JP3890359B2 - Cytochrome P450nor gene - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＮＯ還元酵素遺伝子に関し、詳細にはチトクローム（Cytochrome）Ｐ４５０ｎｏｒ遺伝子に関するものである。更に詳細には、本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅより新規に単離したチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子を用いて、チトクロームＰ４５０ｎｏｒを大量に生産させ、ＮＯの測定や生体内からのＮＯの除去など様々な産業分野に利用することを可能とするものである。
【０００２】
【従来の技術】
チトクロームＰ４５０とは、ヘムタンパクであるチトクローム類中でも、一酸化炭素との複合体を形成した時、特に４５０ｎｍ付近に吸収を持つ着色性蛋白の総称である。これらのタンパクはバクテリアから酵母、植物、動物にわたって広く分布することが判明している。これらのチトクロームＰ４５０分子種は、主に脂溶性物質に酸素を１原子付加するモノオキシゲナーゼ反応を触媒し、（１）外来性異物の代謝や（２）内在性２次代謝産物の生合成・代謝に関与し、生物のバイオレギュレーターとして非常に注目されている。特に異物代謝能力については、生体防御機構と密接な関係があり、医薬、農薬分野での標的酵素として研究が進められている。
【０００３】
これらのチトクロームＰ４５０類の中で、チトクロームＰ４５０ｎｏｒは生体内の有毒分子であるＮＯを還元して、無毒な笑気ガス（Ｎ2Ｏ）に変換する酵素である。ＮＯは、生体内での様々なラジカル反応を触媒するため、チトクローム酸化酵素を阻害してＡＴＰ合成を阻害したり、神経細胞に傷害を与え虚血傷害を発症させることが指摘されている。一般的にチトクロームＰ４５０は微生物から高等生物にまで広く分布し、生物に普遍的な生体防御システムであると考えられているが、このチトクロームＰ４５０ｎｏｒはこのＮＯを無毒化するＮＯスカベンジャーとして機能していると推定される。
【０００４】
このように、チトクロームＰ４５０ｎｏｒはＮＯを特異的に還元する能力を有するため、ＮＯの定量や生体内のＮＯ除去スカベンジャーとしての利用が期待できる。しかしながら、細胞内でのチトクロームＰ４５０ｎｏｒ生産量は極めて微量で、産業用酵素として利用することはできない。またFusariumなどの微生物からチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子が単離されているが、この遺伝子を高生産する技術が開発されておらず、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ蛋白の産業利用については全く検討されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、ＮＯの定量をはじめ様々な産業に利用可能なチトクロームＰ４５０ｎｏｒを、効率よく生産させることである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、チトクロームＰ４５０ｎｏｒを製造するには遺伝子工学的手法によるのが好適であるとの観点にたった。
そして、本発明者らは、鋭意研究の結果、チトクロームＰ４５０ｎｏｒをコードする遺伝子の取得、及びその塩基配列の決定に成功し、さらに該遺伝子を含有した形質転換体の作成、該遺伝子の発現（しかも真核生物による高発現）、該形質転換体の培養によるチトクロームＰ４５０ｎｏｒ又はチトクロームＰ４５０ｎｏｒ活性を有するタンパク質の製造（しかも大量製造）、そしてこの酵素（又は酵素活性を有するタンパク質）の利用、例えばＮＯの測定等を現実に確認するのに成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００７】
チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子をクローニングするため、ＤＰＹ培地を用いた液体培養を行ったＡ．ｏｒｙｚａｅの菌体よりｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライブラリーを構築する。このライブラリーの塩基配列を網羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データーベースとのホモロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンからＦｕｓａｒｉｕｍのチトクロームＰ４５０ｎｏｒと高いホモロジーを示すクローンを検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅのチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子を単離するのに成功した。
【０００８】
このようにして単離するのに成功した遺伝子は、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子であって、本発明に係る本遺伝子は、チトクロームＰ４５０ｎｏｒをコードする遺伝子、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指すものである（以下、単に、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子ということもある）。本発明において、このようにして単離したチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ又はチトクロームＰ４５０ｎｏｒ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ酵素活性を有するタンパク質にはチトクロームＰ４５０ｎｏｒも包含されるものである。
【０００９】
宿主としては、各種微生物が適宜使用可能であるが、本発明においては真核生物を利用することが可能であって、目的酵素を効率よく大量に生産できるという特徴を有する。真核生物、例えば麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的発酵産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用なタンパク質を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419（1988）、特開昭６２−２７２９８８）。本発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白生産においては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特にＡ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量のタンパク質が生産されることを見いだした（特願平１１−１５４２７１、特願２０００−３６７５４）。本発明は、この系を利用することによって、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子を麹菌で効率的に発現せしめ、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子を大量生産することにはじめて成功したものである。
【００１０】
上記により単離したチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子は、単独で、あるいは麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ遺伝子：Biochem. Biophys.Acta., 1261(1）、p.151, 1995）のプロモーターや固体培養において特異的に大量発現する麹菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のプロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、高純度な目的蛋白を大量に生産させるものである。
【００１１】
遺伝子導入方法としては、常法が適宜利用されるが、例えば宿主としては、ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ １０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）を用いる公知方法により、目的遺伝子であるチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子と形質転換用マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子（S.UnkleらMol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）を同時に導入する。この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。そしてこの形質転換体を培養することにより、目的蛋白を菌体内又は菌体外に大量に分泌させることができる。
