JP3907035B2 - Bacteria capable of producing polyester near middle temperature, polyester polymerizing enzyme and gene encoding the same - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリエステル産生能を有する細菌、ポリエステル重合酵素遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現システム、該遺伝子発現システムにより形質転換または形質導入された変異体、ポリエステル重合酵素の製造方法及びポリエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの微生物が体内にエネルギー貯蔵物質としてポリ−３−ヒドロキシアルカノエート（PHA)） を蓄積することが知られている。PHAは熱可塑性を有し、すぐれた生分解性と生体適合性を有することから生分解性プラスチック（グリーンプラ）として注目されている。PHAのモノマー組成はその物性に大きな影響を与え、モノマー組成比はポリエステル重合酵素の基質特異性と宿主のモノマー合成経路によって変化する。これまでに約30種類の微生物からPHA合成酵素遺伝子がクローニングされ、その１次構造と基質特性から3つのグループに分類されている（I〜III）。タイプIとIIIは炭素数3〜6程度の短鎖長のヒドロキシアシルCoAに、タイプIIは炭素数6〜12程度の中鎖長のヒドロキシアシルCoAに基質特異性を示す。PHAの物性はそのモノマー組成によって大きく変化し、様々な物性のPHAを製造するためには幅広い基質特性を有するポリエステル重合酵素が必要である。
【０００３】
また従来のPHA合成は微生物内（in vivo）で行う方法であり、酵素を用いた合成（in vitro合成）は工業的にはほとんど行われていない。この理由の一つとしてPHA合成酵素の不安定性が挙げられ、安定なPHA合成酵素の製造がin vitro合成には必要不可欠である。しかしこれまで報告されているポリエステル重合酵素はその基質特異性が比較的せまく、幅広い基質特性を有するポリエステル重合酵素（特開平10-108682、特開平10-276781）についても中温付近（40〜50℃）で安定でかつ高活性を有するものは報告されていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、中温付近で安定にポリエステル産生能を有する細菌、および該細菌から単離したポリエステル重合酵素遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現システム、該遺伝子発現システムによって形質転換または形質導入された変異体および該変異体を用いて中温付近で安定でかつ幅広い基質特異性を有するポリエステル重合酵素の製造方法およびポリエステルの製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、このような課題を解決するために、中温付近（40〜50℃）で安定にポリエステルを合成し、幅広い基質特異性を有するポリエステル重合酵素を保持している細菌から、その遺伝子およびそれに付随するオープンリーディングフレームをクローニングし、遺伝的増幅、転写及び翻訳活性を高めることにより、目的の酵素生産量を高めるべく鋭意研究を行い本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、４０℃以上でポリエステル産生能を有する細菌に関する。
また、本発明は、バチルス属である、前記細菌に関する。
さらに、本発明は、細菌が、Bacillus sp. INT005 菌株である、前記細菌に関する。
また、本発明は、以下の制限酵素開裂地図を有し、かつ塩基対が3.8kbpであるポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。
【外２】
また、本発明は、配列番号１、配列番号３および配列番号５に示される塩基配列を含む、前記ＤＮＡ断片に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含むポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
さらに、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含むポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
さらに、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性もたらすポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【０００８】
さらに、本発明は、前記ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、前記ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子および前記３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子から成る群から選択される１または２以上の遺伝子を含む遺伝子発現カセットに関する。
また、本発明は、前記ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子と前記ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子とを同時に発現する遺伝子発現システムに関する。
さらに、本発明は、さらに前記３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子を含む、前記遺伝子発現システムに関する。
また、本発明は、前記遺伝子発現システムによって形質転換または形質導入された変異体に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
さらに、本発明は、以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性もたらすポリペプチド。
【００１０】
また、本発明は、前記細菌を培養し、得られた培養物からポリエステル重合酵素を採取することを特徴とする、ポリエステル重合酵素の製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記変異体を培養し、得られた培養物からポリエステル重合酵素を採取することを特徴とする、ポリエステル重合酵素の製造方法に関する。
また、本発明は、前記細菌を培養し、得られた培養物からポリエステルを採取することを特徴とする、ポリエステルの製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記変異体を培養し、得られた培養物からポリエステルを採取することを特徴とする、ポリエステルの製造方法に関する。
また、本発明は、前記方法により得られたポリエステル重合酵素を用いて、ポリエステルを重合することを特徴とする、ポリエステルの製造方法に関する。
【００１１】
本発明によれば、４０℃以上でも安定にポリエステル産生能を有する細菌を培養することにより、中温付近でも安定に、熱安定性の高いポリエステル重合酵素およびポリエステルの製造を行うことができる。
上記細菌から単離したポリエステル生合成に関与する遺伝子断片を得ることで、該遺伝子を含む変異体を用いて、培養することにより、熱安定性の高いポリエステル重合酵素およびポリエステルの製造を行うことができる。
本発明によれば、熱安定性の高いポリエステル重合酵素を得ることができたため、in vitroにおけるポリエステルの合成において、不安定性の点からこれまでにできなかった長期使用が可能となる。さらにバイオリアクター等を構築する際に、高温で反応を行わせることができることから、雑菌の混入を防ぐことができ、ポリエステル合成の応用の幅が広がる。
さらに、ポリエステルの生合成に関与する酵素である３−ケト−アシルCoAリダクターゼが得られたことから、脂肪酸からのポリエステル合成を効率的に行うことができ、基質の幅が広がる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で重合される(R)-３-ヒドロキシブチリル-CoA（(R)-３HB-CoA）は、以下の式（Ｉ）で示されるものである。
【化１】
なお、本発明で重合される化合物は(R)-３HB-CoAのみならず、(R)-３-ヒドロキシアシル-CoA（(R)-３HA-CoA）も含まれる。(R)-３HA-CoAの例としては、式（ＩＩ）に示した。
【化２】
【００１４】
本発明に係る４０℃以上でポリエステルを生産する細菌としては、４０℃以上で安定に生育でき、かつポリエステルを菌体内に蓄積することができるものであればいずれの細菌でもよいが、例えば、Thermus属、Cyanobacterium属、Bacillus属等を挙げることができる。中でも、安定な生育およびポリエステル産生の点から、４５℃以上でも安定に生育できるものが好ましく、本発明者らが分離した新種の菌株である、Bacillus sp. INT005菌株（以下、「本菌株」または「INT005」と略すことがある）が好ましい。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１３年５月９日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２７として寄託されている。
【００１５】
１．Bacillus sp. INT005菌株の単離・同定
INT005株は、本発明者らにより北海道内天然ガス田採掘土壌より分離した。
その菌学的性状は次の通りである。
（１）形態学的性状
−普通寒天培地上、37℃
コロニーの特徴
1） 外形 ： 円形
2） 表面の隆起 ： 低凸状
3） 表面の形状 ： 円形
4） 周縁 ： 巻き毛状
5） 光沢 ： 無
6） 色調 ： クリーム色
−普通寒天培地上、37℃
形態的性質
1） 細胞形態 ： 桿状
2） 運動性 ： あり
3） 胞子形状 ： 円形
4） グラム染色 ： 陽性
【００１６】
（２）生理学的性状
1） 嫌気条件下での生育 ： 陽性
2） カタラーゼ ： 陽性
3） オキシダーゼ ： 陽性
4） OＦテスト ： −
5） カゼイン加水分解 ： 陽性
6） でん粉加水分解 ： 陰性
7） 硝酸塩還元 ： 陰性
8） ＶＰテスト ： 陰性
9） インドロール産生 ： 陰性
10） 硫化水素産生 ： 陰性
11） クエン酸の利用性 ： 陰性
12） ウレアーゼ ： 陰性
13） １０％ＮａＣｌでの生育 ： 陰性
14） 生育温度上限 ： 45℃
15） アルギニンの加水分解 ： 陰性
16） チロシン分解性 ： 陰性
17） 炭素源からの酸の生成
【００１７】
１ グリセロール −
２ エリスリトール −
３ Ｄ−アラビノース −
４ Ｌ−アラビノース −
５ リボース ＋
６ Ｄ−キシロース −
７ Ｌ−キシロース −
８ アドニトール −
９ β?メチルーＤ−キシロース −
１０ ガラクトース −
１１ グルコース ＋
１２ フラクトース ＋
１３ マンノース −
１４ マルトース ＋
１５ トレハロース ＋
１６ マンニトール −
１７ イノシトール −
１８ グリセロール −
１９ スクロース ＋
２０ グルコネート ＋
【００１８】
（３）分類学的考察
−属レベルの同定
本菌株（INT005）は、１）グラム陽性桿菌である、２）運動性を有する、３）芽胞を形成する、４）グルコースから好気的に酸を生成するなどの特徴を示す。これらの特徴から、本菌株は、Bergey’s Mannual of Dterminative Bacteriology 第９巻に記載されている、Endo-spore-forming Gram-Positive Rods and Cocci群のBacillus属菌に帰属することが判明した。
−種レベルの同定
Bacillus属には、現在５０種近い菌が含まれている。16SRNA遺伝子の部分塩基配列を解析し、データーベース検索を行った結果Bacillus cereusと最も高い相同性を有していた。しかしサリシンからの酸産生、ＶＰテスト、硝酸塩還元能、でん粉の加水分解の結果はいずれもBacillus cereusと異なりこれらの結果から本菌株をBacillus sp.と同定した。
（４）ポリエステル産生能
３７℃および４５℃におけるＰＨＡ産生能は、以下の通りである。
37℃ (++>+>+->-)
Ralstnia eutropha ++
Bacillus megaterium ++
Bacillus sp.INT005 ++
45℃
Ralstnia eutropha -
Bacillus megaterium -
Bacillus sp.INT005 +
Bacillus sp.INT005は、４５℃においてもポリエステル産生能を有するものであった。
【００１９】
さらに、本発明では、Bacillus sp. INT005菌株の４０℃以上でのポリエステル産生能に着目し、該菌株より、４０℃以上でも安定でかつ幅広い基質特異性を有するポリエステル重合関連遺伝子を切り出し、これを適当なベクターを用いて適当な宿主に形質転換または形質導入し、変異体を作製し、該変異体を用いてポリエステル重合酵素およびポリエステルを製造することもできる。
【００２０】
２．繊維対の作製
（１）遺伝子のクローニング
