JP3910183B2

JP3910183B2 - 金コロイドの固定化方法

Info

Publication number: JP3910183B2
Application number: JP2004084761A
Authority: JP
Inventors: 秀一浅倉; 篤穂積; 章雄不破
Original assignee: Tanaka Kikinzoku Kogyo KK
Current assignee: Tanaka Kikinzoku Kogyo KK
Priority date: 2004-03-23
Filing date: 2004-03-23
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2024-03-23
Also published as: JP2005272882A

Description

本発明は、ガラス、電極等の基材へ金コロイド粒子を固定する方法に関する。

コロイドとは、金属、セラミックス等からなる直径数十〜数百ｎｍの微小粒子が水等の媒体中を懸濁している状態をいうが、近年、このコロイドを利用して各種の材料、装置を製造する試みがなされている。例えば、バイオチップ（バイオセンサー）の製造への適用が検討されているものとして金コロイド粒子がある。バイオチップとは、生体反応測定に供される機能性デバイスであって、抗体、酵素等の機能タンパク質を実装し、その物理的もしくは化学的信号の有無を検知するためのものである。

金コロイド粒子をかかる用途に適用するためには、金コロイド粒子を基材へ固定化することが必要となる。ここで、従来、金コロイド粒子への基材への固定化技術として、自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄｍｏｎｏｌａｙｅｒ：以下、ＳＡＭと称する。）を金コロイド粒子の下地層として形成する方法が知られている。ＳＡＭとは、アミノ（ＮＨ_２）基やチオール（ＳＨ）基あるいは、フルオロアルキル（ＣＦ_３）基やメチル（ＣＨ_３）基等の非結合性官能基等を持った長鎖アルキル分子からなる膜であり、アルキル鎖間の相互作用により自発的に配向性の高い単分子層を形成するものをいう。このＳＡＭは、高い密度と秩序化された構造を有することを特徴としており、コロイド粒子の固定化においても高密度で秩序化された層を容易に形成することができることからセンサーや電子デバイス等の製造に好適である。

図５は、ＳＡＭを用いて金コロイド粒子を固定化したバイオチップ１の構造を示す。図５において、バイオチップは、必要に応じてＩＴＯ透明電極を備えたガラス等からなる基材１０と、基材上に形成されたＳＡＭ層１１と、金コロイド粒子層１２とを備え、金コロイド層１２上に酵素等の検出目的に応じた機能タンパク質１３が配置されている。このバイオチップでは、測定対象となる検体に対し、機能タンパク質１３が反応し、その際の電流が金コロイド粒子層１２、ＳＡＭ層１１を通じて検出されるようになっている。

また、図６は、ＳＡＭを用いた金コロイド粒子の固定化方法の概略を示すものである。この従来の金コロイド粒子の固定化法では、基材の洗浄後、ＳＡＭの原料となる有機化合物から気相で成長（ＳＡＭの種類によっては液相で浸漬により製造するものもある）させ、形成したＳＡＭを備える基材を金コロイド溶液に浸漬させることで金コロイド粒子の固定化がなされる。

ところで、従来、金コロイドの固定化において適用されるＳＡＭとしては、例えば、ＳＨ基終端のメルカプトプロピルトリメトキシシラン（以下、ＭＰＴＭＳと称する。）や、ＮＨ_２基終端のアミノプロピルトリメトキシシラン（以下、ＡＰＴＭＳと称する。）等を用いたものが知られている。
Ｊｅｎ−ＹｕｎｇＴｓｅｎｇら，ＣｏｌｌｏｉｄａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓＡ１８２（２００１），２３９−２４５．ＹｏｎｇＤｏｎｇＪｉｎａｎｄＳｈａｏｊｕｎＤｏｎｇ、ＣＨＥＭＣＯＭＭＵＮ．，（２００２），１７８０−１７８１．