【００１２】
このように本発明によれば、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子をＡ．ｏｒｙｚａｅから単離するのに成功し、目的蛋白をＡ．ｏｒｙｚａｅによって大量に生産させることに成功したものである。そのうえ更に、該異種遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混入しない方法を採用することにより、セルフクローニング株となり、組換え微生物の規制からも除外されるという著効が奏される。
以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００１３】
チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のホモログのｃＤＮＡをプローブとして、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーより、染色体のチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子を含むポジティブクローンを選択した。得られたポジティブクローンをテンペレートとして、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のコーディング領域、ブロモーター領域、ターミネーター領域を含む全長約４．５ｋｂについてその全塩基配列を決定した（その塩基配列を配列番号３に示す）。その結果、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子は７つのイントロンに切断された８つのエキソンとして存在していることが明らかとなった。また遺伝子から推定されるタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示すように、４０８残基であり、Ｆｕｓｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのチトクロームＰ４５０ｎｏｒとのホモロジーはアミノ酸レベルで６０％であった。また本遺伝子のプロモーター領域には、−７８ｂｐにＴＡＴＡＡ−ｂｏｘとそれに引き続くＣＴ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎの真核生物プロモーターに特徴的な配列が存在していた。
【００１４】
次に、この遺伝子のコーディング領域を、Ａ．ｏｒｙｚａｅでの高発現プロモーターであるｍｅ１Ｏプロモーター下流に連結し、チトクロームＰ４５０ｎｏｒの麹菌での高生産を検討した。Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子発現ベクターにチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のコーディング領域（ＡＴＧ下流１．６ｋｂ）を連結したプラスミドベクターを作成し（図９）、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株に導入した。その結果、ｍｅ１Ｏプロモーター制御下において発現したチトクロームＰ４５０ｎｏｒが麹菌体内に大量に生産された。この酵素蛋白を精製し、ＮＯに対する反応を検討した結果、ＮＯを還元し笑気ガスを生成する活性が検出できた。また本酵素は硝酸やチオ硫酸には全く反応せず、ＮＯを特異的に還元する酵素であることが確認できた。
【００１５】
このようにして新たに開発するのに成功したチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子（配列番号３）について更に研究を続け、その過程において、本遺伝子はコーディング領域の読み方が２通りあることを発見した。その読み枠（オープンリーディングフレーム：ＯＲＦ）のひとつは、上記した配列番号３の２１０１の位置から３７４７の位置までの１６４７ｂｐであり、もうひとつは、上記した読み方の他に、更にその開始コドンよりも５２ｂｐ上流（配列番号３の２０４８の位置のＡＴＧ）に開始コドンがあることを新たに発見したものに係り、配列番号３の２０４８の位置から３７４７の位置までの１６９９ｂｐであることも新たに発見した。
【００１６】
そして更に研究をすすめ、上記した新規ＯＲＦ（構造遺伝子）に着目しただけでなく、プロモーター部分についても詳細な検討を加えた結果、上記した配列番号３に示したプロモーター部分（１の位置から２１００の位置までの２１００ｂｐ）には別の遺伝子が存在していることを発見し、これを排除して（１の位置から７４８の位置までを排除して）、７４９の位置から２０４８の位置までの１３００ｂｐを新たなプロモーターとして構築した。
【００１７】
Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子発現ベクターにチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のコーディング領域（ＡＴＧ下流１．７ｋｂ）を連結したプラスミドベクターを作成し（図１８）、大腸菌に導入した。すなわち、発現ベクターｐＩＮ９３に、ｍｅｌＯプロモーター（１１７３ｂｐ）と上記Ｐ４５０ｎｏｒ遺伝子のＯＲＦ（１６９９ｂｐ）とを結合したＤＮＡ断片（２８７２ｂｐ：ストップコドンＴＧＡを含む）を連結して、プラスミドベクターｐｎｍｅｌＯ：：Ｐ４５０−２（１１．５ｋｂｐ）を作成した。このプラスミドベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｍ−ＣＹＰ５５Ａ５と命名し、これを、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８６５５）として寄託した。
【００１８】
得られた形質転換体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８６５５）を培養してＤＮＡを増幅し、その塩基配列を読んだ。一方、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３：ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）から予じめ２種類の新規ｍ−ＲＮＡを得たので、これらと対比した結果、その一つから予想されるタンパク質の配列は配列番号１に相当し、他のひとつが今回新たに開発するのに成功した新規タンパク質の配列に相当することを発見した。さらに、イントロンの同定にも成功して、既述した配列番号１とはアミノ酸残基が２残基異なる新規タンパク質の配列の決定にも成功した。（配列番号２）
【００１９】
すなわち、この新規チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子は、そのプロモーター領域を約１３００ｂｐに短縮するとともに、コーディング領域の開始部分において配列番号３と相違する点を特徴のひとつとするものである。
【００２０】
そして、この新規チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子の全塩基配列の決定を行い、プロモーター部分（１の位置（ＧＧＧ）から１３００の位置（ＡＣＡ）までの１３００ｂｐ）、コーディング領域（１３０１の位置（ＡＴＧ：開始コドン）から２９９９の位置（ＴＧＡ：終止コドン）までの１６９９ｂｐ）、ターミネーター部分（３０００の位置（ＧＡＴ）から３７８５の位置（ＧＣＴ）までの７８６ｂｐ）をあわせて３７８５ｂｐの塩基配列を決定した（配列番号４：図１４、図１５、図１６、図１７）。
【００２１】
既述したように、別途新たに発見した麹菌由来の本酵素のｍ−ＲＮＡの情報をもとに、両者の配列を比較した結果、上記した新規チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子には８つのイントロン、９つのエキソンが存在し、塩基配列から推定されるタンパク質は４０８残基（４５．７ｋＤａ）であることが明らかとなった（配列番号２：図１２、図１３）。アミノ酸配列は、もう一方の遺伝子（配列番号３）から推定されるアミノ酸配列（配列番号１）とほとんど変らず、Ｍｅｔの次の２つのアミノ酸が変化しているだけであり、該酵素としての作用を有するものである。
【００２２】