遺伝子のクローニングは、公知の方法を用いることができる。例えば、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、ユニット２・４の方法等により染色体ＤＮＡを調製する。
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばPstI、EcoRI等により完全分解する。得られるＤＮＡ断片を、制限酵素（例えばPstI、EcoRI等）で切断してフォスファターゼ処理したベクターとライゲーションを行う。
【００２１】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。ファージベクターとしては、例えばEMBL3、M13、λgt11等が挙げられ、プラスミドベクターとしては、例えばpBR322、pUC18、pBluescript II（STRATAGENE社製）等が挙げられる。さらに、大腸菌やバチルス属菌などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。
【００２２】
宿主微生物に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば、宿主微生物が大腸菌の場合は塩化カルシウム法（カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット１・４、Lederberg, E.M. et al., J. Bacteriol. 119, 1072 (1974)）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）を採用することができ、宿主微生物がファージＤＮＡの場合はインビトロ・パッケージング法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，5.7.1 頁, 1994年）等を採用することができる。本発明では、インビトロ・パッケージング用キット（Gigapack II； STRATAGENE 社製等）を用いてもよい。
【００２３】
次に、本発明のポリエステル重合酵素ＩおよびＩＩ遺伝子並びに３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るためのプローブを調製する。
ポリエステル重合酵素のアミノ酸配列については、既に何種類かのものが知られている（Gabriel J. McCool and Maura C. Cannon, J. Bacteriol., 181,585(1999); Liebergesell, M. and Steinbuchel, Eur. J. Biochem., 209, 135(1992);Kaneko, T., et al., DNA Res., 3, 109(1996); Liebergesell, M. and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, 493(1993) 他）。そこで、これらのアミノ酸配列のうち、よく保存されている領域を選択し、それをコードする塩基配列を推定してオリゴヌクレオチドを設計する。これらオリゴヌクレオチドとしてはPrimer1：GCAGTGAAAAAAGTAATGCGAACTGCAAGA、Primer2： CCGCTGTTCCACCGTAAACAATCGCATATG挙げられるが、これに限定されない。
【００２４】
次に、この合成オリゴヌクレオチドを適当な試薬を用いて標識し、前記染色体ＤＮＡライブラリーから上述のPrimer1・２を用いたPCR法（ライブラリーをいくつかのグループに分け、それぞれのグループからプラスミドを調製した。このプラスミドをテンプレートとしてPCRを行い、断片増幅が行ったグループを更に細分化し最終的に目的遺伝子を含む大腸菌を分離した）によってスクリーニングを行った。
【００２５】
スクリーニングされた大腸菌からアルカリ法（Currnt Protocols in Molecular Biology,1巻,1.6.1頁, 1994年) によってプラスミドを回収することにより、ポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。
上記ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知方法、例えばサンガー法（Molecular Cloning,2巻, 13.3頁, 1989年）等によって行うことができ、塩基配列自動分析装置、例えば種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、ダイエナミック・ET・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（アマシャム・ファルマシア）およびＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）（ABI社）を用いて、常法に従って行うことができる。
【００２６】
なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２７】
Bacillus sp. INT 005株由来のポリエステル重合酵素遺伝子を含む3.8kbpのＤＮＡ断片の全塩基配列を解析したところ、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が確認された。今回確認された３つのＯＲＦをプロモーターから順方向にＯＲＦ１〜３とする。ＯＲＦ２は、744塩基で構成され、Bacillus megaterium由来３−ケト−アシルCoAリダクターゼをコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約72.5％の相同性（FASTAプログラム）を持つことが確認された。ＯＲＦ３は、1086塩基で構成され、Bacillus megaterium由来ポリエステル重合酵素をコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約71.5％の相同性（FASTAプログラム）を持つことが確認された。３−ケト−アシルCoAリダクターゼはポリエステル生合成に関与する酵素であり、脂肪酸からのポリエステル合成を効率的に行うことができ、ポリエステル重合における幅広い基質特性を得ることができる。また、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３の上流に位置するＯＲＦ１は、ポリエステル産生に関与する遺伝子と考えられ、ＯＲＦ３と同時に発現することで、ポリエステル重合酵素活性が得られ、ＯＲＦ１およびＯＲＦ３の同時の発現が、必須であることが確認された。
従って、ＯＲＦ３を、ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、ＯＲＦ１をポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子、およびＯＲＦ２を３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子とした。
【００２８】
本発明のポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子の全塩基配列を配列番号１に、次いでこの塩基配列によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子の全塩基配列を配列番号３に、次いでこの塩基配列によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に、３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子の全塩基配列を配列番号５に、次いでこの塩基配列によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に記載する。
なお、配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列において、１または２以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつポリエステル重合酵素活性および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性をもたらすポリペプチドをコードする遺伝子は、全て本発明に含まれる。
【００２９】
そして、配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列において、１または２以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつポリエステル重合酵素活性をもたらすポリエステル重合酵素をコードする遺伝子を得るには如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知の技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで選択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法などがある。
また、本発明のポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子は、配列番号１、３および５に示される塩基配列を含むものに限定されず、これらの塩基配列で、遺伝コードの縮重のために、アミノ酸に対するコドンが等価の他のコドンに置き換えられた塩基配列であってもよい。等価の他のコドンで置き換えるとは、例えば、セリン残基の場合は、コドンＴＣＡ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴまたはＡＧＣの６つのコドンでコードされるが、これらは、セリン残基をコードする目的では等価であるため、これらのコドンであれば、他のコドンで置き換えてもよいことをいう。他のそれぞれのアミノ酸残基についても同様に、他の等価のコドンで置き換えられてよく、同じアミノ酸配列をコードするものであれば、本発明の塩基配列に含まれる。
【００３０】
(2) 変異体の作製
本発明の遺伝子発現カセットは、プロモーターと、ポリエステル重合酵素活性および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性を有する遺伝子、例えば上述のポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子から選択される１または２以上のＤＮＡを含み、上記プロモーターに対応するターミネーターを含むもので、これらが５’末端方向から３’末端方向に連結されたものである。この遺伝子発現カセットを１または２以上の組換えベクターに組み込む本発明の遺伝子発現システムにより、宿主に導入することで、本発明の変異体を得ることができる。さらには、該変異体において発現を調節することができる。
【００３１】
本発明の遺伝子発現システムは、効率よくポリエステル重合酵素およびポリエステルを生産したい場合には、ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子およびポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子を同時に発現できることが好ましく、この場合、同一宿主内で同時に発現するのであれば、必ずしもポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子は、ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子の上流に存在する必要はなく、さらには、該遺伝子を同一ＤＮＡ断片上に存在させる１の組換えベクターであっても、または異なるＤＮＡ断片上に存在させる２以上の組換えベクターを用いて分けて同一宿主内に導入することもできる。
さらに、幅広い基質特異性をもつポリエステル重合酵素を生産したい場合には３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性を有する遺伝子を上記の遺伝子発現システムに含ませることができる。
【００３２】
本発明の変異体は、本発明の遺伝子発現システムによる組換えベクターを宿主中に形質転換および形質導入することにより得られる。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、アルカリゲネス属に属する微生物、シュードモナス属に属する微生物、バチルス属に属する微生物、大腸菌等の細菌、サッカロミセス属、カンジダ属等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞などが挙げられる。
【００３３】
大腸菌等を宿主として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるRK2複製起点を有するpLA2917 (ATCC 37355)やRSF1010複製起点を有するpJRD215 (ATCC 37533)等が挙げられる。
【００３４】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、tac プロモーター、trc プロモーター、lac プロモーター、ＰL プロモーター、ＰR プロモーター、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられ得る。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, 1.8.1頁，1994年）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）等が挙げられる。