上記したＳＡＭを適用する金コロイド粒子の固定化技術では、確かに金コロイドを高密度で固定化することができる。しかし、これらの方法では次のような問題がある。即ち、ＭＰＴＭＳからなるＳＡＭによる場合、この化合物はチオール基を含有することから人体適合性の問題がある。金コロイド粒子は上記したバイオチップの他、特定の薬物（ドラッグ）捕獲した状態で人体内へ搬送するドラッグデリバリーシステムへも応用可能であるが、かかる用途へ適用する場合、チオール基は生体内の鉛と結合しやすく、その結果、酵素・タンパク質等の働きを阻害するため、これを使用することは好ましくない。一方、ＮＨ２終端のＡＰＴＭＳを適用する場合には、かかる人体適合性の問題は少ないが、ＳＡＭを使用することの共通の問題として、バイオチップ、電子デバイスへの応答性への影響が懸念される。これは、図５で示したように、バイオチップでは先端の機能性タンパク質の反応による電気信号は、金コロイド粒子からＳＡＭを経由して基材へ到達するため、ＳＡＭがある分の応答性の低下が懸念されるのである。

本発明は、以上のような背景のもとになされたものであり、金コロイド粒子を基材上へ固定化する方法であって、上記のような問題を考慮することなく、かつ、高密度で良好な結合性でもって金コロイド粒子を固定化するものを提供することを目的とする。

本発明者等は、本件課題を解決すべく検討を行い、その過程でＳＡＭを適用することなく金コロイドを基材へ固定化する手法に想到した。この方法は、ＯＨ基終端又はＣＯＯＨ基の親水性に修飾された基材表面に対し金コロイド粒子が効果的に固定化できるとの発見により完成されたものである。

本発明は、金コロイド粒子を基材表面に固定化する方法において、前記基材表面をＯＨ基終端又はＣＯＯＨ基終端で覆われた親水性とする表面修飾処理を行った後、基材表面と金コロイド粒子とを接触させることを特徴とする金コロイドの固定化法である。

以下、本発明につき詳細に説明する。本発明では、まず、基材を修飾処理し、基材表面をＯＨ基終端又はとＣＯＯＨ基終端する。金コロイドを固定化する基材には特に制限はなく、ガラス基材、Ｓｉ／ＳｉＯ_２基材、ＩＴＯのような透明電極を備えたものや、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ＰＳ等のポリマー基材にも本発明は適用可能である。また、後述するように、まずＭＰＴＭＳ等のＳＡＭを形成した後に行なっても金コロイドの固定化は可能である。紫外光照射によりＳＡＭは分解、除去され、基材表面はＯＨ基終端となるからである。表面修飾処理の手法としては、X線、電子線、ガンマ線、化学処理、紫外光照射のいずれかにより可能であり、例えば、基材を純水中で超音波洗浄するような処理のみでも可能である。但し、金コロイド粒子の固定をより確実なものとする特に好ましい方法としては、紫外光照射を行なうことによるものである。この紫外光照射による表面修飾処理の際の紫外光波長は、１２６〜２５４ｎｍとするのが好ましい。また、紫外光の照射時間は、金属又は半導体基材の場合は、１０分以上照射すれば十分に親水化される。一方、ポリマー基材の場合、紫外光によってポリマーが分解され、長時間の照射は基材の変形、黄変が生じるため、３０分以内とするのが好ましい。

修飾処理後の金コロイドの固定化は、溶媒に金コロイド粒子が分散するコロイド溶液を用い、これに処理後の基材を浸漬するものが好ましい。ここで、金コロイド溶液には、溶媒、金コロイド粒子に加えて保護剤が添加されているのが一般的である。保護剤とは、コロイド溶液中でコロイド粒子の周辺に化学的又は物理的に結合、吸着する化合物であって、コロイド粒子同志の凝集を抑制し粒径分布を適性範囲に制御し安定化させるものをいう。この保護剤としては、金コロイド粒子に対して化学的又は物理的に結合、吸着することができる有機化合物であれば、特に、限定はなく、ポリビニルピロリドン（以下、ＰＶＰという。）、ポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩという。）、ポリアクリル酸（以下、ＰＡＡという。）、カルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣという。）、ポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡという。）の他、クエン酸、アスコルビン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸、マレイン酸等の有機酸又はそのアルカリ金属塩若しくはそのアンモニウム塩、更には、ポリ（Ｎ−カルボキシメチル）アリルアミン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチル）アリルアミン、ポリ（Ｎ−カルボキシメチル）エチレンイミン等の有機化合物が適用できる。また、金コロイド溶液中の金コロイド粒子の含有量は、０．００４〜０．０１重量％のものが好ましい。

