerans AJ2666)
[0010]
Klebsiella Planticola AJ13399 was deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on February 19, 1998, under the accession number FERM P-16646 and entered into the Budapest Treaty on January 11, 1999. Transferred to the international deposit, based on the deposit number FERM BP-6616. Microorganisms that have been classified as Erwinia herbicola are now classified as Pantoea agglomerans. Therefore, Elvinia Herbicola IAM 1595 was named Pantoea Agromerans AJ2666, and was deposited at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, Ministry of International Trade and Industry as an international deposit based on the Budapest Treaty on February 25, 1999. 6660 is assigned.
[0011]
Klebsiella planticola AJ13399 strain is a strain isolated from the soil of Sapporo City, Hokkaido.
The physiological properties of AJ13399 are described below.
[0012]
(1) Cell shape: Neisseria gonorrhoeae
(2) Mobility: None
(3) Spore: None
(4) Colony morphology on LabM nutrient agar medium: circular, smooth surface, cream color, smooth, raised, glossy.
(5) Glucose OF test: Fermentation ability positive
(6) Gram stainability: negative
(7) Behavior to oxygen: facultative anaerobic
(8) Catalase: Positive
(9) Oxidase: negative
(10) Urease: Positive
[0013]
(11) Cytochrome oxidase: negative
(12) β-galactosidase: positive
(13) Arginine dehydratase: negative
(14) Ornithine decarboxylase: negative
(15) Lysine decarboxylase: positive
(16) Tryptophan deaminase: negative
(17) Foguez-Proskawell test: positive
(18) Indole generation: Positive
(19) Hydrogen sulfide production in TSI medium: negative
(20) Citric acid assimilation: positive
[0014]
(21) M-hydroxybenzene acid utilization: negative
(22) Gelatin liquefaction ability: negative
(23) Production of acid from sugar
Glucose: positive
Mannitol: Positive
Rhamnose: Positive
Arabinose: Positive
Sucrose: Positive
Sorbitol: positive
Inositol: Positive
Melibiose: Positive
Amygdalin: Positive
Adonitol-peptone-water: positive
Cellobiose-Peptone-Water: Positive
Dulcitol-Peptone-Water: Negative
Raffinose-Peptone-Water: Positive
(24) Growth temperature 37 ° C good growth, 45 ° C growth impossible
[0015]
From these mycological properties, AJ13399 was determined to be Klebsiella planticola.
[0016]
In the 9th edition of Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, there is no Elvinia halbicola, and microorganisms previously classified as erbinia halbicola are classified as Pantoea agglomerans. Thus, Erwinia bacteria and Pantoea bacteria are very closely related, and in the present invention, both Erwinia bacteria and Pantoea bacteria can be used.
[0017]
Sugar metabolism by bacteria belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea as described above is carried out via the Emden-Meyerhof pathway, and pyruvic acid produced in this pathway is oxidized in the tricarboxylic acid cycle under aerobic conditions. The L-glutamic acid is biosynthesized from α-ketoglutaric acid, which is an intermediate of the tricarboxylic acid cycle, by GDH or glutamine synthetase / glutamate synthase. Thus, these microorganisms share the same L-glutamic acid biosynthetic pathway, and in the present invention, microorganisms belonging to the genera Klebsiella, Erbinia or Pantoea form a single concept. Accordingly, microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erwinia or Pantoea other than the above-mentioned species or strains are also included in the present invention.
[0018]
The microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea as described above, and having L-glutamic acid-producing ability. Here, “having the ability to produce L-glutamic acid” means having the ability to accumulate L-glutamic acid in the medium when cultured. This L-glutamic acid-producing ability may be a property of a wild strain, or may be a property imparted or enhanced by breeding. Examples of microorganisms having the ability to produce L-glutamic acid among microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea include, for example, microorganisms with enhanced activity of an enzyme that catalyzes the biosynthesis reaction of L-glutamic acid, or the production of L-glutamic acid. Examples include microorganisms that have a decreased or deficient activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches off from the synthetic pathway to produce a compound other than L-glutamic acid. Moreover, the activity of the enzyme that catalyzes the biosynthesis reaction of L-glutamic acid is enhanced, and the activity of the enzyme that catalyzes the reaction that produces a compound other than L-glutamic acid by branching from the biosynthesis pathway of L-glutamic acid is reduced. Alternatively, deficient microorganisms are included.