【００３５】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal 10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Methods Enzymol.,194,182-187(1990))、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933 (1978))、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)）等が挙げられる。
【００３６】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００３７】
３．ポリエステル重合酵素およびポリエステルの製造
本発明のポリエステル重合酵素は、本発明の細菌または変異体を培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に本発明のポリエステル重合酵素を生成蓄積させ、該培養物からポリエステル重合酵素を採取することにより行われる。本発明の細菌および変異体を培養する方法は、通常の方法に従って行われる。
さらに、ポリエステルの製造は、本発明の細菌または変異体を培養し、培養物又は培養菌体中に本発明のポリエステルを生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物からポリエステルを採取することにより行われる。本発明の細菌および変異体を培養する方法は、通常の方法に従って行われる。
【００３８】
細菌および変異体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、pH7〜９、培養温度は30〜37℃の範囲で好気的に4〜24時間培養することによりポリエステル重合酵素およびポリエステルを菌体内に蓄積させ、回収する。
なお、Bacillus sp. INT005菌株を用いた場合には、30〜45℃の範囲でも培養可能である。
本発明の炭素源は微生物の増殖に必要であり、かつポリエステル合成の原料となるものであり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。
また、３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子を用いることで、ポリエステル合成の原料に脂肪酸を用いることもできる。脂肪酸としては、酪酸、ヒドロキシ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸等が挙げられる。
【００３９】
窒素源としては例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。
無機物としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸マンガン等が挙げられる。
【００４０】
培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、25〜37℃で発現誘導後２時間以上行う。培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４１】
誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG) 、インドールアクリル酸(IAA) 等を培地に添加することができる。
【００４２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばRPMI-1640 、DMEM培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ2存在下、30〜37℃で１〜７日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４３】
ポリエステル重合酵素の精製は、培養終了後、該培養物から採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波破砕処理等で等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて菌体を溶菌して酵素を抽出する。そして、得られる粗酵素をイオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過による各種クロマトグラフィーを用いて精製する。
菌体および変異体から得られたポリエステルの精製は例えば以下のように行うことができる。培養液から遠心分離によって菌体および変異体を集め、蒸留水で洗浄した後、乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した菌体および変異体を懸濁し、加熱することによってポリエステルを抽出する。なお、濾過によって残渣を取り除く。このクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリエステルを沈殿させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥して精製ポリエステルを得る。
また、上述の方法によって得られたポリエステル重合酵素を用いて、(R)-３HB-CoAを添加すれば、酵素反応によりポリエステル（ポリ−3−ヒドロキシブチレート（P3HB））を得ることができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（１）Bacillus sp. INT 005株の染色体ＤＮＡの調製
Bacillus sp. INT 005株を2mlの滅菌したLB培養液［LB Broth Base (GIBCO BRL)］からなる液体培地（蒸留水使用、pH7.4）において37℃で一晩培養した。培養液全量を100mlのLB培養液に入れ、培養液の濁度（600nmの吸光度）が0.7になるまで37℃で振とう培養した。培養終了後、培養液から7000rpm、10分間の遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体からカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット２・４に記載の方法に従って、染色体ＤＮＡを得た。
【００４５】
次にこの染色体ＤＮＡ0.05mgを制限酵素PstI（宝酒造）500ユニットと供に、50mMトリス−塩酸緩衝液（100mMNaCl、10mMMgSO4、1mMジチオスレイトール含有）（pH7.5）に混合し、37℃で8時間反応させて、ＤＮＡの完全消化を行った。反応終了後、反応液を0.7%アガロース電気泳動にかけ、約8kbp付近のＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルの中に含まれているＤＮＡをQIAEX II Gel Extraction Kit（Qiagen製）を使用して抽出、精製し、１μgの染色体ＤＮＡ断片を得た。
【００４６】
（２）プラスミドベクターpUC19を用いたBacillus sp. INT 005株の染色体ＤＮＡライブラリーの作成及びポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の検索プラスミドベクターpUC19 ２μg及び制限酵素PstI（宝酒造）1ユニットを50mMトリス−塩酸緩衝液（100mMNaCl、10mMMgSO4、1mMジチオスレイトール含有）（pH7.5）に混合し、37℃で3時間反応させて消化し、さらにフォスファターゼ処理を行った。反応後常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈殿処理して、PstIで消化されたプラスミドベクターpUC19を得た。
【００４７】
次いで、このPstIで消化されたプラスミドベクターpUC19のＤＮＡ断片100ngと、上記項目（１）で得られたPstIで完全消化された染色体ＤＮＡ断片200ngを混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いて、常法に従ってＤＮＡを連結させた。このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡ含有液をカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット１・４に記載の方法に従って、大腸菌JM109に塩化カルシウム法によって導入した。形質転換液をLB培地に塗布し、37℃で24時間静置培養した。生じたコロニー2000個を100クローンずつ20グループに分割した。それぞれのグループからカレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・ユニット１・６の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。ポリエステル重合酵素遺伝子特異的に結合するオリゴＤＮＡを用い、TaqDNAポリメラーゼ（シグマ）によって当該遺伝子の部分的増幅を行った。断片増幅が起こったグループについてさらに分割を行い最終的に断片増幅が起こる形質転換体1株を得た。
【００４８】
（３）ポリエステル重合酵素遺伝子の塩基配列の解析及びポリエステル重合酵素遺伝子の検索
上記項目（２）で得られた形質転換体を培養し、プラスミドをカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット1.6に記載された方法によって調製した結果、約8.0キロ塩基の大きさの挿入ＤＮＡ部分を持つプラスミドが得られた。このプラスミドをpNAと命名した。プラスミドpNAを種々の制限酵素で消化することにより、得られた挿入ＤＮＡ部分の制限酵素地図を作製した。解析の結果をもとにして、pNAを制限酵素DraIで消化し、その結果生じた約3.8キロ塩基のＤＮＡ断片をSmaIで消化、フォスファターゼ処理したプラスミドベクターpUC19にサブクローニングした（pNAD38、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１３年５月９日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２６として寄託）。サブクローニングして得られたプラスミドを鋳型にして、それぞれのＤＮＡ断片の塩基配列決定を行った。塩基配列の決定は種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、ダイエナミック・ET・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（アマシャム・ファルマシア）およびＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）（ABI社）を用いて、常法に従って行った。
サブクローニングされた挿入ＤＮＡ部分を、種々の合成ＤＮＡをプライマーとして用いて、ジデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【００４９】
Bacillus sp. INT 005株由来のポリエステル重合酵素遺伝子を含む3.8kbのＤＮＡ断片の全塩基配列を解析したところ、３つのオープンリーディングフレームが確認された。その内の１つで、1086塩基で構成されたオープンリーディングフレーム（ORF3）は、Bacillus megaterium由来ポリエステル重合酵素をコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約71.5％の相同性（FASTAプログラム）を、また744塩基で構成されたオープンリーディングフレーム（ORF2）は、Bacillus megaterium由来３−ケト−アシルCoAリダクターゼをコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約72.5％の相同性（FASTAプログラム）を持つことが確認された。
【００５０】
得られたBacillus sp. INT 005株由来のＯＲＦ３の塩基配列を配列番号１に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号２に、ＯＲＦ２の塩基配列を配列番号５に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号６に、ＯＲＦ１の塩基配列を配列番号３に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号４にそれぞれ示した。得られた塩基配列を基にして、pNAD38にクローニングされたBacillus sp. INT 005株由来の3.8kbpのＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成した。この制限酵素地図のとおりである。
【００５１】
【外３】
この制限酵素地図上でORF3は約1.6〜2.7kbpの間に左から右の方向に存在する。