これらの関係は、図１９から更に明らかである。すなわち、今回新たに開発した遺伝子（配列番号４）は、もう一方の遺伝子（配列番号３）の開始コドン（図１９：配列番号４の１３５３位置のＡＴＧ）よりも５２ｂｐ上流（図１９：配列番号４の１３０１位置のＡＴＧ）に開始コドンがあることを見出したものである。そして、翻訳にあたり、もう一方の遺伝子（配列番号３：旧配列として図１９において下段に指示）は、１３５３位置のＡＴＧから読みはじめて、アミノ酸配列はＭｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ・・・となる。
【００２３】
これに対して、今回開発したプロモーターが短縮された遺伝子（配列番号４：新配列として図１９において上段に指示）は、１３０１位置のＡＴＧから読みはじめるが、１３１１位置のＧＴから１３６２位置のＡＧまでの配列はスプライシングを受け、１３１０位置のＧと１３６３位置のＡＡが結合してＧｌｕに翻訳される。したがって、この遺伝子（配列番号４）においては、アミノ酸配列はＭｅｔ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ・・・となり、旧配列のアミノ酸とは第２、３番目のアミノ酸が相違しているが、両者ともに、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ酵素活性を有している。
【００２４】
このチトクロームＰ４５０ｎｏｒは、ＮＯを還元して笑気ガスを生成する反応を触媒する酵素であって、モノオキシゲナーゼではなく、ＮＯをＮ2Ｏに還元するレダクターゼであり、この性質を利用して、例えば電子供与体として、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は同リン酸（ＮＡＤＰＨ）の酵素反応による減少を３４０ｎｍでの吸光度の減少でモニタリングし、その測定値を利用してＮＯの分析を行うことができる（下記反応式）。
【００２５】
２ＮＯ ＋ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ＋ Ｈ+
→ Ｎ2Ｏ ＋ ＮＡＤ（Ｐ）+＋ Ｈ2Ｏ
【００２６】
また、分析試料を本酵素で処理し、生成したＮ2Ｏをガスクロマトグラフィー（以下ＧＬＣと記す）分析等により直接測定し、もってＮＯの分析を行うこともできる。具体的には、例えば、本酵素溶液０．５ｍｌ、５０ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．５ｍｌ、０．１Ｍ カリウム−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．２）４ｍｌ（合計５ｍｌ）に、分析試料液０．５ｍｌを加えて３０℃で反応を開始し、０．５ｍｌのサンプル液を採取して、これをＧＬＣ分析（検出：ＴＣＤ、カラム：ＰｏｒａｐａｃｋＱ（３ｍｍ×２ｍ）、キャリアガス：Ｈｅ）によりＮ2Ｏを測定し、もって分析試料中のＮＯの分析を行うことができる。
【００２７】
更にまた、例えば、本酵素溶液２０μｌ、１６ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ １０μｌ、分析試料１０μｌ、１Ｍ ナトリウム−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに蒸留水を加えて全量を１０００μｌとし、これを３７℃でインキュベートして酵素反応を行わせ、ＮＯ量に伴うＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費量を３４０ｎｍの吸光度で測定し、ＮＯの分析を行うこともできる。一般のＮＯ測定では、ＮＯを直接定量することは困難で、その分解物である硝酸の測定値からＮＯを間接的に定量している。またＮＯを直接測定する方法も開発されているが、そのためには電子スピン測定装置などの、高価な分析機器が必要である。しかし、このチトクロームＰ４５０ｎｏｒを用いたＮＯ測定は、ＮＯ量を直接測定することができ、かつ分析操作も簡便で分析に必要な試薬や機器なども安価なもので対応が可能である。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量から測定するため測定感度も高く、さらに蛍光法などを利用することにより高感度化も期待できる。
【００２８】
このように、本発明によって生産された酵素タンパク質は、各種のＮＯアッセイ系に広く利用することができ、迅速、的確なＮＯアッセイが可能となる。そしてその際、本酵素タンパク質のほかに、ＮＯアッセイに必要な各種試薬（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、緩衝液、蒸留水等）をひとつのキットにして組み立てておくと、ＮＯアッセイが更に効率的に行われる。
【００２９】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片には、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ蛋白を高生産させることが可能であり、生産されたタンパク質はＮＯの定量の他様々な産業分野で応用が可能であることを確認した。
【００３０】
ＮＯは、生体内の含有量だけでなく、大気、土壌など広く環境中の含有量に注意を払わねばならない。このチトクロームＰ４５０ｎｏｒを用いるＮＯ定量法は、臨床検査や組織細胞の研究などの生体内のＮＯ濃度測定から、大気中、土壌中などの環境中のＮＯ濃度の測定へも応用が可能である。さらにこの蛋白が持つＮＯに選択的な分解能力は、ＮＯにより傷害を受けた細胞の修復などの医薬への利用も期待できる。
以下、実施例について述べる。
【００３１】
【実施例１】
チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のクローニング
液体培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラリー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子に相同性の高いクローンＡＣ２４５６を選択した。ラムダＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託 ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の染色体ジーンライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子をクローニングした。ＥＳＴ配列を元にプローブを作成するため、以下に記載する配列のヌクレオチドプライマーを２種類合成した。ついでアスペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株のゲノムをテンペレートとして常法に従ってＰＣＲを行い、反応生成物をランダムプライムラベリング法により蛍光標識してプローブとした。
【００３２】
上記２種類のオリゴＤＮＡプライマーの内、一方は、センスプライマーであって、その塩基配列は配列番号５（図６）に示され、他方は、アンチセンスプライマーであって、その塩基配列は配列番号６（図７）に示される。
【００３３】
この方法によって、約３０００個のファージクローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズするクローンλＣＹ１２を単離した。上記のオリゴＤＮＡをプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定し、本クローンが確かに目的のチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子であることを確認した。
【００３４】
【実施例２】
チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子の塩基配列の決定
ポジティブクローンλＣＹ１２株をテンペレートとしてチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子の全塩基配列の決定を行った。プロモーター部分（２１００ｂｐ）、コーディング領域（１６４７ｂｐ）、ターミネーター部分（７８６ｂｐ）をあわせて４５３３ｂの塩基配列を決定した（配列番号３：図３、図４、図５）。上記配列の内、１位置（ＴＧＧ）から２１００位置（ＡＡＣ）までがプロモーター部分（７４９位置（ＧＧＧ）から２１００位置までのプロモーターの中核をなす部分（１３５２ｂｐ）を含む）であり、２１０１位置（ＡＴＧ）から３７４７位置（ＴＧＡ）までがコーディング領域であり、３７４８位置（ＧＡＴ）から４５３３の位置（ＧＣＴ）までがターミネーター部分である。
【００３５】
ＥＳＴ情報を元にｃＤＮＡ配列を決定した。後にゲノムＤＮＡ配列を決定し、両者を比較した結果から、麹菌のチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子には７つのイントロンが存在し、塩基配列から推定されるタンパク質は４０８残基（４５．７ｋＤａ）であることが明らかとなった。（配列番号１：図１、図２）。