[0019]
Enzymes that catalyze the biosynthetic reaction of L-glutamate include GDH, glutamine synthetase, glutamate synthase, isocitrate dehydrogenase, aconite hydratase, CS, PEPC, pyruvate dehydrogenase, pyruvate kinase, enolase, phosphoglyceromutase, phospho Examples thereof include glycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, fructose bisphosphate aldolase, phosphofructokinase, and glucose phosphate isomerase. Among these enzymes, one, two or three of CS, PEPC and GDH are preferable. Furthermore, in the microorganism of the present invention, it is preferable that the activities of the three enzymes CS, PEPC and GDH are all enhanced. The activity of the target enzyme in the cell is increased, and the extent of the activity increase is confirmed by measuring the enzyme activity of the microbial cell extract or purified fraction and comparing it with the wild strain or the parent strain. be able to.
[0020]
A microorganism belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea and having an enhanced activity of an enzyme that catalyzes the biosynthetic reaction of L-glutamic acid, for example, uses the above-mentioned microorganism as a starting parent strain, and a gene encoding these enzymes It can be obtained as a mutant strain in which a mutation has occurred or as a genetically modified strain.
[0021]
In order to increase CS, PEPC or GDH activity, a gene encoding CS, PEPC or GDH is cloned on an appropriate plasmid, and the obtained starting parent strain as a host is transformed with the obtained plasmid. The number of copies of CS, PEPC, or GDH-encoding genes (hereinafter, abbreviated as “gltA gene”, “ppc gene”, “gdhA gene” in this order) in the cells of the transformed strain increased, and as a result CS, PEPC or GDH activity is increased.
[0022]
The cloned gltA gene, ppc gene, and gdhA gene are introduced into the starting parent strain alone or in any two or three combinations. When introducing two or three kinds of genes, two or three kinds of plasmids are cloned into one kind of plasmid and introduced into the host, or two or three kinds of plasmids that can coexist. It is cloned separately above and introduced into the host.
[0023]
The plasmid is not particularly limited as long as it is a plasmid that can autonomously replicate in cells of microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea.For example, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 etc. are mentioned. In addition, phage DNA vectors can also be used.
[0024]
Transformation can be accomplished, for example, by DM Morrison's method (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or by treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J Mol. Biol., 53, 159 (1970)) and the like.
[0025]
Increasing the CS, PEPC or GDH activity can also be achieved by making multiple copies of the gltA gene, the ppc gene or the gdhA gene on the chromosomal DNA of the starting parent strain as a host. To introduce multiple copies of the gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene onto the chromosomal DNA of microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea, a repetitive DNA, an inverted repeat at the end of a transposable element, etc. Sequences that exist in multiple copies on chromosomal DNA can be used. Alternatively, the gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA. The copy number of the gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene in the cell of the transformed strain is increased, and as a result, CS, PEPC or GDH activity is increased.
[0026]
The organism that is the source of the gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene that increases the copy number may be any organism that has CS, PEPC, or GDH activity. Among them, bacteria that are prokaryotes, for example, bacteria belonging to the genus Enterobacter, Klebsiella, Erbinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus are preferred. A specific example is Escherichia coli. The gltA gene, the ppc gene, and the gdhA gene can be obtained from the chromosomal DNA of the microorganism as described above.
[0027]
The gltA gene, the ppc gene, and the gdhA gene are obtained by isolating DNA fragments that complement their auxotrophy from the chromosomal DNA of the above microorganisms, using mutants that lack CS, PEPC, or GDH activity. it can. In addition, since the base sequences of these genes of Escherichia bacteria and Corynebacterium bacteria have already been elucidated (Biochemistry, Vol. 22, 5243-5249, 1983; J. Biochem., 95). Vol., 909-916, 1984; Gene, 27, 193-199, 1984; Microbiology, 140, 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., 218, 330 339 pages, 1989; Molecular Microbiology, Vol. 6, pages 317-326, 1992), primers can be synthesized based on the respective nucleotide sequences, and can be obtained by PCR using chromosomal DNA as a template. is there.
[0028]
The CS, PEPC or GDH activity is increased by enhancing the expression of the gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene in addition to the gene amplification described above. For example, expression is enhanced by replacing the promoter of the gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene with another stronger promoter. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage P _R Promoter, P _L Promoters are known as strong promoters. The gltA gene, ppc gene or gdhA gene in which the promoter has been replaced is cloned on a plasmid and introduced into the host microorganism, or on the chromosomal DNA of the host microorganism using a repetitive DNA, inverted repeat, transposon, or the like. To be introduced.
