JP3913289B2

JP3913289B2 - Glucose biosensor

Info

Publication number: JP3913289B2
Application number: JP17558596A
Authority: JP
Inventors: 博樹牟礼; 正男後藤
Original assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Current assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2007-05-09
Anticipated expiration: 2016-06-14
Also published as: JPH102874A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコースバイオセンサに関する。更に詳しくは、グルコースオキシダーゼを固定化せしめたグルコースバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースオキシダーゼを作用極上に固定化せしめた従来のグルコースバイオセンサにあっては、作用極以外に対極あるいは対極と参照極とが平面状基板の同一面上に配置されている。このような電極配置のグルコースバイオセンサにおいて、測定サンプルを作用極に接触させるには２つの方法がとられている。
【０００３】
その第１の方法は、直接測定サンプルを作用極上に滴下する方法であるが、この方法ではサンプリングから滴下迄手間と時間を要するという問題がある。その第２の方法は、電極基板の上に溝を有するスペーサを配置し、その上に更に空気孔を設けたカバーを配置した構造のものを用いるという方法である。この方法では、測定サンプルが直接作用極上に導かれるため手間や時間がとられないという利点がある反面、空気孔の設置を必要とするなど、素子製作において煩雑な工程を必要とするという欠点を有している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、グルコースオキシダーゼを固定化せしめたグルコースバイオセンサであって、容易に製作および測定が可能であり、従って使い捨てグルコースバイオセンサとしても適しているものを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる本発明の目的は、上記グルコースバイオセンサにおいて、作用極と対極とを対面構造をとるように配置したものによって達成される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
図１は、基板１上に作用極２および参照極リード３を形成させたもの(a)、基板１´上に対極４を形成させたもの(b)および両面接着剤付きスペーサ(厚さ約100〜500μm)５(c)よりなる素子構成要素を示しており、それらから組み立てられる素子の平面図は図２に、またその側面図は図３に示される。
【０００７】
基板としては、ガラス、セラミックス、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリエステル等)などが用いられる。作用極、対極および参照極リードは、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成され、参照極６は参照極リード上にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩化第２鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによって形成される。参照極は、作用極側の基板上あるいは対極側の基板上のいずれにも設置することができるが、作用極側の基板上に設置することが好ましい。なお、参照極が設けられない２電極構造のものも、同様に構成される。
【０００８】
グルコースオキシダーゼは、一般には作用極上に固定化せしめるが、グルコースオキシダーゼは測定サンプルである水溶液中に溶解され、作用極上で反応するようになるため、作用極周辺、対極またはその周辺などに固定化させていてもよい。
【０００９】
グルコースオキシダーゼの固定化、好ましくは作用極上への固定化は、以下に列挙される如く、グルコースオキシダーゼ単体としてばかりではなく、電子受容体(メディエータ)およびアルブミンの少なくとも一種を添加した混合物層としても形成される。
(1)グルコースオキシダーゼ層
(2)グルコースオキシダーゼ-電子受容体混合物層
(3)グルコースオキシダーゼ-アルブミン混合物層
(4)グルコースオキシダーゼ-電子受容体-アルブミン混合物層
【００１０】
グルコースオキシダーゼ層(1)の形成は、グルコースオキシダーゼ(GOD)を、例えば165800単位/gのGODの場合その約1〜50mg、好ましくは約5〜30mgを蒸留水または緩衝液１mlに溶解させ、その溶液(GOD溶液)約0.5〜10μl、好ましくは約1〜3μlを滴下法、スピンコート法などによって滴下し、室温で乾燥させて、膜厚約0.05〜10μm、好ましくは約0.1〜2μmの層を形成させることにより行われる。
【００１１】
混合物層(2)〜(4)の場合にも、この場合と同様の形成方法が行われ、ただしGOD水溶液中に更に次の各成分が添加された溶液が用いられる。
混合物層(2)の場合：フェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等が電子受容体として用いられ、フェリシアン化カリウムにあっては約1〜100mg、好ましくは約30〜60mgを、パラベンゾキノンにあっては約1〜200mg、好ましくは約50〜150mgを更に添加した溶液を使用
混合物層(3)の場合：牛血清アルブミンを約1〜100mg、好ましくは約5〜30mgを更に添加した溶液を使用
混合物層(4)の場合：混合物層(2)の形成に用いられた量の電子受容体および混合物層(3)の形成に用いられた量の牛血清アルブミンを更に添加した溶液を使用
【００１２】
添加された電子受容体は下記の如く作用し、またアルブミンの添加は、測定液(グルコース水溶液)のpH変化に対して、バラツキのより少ない測定結果を与える。
【００１３】
グルコースがGODの作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生するH₂O₂を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求める方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素濃度に律速されるため、グルコース濃度が約100mg/dl程度迄しか直線検量範囲を示さない。
【００１４】
そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代わりに、電子受容体がGODと共に用いられる。メディエータがフェリシアン化カリウムK₃Fe(CN)₆の場合、この反応は次のように進行する。