プラスミドpNAD38で大腸菌JM109を形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を得た。pNAD38にはベクター上のlacプロモーターと順方向にORF1〜3が存在しており、培養液にイソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（IPTG）を加えることによって ORF1〜3の発現を誘導することができる。形質転換によって得られた大腸菌JM109（pNAD38）をLB培養液5ml中で培養液の600nmでの吸光度が0.6（初期対数増殖期）になるまで振とう培養した（37℃）。この時点で培養液に終濃度0.2mMになるようにIPTGを加え、さらに3時間振とう培養を続けた。培養後、遠心分離により菌体を回収し、菌体を1mlの25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）で洗浄後、5％グリセロールを含む25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心し、その上清をポリエステル重合酵素を含む粗抽出液とした。この粗抽出液を1mM(R)-３HB-CoAを含む25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）に10分の1量加え、ポリエステル重合酵素活性測定反応液とした。この反応液を30℃で保温、一定時間ごとにサンプリングし、2倍量の5%TCAをサンプルに加えて反応を停止させたあと、遠心して変性したタンパク質を沈殿させた。遠心後の上清に500mMリン酸バッファーとDTNB（発色液）を添加し、30℃で10分間インキュベートした。ポリエステルの重合反応にともなって遊離するCoAとDTNBが反応し412nmの吸収を呈することを利用し、吸光度変化から反応量を定量した。ポリエステル重合活性試験の結果を図１に示した。ベクターＤＮＡ（pUC19）のみを含んだ大腸菌の抽出液を添加した反応液では吸光度がほとんど変化しないのに対し、pNAD38を含んだ大腸菌の抽出液を添加した反応液では時間とともに吸光度が増加した。
【００５３】
次にORFのコードするポリペプチドの活性を確認するために、ORF1、ORF1・2をベクターDNA［pSTV28（宝酒造）］にORF3をベクターDNA［pQE30（キアゲン）］に組み込んだ。このプラスミドを大腸菌JM109に導入し、以下の6つの菌株を作成した（JM109（pSTV28、pQE30）、JM109（pSTV-ORF1、pQE30）、JM109（pSTV-ORF1・2、pQE30）、JM109（pSTV28、pQE-ORF3）、JM109（pSTV-ORF1、pQE-ORF3）、JM109（pSTV-ORF1・2、pQE-ORF3））。同様に粗酵素溶液を調製し、ポリエステル重合酵素活性を測定した（図２）。これらの結果より、ORF1と3の発現がポリエステル重合酵素活性に必須であることが確認された。
【００５４】
JM109（pSTV28）、JM109（pSTV-ORF1）、JM109（pSTV-ORF1・2）を用いて同様に粗酵素溶液を調製した。この粗抽出液を0.125mM、NADPH、0.025mMアセトアセチルを含む125mMトリス塩酸バッファー（pH8.0）に80分の1量加え、３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性測定反応液とした。この反応液を30℃で保温、340nmの吸光度変化（NADPHの吸収）を測定した（図３）。この結果、ORF2が３−ケト−アシルCoAリダクターゼをコードしていることがわかった。
【００５５】
JM109（pSTV-ORF1、pQE-ORF3）を用いて同様に粗酵素溶液を調製した。この粗抽出液を1mM(R)-３HB-CoAを含む25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）に10分の1量加え、ポリエステル重合酵素活性測定反応液とした。この反応液を25、30、37、40、42、45、50℃で保温、一定時間ごとにサンプリングした。この結果、45℃という比較的高い温度で最も高い活性を有していることがわかった（図４）。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、幅広い基質特性と安定性を有するポリエステル重合酵素関連遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現カセット、該遺伝子発現カセットを含む変異体、ポリエステル重合酵素の製造方法及びポリエステルの製造方法を提供することができる。また本発明の細菌および変異体により安定で幅広い基質特性を有するポリエステル重合酵素を効率的に生産することができ、該酵素を用いて効率的にポリエステルを合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】pNAD38を用いてORF1・2・3を発現させた大腸菌粗抽出液による(R)-３HB-CoAの重合反応の経時変化（反応の進行によって遊離するCoAをDTNB試薬によって定量）を示す。
【図２】ORF1・2・３を種々の組み合わせで発現させた大腸菌粗抽出液による(R)-３HB-CoAの重合反応の経時変化（反応の進行によって遊離するCoAをDTNB試薬によって定量）を示す。
【図３】ORF1およびORF1・2を発現させた大腸菌粗抽出液による３−ケト−アシルCoA還元反応の経時変化（反応の進行によって減少するNADPH量を340nmの吸光度変化によって定量）を示す。
【図４】ORF1・3を発現させた大腸菌粗抽出液による(R)-３HB-CoAの重合反応の至適温度を（30℃の活性を100とした相対活性として表示）示す。
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bacterium having polyester-producing ability, a polyester polymerizing enzyme gene, a gene expression system containing the gene, a mutant transformed or transduced by the gene expression system, a method for producing a polyester polymerizing enzyme, and a method for producing a polyester About.
[0002]
[Prior art]
Many microorganisms are known to accumulate poly-3-hydroxyalkanoate (PHA) as an energy storage substance in the body. PHA is attracting attention as a biodegradable plastic (green plastic) because it has thermoplasticity and excellent biodegradability and biocompatibility. The monomer composition of PHA greatly affects its physical properties, and the monomer composition ratio varies depending on the substrate specificity of the polyester polymerizing enzyme and the monomer synthesis pathway of the host. So far, PHA synthase genes have been cloned from about 30 types of microorganisms and classified into three groups based on their primary structure and substrate characteristics (I-III). Types I and III have substrate specificity for short chain length hydroxyacyl CoA having about 3 to 6 carbon atoms, and type II has medium chain length hydroxyacyl CoA having about 6 to 12 carbon atoms. The physical properties of PHA vary greatly depending on the monomer composition, and in order to produce PHA having various physical properties, a polyester polymerizing enzyme having a wide range of substrate properties is required.
[0003]
Further, conventional PHA synthesis is a method carried out in a microorganism (in vivo), and synthesis using an enzyme (in vitro synthesis) is hardly carried out industrially. One reason for this is the instability of PHA synthase, and the production of a stable PHA synthase is essential for in vitro synthesis. However, polyester polymerizing enzymes reported so far have relatively low substrate specificity, and polyester polymerizing enzymes having a wide range of substrate properties (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 10-108682 and 10-276781) are also in the middle temperature range (40-50 ° C.). ) Which is stable and has high activity has not been reported.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a bacterium having a polyester-producing ability stably at around an intermediate temperature, a polyester polymerizing enzyme gene isolated from the bacterium, a gene expression system containing the gene, and transformation or transduction by the gene expression system. It is an object of the present invention to provide a method for producing a polyester polymerizing enzyme and a method for producing a polyester, which are stable at around an intermediate temperature and have a wide range of substrate specificities.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve such a problem, the present invention synthesizes a polyester stably at an intermediate temperature (40 to 50 ° C.), and from a bacterium having a polyester polymerizing enzyme having a wide substrate specificity, its gene and The open reading frame that accompanies it is cloned, and the gene amplification, transcription, and translational activities are enhanced to intensively study to increase the target enzyme production amount, and the present invention has been completed.
[0006]
That is, the present invention relates to a bacterium having a polyester-producing ability at 40 ° C. or higher.
Moreover, this invention relates to the said bacterium which is a Bacillus genus.
Furthermore, the present invention relates to the bacterium, wherein the bacterium is a Bacillus sp. INT005 strain.