[0029]
In order to increase CS, PEPC or GDH activity, the promoter of the gltA gene, the ppc gene or the gdhA gene on the chromosome is replaced with a promoter stronger than those promoters (WO87 / 03006, JP-A-61-268183). Or by inserting a strong promoter upstream of the coding sequence of each gene (see Gene, 29, (1984) 231-241). Specifically, homologous recombination may be caused between a DNA containing a gltA gene, a ppc gene, a gdhA gene or a part thereof substituted with a strong promoter, and a corresponding gene on a chromosome.
[0030]
Specific examples of microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erwinia or Pantoea with enhanced CS, PEPC or GDH activity include Klebsiella plantacola AJ13399 / RSFCPG and Erwinia herbicola IAM1595 / RSFCPG.
[0031]
As an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce a compound other than L-glutamic acid, αKGDH, isocitrate lyase, phosphate acetyltransferase, acetate kinase, acetohydroxyacid synthase, acetolactate synthase , Formate acetyltransferase, lactate dehydrogenase, L-glutamate decarboxylase, 1-pyrroline dehydrogenase and the like. Of these enzymes, αKGDH is preferred.
[0032]
In microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea, in order to reduce or eliminate the activity of the enzyme as described above, the gene of the enzyme is introduced into the cell by a usual mutation treatment method or a genetic engineering technique. It is sufficient to introduce a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme.
[0033]
Examples of the mutation treatment method include a method of irradiating with X-rays and ultraviolet rays, a method of treating with a mutation agent such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, and the like. The site where the mutation is introduced into the gene may be a coding region encoding an enzyme protein or an expression control region such as a promoter.
[0034]
Examples of genetic engineering techniques include a method using a gene recombination method, a transduction method, a cell fusion method and the like. For example, a drug resistance gene is inserted into the cloned target gene to produce a gene that has lost its function (defective gene). Next, this defective gene is introduced into cells of a microorganism belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea, and the target gene on the chromosome is replaced with the defective gene by utilizing homologous recombination (gene disruption).
[0035]
The activity of the target enzyme in the cell is reduced or deficient, and the degree of the activity reduction is determined by measuring the enzyme activity of the bacterial cell extract or purified fraction of the candidate strain and comparing it with the wild strain or the parent strain. Can be confirmed. For example, αKGDH activity can be measured for enzyme activity according to the method of Reed et al. (LJ Reed and BBMukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61).
[0036]
Depending on the target enzyme, the target mutant can be selected depending on the phenotype of the mutant. For example, mutant strains deficient or reduced in αKGDH activity cannot grow on a minimal medium containing glucose or a minimal medium containing acetic acid or L-glutamic acid as the sole carbon source under aerobic culture conditions, or have a growth rate. It drops significantly. However, normal growth becomes possible by adding succinic acid or lysine, methionine, and diaminopimelic acid to a minimal medium containing glucose even under the same conditions. Using these phenomena as indicators, it is possible to select mutant strains in which αKGDH activity is deficient or reduced.
[0037]
A method for producing an αKGDH gene-deficient strain of Brevibacterium lactofermentum using homologous recombination is described in detail in WO95 / 34672, and the same method applies to microorganisms belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea Can be applied.
[0038]
In addition, techniques such as gene cloning, DNA cleavage, ligation, and transformation methods are described in detail in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)).
[0039]
A specific example of the mutant strain in which αKGDH activity is obtained or reduced as described above is Klebsiella plantacola AJ13410. Klebsiella Planticola AJ13410 was deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on February 19, 1998 under the accession number FERM P-16647, and entered into the Budapest Treaty on January 11, 1999. Transferred to the international deposit based on, and given the accession number FERM BP-6617.
[0040]
A strain belonging to the genus Klebsiella, erbinia or Pantoea and having a decreased or lacking αKGDH activity as described above, or a strain having an increased CS, PEPC or GDH activity, as described in Examples below, is L-glutamic acid. Has production ability.
[0041]
Regarding microorganisms belonging to the genus Escherichia included in the same enteric bacteria group as those of the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea, strains with reduced or deficient αKGDH activity can produce L-glutamic acid (JP-A-5-244970). A strain in which αKGDH activity is reduced or deficient and PEPC activity and GDH activity are increased can further produce a significant amount of L-glutamic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 7-203980), and exhibits valine sensitivity and CS activity. It is known that strains with enhanced GDH activity can produce L-glutamic acid (WO 97/08294).