この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。

【００１５】
また、メディエータとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、GOD存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測定される。

【００１６】
一方、対極上には、特に何も固定化しなくとも使用し得るが、アルブミンおよび電子受容体の少なくとも一種からなる層を形成させて用いてもよい。
【００１７】
なお、固定化せしめたGODへの測定サンプル液の接触を円滑に行わしめるために、作用極上、対極上、作用極周辺、対極周辺、作用極上およびその周辺、対極上およびその周辺などに、レシチン等の界面活性剤を塗布したり、不織布、ロ紙等の含浸促進剤をスペーサ間隙を利用して挾着させるなどの手段を適用することも可能である。
【００１８】
グルコース濃度の測定は、このようにして作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグルコース水溶液約0.1〜10μlを接触させ、約1〜120秒間程度反応させた後、そこに約0.05〜0.8V、好ましくは約0.4〜0.7Vの電圧を印加し、例えば印加20秒後の電流値を測定することによって行われる。測定には、ポテンショガルバノスタットおよびファンクションジェネレータが用いられる。
【００１９】
グルコースバイオセンサをグルコース水溶液に接触させる際、図４に示されるように、各基板１(１´)の一端側がテーパー部８(８´)を形成しており、テーパー部、好ましくはその先端に作用極２(または対極４)の先端部９(９´)が設けられている。即ち、図４は、基板１(あるいは１´)上に作用極２(あるいは対極４)を形成させたもの(ａ)および両面接着剤付きスペーサ５(ｂ)よりなる素子構成要素を示しており、基板１，１´の作用極２側および対極４側を内側に向けて、スペーサ５を介して一体化させることができる。このような態様のセンサにあっては、離間された電極間がとがった形状の基板テーパー部に設けられることになるので、測定液が微少量ではあってもそれを直接採取することができ、従って作用極との接触も速やかに行われるので非常に好都合である。
【００２０】
【発明の効果】
グルコースオキシダーゼを固定化せしめたグルコースバイオセンサにおいて、作用極と対極とを対面構造とすることにより、容易に製作および測定が可能であり、従ってこのようなグルコースバイオセンサは、原液サンプルが測定液とされる使い捨てバイオセンサとして、家庭内健康診断(セルフケァ)、特に血糖、尿糖の測定による糖尿病の自己管理、糖尿病の予防および早期発見などに効果的に用いることができ、また食品製造工程中のグルコース管理に用いられるなど、幅広い用途を期待することができる。
【００２１】
【実施例】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００２２】
実施例
ポリエチレンテレフタレートフィルム(厚さ0.25mm)上に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の対極、作用極および参照極リードを図１〜３に示される態様として、膜厚5μmで形成させた。次いで、参照極リード上に、銀ペーストをスクリーン印刷法によって5μmの厚さで印刷し、焼成して銀電極とした。銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.6mA/cm²の電流密度で20分間の定電流電解を行い、その表面を塩化銀化して、銀/塩化銀参照極を形成させた。この定電流電解には、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA501)が用いられた。
【００２３】
このような構成の各電極の内の作用極上に、リン酸緩衝液(pH7.0)１mlにグルコースオキシダーゼ(165800単位)10mgおよびフェリシアン化カリウム48mgよりなる混合液を1.5μl滴下して室温条件下で乾燥させ、２種類のグルコースバイオセンサＡ(参照極なし)およびＢ(参照極あり)を作製した。
【００２４】
作製されたグルコースバイオセンサに、所定濃度のグルコース水溶液5μlをサンプル導入部より導入して5秒間反応を進行させた後、0.6Vの電圧を印加し、印加20秒後の電流値を測定した。測定には、ポテンショガルバノスタット(HA501)およびファンクションジェネレータ(北斗電工製HB-104)が用いられた。
【００２５】
測定結果(出力)は、次の表および図５のグラフに示される。