【００３６】
既にクローニングされているＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子、Ｃｙｌｉｄｒｏｃａｒｏｎ ｔｏｎｋｉｎｅｓｅチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子Ａ２、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子Ａ３と、麹菌のチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子とその遺伝構造を比較した結果、イントロンの数およびその挿入位置は極めて厳密に保存されていた。またチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子の解析から明らかとなっているヘム配位因子のシステイン近傍、コファクターであるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合領域近傍は非常に高い相同性を示した。
【００３７】
【実施例３】
チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子の麹菌への導入
得られたチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のなかのコーディング領域を麹菌の高発現プロモーターであるｍｅ１Ｏプロモーター下流に連結した。ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を配列番号７（図８）に示す。更に、この融合遺伝子を麹菌発現ベクターであるｐＩＮ９３に連結し、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ発現用プラスミドｐｎｍｅｌＯ：：Ｐ４５０を構築した（図９）。このプラスミドｐｎｍｅｌＯ：：Ｐ４５０を、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託 ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）に常法にしたがい導入した。硝酸資化能が回復した株を遺伝子導入として選択した。このようにして得た形質転換体をアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＭＥＬ−Ｐ４５０ｎｏｒと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７９４２として寄託した。
【００３８】
この遺伝子導入株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９４２）を、ＤＰＹ培地にて液体培養を行い、菌体内のチトクロームＰ４５０ｎｏｒ活性を測定した。チトクロームＰ４５０ｎｏｒ活性の測定は城らの方法（Shiro, Y., et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 1617-1623)に従い行った。その結果、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子を導入した形質転換体は、菌体内に非常に高いチトクロームＰ４５０ｎｏｒ活性が認められた。この結果、単離したチトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子には、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。
【００３９】
【実施例４】
組み換えチトクロームＰ４５０ｎｏｒの大量生産
実施例３で作成した、チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子導入株を培養し、組換えチトクロームＰ４５０ｎｏｒの大量生産を試みた。３ＬのＣｚ−Ｄｏｘ培地で、３０℃で７日間培養した菌体を遠心分離などで集菌して、液体窒素下でパウダー状になるまですりつぶした。この破砕した菌体に、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加え、よく混合した後、遠心分離によって固形分を除去した。
【００４０】
このようにして得られた菌体抽出液を、５０ｍＭのリン酸バッファーで透析し、低分子画分を除いたのち、これをチトクロームＰ４５０ｎｏｒ粗酵素液とした。また補酵素としては、ＮＡＤＰＨよりＮＡＤＨを使用した方が、高い活性が得られた（図１０）。
【００４１】
【実施例５】
組み換えチトクロームＰ４５０ｎｏｒによるＮＯ量の測定
実施例４で調製した組換え酵素を用いて、ＮＯ濃度の定量を検討した。まずＮＯ発生剤であるＮＯＣ５（中性又は酸性条件下でＮＯを発生するＮＯドナー：同仁化学社製）を、ＮＡＤＨ及び緩衝液の存在下、種々濃度を変えて酵素液に添加し、ＮＡＤＨの消費に伴う３４０ｎｍの吸収の減少量を測定した。図１１に示すように添加するＮＯＣ５量が増加させるに従い、ＮＡＤＨの消費速度が上昇し、本酵素によりＮＯ濃度が測定できることが確認された。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、麹菌のチトクロームＰ４５０ｎｏｒを大量に生産することが可能となり、溶液中のＮＯ量の定量、生体内でのＮＯスカベンジャー、脱窒による窒素成分の気化など様々な産業分野に利用することを可能にするものである。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素蛋白質は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
本発明によって２種類の新規チトクロームＰ４５０ｎｏｒタンパク質をコードする遺伝子（プロモーターが長いタイプ及びそれを短縮したタイプの遺伝子）が開発され、該タンパク質の大量生産が可能となった。しかも、これらの遺伝子を導入した形質転換体は、いずれも、特許生物寄託センター、生命研（現、特許生物寄託センター）に寄託されており、入手可能である。
【００４３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】チトクロームＰ４５０ｎｏｒの一方のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子の一方の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】センスプライマーを示す。
【図７】アンチセンスプライマーを示す。
【図８】ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を示す。
【図９】チトクロームＰ４５０ｎｏｒ発現プラスミドｐｎｍｅｌＯ：：Ｐ４５０の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図１０】Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｐ４５０ｎｏｒのＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ選択性を示す。
【図１１】基質濃度変化への対応を示す。
【図１２】チトクロームＰ４５０ｎｏｒのもう一方のアミノ酸配列を示す。
【図１３】同上続きを示す。
【図１４】チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のもう一方の塩基配列を示す。
【図１５】同上続きを示す。
【図１６】同上続きを示す。
【図１７】同上続きを示す。
【図１８】チトクロームＰ４５０ｎｏｒ発現プラスミドｐｎｍｅｌＯ：：Ｐ４５０−２の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図１９】チトクロームＰ４５０ｎｏｒ遺伝子のＡＴＧ付近の構造を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a NO reductase gene, and in particular, to a cytochrome P450nor gene. More specifically, the present invention uses a cytochrome P450nor gene newly isolated from Aspergillus oryzae to produce a large amount of cytochrome P450nor and uses it in various industrial fields such as NO measurement and removal of NO from the living body. It is possible to do.