The present invention also relates to a DNA fragment containing a polyester polymerase gene having the following restriction enzyme cleavage map and having a base pair of 3.8 kbp.
[Outside 2]
The present invention also relates to the DNA fragment comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5.
[0007]
Furthermore, the present invention relates to a polyester synthase I gene encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) Polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) Polyester having an activity of polyester polymerase comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) peptide.
The present invention also relates to a polyester polymerase I gene comprising the following base sequence (a) or (b):
(A) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) a base sequence encoding the same amino acid sequence, although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code.
Furthermore, the present invention relates to a polyester synthase II gene encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) Polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) Polyester having a polyester polymerizing enzyme activity comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) peptide.
The present invention also relates to a polyester polymerizing enzyme II gene comprising the following base sequence (a) or (b):
(A) The base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (b) A base sequence encoding the same amino acid sequence, although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code.
Furthermore, the present invention relates to a 3-keto-acyl CoA reductase gene encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (b) a 3-keto-acyl CoA reductase comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) Polypeptide that brings about activity.
The present invention also relates to a 3-keto-acyl CoA reductase gene comprising the following base sequence (a) or (b):
(A) The base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (b) A base sequence encoding the same amino acid sequence, although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code.
[0008]
Furthermore, the present invention relates to a gene expression cassette comprising one or more genes selected from the group consisting of the polyester synthase I gene, the polyester synthase II gene, and the 3-keto-acyl CoA reductase gene.
The present invention also relates to a gene expression system that simultaneously expresses the polyester polymerase I gene and the polyester polymerase II gene.
Furthermore, the present invention relates to the gene expression system further comprising the 3-keto-acyl CoA reductase gene.
The present invention also relates to a mutant transformed or transduced by the gene expression system.
[0009]
Furthermore, the present invention relates to the following polypeptide (a) or (b):
(A) Polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) Polyester having an activity of polyester polymerase comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) peptide.
The present invention also relates to the following polypeptide (a) or (b):
(A) Polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) Polyester having a polyester polymerizing enzyme activity comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) peptide.
Furthermore, the present invention relates to the following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (b) a 3-keto-acyl CoA reductase comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) Polypeptide that brings about activity.
[0010]
The present invention also relates to a method for producing a polyester polymerizing enzyme, comprising culturing the bacterium and collecting the polyester polymerizing enzyme from the obtained culture.
Furthermore, the present invention relates to a method for producing a polyester polymerizing enzyme, wherein the mutant is cultured and the polyester polymerizing enzyme is collected from the obtained culture.
The present invention also relates to a method for producing polyester, wherein the bacterium is cultured and the polyester is collected from the obtained culture.
Furthermore, this invention relates to the manufacturing method of polyester characterized by culture | cultivating the said variant and extract | collecting polyester from the obtained culture.
The present invention also relates to a method for producing a polyester, wherein the polyester is polymerized using the polyester polymerizing enzyme obtained by the above method.
[0011]
According to the present invention, a polyester polymerizing enzyme and a polyester having high thermal stability can be produced stably even at around medium temperature by culturing bacteria having a polyester-producing ability stably even at 40 ° C. or higher.
By obtaining a gene fragment involved in polyester biosynthesis isolated from the bacterium described above, it is possible to produce a polyester polymerase and polyester having high thermal stability by culturing using a mutant containing the gene. it can.
According to the present invention, since a polyester polymerizing enzyme having high thermal stability can be obtained, long-term use that has not been possible in the past in terms of instability in synthesis of polyester in vitro becomes possible. Furthermore, when a bioreactor or the like is constructed, the reaction can be carried out at a high temperature, so that contamination with germs can be prevented and the range of applications for polyester synthesis is expanded.
Furthermore, since 3-keto-acyl CoA reductase, an enzyme involved in polyester biosynthesis, has been obtained, polyester synthesis from fatty acids can be performed efficiently, and the range of substrates is expanded.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(R) -3-Hydroxybutyryl-CoA ((R) -3HB-CoA) polymerized in the present invention is represented by the following formula (I).
[Chemical 1]
The compound polymerized in the present invention includes not only (R) -3HB-CoA but also (R) -3-hydroxyacyl-CoA ((R) -3HA-CoA). An example of (R) -3HA-CoA is shown in Formula (II).
[Chemical 2]
[0014]
The bacterium producing polyester at 40 ° C. or higher according to the present invention may be any bacterium as long as it can grow stably at 40 ° C. or higher and can accumulate polyester in the microbial cells. Genus, Cyanobacterium genus, Bacillus genus and the like. Among these, from the viewpoint of stable growth and polyester production, those capable of stable growth at 45 ° C. or higher are preferred, and Bacillus sp. INT005 strain (hereinafter referred to as “this strain” or “this strain”, which is a new strain isolated by the present inventors). “INT005” may be abbreviated). This strain was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as an accession number FERM P-18327 on May 9, 2001.
[0015]
1. Isolation and identification of Bacillus sp. INT005 strain
The INT005 strain was isolated from natural gas field mining soil in Hokkaido by the present inventors.
Its bacteriological properties are as follows.
(1) Morphological properties-37 ° C on normal agar medium
Colony features
1) Outline: Circular
2) Surface bumps: low convex
3) Surface shape: circular
4) Perimeter: curly
5) Gloss: None
6) Color: Cream color-37 ° C on normal agar medium
Morphological properties
1) Cell morphology: Spider
2) Mobility: Yes
3) Spore shape: circular
4) Gram staining: Positive [0016]
(2) Physiological properties
1) Growth under anaerobic conditions: positive
2) Catalase: Positive
3) Oxidase: Positive
4) OF test:-
5) Casein hydrolysis: positive
6) Starch hydrolysis: negative
7) Nitrate reduction: negative
8) VP test: negative
9) Indolol production: Negative
10) Hydrogen sulfide production: Negative
11) Use of citric acid: Negative
12) Urease: Negative
13) Growth with 10% NaCl: negative
14) Growth temperature upper limit: 45 ℃
15) Hydrolysis of arginine: negative
16) Tyrosine degradation: Negative
17) Generation of acid from carbon source
1 Glycerol-
2 Erythritol −
3 D-arabinose-
4 L-arabinose-
5 Ribose +
6 D-xylose −
7 L-xylose −
8 Adonitol-
9 β-methyl-D-xylose −
10 Galactose-
11 Glucose +
12 Fructose +
13 Mannose-
14 Maltose +
15 Trehalose +
16 Mannitol-
17 Inositol-
18 Glycerol-
19 Sucrose +
20 Gluconate +
[0018]
(3) Taxonomic considerations-identification at the genus level This strain (INT005) is 1) a Gram-positive bacillus, 2) has motility, 3) forms spores, 4) aerobically acid from glucose Features such as generating From these characteristics, it was found that this strain belongs to the genus Bacillus of the Endo-spore-forming Gram-Positive Rods and Cocci group described in the 9th volume of Bergey's Mannual of Dterminative Bacteriology.
-Species level identification
The Bacillus genus currently contains nearly 50 species of bacteria. Analysis of the partial nucleotide sequence of 16SRNA gene and database search revealed that it had the highest homology with Bacillus cereus. However, the results of acid production from salicin, VP test, nitrate reducing ability, and starch hydrolysis were all different from Bacillus cereus, and from these results, this strain was identified as Bacillus sp.
(4) Polyester production ability The PHA production ability at 37 ° C and 45 ° C is as follows.
37 ℃ (++>+>+->-)
Ralstnia eutropha ++
Bacillus megaterium ++
Bacillus sp.INT005 ++
45 ℃
Ralstnia eutropha-
Bacillus megaterium-
Bacillus sp.INT005 +
Bacillus sp. INT005 was capable of producing polyester even at 45 ° C.
[0019]
Furthermore, in the present invention, focusing on the ability of Bacillus sp. INT005 strain to produce polyester at 40 ° C. or higher, a polyester polymerization-related gene that is stable at 40 ° C. or higher and has a wide range of substrate specificities is excised. It is also possible to transform or transduce an appropriate host using an appropriate vector to produce a mutant, and to produce a polyester polymerizing enzyme and a polyester using the mutant.
[0020]
2. Production of Fiber Pair (1) Gene Cloning Gene cloning can be performed by a known method. For example, chromosomal DNA is prepared by Current Protocols in Molecular Biology, the method of
The obtained chromosomal DNA is completely degraded with an appropriate restriction enzyme such as PstI or EcoRI. The obtained DNA fragment is ligated with a phosphatase-treated vector cut with a restriction enzyme (eg, PstI, EcoRI, etc.).