これらの結果から、グルコース濃度0〜1000mg/dlの範囲での直線検量性が得られることが分かる。なお、各センサは、１サンプル測定毎に使い捨てとした。また、グルコース濃度100mg/dlでの各センサ間の再現性(n＝10)を示す変動係数は、センサＡでは3.6%、センサＢでは3.5%であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るグルコースバイオセンサの製作に用いられる素子構成要素の各平面図である。
【図２】組み立てられたグルコースバイオセンサの平面図である。
【図３】組み立てられたグルコースバイオセンサの側面図である。
【図４】本発明に係る好ましいグルコースバイオセンサの製作に用いられる素子構成要素の各平面図である。
【図５】実施例におけるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線グラフである。
【符号の説明】
１基板
２作用極
３参照極リード
４対極
５スペーサ
６参照極
７固定化グルコースオキシダーゼ
８基板テーパー部
９電極先端部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a glucose biosensor. More specifically, the present invention relates to a glucose biosensor in which glucose oxidase is immobilized.
[0002]
[Prior art]
In the conventional glucose biosensor in which glucose oxidase is immobilized on the working electrode, the counter electrode or the counter electrode and the reference electrode are arranged on the same surface of the planar substrate in addition to the working electrode. In the glucose biosensor having such an electrode arrangement, two methods are used to bring the measurement sample into contact with the working electrode.
[0003]
The first method is a method in which a measurement sample is directly dropped on the working electrode, but this method has a problem that it takes time and effort from sampling to dropping. The second method is a method of using a structure in which a spacer having a groove is arranged on an electrode substrate, and a cover provided with air holes is further arranged thereon. Although this method has the advantage that the measurement sample is directly guided to the working electrode, it does not take time and effort, but it has the disadvantage of requiring complicated steps in device fabrication, such as the need to install air holes. Have.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a glucose biosensor having glucose oxidase immobilized thereon, which can be easily manufactured and measured, and is therefore suitable as a disposable glucose biosensor.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The object of the present invention is achieved by the glucose biosensor in which the working electrode and the counter electrode are arranged so as to have a facing structure.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
FIG. 1 shows that a working electrode 2 and a reference electrode lead 3 are formed on a substrate 1 (a), a counter electrode 4 is formed on a substrate 1 ′ (b), and a double-sided adhesive spacer (thickness of about 100 to 500 μm) 5 (c) is shown. FIG. 2 shows a plan view of the element assembled from the element, and FIG. 3 shows a side view thereof.
[0007]
As the substrate, glass, ceramics, paper, biodegradable material (for example, microbially produced polyester) and the like are used. The working electrode, counter electrode, and reference electrode lead are formed from platinum, gold, carbon, etc. by screen printing, vapor deposition, sputtering, etc., and the reference electrode 6 is screen printing, vapor deposition, sputtering, etc. on the reference electrode lead. After the silver electrode is formed by the above method, it is formed by a method of constant current electrolysis, a method of dipping in a ferric chloride aqueous solution, a method of applying and laminating silver chloride by a screen printing method or the like. The reference electrode can be installed on either the working electrode side substrate or the counter electrode side substrate, but it is preferable to install the reference electrode on the working electrode side substrate. A two-electrode structure in which no reference electrode is provided is similarly configured.
[0008]
Glucose oxidase is generally immobilized on the working electrode, but glucose oxidase is dissolved in the aqueous solution that is the measurement sample and reacts on the working electrode. Therefore, it is immobilized on the working electrode, around the counter electrode, or around it. It may be.
[0009]
Immobilization of glucose oxidase, preferably immobilization on the working electrode, is formed not only as glucose oxidase alone but also as a mixture layer to which at least one of an electron acceptor (mediator) and albumin is added as listed below. Is done.
(1) Glucose oxidase layer
(2) Glucose oxidase-electron acceptor mixture layer
(3) Glucose oxidase-albumin mixture layer
(4) Glucose oxidase-electron acceptor-albumin mixture layer
Glucose oxidase layer (1) is formed by dissolving glucose oxidase (GOD), for example, about 1 to 50 mg, preferably about 5 to 30 mg of GOD at 165800 units / g in 1 ml of distilled water or buffer. A solution (GOD solution) of about 0.5 to 10 μl, preferably about 1 to 3 μl, is dropped by a dropping method, spin coating method, etc., and dried at room temperature to form a layer having a thickness of about 0.05 to 10 μm, preferably about 0.1 to 2 μm. This is done by forming.
[0011]
In the case of the mixture layers (2) to (4), the same formation method as that in this case is performed, except that a solution in which the following components are further added to the GOD aqueous solution is used.
In the case of the mixture layer (2): potassium ferricyanide, parabenzoquinone or the like is used as the electron acceptor, about 1 to 100 mg, preferably about 30 to 60 mg for potassium ferricyanide, about 1 to about parabenzoquinone. In the case of the use mixture layer (3), a solution further added with 200 mg, preferably about 50 to 150 mg: a solution further added with about 1 to 100 mg, preferably about 5 to 30 mg of bovine serum albumin is used mixture layer (4) In the case of: a solution further added with the amount of electron acceptor used to form the mixture layer (2) and the amount of bovine serum albumin used to form the mixture layer (3) is used.
The added electron acceptor acts as follows, and the addition of albumin gives a measurement result with less variation with respect to the pH change of the measurement solution (glucose aqueous solution).
[0013]
Glucose is oxidized in the presence of an enzyme by the action of GOD to produce gluconolactone, and H ₂ O ₂ generated at that time is oxidized on the working electrode, and the concentration of glucose is measured by measuring the oxidation current value at that time. The method of indirectly obtaining is known. However, in the case of a stock solution sample in which the measurement solution is not diluted with water, the oxidation reaction is rate-limited to the dissolved oxygen concentration, so that the linear calibration range is only shown until the glucose concentration is about 100 mg / dl.
[0014]
Thus, instead of oxygen having a finite concentration in solution, an electron acceptor is used with GOD. When the mediator is potassium ferricyanide K ₃ Fe (CN) ₆ , this reaction proceeds as follows.