[0002]
[Prior art]
Cytochrome P450 is a generic name for coloring proteins having absorption in the vicinity of 450 nm when a complex with carbon monoxide is formed among cytochromes which are heme proteins. These proteins have been found to be widely distributed from bacteria to yeast, plants and animals. These cytochrome P450 molecular species mainly catalyze the monooxygenase reaction that adds one atom of oxygen to fat-soluble substances, and (1) metabolism of foreign substances and (2) biosynthesis and metabolism of endogenous secondary metabolites. Has been attracting much attention as a biological bioregulator. In particular, the ability to metabolize foreign substances has a close relationship with biological defense mechanisms and is being studied as a target enzyme in the fields of medicine and agricultural chemicals.
[0003]
Among these cytochrome P450s, cytochrome P450nor reduces NO, which is a toxic molecule in the living body, and produces non-toxic laughing gas (N2It is an enzyme that converts to O). Since NO catalyzes various radical reactions in the living body, it has been pointed out that it inhibits cytochrome oxidase to inhibit ATP synthesis or damage nerve cells to cause ischemic injury. In general, cytochrome P450 is widely distributed from microorganisms to higher organisms and is considered to be a universal defense system for organisms, but this cytochrome P450nor functions as a NO scavenger that detoxifies this NO. It is estimated to be.
[0004]
Thus, since cytochrome P450nor has the ability to specifically reduce NO, it can be expected to be used as a NO quantification or in vivo NO removal scavenger. However, the amount of cytochrome P450nor produced in the cell is extremely small and cannot be used as an industrial enzyme. Moreover, although the cytochrome P450nor gene has been isolated from microorganisms such as Fusarium, a technique for producing this gene at a high level has not been developed, and industrial use of the cytochrome P450nor protein has not been studied at all.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the inventor is to efficiently produce cytochrome P450nor that can be used in various industries including the determination of NO.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made to achieve the above object, and was based on the viewpoint that genetic engineering techniques are suitable for producing cytochrome P450nor.
As a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in obtaining a gene encoding cytochrome P450nor and determining its base sequence, creating a transformant containing the gene, and expressing the gene (and High expression by eukaryotes), production of cytochrome P450nor or protein having cytochrome P450nor activity by culturing the transformant (and mass production), and use of this enzyme (or protein having enzyme activity), for example, measurement of NO The present invention has been successfully confirmed, and the present invention has been completed.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0007]
In order to clone the cytochrome P450nor gene, liquid culture using DPY medium was performed. mRNA is prepared from oryzae cells and a cDNA library synthesized from this mRNA is constructed. The base sequence of this library is comprehensively determined, and the homology between each sequence and a known gene database is searched. Clones showing high homology with Fusarium cytochrome P450nor were searched from these cDNA clones. The oryzae cytochrome P450nor gene was successfully isolated.
[0008]
The gene successfully isolated in this way is a cytochrome P450nor gene, and the present gene according to the present invention includes a gene encoding cytochrome P450nor, a gene encoding a protein having cytochrome P450nor enzyme activity, It refers to at least one selected from genes containing at least one of the genes (hereinafter sometimes simply referred to as cytochrome P450nor gene). In the present invention, the cytochrome P450nor gene isolated as described above is introduced into a host and expressed, thereby producing a protein having cytochrome P450nor or cytochrome P450nor enzyme activity. In the present invention, the protein having cytochrome P450nor enzyme activity includes cytochrome P450nor.
[0009]
As the host, various microorganisms can be used as appropriate. In the present invention, eukaryotes can be used, and the target enzyme can be efficiently produced in large quantities. Eukaryotes such as Neisseria gonorrhoeae oryzae is a filamentous fungus that has been used in traditional Japanese fermentation industries such as sake, soy sauce, and miso. The feature of this strain is that it produces a very large amount of protein useful in the fermentation industry. Due to the high protein production ability of this strain and the safety as a brewing microorganism, it has been attracting attention as a host for heterologous protein production (Biotechnology, 6, 1419 (1988), JP-A-62-272988). From our study, A.I. In the production of heterologous proteins using oryzae, it was confirmed that the production ability of a gene of a near species such as Aspergillus was further increased. In particular A. oryzae gene It was found that a very large amount of protein was produced when expressed under the control of an oryzae high expression promoter (Japanese Patent Application No. 11-154271, Japanese Patent Application No. 2000-36754). The present invention is the first to succeed in mass-producing cytochrome P450nor gene by efficiently expressing cytochrome P450nor gene in Aspergillus by using this system.
[0010]
The cytochrome P450nor gene isolated as described above alone or in large quantities specifically in the promoter or solid culture of the gonococcal tyrosinase gene (melO gene: Biochem. Biophys. Acta., 1261 (1), p.151, 1995). Along with a high expression promoter such as the promoter of the glucoamylase gene (glaB) derived from Aspergillus oryzae (Japanese Patent Application Nos. 11-154271 and 11-243965), A. It is expressed in oryzae to produce a high-purity target protein in large quantities.