[0042]
In addition, regarding microorganisms belonging to the genus Enterobacter which are also included in the enterobacteria group, strains with decreased or lacked αKGDH activity, or strains with increased PEPC activity, GDH activity, and CS activity produce L-glutamic acid. The inventors discovered that this was the case (Japanese Patent Application No. 10-69068).
[0043]
Furthermore, regarding microorganisms belonging to the genus Serratia, the inventors have found that a strain having enhanced PEPC activity, GDH activity, and CS activity can produce L-glutamic acid (Japanese Patent Application No. 10-69068).
[0044]
From these facts, not only the strains shown in the Examples, but also other strains of the genus Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Escherichia, Enterobacter, or Serratia that have reduced or lacked αKGDH activity, Alternatively, it is easily guessed that a strain in which PEPC activity, GDH activity, and CS activity are amplified can produce L-glutamic acid. In addition, as shown in the Examples, the ability to produce L-glutamic acid to Klebsiella planticola AJ13399 strain by deleting αKGDH is also applicable to other Klebsiella bacteria, Erwinia bacteria or Pantoea bacteria What can be done is strongly supported.
[0045]
A microorganism belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea and having an ability to produce L-glutamic acid is cultured in a liquid medium, and L-glutamic acid is produced and accumulated in the medium, and this is collected from the medium to obtain L-glutamic acid. Can be manufactured. As the medium, a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary can be used. Either synthetic or natural media can be used. The carbon source and nitrogen source used in the medium may be any one that can be used by the strain to be cultured.
[0046]
As the carbon source, saccharides such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, galactose, starch hydrolysate, molasses are used, and other organic sources such as acetic acid and citric acid are used alone or in other carbon sources. Used in combination with.
[0047]
As the nitrogen source, ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate, nitrates, and the like are used.
[0048]
As organic micronutrients, amino acid, vitamin, fatty acid, nucleic acid, and peptone, casamino acid, yeast extract, soy protein hydrolyzate, etc. containing these are used, and auxotrophic mutants that require amino acids for growth. When using, it is necessary to supplement the required nutrients.
[0049]
As inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like are used.
In the culture method, aeration culture is performed while controlling the fermentation temperature at 20 to 42 ° C. and the pH at 4 to 8. Thus, by culturing for about 10 hours to 4 days, a significant amount of L-glutamic acid is accumulated in the culture solution.
[0050]
After culturing, the method for isolating L-glutamic acid accumulated in the culture solution may be performed according to a known method. For example, it can be isolated by removing microbial cells from the culture solution and then concentrating crystallization, ion exchange chromatography or the like.
[0051]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0052]
(1) Preparation of a plasmid having a gltA gene, a ppc gene, and a gdhA gene
A procedure for preparing a plasmid having the gltA gene, the ppc gene, and the gdhA gene will be described with reference to FIGS.
[0053]
A plasmid pBRGDDH (JP-A-7-203980) having a gdhA gene derived from Escherichia coli was digested with HindIII and SphI, and both ends were blunted by T4 DNA polymerase treatment, and then a DNA fragment having the gdhA gene was purified and recovered. On the other hand, a plasmid pMWCP (WO97 / 08294) having a gltA gene derived from Escherichia coli and a ppc gene (WO97 / 08294) was digested with XbaI, and both ends were blunted with T4 DNA polymerase. The DNA fragment having the gdhA gene purified above was mixed with this and then ligated with T4 ligase to obtain a plasmid pMWCPG further carrying the gdhA gene on pMWCP (FIG. 1).
[0054]
Further, after purifying and recovering a DNA fragment having the gdhA gene obtained by digesting pBRGDDH with HindIII and SalI, the plasmid pMWG was obtained by introducing it into the HindIII and SalI sites of the plasmid pMW219 (purchased from Nippon Gene Co., Ltd.). (FIG. 2). Further, after purifying and collecting the DNA fragment having the gltA gene obtained by digesting the plasmid pTWVC (WO97 / 08294) having the gltA gene derived from Escherichia coli with HindIII and EcoRI, it is introduced into the HindIII and EcoRI sites of the plasmid pMW219. Thus, plasmid pMWC was obtained (FIG. 3).