金コロイド溶液に基材を浸漬する際の浸漬時間は、１０〜７０分間とするのが好ましい。１０分未満では金コロイド粒子が完全に固定化されないからである。また、７０分を超えて浸漬すると、金コロイドが凝集して単層で固定化されないからである。

更に、本発明ではコロイド溶液のｐＨの調整が重要である。好ましいｐＨの範囲は、２．０〜６．０であり、特に好ましいｐＨは３．５〜４．５である。コロイド溶液のｐＨが２．０未満及び６．０を超える場合、金コロイド粒子の固定化は生じないからである。

上記した、表面修飾処理、金コロイド粒子の接触の２工程で金コロイドの固定化は完了する。後は基材を取り出し、乾燥等の適宜の後処理を行い、表面に機能タンパク質を固定するなどして利用に供することができる。

本発明では微細なパターンニングも可能である。即ち、基材への表面修飾処理を部分的、局所的に行った後に基材とコロイド粒子とを接触させることで、所望のパターンで固定化することができる。例えば、図１（ａ）のように、パターン以外の箇所をマスキングして紫外光照射を行なうことで、ＯＨ基終端のパターンを形成することパターンニングできる。また、本発明者等によれば、金コロイド粒子の固定化はＳＨ終端の表面でも生じるが、ＯＨ基終端部とＳＨ基終端部とが共存する場合には、ＯＨ基終端部に優先的に固定化されることが確認されている。従って、図１（ｂ）のように、先ず基材全体にＳＡＭを形成しＳＨ基終端となるようにした後に、マスキングを行って紫外光照射することで、ＳＡＭを分解、除去し、ＯＨ基終端部のパターンを形成した後に金コロイド粒子を固定化してもパターン形成が可能である。

本発明によれば、金コロイド粒子を基材に直接的に固定化することができる。従って、従来法のように、基材にＳＡＭを形成する工程が不要となり、固定化のための工程数を削減し、バイオチップ等の生産効率を向上させることができる。

本発明の適用例としては、バイオチップの機能タンパク質の下地層形成が先ず挙げられるが、本発明によれば、基材に直接的に金コロイド粒子層を形成することができるため、従来のようにＳＡＭが介在している場合に比べて応答性が良好なチップを製造することができる。これは、バイオチップ以外の電子デバイスの製造にも有用である。

また、上記のように本発明による金コロイド粒子の固定化法では、金コロイドの固定化にｐＨ感応性がある。この特性を利用すれば、本発明は特定の薬剤、酵素、タンパク質を人体へ輸送するドラッグデリバリーシステムへの応答も有望である。即ち、本発明により固定化される金コロイドは、雰囲気のｐＨが２．０〜６．０を外れると、基材からの拘束を解かれ基材から離脱する。従って、ドラッグ調整時のｐＨを上記範囲で行い、これを人体へ投与することで所定のｐＨとなる部位でドラッグを放出するようにすることでドラッグの集中的、効果的投与が可能となる。この点、従来用いられていたＭＰＴＭＳも用いる金コロイド粒子の固定化法でも、ｐＨ感応性はあるが、ＭＰＴＭＳは人体にとって好ましくない物質であることからかかる用途への適用は問題があるが、本発明ではこのような物質を利用することなく、また、金は人体への適合性も良好であることから、本発明はかかる用途への応用について有望である。尚、これらの用途に供するため、本発明では、基材に金コロイド粒子を単層で固定化したものが好ましい。

以下、本発明の好適な実施形態を図面と共に説明する。

第１実施形態：Ｓｉ／ＳｉＯ_２基材（寸法１．０×１．０ｃｍ）を前処理として、アセトン中での１０分間の超音波洗浄を３回繰り返し、更に超純水中での１０分間の超音波洗浄を３回繰り返した。そして、この基材に真空紫外光（光源：エキシマランプ）を大気圧雰囲気で１５分間照射して基材表面の修飾処理を行なった。