The ferrocyan ion generated at this time is oxidized at the working electrode to generate an oxidation current.

[0015]
In addition, when parabenzoquinone is used instead of potassium ferricyanide as a mediator, hydroquinone is produced by the reaction of glucose and parabenzoquinone in the presence of GOD, and the hydroquinone produced at this time is oxidized at the working electrode, resulting in an oxidation current. This value is measured.

[0016]
On the other hand, it can be used on the counter electrode without immobilizing anything, but a layer composed of at least one of albumin and electron acceptor may be formed.
[0017]
In order to ensure smooth contact of the measurement sample solution with the immobilized GOD, lecithin is applied on the working electrode, on the counter electrode, around the working electrode, around the counter electrode, on and around the working electrode, on and around the counter electrode, etc. It is also possible to apply means such as applying a surface active agent such as non-woven fabric or paper using a spacer gap.
[0018]
The glucose concentration is measured by bringing the glucose biosensor thus prepared into contact with about 0.1 to 10 μl of a glucose aqueous solution having a predetermined concentration and reacting for about 1 to 120 seconds, and then reacting there for about 0.05 to 0.8 V, preferably Is performed by applying a voltage of about 0.4 to 0.7 V, for example, by measuring a current value 20 seconds after application. For the measurement, a potentiogalvanostat and a function generator are used.
[0019]
When the glucose biosensor is brought into contact with the aqueous glucose solution, as shown in FIG. 4, one end side of each substrate 1 (1 ′) forms a tapered portion 8 (8 ′), and the tapered portion, preferably at the tip thereof. A tip 9 (9 ') of the working electrode 2 (or the counter electrode 4) is provided. That is, FIG. 4 shows an element component composed of a working electrode 2 (or counter electrode 4) formed on a substrate 1 (or 1 ') (a) and a double-sided adhesive spacer 5 (b). The working electrode 2 side and the counter electrode 4 side of the