[0021]
As the vector, a phage or a plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is used. Examples of the phage vector include EMBL3, M13, and λgt11. Examples of the plasmid vector include pBR322, pUC18, and pBluescript II (manufactured by STRATAGENE). Furthermore, various shuttle vectors can be used in addition to vectors capable of autonomous growth in two or more host microorganisms such as Escherichia coli and Bacillus. Such a vector can also be cleaved with the restriction enzyme to obtain a fragment thereof.
A known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment. Then, the DNA fragment and the vector fragment are annealed and then ligated to produce a recombinant vector.
[0022]
Introduction of the recombinant vector into the host microorganism can be performed by a known method. For example, when the host microorganism is Escherichia coli, the calcium chloride method (Current Protocols in Molecular Biology Units 1 and 4, Lederberg, EM et al., J. Bacteriol. 119, 1072 ( 1974)) and electroporation (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1.8.4, 1994) can be employed. When the host microorganism is phage DNA, the in vitro packaging method (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, page 5.7.1, 1994) can be employed. In the present invention, an in vitro packaging kit (Gigapack II; manufactured by STRATAGENE, etc.) may be used.
[0023]
Next, a probe for obtaining a DNA fragment containing the polyester polymerizing enzyme I and II genes of the present invention and the 3-keto-acyl CoA reductase gene is prepared.
Several amino acid sequences of polyester polymerizing enzymes are already known (Gabriel J. McCool and Maura C. Cannon, J. Bacteriol., 181,585 (1999); Liebergesell, M. and Steinbuchel, Eur. J. Biochem., 209, 135 (1992); Kaneko, T., et al., DNA Res., 3, 109 (1996); Liebergesell, M. and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, 493 ( 1993) and others). Therefore, a well-conserved region is selected from these amino acid sequences, and an oligonucleotide is designed by estimating a base sequence encoding it. These oligonucleotides include, but are not limited to, Primer1: GCAGTGAAAAAAGTAATGCGAACTGCAAGA, Primer2: CCGCTGTTCCACCGTAAACAATCGCATATG.
[0024]
Next, this synthetic oligonucleotide is labeled with an appropriate reagent, and the PCR method using the above-mentioned
[0025]
By recovering the plasmid from the screened E. coli by the alkaline method (Currnt Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1.6.1, 1994), a DNA fragment containing the polyester polymerase gene can be obtained.
The base sequence of the DNA fragment can be determined by a known method such as the Sanger method (Molecular Cloning, Vol. 2, 13.3, 1989), etc., and an automatic base sequence analyzer such as various synthetic DNAs as primers. , Using a Dynamic ET Terminal Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia) and a DNA sequencer (Perkin Elmer Applied Biosystems) (ABI).
[0026]
After the base sequence is determined by the above method, the gene of the present invention is obtained by chemical synthesis, by PCR using chromosomal DNA as a template, or by hybridizing with a DNA fragment having the base sequence as a probe. Can be obtained.
[0027]
Analysis of the entire base sequence of the 3.8 kbp DNA fragment containing the polyester polymerase gene derived from the Bacillus sp. INT 005 strain revealed a plurality of open reading frames (ORF). The three ORFs confirmed this time are referred to as ORFs 1 to 3 in the forward direction from the promoter. ORF2 is composed of 744 bases and has a homology of about 72.5% at the amino acid sequence level with a gene encoding 3-keto-acyl CoA reductase derived from Bacillus megaterium (J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)). FASTA program) was confirmed. ORF3 is composed of 1086 bases and has about 71.5% homology (FASTA program) at the amino acid sequence level with the gene encoding polyester polymerase from Bacillus megaterium (J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)). It was confirmed to have. 3-Keto-acyl-CoA reductase is an enzyme involved in polyester biosynthesis, can efficiently synthesize polyester from fatty acids, and can obtain a wide range of substrate characteristics in polyester polymerization. In addition, ORF1 located upstream of ORF2 and ORF3 is considered to be a gene involved in polyester production. When it is expressed simultaneously with ORF3, polyester polymerase activity is obtained, and simultaneous expression of ORF1 and ORF3 is essential. It was confirmed that there was.
Therefore, ORF3 was designated as the polyester synthase I gene, ORF1 as the polyester synthase II gene, and ORF2 as the 3-keto-acyl CoA reductase gene.
[0028]
The entire base sequence of the polyester polymerase I gene of the present invention is shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the polypeptide translated by this base sequence is shown in SEQ ID NO: 2, and the entire base sequence of the polyester polymerase II gene is shown in SEQ ID NO: 3. Next, the amino acid sequence of the polypeptide translated by this base sequence is SEQ ID NO: 4, the entire base sequence of the 3-keto-acyl CoA reductase gene is SEQ ID NO: 5, and then the polypeptide translated by this base sequence The amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 6.
In addition, in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 6, one or more amino acids are deleted, substituted or added, and a polyester polymerizing enzyme activity and a 3-keto-acyl CoA reductase activity are produced. All genes encoding peptides are included in the present invention.
[0029]
In order to obtain a gene encoding a polyester polymerizing enzyme in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 6, and bring about a polyester polymerizing enzyme activity Can be any method, for example, site-directed mutagenesis, a well-known technique for generating point mutations or deletion mutations in a gene; then selectively cleaving the gene and then removing or adding selected nucleotides. A method of ligating genes; an oligonucleotide mutagenesis method.
Further, the polyester synthase I gene, the polyester synthase II gene and the 3-keto-acyl CoA reductase gene of the present invention are not limited to those containing the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5, and these bases The sequence may be a base sequence in which a codon for an amino acid is replaced with another equivalent codon due to degeneracy of the genetic code. For example, in the case of a serine residue, it is encoded by 6 codons of codons TCA, TCG, TCT, TCC, AGT, or AGC. Since these are equivalent for the purpose, these codons may be replaced with other codons. Similarly, other respective amino acid residues may be replaced with other equivalent codons, and any other amino acid residue encoding the same amino acid sequence is included in the base sequence of the present invention.
[0030]
(2) Production of mutant The gene expression cassette of the present invention comprises a promoter, a gene having polyester polymerizing enzyme activity and 3-keto-acyl CoA reductase activity, such as the above-mentioned polyester polymerizing enzyme I gene, polyester polymerizing enzyme II gene and It contains one or more DNAs selected from a 3-keto-acyl CoA reductase gene and contains a terminator corresponding to the promoter, and these are linked from the 5 ′ end direction to the 3 ′ end direction. . The mutant of the present invention can be obtained by introducing this gene expression cassette into a host by the gene expression system of the present invention incorporating one or more recombinant vectors. Furthermore, expression can be regulated in the mutant.
[0031]
In the gene expression system of the present invention, when it is desired to efficiently produce polyester polymerizing enzyme and polyester, it is preferable that the polyester polymerizing enzyme I gene and the polyester polymerizing enzyme II gene can be expressed simultaneously. The polyester synthase II gene need not necessarily be present upstream of the polyester synthase I gene, and may be a single recombinant vector that allows the gene to be present on the same DNA fragment, or Two or more recombinant vectors present on different DNA fragments can be used separately and introduced into the same host.
Furthermore, when it is desired to produce a polyester polymerizing enzyme having a wide range of substrate specificities, a gene having 3-keto-acyl CoA reductase activity can be included in the above gene expression system.
[0032]
The mutant of the present invention can be obtained by transforming and transducing a recombinant vector by the gene expression system of the present invention into a host. The host is not particularly limited as long as it can express the target gene. For example, microorganisms belonging to the genus Alkagenes, microorganisms belonging to the genus Pseudomonas, microorganisms belonging to the genus Bacillus, bacteria such as Escherichia coli, Saccharomyces genus, Candida genus And yeast cells such as COS cells and CHO cells.
[0033]
When Escherichia coli or the like is used as a host, it is preferable that the recombinant DNA of the present invention is capable of autonomous replication in the host and at the same time includes a promoter, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. Examples of expression vectors include pLA2917 (ATCC 37355) having an RK2 origin of replication and pJRD215 (ATCC 37533) having an RSF1010 replication origin that are replicated and maintained in a wide range of hosts.