[0055]
At the same time, the plasmid pVIC40 (JP-A-8-047397) having the origin of replication of the broad host range plasmid RSF1010 was digested with NotI, treated with T4 DNA polymerase, then digested with PstI, and pBR322 digested with EcoT141 and treated with T4 DNA polymerase. Then, after mixing with PstI-digested one, it was ligated with T4 ligase to obtain a plasmid RSF-Tet having an RSF1010 replication origin and a tetracycline resistance gene (FIG. 4).
[0056]
Next, pMWCPG is digested with EcoRI and PstI, a DNA fragment having the gltA gene, the ppc gene, and the gdhA gene is purified and recovered, RSF-Tet is similarly digested with EcoRI and PstI, and a DNA fragment having the RSF1010 replication origin is obtained. After being mixed with the purified product, it was ligated with T4 ligase to obtain a plasmid RSFCPG carrying the gltA gene, the ppc gene, and the gdhA gene on RSF-Tet (FIG. 5). The resulting plasmid RSFCPG expresses the gltA gene, the ppc gene, and the gdhA gene. This means that the complementation of the auxotrophy of the Escherichia coli gltA gene, the ppc gene, or the gdhA gene-deficient strain and the respective enzyme activities. Confirmed by measurement. Similarly, that pMWG or pMWC expresses the gdhA gene or the gltA gene was confirmed by complementation of the auxotrophy of the Escherichia coli gdhA gene or the gltA gene-deficient strain and measurement of each enzyme activity.
[0057]
(2) Introduction of RSFCPG, pMWC and pMWG to Klebsiella and Erwinia (Panthoea) bacteria and evaluation of L-glutamic acid productivity
Using RSFCPG, pMWC and pMWG, Elvinia Herbicola IAM1595 (Pantoeia agglomerans AJ2666) or Klebsiella plantacola AJ13399 strain was electroporated (Miller JH, "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press , USA, 1992), and a transformed strain exhibiting tetracycline resistance was obtained.
[0058]
The obtained transformant or each parent strain was obtained by adding glucose 40 g / L, ammonium sulfate 20 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, sodium chloride 0.5 g / L, Calcium chloride heptahydrate 0.25 g / L, Ferrous sulfate heptahydrate 0.02 g / L, Manganese sulfate tetrahydrate 0.02 g / L, Zinc sulfate dihydrate 0.72 mg / L, Copper sulfate 5 water 0.64 mg / L of salt, 0.72 mg / L of cobalt chloride hexahydrate, 0.4 mg / L of boric acid, 1.2 mg / L of sodium molybdate dihydrate, 2 g / L of yeast extract, 30 g / L of calcium carbonate A 50 ml large test tube into which 5 ml of the contained medium was injected was inoculated and cultured at 37 ° C. until the sugar in the medium was consumed. For the culture of the transformant, 25 mg / L of tetracycline was added. Table 1 shows the results of measurement of L-glutamic acid accumulated in the culture solution after completion of the culture.
[0059]
[Table 1]

[0060]
Elvinia herbicola IAM1595 or Klebsiella plantacola AJ13399 strain did not accumulate L-glutamic acid, but 5.0 g / L, 3 and 3 for strains that amplified CS, PEPC, and GDH activity by introducing RSFCPG, respectively. Accumulated 1 g / L L-glutamic acid. Further, 2.5 g / L L-glutamic acid was accumulated by amplifying only CS activity of AJ13399 strain, and 0.8 g / L L-glutamic acid was accumulated by amplifying only GDH activity.
[0061]
(3) Cloning of a fragment having a part of the αKGDH gene of Klebsiella planticola AJ13399 strain
Klebsiella planticola AJ13399 strain having a part of αKGDH gene has already been reported for Azotobacter vinelandi, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Haemophilus influenza, human And αKGDH gene of each organism of Saccharomyces cerevisiae (Eur. J. Biochem., 187, 235-239, 1990; Mol. Gen. Genet., 234, 285-296, 1992; Eur.J.Biochem., 141, 351-359, 1984; Microbiology, 142, 3347-3354, 1996; Science, 269, 496-512, 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1963-1967, 1992; Mol. Cel. Biol., 9, 2695-2705, 1989). The cloning was performed by PCR using an oligonucleotide having a base sequence and an EcoRI site as a primer.
Specifically, the following were used as primers.