substrates

1 and 1 ′ can be integrated with the spacer 5 facing inward. In the sensor of such an aspect, since it is provided in the substrate taper portion having a sharp shape between the spaced apart electrodes, it can be directly collected even if the measurement liquid is very small, Therefore, the contact with the working electrode can be made quickly, which is very convenient.
[0020]
【The invention's effect】
In a glucose biosensor in which glucose oxidase is immobilized, the working electrode and the counter electrode can be easily manufactured and measured by using a face-to-face structure. As a disposable biosensor, it can be used effectively for home health check (self-care), especially for self-management of diabetes by measuring blood sugar and urine sugar, prevention and early detection of diabetes, etc. A wide range of uses such as being used for glucose management can be expected.
[0021]
【Example】
Next, the present invention will be described with reference to examples.
[0022]
Example On a polyethylene terephthalate film (thickness: 0.25 mm), a counter electrode made of carbon, a working electrode, and a reference electrode lead were all formed with a film thickness of 5 μm as shown in FIGS. . Next, a silver paste was printed on the reference electrode lead by a screen printing method to a thickness of 5 μm and baked to obtain a silver electrode. The silver electrode portion was immersed in 0.1 M hydrochloric acid, and constant current electrolysis was performed at a current density of 0.6 mA / cm ² for 20 minutes, and the surface was silver chlorided to form a silver / silver chloride reference electrode. A potentiogalvanostat (HA501 manufactured by Hokuto Denko) was used for the constant current electrolysis.
[0023]
1.5 μl of a mixture of 10 mg glucose oxidase (165800 units) and 48 mg potassium ferricyanide was added dropwise to 1 ml of phosphate buffer (pH 7.0) on the working electrode of each electrode having such a configuration at room temperature. Two types of glucose biosensors A (without reference electrode) and B (with reference electrode) were prepared by drying.
[0024]
After 5 μl of a glucose aqueous solution having a predetermined concentration was introduced from the sample introduction part into the prepared glucose biosensor and the reaction was allowed to proceed for 5 seconds, a voltage of 0.6 V was applied, and the current value 20 seconds after application was measured. For the measurement, a potentiogalvanostat (HA501) and a function generator (HB-104 manufactured by Hokuto Denko) were used.
[0025]
The measurement results (output) are shown in the following table and the graph of FIG.

From these results, it can be seen that linear calibration is obtained in the glucose concentration range of 0 to 1000 mg / dl. Each sensor was disposable for each sample measurement. The coefficient of variation indicating reproducibility (n = 10) between the sensors at a glucose concentration of 100 mg / dl was 3.6% for sensor A and 3.5% for sensor B.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a plan view of element components used for manufacturing a glucose biosensor according to the present invention.
FIG. 2 is a plan view of the assembled glucose biosensor.
FIG. 3 is a side view of an assembled glucose biosensor.
FIG. 4 is a plan view of element components used for manufacturing a preferred glucose biosensor according to the present invention.
FIG. 5 is a calibration curve graph showing the relationship between the concentration of aqueous glucose solution and the output in Examples.
[Explanation of symbols]
1 Substrate 2 Working Electrode 3 Reference Electrode Lead 4 Counter Electrode 5 Spacer 6 Reference Electrode 7 Immobilized Glucose Oxidase 8 Substrate Taper 9 Electrode Tip

Claims

In a glucose biosensor in which glucose oxidase is immobilized, the working electrode and the counter electrode are disposed so as to have a facing structure, and a spacer is disposed between the substrate on which the working electrode is disposed and the substrate on which the counter electrode is disposed. The glucose biosensor, wherein one opposite end of each substrate forms a tapered portion, and the tips of the working electrode and the counter electrode are disposed in the tapered portion for testing the collected sample.