[0011]
As a gene introduction method, a conventional method is appropriately used. For example, as a host, an niaD mutant strain (Negative mutant capable of assimilating nitrate: a nitrate reductase-deficient strain, such as Aspergillus oryzae 1013-niaD (FERM P-17707) The cytochrome P450nor gene that is the target gene and the niaD gene that is the marker gene for transformation (S. Unkle et al., Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989) are introduced simultaneously by a known method using the above. When this gene is introduced, a heterologous gene, such as a vector sequence, is excluded to obtain a transformant of a self-cloning strain that does not contain any heterologous gene. A large amount of protein can be secreted inside or outside the cell.
[0012]
Thus, according to the present invention, the cytochrome P450nor gene is expressed as A. was successfully isolated from oryzae and the target protein was isolated from A. oryzae. It has been successfully produced in large quantities by oryzae. Furthermore, when the heterologous gene is introduced, A. By adopting a method in which heterologous DNA other than oryzae is not mixed, a self-cloning strain is obtained, and a remarkable effect is obtained that it is excluded from the regulation of recombinant microorganisms.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
[0013]
Using the cDNA of the homologue of cytochrome P450nor gene as a probe, Positive clones containing the chromosomal cytochrome P450nor gene were selected from the oryzae EMBL3 phage library. Using the obtained positive clone as a template, the entire base sequence was determined for a total length of about 4.5 kb including the coding region of the cytochrome P450nor gene, the blower region, and the terminator region (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 3). As a result, it was revealed that the cytochrome P450nor gene exists as 8 exons cleaved into 7 introns. The amino acid sequence of the protein deduced from the gene was 408 residues as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the homology of Fusium oxysporum with cytochrome P450nor was 60% at the amino acid level. In the promoter region of this gene, a characteristic sequence of a eukaryotic promoter of TATAA-box and subsequent CT-rich region was present at -78 bp.
[0014]
The coding region of this gene is It was ligated downstream of the me1O promoter, which is a high-expression promoter in oryzae, and high production of cytochrome P450nor in Aspergillus was examined. A. A plasmid vector was prepared by linking the cytochrome P450nor gene coding region (1.6 kb downstream of ATG) to the oryzae gene expression vector (FIG. 9). It was introduced into the niaD mutant of oryzae. As a result, a large amount of cytochrome P450nor expressed under the control of the me1O promoter was produced in the rods. As a result of purifying this enzyme protein and examining the reaction to NO, the activity of reducing NO and generating laughing gas could be detected. Moreover, this enzyme did not react at all with nitric acid or thiosulfuric acid, and it was confirmed that it was an enzyme that specifically reduced NO.
[0015]
Further research was continued on the cytochrome P450nor gene (SEQ ID NO: 3), which was successfully developed in this way, and in the process, the gene was found to have two ways of reading the coding region. One of the reading frames (open reading frame: ORF) is 1647 bp from the position 2101 to the position 3747 of the above-mentioned SEQ ID NO: 3, and the other is in addition to the above-mentioned reading codon. 52 bp upstream (at position 2048 of SEQ ID NO: 3ATG) was newly discovered to have an initiation codon, and it was also newly discovered that it was 1699 bp from position 2048 to position 3747 of SEQ ID NO: 3.
[0016]
As a result of further research and not only focusing on the above-mentioned novel ORF (structural gene), but also a detailed examination of the promoter portion, the promoter portion shown in SEQ ID NO: 3 (from
[0017]
A. A plasmid vector was prepared by linking the cytochrome P450nor gene coding region (1.7 kb downstream of ATG) to the oryzae gene expression vector (FIG. 18) and introduced into Escherichia coli. That is, a DNA fragment (2872 bp: including stop codon TGA) in which the melO promoter (1173 bp) and the ORF (1699 bp) of the P450 nor gene were linked to the expression vector pIN93 was ligated to the plasmid vector pnmelO :: P450-2 ( 11.5 kbp) was created. This plasmid vector was introduced into E. coli and transformed. The obtained transformant was named Escherichia coli M-CYP55A5, and this was deposited as FERM P-18655) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST).
[0018]
The obtained transformant (FERM P-18655) was cultured to amplify DNA, and the base sequence was read. On the other hand, two novel m-RNAs were obtained in advance from A. oryzae O-1013 (FERM P-16528), and as a result of comparison with these, the protein sequence predicted from one of them was the sequence It was found that it corresponds to the
[0019]
That is, this novel cytochrome P450nor gene is characterized in that its promoter region is shortened to about 1300 bp and that it differs from SEQ ID NO: 3 at the start of the coding region.
[0020]
Then, the entire nucleotide sequence of this novel cytochrome P450nor gene was determined, and the promoter portion (position 1 (G(GG) 1300 position (ACA1300 bp), coding region (1301 position (ATG: position 2999 from the start codon) (TGA: 1699 bp) to the stop codon), terminator part (position of 3000 (GAT) to position 3785 (GC)T) 786 bp) and the base sequence of 3785 bp was determined (SEQ ID NO: 4: FIGS. 14, 15, 16, and 17).
[0021]
As described above, as a result of comparing the sequences of both of them based on the information of m-RNA of the present enzyme derived from Aspergillus oryzae newly discovered, the above-mentioned novel cytochrome P450nor gene has 8 introns and 9 exons. It was revealed that the protein deduced from the nucleotide sequence was 408 residues (45.7 kDa) (SEQ ID NO: 2: FIGS. 12 and 13). The amino acid sequence is almost the same as the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) deduced from the other gene (SEQ ID NO: 3), and only the next two amino acids of Met are changed. It is what has.
[0022]
These relationships are further apparent from FIG. That is, the newly developed gene (SEQ ID NO: 4) is the start codon of the other gene (SEQ ID NO: 3) (FIG. 19: position 1353 of SEQ ID NO: 4).A52 bp upstream from (TG) (FIG. 19: at position 1301 of SEQ ID NO: 4)ATG) has been found to have an initiation codon. For translation, the other gene (SEQ ID NO: 3: indicated as the old sequence in the lower part of FIG. 19) is at position 1353.AStarting from TG, the amino acid sequence is Met, Gln, Leu, Glu.