[0062]
(Primer 1)
5'CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA3 '(SEQ ID NO: 1)
(Primer 2)
5'GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC3 '(SEQ ID NO: 2)
[0063]
The chromosomal DNA of Klebsiella planticola AJ13399 strain used as a template for PCR is the same as that used for normal chromosomal DNA extraction in Escherichia coli (Biotechnological Experiments, Biotechnology Society of Japan, 97-98, Bafukan, 1992).
[0064]
PCR conditions were 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute, 73 ° C. for 3 minutes, 30 cycles. The obtained DNA fragment was digested with EcoRI and inserted into the EcoRI-digested vector plasmid pT7Blue to obtain a recombinant plasmid pT7KP. . As the vector plasmid pT7Blue (ampicillin resistance), a commercial product manufactured by Novagen was used.
[0065]
The DNA base sequence of the cloned fragment and the amino acid sequence encoded by this sequence are shown in SEQ ID NO: 3. Only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4. This sequence shows 82.3% homology with the αKGDH-E1 subunit gene of Escherichia coli (hereinafter referred to as “sucA gene”), and is apparently part of the sucA gene of Klebsiella planticola AJ13399. it is conceivable that. In the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, base numbers 18 to 1659 are derived from the sucA gene, and base numbers 0 to 17 and 1660 to 1679 are derived from the primers.
[0066]
(4) Acquisition of αKGDH-deficient strain derived from Klebsiella planticola AJ13399 strain
Using a fragment having a part of the sucA gene of Klebsiella planta cola obtained as described above, an αKGDH-deficient strain of Klebsiella plantacola was obtained by homologous recombination.
[0067]
First, pT7KP was cleaved with BstEII, cloned into the plasmid pNEO (purchased from Pharmacia) by PCR, and a kanamycin resistance gene fragment having a BstEII site introduced at both ends was introduced into the center of the sucA gene of Klebsiella planticola. Plasmid pT7KPKm having the kanamycin resistance gene inserted in its part was obtained.
The primers used for the cloning of the kanamycin resistance gene are as follows.
[0068]
(Primer 3)
5'TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT3 '(SEQ ID NO: 5)
(Primer 4)
5′CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG3 ′ (SEQ ID NO: 6)
[0069]
Next, pT7KPKm was cleaved with KpnI, cloned into the plasmid pBR322 (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.) by PCR, and introduced with a tetracycline resistance gene fragment into which KpnI sites were introduced at both ends, and sucA of Klebsiella planticola. A plasmid pT7KPKmTc was obtained in which a kanamycin resistance gene was inserted at the center of the gene and a tetracycline resistance gene was inserted next to it.
The primers used for the cloning of the tetracycline resistance gene are as follows.
[0070]
(Primer 5)
5'GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG3 '(SEQ ID NO: 7)
(Primer 6)
5′GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG3 ′ (SEQ ID NO: 8)
[0071]
Subsequently, by digesting plasmid pT7KPKmTc with SacI and XbaI, a kanamycin resistance gene was inserted into the central part of the sucA gene of Klebsiella planticocola and a DNA fragment having a tetracycline resistance gene next to it was excised. Was inserted into a chromosome insertion plasmid vector pGP704 (Marta Herrero et al., Journal of Bacteriology, 1990, 172, p.6557-6567) for Gram-negative bacteria digested with XbaI to obtain a plasmid pUTNOTOK.
[0072]
Using the resulting plasmid pUTONOTK, the Klebsiella planticola AJ13399 strain was transformed by electroporation, and the plasmid pUTNOTOK was inserted into the chromosome by homologous recombination of the sucA gene fragment using tetracycline resistance and kanamycin resistance as indices. Acquired shares. Furthermore, from this strain, the sucA-deficient Klebsiella planticola AJ13410 strain, which is thought to have been replaced with the sucA gene with the kanamycin resistance gene inserted in the center, was obtained using tetracycline sensitivity and kanamycin resistance as an index. did.
[0073]
In order to confirm that the AJ13410 strain obtained as described above is deficient in αKGDH activity, the enzyme activity was determined according to the method of Reed et al. (LJ Reed and BBMukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61). It was measured. As a result, as shown in Table 2, αKGDH activity was not detected in the AJ13410 strain, and it was confirmed that sucA was deleted as intended.