[0034]
Any promoter that can be expressed in the host may be used. For example, promoters derived from Escherichia coli or phages such as tac promoter, trc promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be used. Examples of methods for introducing recombinant DNA into bacteria include a method using calcium ions (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1.8.1, 1994) and an electroporation method (Current Protocols in Molecular Biology, 1 Volume, page 1.8.4, 1994).
[0035]
When yeast is used as a host, examples of expression vectors include YEp13 and YCp50. Examples of the promoter include gal 1 promoter and gal 10 promoter. Examples of methods for introducing recombinant DNA into yeast include electroporation (Methods Enzymol., 194, 182-287 (1990)) and spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929- 1933 (1978)), lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)) and the like.
[0036]
When animal cells are used as hosts, for example, pcDNAI, pcDNAI / Amp (Invitrogen) and the like are used as expression vectors. Examples of methods for introducing recombinant DNA into animal cells include the electroporation method and the calcium phosphate method.
[0037]
3. Polyester Polymerase and Production of Polyester The polyester polymerase of the present invention cultivates the bacterium or mutant of the present invention, and produces and accumulates the polyester polymerase of the present invention in the culture (cultured cells or culture supernatant), It is carried out by collecting polyester polymerizing enzyme from the culture. The method for culturing the bacterium and the mutant of the present invention is performed according to a usual method.
Furthermore, the polyester is produced by culturing the bacterium or mutant of the present invention, producing and accumulating the polyester of the present invention in the culture or cultured cells, and collecting the polyester from the cultured cells or culture. Is called. The method for culturing the bacterium and the mutant of the present invention is performed according to a usual method.
[0038]
As a medium for culturing bacteria and mutants, a complete medium or a synthetic medium, for example, LB medium, M9 medium or the like can be mentioned. Further, the polyester polymerizing enzyme and the polyester are accumulated in the cells and collected by aerobically culturing for 4 to 24 hours at a pH of 7 to 9 and a culture temperature of 30 to 37 ° C.
In addition, when Bacillus sp. INT005 strain is used, it can be cultured in the range of 30 to 45 ° C.
The carbon source of the present invention is necessary for the growth of microorganisms and serves as a raw material for polyester synthesis. Examples thereof include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose.
In addition, by using a 3-keto-acyl CoA reductase gene, a fatty acid can also be used as a raw material for polyester synthesis. Examples of fatty acids include butyric acid, hydroxybutyric acid, valeric acid, hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, and the like.
[0039]
Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, and the like.
Examples of the inorganic substance include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, magnesium chloride, ferric chloride, manganese sulfate and the like.
[0040]
The culture is usually performed at 25 to 37 ° C. for 2 hours or more after induction of expression under aerobic conditions such as shaking culture. During the culture, antibiotics such as kanamycin, ampicillin, and tetracycline may be added to the medium.
[0041]
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter, an inducer can be added to the medium. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), indoleacrylic acid (IAA), etc. can be added to the medium.
[0042]
As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, for example, RPMI-1640, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum to these mediums is used. The culture is usually performed at 30 to 37 ° C. for 1 to 7 days in the presence of 5% CO 2 . During culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium.
[0043]
Purification of the polyester polymerizing enzyme can be obtained from the culture using a collecting means after the culture is completed. For example, the cells are disrupted by an ultrasonic disruption process or the like by a conventional method, or the enzymes are extracted by lysing the cells using a lytic enzyme such as lysozyme. Then, the resulting crude enzyme is purified using various types of chromatography such as ion exchange chromatography and gel filtration.
Purification of the polyester obtained from the cells and mutants can be performed, for example, as follows. Bacteria and mutants are collected from the culture by centrifugation, washed with distilled water, and dried. Thereafter, the dried microbial cells and mutants are suspended in chloroform, and the polyester is extracted by heating. The residue is removed by filtration. Methanol is added to the chloroform solution to precipitate the polyester. The supernatant is removed by filtration or centrifugation, and then dried to obtain purified polyester.
Moreover, if (R) -3HB-CoA is added using the polyester polymerization enzyme obtained by the above-mentioned method, a polyester (poly-3-hydroxybutyrate (P3HB)) can be obtained by an enzymatic reaction.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1]
(1) Preparation of chromosomal DNA of Bacillus sp. INT 005 strain
Bacillus sp. INT 005 strain was cultured overnight at 37 ° C. in a liquid medium (using distilled water, pH 7.4) consisting of 2 ml of sterilized LB culture solution [LB Broth Base (GIBCO BRL)]. The total amount of the culture solution was put into 100 ml of LB culture solution, and cultured with shaking at 37 ° C. until the turbidity of the culture solution (absorbance at 600 nm) reached 0.7. After completion of the culture, the cells are separated from the culture by centrifugation at 7000 rpm for 10 minutes, and the cells are described in Current Protocols in Molecular Biology units 2.4. According to the method, chromosomal DNA was obtained.
[0045]
Next, 0.05 mg of this chromosomal DNA was mixed with 50 units of restriction enzyme PstI (Takara Shuzo) and mixed with 50 mM Tris-HCl buffer (containing 100 mM NaCl, 10 mM MgSO 4 , 1 mM dithiothreitol) (pH 7.5) at 37 ° C. The reaction was performed for 8 hours to complete digestion of the DNA. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to 0.7% agarose electrophoresis, and a DNA band around 8 kbp was excised. DNA contained in the gel was extracted and purified using QIAEX II Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) to obtain 1 μg of chromosomal DNA fragment.
[0046]
(2) Preparation of chromosomal DNA library of Bacillus sp. INT 005 strain using plasmid vector pUC19 and search for DNA fragment containing
[0047]
Next, 100 ng of the DNA fragment of plasmid vector pUC19 digested with PstI and 200 ng of the chromosomal DNA fragment completely digested with PstI obtained in the above item (1) were mixed, and a DNA ligation kit (Takara Shuzo) was used. DNA was ligated according to a conventional method. The recombinant plasmid DNA-containing solution thus obtained was introduced into Escherichia coli JM109 by the calcium chloride method according to the method described in Current Protocols in Molecular Biology Units 1 and 4. . The transformant was applied to LB medium and left to stand at 37 ° C. for 24 hours. The resulting 2000 colonies were divided into 20 groups of 100 clones. Plasmid DNA was extracted from each group by the method of Current Protocols in Molecular Biology Units 1 and 6. Polyester polymerase enzyme gene-specific oligo DNA was used, and the gene was partially amplified by Taq DNA polymerase (Sigma). The group in which fragment amplification occurred was further divided to obtain one transformant strain in which fragment amplification finally occurred.
[0048]
(3) Analysis of base sequence of polyester polymerase gene and search for polyester polymerase gene The transformant obtained in item (2) above is cultured, and the plasmid is transformed into Current Protocols in Molecular Biology (Current Protocols As a result of preparation by the method described in Unit 1.6, a plasmid having an inserted DNA portion of about 8.0 kilobases was obtained. This plasmid was named pNA. Digestion of plasmid pNA with various restriction enzymes produced a restriction enzyme map of the obtained inserted DNA portion. Based on the results of the analysis, pNA was digested with the restriction enzyme DraI, and the resulting DNA fragment of about 3.8 kilobases was subcloned into the plasmid vector pUC19 digested with SmaI and treated with phosphatase (pNAD38, Independent Administrative Institution Deposited with the Technical Research Institute on May 9, 2001 as deposit number FERM P-18326). Using the plasmid obtained by subcloning as a template, the base sequence of each DNA fragment was determined. The base sequence is determined using various synthetic DNAs as primers, using the Dynamic ET Terminal Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia) and the DNA sequencer (Perkin Elmer Applied Biosystems) (ABI). , Conducted according to conventional methods.
The nucleotide sequence of the subcloned inserted DNA portion was determined by the dideoxy method using various synthetic DNAs as primers.
[0049]
Analysis of the entire base sequence of a 3.8 kb DNA fragment containing the polyester polymerase gene derived from Bacillus sp. INT 005 strain revealed three open reading frames. One of them, an open reading frame (ORF3) composed of 1086 bases, is a gene encoding a polyester polymerizing enzyme derived from Bacillus megaterium (J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)) and amino acid sequence level. And an open reading frame (ORF2) composed of 744 bases is a gene encoding 3-keto-acyl CoA reductase from Bacillus megaterium (J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)) and about 72.5% homology (FASTA program) at the amino acid sequence level.