[0023]
On the other hand, the newly developed gene with the shortened promoter (SEQ ID NO: 4: indicated in the upper part of FIG. 19 as a new sequence) is located at position 1301.AStart reading from TG, but at 1311GA at 1362 from TGThe sequences up to are spliced, G at 1310 and 1363AA is combined and translated into Glu. Therefore, in this gene (SEQ ID NO: 4), the amino acid sequence is Met, Asn, Ser, Glu..., And the second and third amino acids are different from the old sequence amino acids. It has cytochrome P450nor enzyme activity.
[0024]
This cytochrome P450nor is an enzyme that catalyzes the reaction of reducing NO to produce laughing gas, which is not a monooxygenase, but converts NO to N2This is a reductase that reduces to O. Using this property, for example, as an electron donor, the decrease in absorbance at 340 nm is reduced by the enzymatic reaction of the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or the same phosphate (NADPH). And NO can be analyzed using the measured value (the following reaction formula).
[0025]
2NO + NAD (P) H + H+
→ N2O + NAD (P)++ H2O
[0026]
In addition, N sample produced by treating the analysis sample with this enzyme2NO can be analyzed by directly measuring O by gas chromatography (hereinafter referred to as GLC) analysis or the like. Specifically, for example, 0.5 ml of this sample solution, 0.5 ml of 50 mM NAD (P) H, 4 ml of 0.1M potassium-phosphate buffer (pH 7.2) (5 ml in total) are mixed with 0.5 ml of the sample solution for analysis. In addition, the reaction was started at 30 ° C., and 0.5 ml of a sample solution was collected. This was analyzed by GLC analysis (detection: TCD, column: PorapackQ (3 mm × 2 m), carrier gas: He).2O can be measured to analyze NO in the analysis sample.
[0027]
Furthermore, for example, 20 μl of this enzyme solution, 10 μl of 16 mM NAD (P) H, 10 μl of analysis sample, 100 μl of 1M sodium-phosphate buffer (pH 7.0) are added with distilled water to make a total volume of 1000 μl, and this is incubated at 37 ° C. Then, the enzyme reaction is performed, and the consumption of NAD (P) H accompanying the amount of NO can be measured at an absorbance of 340 nm to analyze NO. In general NO measurement, it is difficult to directly quantify NO, and NO is indirectly quantified from the measured value of nitric acid which is a decomposition product thereof. In addition, a method for directly measuring NO has been developed. For this purpose, an expensive analytical instrument such as an electron spin measuring device is required. However, the NO measurement using this cytochrome P450nor can directly measure the amount of NO, can be handled with a simple analytical operation and inexpensive reagents and equipment necessary for the analysis. Furthermore, the measurement sensitivity is high because measurement is performed from the amount of decrease in NAD (P) H, and higher sensitivity can be expected by using a fluorescence method or the like.
[0028]
Thus, the enzyme protein produced by the present invention can be widely used in various NO assay systems, and a rapid and accurate NO assay is possible. At that time, in addition to this enzyme protein, various reagents necessary for NO assay (for example, NAD (P) H, buffer solution, distilled water, etc.) are assembled in one kit, and the NO assay becomes more efficient. Done.
[0029]
From the above results, it was confirmed that the cloned gene fragment encoded a protein having cytochrome P450nor activity. It was also confirmed that the cytochrome P450nor protein can be highly produced using this gene, and that the produced protein can be applied in various industrial fields in addition to the determination of NO.
[0030]
Attention must be paid not only to the content in the living body but also to the content of the environment such as air and soil. This NO quantification method using cytochrome P450nor can be applied to the measurement of NO concentration in the environment such as air and soil from the measurement of in vivo NO concentration such as clinical examination and tissue cell research. Furthermore, the ability of this protein to selectively decompose NO can be expected to be used in medicine such as repair of cells damaged by NO.
Examples will be described below.
[0031]
[Example 1]
Cloning of cytochrome P450nor gene
A clone AC2456 having high homology to the cytochrome P450nor gene of Fusarium oxysporum was selected from a cDNA library (EST library) using mRNA obtained from liquid culture. The cytochrome P450nor gene was cloned from the chromosomal gene library of Aspergillus oryzae O-1013 strain using lambda EMBL3 phage (FERM P-16528 deposited by Biotechnology Institute of Industrial Science and Technology, Institute of Industrial Science and Technology) by plaque hybridization. In order to create a probe based on the EST sequence, two types of nucleotide primers having the sequences described below were synthesized. Subsequently, PCR was performed according to a conventional method using the genome of Aspergillus oryzae O-1013 strain as a template, and the reaction product was fluorescently labeled by a random priming labeling method to obtain a probe.
[0032]
Of the two types of oligo DNA primers, one is a sense primer whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 5 (FIG. 6), and the other is an antisense primer whose base sequence is SEQ ID NO: 6 (FIG. 7).
[0033]
By this method, clone λCY12 that hybridizes with the probe was isolated from about 3000 phage clones. The DNA base sequence was determined by the dideoxy method using the above oligo DNA as a primer, and it was confirmed that this clone was indeed the target cytochrome P450nor gene.
[0034]
[Example 2]
Determination of the base sequence of cytochrome P450nor gene
Using the positive clone λCY12 strain as a template, the entire nucleotide sequence of the cytochrome P450nor gene was determined. The nucleotide sequence of 4533b was determined by combining the promoter portion (2100 bp), coding region (1647 bp), and terminator portion (786 bp) (SEQ ID NO: 3, FIG. 4, FIG. 5). One position (TGG) to 2100 position (AAC) Until the promoter part (position 749 (GGG) to 2100 position (including the central part of the promoter (1352 bp)), 2101 position (ATG) to 3747 position (TGA) Is the coding region, and 3748 positions (GAT) position 4533 (GC)T) Is the terminator part.