[0074]
[Table 2]

[0075]
(5) Evaluation of L-glutamic acid productivity of Klebsiella planticola αKGDH-deficient strain
Both strains AJ13399 and AJ13410 were obtained by using glucose 40 g / L, ammonium sulfate 20 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, sodium chloride 0.5 g / L, calcium chloride 7 water. Salt 0.25g / L, Ferrous sulfate heptahydrate 0.02g / L, Manganese sulfate tetrahydrate 0.02g / L, Zinc sulfate dihydrate 0.72mg / L, Copper sulfate pentahydrate 0.64mg / L, cobalt chloride hexahydrate 0.72 mg / L, boric acid 0.4 mg / L, sodium molybdate dihydrate 1.2 mg / L, yeast extract 2 g / L, calcium carbonate 30 g / L, one L-lysine 500 ml flask in which 20 ml of medium containing 200 mg / L of hydrochloride, 200 mg / L of L-methionine, 200 mg / L of DL-α, ε-diaminopimelic acid (DAP) was injected And inoculated at 37 ° C. with shaking until the sugar in the medium was consumed. Table 3 shows the results of measurement of L-glutamic acid and α-ketoglutaric acid (hereinafter abbreviated as “αKG”) accumulated in the culture solution after completion of the culture.
[0076]
[Table 3]

[0077]
The AJ13410 strain deficient in αKGDH activity accumulated 12.8 g / L of L-glutamic acid. At the same time, 1.5 g / L of αKG was accumulated.
[0078]
(6) Introduction of RSFCPG into Klebsiella planticola αKGDH-deficient strain and evaluation of L-glutamic acid productivity
The AJ13410 strain was transformed with RSFCPG, and the resulting RSFCPG-introduced strain AJ13410 / RSFCPG was converted into glucose 40 g / L, ammonium sulfate 20 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, sodium chloride 0.5 g / L, calcium chloride heptahydrate 0.25 g / L, ferrous sulfate heptahydrate 0.02 g / L, manganese sulfate tetrahydrate 0.02 g / L, zinc sulfate dihydrate 0.72 mg / L, copper sulfate pentahydrate 0.64 mg / L, cobalt chloride hexahydrate 0.72 mg / L, boric acid 0.4 mg / L, sodium molybdate dihydrate 1.2 mg / L, yeast extract 2 g / L, tetracycline 25 mg / L, calcium carbonate 30 g / L, L-lysine monohydrochloride 200 mg / L, L-methionine 200 mg / L, DL-α Was inoculated into 500ml flask injected with medium 20ml containing ε-DAP200mg / L, and cultured with shaking until sugars in the medium was consumed at 37 ° C.. Table 4 shows the results of measurement of L-glutamic acid and αKG accumulated in the culture solution after completion of the culture.
[0079]
[Table 4]

[0080]
In strains in which RSFCPG was introduced and CS, PEPC, and GDH activities were amplified, αKG accumulation decreased and L-glutamic acid accumulation further improved.
[0081]
【The invention's effect】
Since the microorganism of the present invention has a high L-glutamic acid-producing ability, it is considered that a higher production ability can be imparted by using a conventionally known breeding technique for coryneform L-glutamic acid-producing bacteria. Etc. are expected to lead to the development of an inexpensive and efficient L-glutamic acid production method.
[0082]
[Sequence Listing]

[0083]

[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

[0090]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the construction of a plasmid pMWCPG having a gltA gene, a ppc gene and a gdhA gene.
FIG. 2 is a diagram showing the construction of a plasmid pMWG having a gdhA gene.
FIG. 3 shows the construction of plasmid pMWC having the gltA gene.
FIG. 4 is a diagram showing the construction of a plasmid RSF-Tet containing a replication origin of a broad host range plasmid RSF1010 and a tetracycline resistance gene.
FIG. 5 shows the construction of plasmid RSFCPG having the origin of replication of broad host range plasmid RSF1010, tetracycline resistance gene, gltA gene, ppc gene and gdhA gene.

Claims

A microorganism belonging to the genus Klebsiella, Erbinia or Pantoea, having the ability to produce L-glutamic acid, wherein all the enzyme activities of citrate synthase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and glutamate dehydrogenase are enhanced by genetic recombination .

The microorganism according to claim 1, which belongs to Klebsiella planticola or Pantoea agglomerans.

Furthermore, the microorganism according to claim 1 or 2 , wherein the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase is reduced or lost.

A method for producing L-glutamic acid, comprising culturing the microorganism according to any one of claims 1 to 3 in a liquid medium, producing and accumulating L-glutamic acid in the medium, and collecting this from the medium. .