[0050]
The base sequence of ORF3 derived from the obtained Bacillus sp. INT 005 strain is SEQ ID NO: 1, the primary amino acid sequence of the polypeptide translated from the base sequence is SEQ ID NO: 2, the base sequence of
[0051]
[Outside 3]
On this restriction map, ORF3 is present in the direction from left to right between about 1.6 and 2.7 kbp.
Escherichia coli JM109 was transformed with the plasmid pNAD38, and transformants were obtained using ampicillin resistance as an indicator. pNAD38 has ORF1-3 in the forward direction with the lac promoter on the vector, and can induce the expression of ORF1-3 by adding isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG) to the culture medium it can. Escherichia coli JM109 (pNAD38) obtained by transformation was cultured with shaking (37 ° C.) in 5 ml of LB culture solution until the absorbance at 600 nm of the culture solution reached 0.6 (initial logarithmic growth phase). At this point, IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 0.2 mM, and shaking culture was continued for another 3 hours. After incubation, the cells are collected by centrifugation, washed with 1 ml of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), suspended in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 5% glycerol, and subjected to ultrasound. The cells were crushed by crushing. The cell disruption solution was centrifuged, and the supernatant was used as a crude extract containing a polyester polymerizing enzyme. This crude extract was added to a 1/10 volume of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mM (R) -3HB-CoA to obtain a polyester polymerization enzyme activity measurement reaction solution. This reaction solution was kept at 30 ° C., sampled at regular intervals, and the reaction was stopped by adding twice the amount of 5% TCA to the sample, followed by centrifugation to precipitate the denatured protein. To the supernatant after centrifugation, 500 mM phosphate buffer and DTNB (color developing solution) were added and incubated at 30 ° C. for 10 minutes. The amount of reaction was quantified from the change in absorbance using the fact that CoA and DTNB liberated with the polymerization reaction of polyester react to exhibit absorption at 412 nm. The results of the polyester polymerization activity test are shown in FIG. The absorbance hardly changed in the reaction solution to which the E. coli extract containing only vector DNA (pUC19) was added, whereas the absorbance increased with time in the reaction solution to which the E. coli extract containing pNAD38 was added.
[0053]
Next, in order to confirm the activity of the polypeptide encoded by ORF, ORF1 and ORF1-2 were incorporated into vector DNA [pSTV28 (Takara Shuzo)] and ORF3 was incorporated into vector DNA [pQE30 (Qiagen)]. This plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the following 6 strains were prepared (JM109 (pSTV28, pQE30), JM109 (pSTV-ORF1, pQE30), JM109 (pSTV-ORF1, 2, pQE30), JM109 (pSTV28, pQE) -ORF3), JM109 (pSTV-ORF1, pQE-ORF3), JM109 (pSTV-ORF1, 2, pQE-ORF3)). Similarly, a crude enzyme solution was prepared, and the polyester polymerization enzyme activity was measured (FIG. 2). From these results, it was confirmed that the expression of ORF1 and 3 is essential for polyester polymerase activity.
[0054]
A crude enzyme solution was similarly prepared using JM109 (pSTV28), JM109 (pSTV-ORF1), and JM109 (pSTV-ORF1 · 2). The crude extract was added to a 125 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.125 mM, NADPH, and 0.025 mM acetoacetyl in an amount of 1/80 to obtain a 3-keto-acyl CoA reductase activity measurement reaction solution. This reaction solution was kept at 30 ° C., and the change in absorbance at 340 nm (NADPH absorption) was measured (FIG. 3). As a result, it was found that ORF2 encodes 3-keto-acyl CoA reductase.
[0055]
A crude enzyme solution was prepared in the same manner using JM109 (pSTV-ORF1, pQE-ORF3). This crude extract was added to a 1/10 volume of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mM (R) -3HB-CoA to obtain a polyester polymerization enzyme activity measurement reaction solution. This reaction solution was kept warm at 25, 30, 37, 40, 42, 45, and 50 ° C. and sampled at regular intervals. As a result, it was found that the compound had the highest activity at a relatively high temperature of 45 ° C. (FIG. 4).
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, a polyester polymerizing enzyme-related gene having a wide range of substrate properties and stability, a gene expression cassette containing the gene, a mutant containing the gene expression cassette, a method for producing a polyester polymerizing enzyme, and a method for producing a polyester are provided. Can do. In addition, the polyester and the mutant of the present invention can efficiently produce a polyester polymerization enzyme having stable and wide substrate characteristics, and the polyester can be efficiently synthesized using the enzyme.
[Brief description of the drawings]
[Fig. 1] Time-dependent change of polymerization reaction of (R) -3HB-CoA by crude extract of E. coli expressing ORF1, 2, 3 using pNAD38 (quantification of CoA released by the progress of reaction using DTNB reagent) Show.
[Fig. 2] Time course of polymerization reaction of (R) -3HB-CoA by crude extract of Escherichia coli expressing ORF1, 2, 3 in various combinations (quantification of CoA released by the progress of reaction using DTNB reagent) Show.
FIG. 3 shows the time course of the 3-keto-acyl CoA reduction reaction by the crude extract of E. coli expressing ORF1 and ORF1,2 (the amount of NADPH that decreases with the progress of the reaction is determined by the change in absorbance at 340 nm).
FIG. 4 shows the optimum temperature for the polymerization reaction of (R) -3HB-CoA by the crude extract of E. coli expressing ORF1 · 3 (expressed as relative activity with the activity at 30 ° C. as 100).
[Sequence Listing]
Claims (19)
【外１】
[Outside 1]
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む４０℃以上でポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。Polyester synthase I gene encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) Polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) Polyester polymerizing enzyme at 40 ° C. or higher containing an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in amino acid sequence (a) A polypeptide having activity.
（ａ）配列番号１に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。Polyester synthase I gene comprising the following base sequence (a) or (b):
(A) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) a base sequence encoding the same amino acid sequence, although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code.
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む４０℃以上でポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。Polyester synthase II gene encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) Polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) Polyester polymerizing enzyme at 40 ° C. or higher containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in amino acid sequence (a) A polypeptide having activity.
（ａ）配列番号３に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。Polyester synthase II gene comprising the following base sequence (a) or (b):
(A) The base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (b) A base sequence encoding the same amino acid sequence, although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code.
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシル CoA リダクターゼ活性もたらすポリペプチド。 A 3-keto-acyl CoA encoding the polyester synthase I gene according to claim 3 or 4, the polyester synthase II gene according to claim 5 or 6, and the following polypeptide (a) or (b) : A gene expression cassette comprising one or more genes selected from the group consisting of reductase genes:
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
(B) A polypeptide that causes 3-keto-acyl CoA reductase activity , comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence (a) .
（ａ）配列番号５に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸 配列をコードする塩基配列。 A 3-keto-acyl CoA reductase comprising the polyester synthase I gene according to claim 3 or 4 , the polyester synthase II gene according to claim 5 or 6 , and the following base sequence (a) or (b): A gene expression cassette comprising one or more genes selected from the group consisting of genes:
(A) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5
(B) A base sequence encoding the same amino acid sequence , although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code .
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシル CoA リダクターゼ活性もたらすポリペプチド。 The gene expression system according to claim 9 , further comprising a 3-keto-acyl CoA reductase gene encoding the following polypeptide (a) or (b) :
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
(B) A polypeptide that causes 3-keto-acyl CoA reductase activity , comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence (a) .
（ａ）配列番号５に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。 Furthermore, the gene expression system of Claim 9 containing the 3-keto-acyl CoA reductase gene containing the base sequence of the following (a) or (b) :
(A) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5
(B) A base sequence encoding the same amino acid sequence, although the codon sequence is different from the base sequence of (a) due to the degeneracy of the genetic code.
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む４０℃以上でポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。The following (a) or (b) polypeptide:
(A) Polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) Polyester polymerizing enzyme at 40 ° C. or higher containing an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in amino acid sequence (a) A polypeptide having activity.
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む４０℃以上でポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。The following (a) or (b) polypeptide:
(A) Polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) Polyester polymerizing enzyme at 40 ° C. or higher containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in amino acid sequence (a) A polypeptide having activity.
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