[0035]
The cDNA sequence was determined based on the EST information. Later, genomic DNA sequences were determined and the results were compared. As a result, 7 introns existed in the cytochrome P450nor gene of Neisseria gonorrhoeae, and the protein deduced from the base sequence was 408 residues (45.7 kDa). It became. (SEQ ID NO: 1: FIGS. 1 and 2).
[0036]
As a result of comparing the genetic structure with the already cloned Fusarium oxysporum cytochrome P450nor gene, Cylidrocaron tonkine cytochrome P450nor gene A2 and cytochrome P450nor gene A3, the exact number of introns and their insertion positions were found. It had been. Moreover, the vicinity of cysteine of the heme coordination factor and the vicinity of the NAD (P) H binding region, which is a cofactor, revealed from the analysis of the cytochrome P450nor gene showed very high homology.
[0037]
[Example 3]
Introduction of cytochrome P450nor gene into Neisseria gonorrhoeae
The coding region in the obtained cytochrome P450nor gene was ligated downstream of the me1O promoter, which is a high expression promoter of Neisseria gonorrhoeae. The nucleotide sequence of the melO promoter is shown in SEQ ID NO: 7 (FIG. 8). Further, this fusion gene was ligated to pIN93, which is an gonococcal expression vector, to construct a cytochrome P450nor expression plasmid pnmelO :: P450 (FIG. 9). This plasmid pnmelO :: P450 was introduced into the niaD mutant of A. oryzae (Deposited by the National Institute of Biotechnology, FERM P-17707) according to a conventional method. Strains that recovered nitrate utilization were selected for gene transfer. The transformant thus obtained was named Aspergillus oryzae MEL-P450nor and deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science as FERM P-17942.
[0038]
This gene-introduced strain (FERM P-17794) was subjected to liquid culture in DPY medium, and cytochrome P450nor activity in the cells was measured. Cytochrome P450nor activity was measured according to the method of Shiro et al. (Shiro, Y., et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 1617-1623). As a result, the transformant introduced with the cytochrome P450nor gene showed very high cytochrome P450nor activity in the microbial cells. As a result, it was confirmed that the isolated cytochrome P450nor gene encodes a protein having cytochrome P450nor activity.
[0039]
[Example 4]
Mass production of recombinant cytochrome P450nor
The cytochrome P450nor gene-introduced strain prepared in Example 3 was cultured to attempt mass production of recombinant cytochrome P450nor. Bacteria cultured for 7 days at 30 ° C. in 3 L of Cz-Dox medium were collected by centrifugation or the like, and crushed until powdered under liquid nitrogen. A 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) was added to the crushed cells and mixed well, and then the solid content was removed by centrifugation.
[0040]
The bacterial cell extract thus obtained was dialyzed with 50 mM phosphate buffer to remove the low molecular fraction, and this was used as a cytochrome P450nor crude enzyme solution. As a coenzyme, higher activity was obtained when NADH was used than NADPH (FIG. 10).
[0041]
[Example 5]
Measurement of NO amount with recombinant cytochrome P450nor
Using the recombinant enzyme prepared in Example 4, quantification of NO concentration was examined. First, NOC5 (NO donor that generates NO under neutral or acidic conditions: manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) is added to the enzyme solution at various concentrations in the presence of NADH and buffer solution. The decrease in absorption at 340 nm with consumption was measured. As shown in FIG. 11, as the amount of NOC5 added increased, the consumption rate of NADH increased, and it was confirmed that the NO concentration could be measured by this enzyme.
[0042]
【The invention's effect】
The present invention makes it possible to produce a large amount of Aspergillus cytochrome P450nor, which can be used in various industrial fields such as quantitative determination of NO in solution, NO scavenger in vivo, and vaporization of nitrogen components by denitrification. It is what makes it possible. In addition, the present invention is an epoch-making technique that can be applied to food, pharmaceuticals, cosmetics industry, etc. because the enzyme protein produced is very safe because the koji mold is produced by koji mold.
According to the present invention, two types of genes encoding a novel cytochrome P450nor protein (a gene with a long promoter and a gene with a shortened type) were developed, and mass production of the protein became possible. Moreover, all of the transformants into which these genes have been introduced have been deposited at the Patent Organism Depositary and Life Research Institute (currently the Patent Organism Depositary) and are available.
[0043]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows one amino acid sequence of cytochrome P450nor.
FIG. 2 shows the continuation of the above.
FIG. 3 shows the base sequence of one of the cytochrome P450nor genes.
FIG. 4 shows the continuation of the above.
FIG. 5 shows the continuation of the above.
FIG. 6 shows sense primers.
FIG. 7 shows antisense primers.
FIG. 8 shows the base sequence of the melO promoter.
FIG. 9 shows the construction of cytochrome P450nor expression plasmid pnmelO :: P450 and its restriction enzyme map.
FIG. Figure 5 shows the NADP / NADPH selectivity of oryzae P450nor.
FIG. 11 shows the response to changes in substrate concentration.
FIG. 12 shows the other amino acid sequence of cytochrome P450nor.
FIG. 13 shows the continuation of the above.
FIG. 14 shows the other nucleotide sequence of the cytochrome P450nor gene.
FIG. 15 shows the continuation of the above.
FIG. 16 shows the continuation of the above.
FIG. 17 shows the continuation of the above.
FIG. 18 shows the construction of cytochrome P450nor expression plasmid pnmelO :: P450-2 and its restriction enzyme map.
FIG. 19 shows the structure near the ATG of the cytochrome P450nor gene.
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