表面修飾処理後、基材を金コロイド溶液に浸漬した。この金コロイド溶液は、保護剤をクエン酸ナトリウムとし、金濃度０．００７重量％のものを用いた。ここでは、コロイド溶液のｐＨを１．５、２．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．５と調整したものを用意し、それぞれについて複数用意した基材を浸漬した。浸漬時間は全て６０分間とした。

以上の金コロイド粒子の固定化工程を図２に示す。そして、異なるｐＨのコロイド溶液について行なった金コロイド粒子固定化の良否を表１に示す。また、図３は、ｐＨ３．５、５．０としたときの基材表面の形態を示す原子間力顕微鏡の像である。

表１から、金コロイド粒子は、ｐＨ２．０〜５．５まででは固定化が可能であり、特に３．５〜４．５の範囲では良好な状態で固定化できることがわかる。また、この範囲を超えると固定化が不可能となることがわかる。

第２実施形態：ここでは、上記で説明した金コロイド粒子固定化によるパターンニングの確認を行なった。先ず、第１実施形態と同様のＳｉ／ＳｉＯ_２基材を第１実施形態と同様の工程で洗浄し、真空紫外光（光源：エキシマランプ）を大気圧雰囲気で１５分間照射した。そして、この基材をＰＴＦＥ容器（容量１８０ｃｍ^３）に、ＭＰＴＭＳ２００μＬを脱水トルエン７００μＬで希釈したものと共に封入し、ＰＴＦＥ容器を炉に入れ、８０℃で３時間加熱し、ＭＰＴＭＳ−ＳＡＭを形成した。

次に、この基材にフォトマスクでパターン形成し、その上に基板とフォトマスクとの密着性を高めるための重しとして石英ガラスを載置し、これに真空紫外光（光源：エキシマランプ）を１．０×１０Ｐａの雰囲気中で３０分間照射し、パターン上のＳＡＭを分解、除去した。

以上の処理がなされた基材を第１実施形態と同様の金コロイド溶液（ｐＨ３．５）に６０分間浸漬した。

図４は、コロイド溶液に浸漬後の基材表面の形態を示す原子間力顕微鏡の平面及び断面画像写真である。図から明らかなように、この実施形態では明瞭な金微粒子のパターン（段差約２０ｎｍ）が形成できたことが確認できる。

本発明を適用して金コロイド粒子のパターンニングを行う工程を説明する図。本発明を適用して金コロイド粒子のパターンニングを行う工程を説明する図（ＳＡＭ形成経由）。第１実施形態の金コロイド粒子固定化工程の概略を示す図。第１実施形態の金コロイド粒子固定化後の基材表面の形態を示す写真。第２実施形態の金コロイド粒子をパターン化して固定化した後の基材表面の形態を示す写真。ＳＡＭを適用するバイオチップの構造を示す図。ＳＡＭを用いた金コロイド粒子の固定化方法の概略を示す図。

符号の説明

１０基材
１１ＳＡＭ層
１２金コロイド粒子層
１３機能タンパク質

Claims

金コロイド粒子を基材表面に直接的に固定化する方法において、
前記基材表面の少なくとも一部に波長１２６〜２５４ｎｍの紫外光を照射し、基材表面の少なくとも一部をＯＨ基終端又はＣＯＯＨ基終端で覆われた親水性とする表面修飾処理を行った後、
前記基材を、溶媒に金コロイド粒子が分散するｐＨ３．５〜４．５のコロイド溶液に１０〜７０分間浸漬して金コロイド粒子を固定化することを特徴とする金コロイドの固定化法。
基材への表面修飾処理を部分的に行った後、基材を金コロイド溶液に浸漬し、所望のパターンで金コロイド粒子を固定化する請求項１記載の金コロイドの固定化法。
基材への部分的な表面修飾処理として、フォトマスク、ＴＥＭグリッドのパターンマスクを形成した後、紫外光を照射して基材表面の少なくとも一部をＯＨ基終端又はＣＯＯＨ基終端で覆われた親水性とする請求項２記載の金コロイドの固定化法。
金コロイド粒子を単層で固定化する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の金コロイドの固定化法。