JP3863564B2 - 安定化標準物質および検定物質 - Google Patents

Description

発明の背景
技術分野
本発明は、増大した安定性を有する、薬物、好ましくはタクロリムスを含んで成るインビトロ水性組成物に関する。本発明は、水性マトリックス中の薬物を安定化する結合性蛋白質を用いる。
背景
治療目的で投与される多くの薬物は、体液中の薬物測定のため精密で明確な分析を必要とする。典型的には、このような分析法は、１種以上の検定物質または対照溶液中の、薬物の組成物を用いる。これらの溶液は、例えば、患者の試料（未知の濃度の目的の薬物を有する）を正確に外挿法により推定することのできる検量線を作るのに用いる。更に、大部分の測定システムの品質管理のしくみは、安定な薬物標準物質を用いて測定信頼度を評価することに基づいている。
薬物標準物質が測定キットの１成分として供給される場合がよくあり、そして、従って、キット成分は、輸送の過酷さ、取り扱い及び貯蔵に安定であることが望ましい。技師の用い易さのためには、測定標準物質を実質的に水性組成物として提供するのが好ましい。しかしながら、これらの多数の同じ薬物は、水性環境で安定ではなく、従って、水性マトリックス中で急速に分解する傾向がある。水性環境で安定ではないこのような薬物の代表例は、免疫抑制薬タクロリムス（ＦＫ５０６としても知られている）およびラパマイシンである。商業的診断用測定物の開発は、このような不安定な化合物により妨げられている。これらの問題の克服は、診断用測定物の開発における挑戦を表す。
タクロリムスおよびラパマイシンは、両方とも、移植療法後の組織拒絶を制御する免疫抑制薬として用いられてきた。従って、シクロスポリン療法中に行うものと同様、これらの薬物の血中濃度の監視が臨床的ケアの重要な一面である。
ＥＰ ０ ２９３ ８９２は、１）抗−ＦＫ５０６抗体で被覆したＥＬＩＳＡプレート、２）遊離のＦＫ５０６と競合しシグナル発生試薬として働くＦＫ５０６−西洋わさびペルオキシダーゼ結合物および３）ペルオキシダーゼにとって適切な基質から成るＦＫ５０６（タクロリムス）を測定するＥＬＩＳＡ法について述べている。このプロトコールは、測定に用いるＦＫ５０６の対照溶液を、２−８℃でエタノール中で貯蔵したＦＫ５０６の一部から使用直前に作ることを必要とする。
Grenier等の米国特許５，３３８，６８４は、薬物を全血または溶解した血液の存在下で貯蔵するＦＫ５０６の安定化組成物について述べている。この特許は、このような組成物が、全血または溶解した血液の非存在下で貯蔵した薬物と比較した場合、３７℃で少なくとも１日安定であることを開示している。この組成物は、ＦＫ５０６の測定における標準物質または検定物質として有用であると言われている。しかしながら、このような組成物は、組成物における血液または血液成分の使用およびこのような製品を扱うことにより生じた潜在的バイオハザードの不利益を被っている。
免疫抑制薬系の薬物に対する結合性蛋白質が報告されてきた。薬物タクロリムスまたはラパマイシンに対する結合性蛋白質の例示は、米国特許５，１９６，３５２、５，１０９，１１２、国際公開番号ＷＯ ９３／０７２６９およびＷＯ ９２／１８５２７ならびにヨーロッパ特許出願０ ５８４ ２１７および０ ４８２ １８９である。
国際公開番号ＷＯ ９２／０１０５２およびヨーロッパ特許出願０ ４８１ ６７３は、ＦＫ５０６結合性蛋白質をコードするＤＮＡ配列を開示している。
国際公開番号ＷＯ ９３／２５５３３は、組み換えＦＫＢＰ融合蛋白質およびタクロリムスの精製のための測定におけるその使用を開示している。
国際公開番号ＷＯ ９４／０４７００は、ＦＫ５０６およびＦＫＢＰの両方上の抗原決定基に特異的であるモノクローナル抗体並びにこのような抗体を用いる測定法を開示している。
国際公開番号ＷＯ ９５／００１７４は、抗体に低親和性を有する保護リガンドの溶液により抗体を貯蔵中に安定化することができることを開示している。
よって、例えば、このような薬物の診断用測定の水性標準物質としての利用に水性条件下で不安定である薬物の安定なインビトロ水性組成物の必要性が存する。
発明の概要
本発明は、水性条件下で通常不安定な薬物および効果的な量の結合性蛋白質から成る安定化水性マトリックスを提供する。
本発明の好ましいマトリックスにおいて、薬物は、ラパマイシンまたはタクロリムスであり、結合性蛋白質は、ＦＫＢＰである。最も好ましくは、結合性蛋白質ＦＫＢＰ−１２である。
やはり開示されるのは、薬物の診断用測定における標準として本発明の安定化マトリックスの使用法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、タクロリムス溶液に対するＦＫＢＰ１２の保護作用を示す。
図２ａから２ｆは、タクロリムス溶液に対する抗−タクロリムス抗体の保護作用を示す。
図３は、本発明の組成物中の検定物質溶液の安定化を示す。
図４はａから４ｃは、本発明の組成物中のラパマイシンの安定化を示す。
図５は、本発明の組成物中のラパマイシン検定物質溶液の安定化を示す。
発明の詳細な説明
以下の用語は、本開示中で用いる場合、以下の意味を有する：
本発明の安定化マトリックスに関して用いた場合の「薬物」とは、一定期間水性環境で、および薬物の診断用測定の標準または対照としての使用に好適な条件下で安定ではないであろう薬物または生理学的に活性な物質を意味する。
「効果的な量」とは、診断用測定において組成物を標準として用いるのを好適にする条件下および時間で薬物を安定化するのに効果的である結合性蛋白質の量を意味する。
上述のように、本発明の安定化マトリックスは、薬物および、薬物の診断用測定において組成物を標準として用いるのを好適にする条件下および時間で水性環境で薬物を安定化するのに効果的である量の結合性蛋白質を含んで成る。
薬物が水性環境で不安定であり、薬物のための適切な結合性蛋白質が利用可能であれば、いずれの薬物または生理学的に活性な物質であっても本発明の使用に好適である。
水性システムで不安定であることが公知である薬物には、免疫抑制化合物ラパマイシンおよびタクロリムスがある。ラパマイシンおよびタクロリムスの両者は、不安定であることが当業界で周知であり、更に、これらの化合物の結合性蛋白質は、性質が調べられている。ラパマイシンおよびタクロリムスは、本発明の組成物に好ましい。更に、他の薬物、例えばシクロスポリンは、水溶液に露出した場合分解を受けやすいことが業界で周知である。
業界で公知であるタクロリムスおよびラパマシンのいずれの結合性蛋白質も本発明の使用に好適であり、結合性蛋白質は、上述の方法に従い単離および／または特徴付けすることができる。更に、タクロリムスおよび／またはラパマイシンに対する抗体を作る技法は、周知であり（例えばヨーロッパ特許出願０ ２９３ ８９２および国際特許出願ＷＯ ９４／２４３０４およびＷＯ ９４／２５０２２参照）、これらの方法について特に言及する必要が無い。
不安定な薬物が効果的な量の結合性蛋白質を用いることにより安定になる条件および期間は、当然のことながら、ある薬物は他より本質的に多かれ少なかれ安定であるから、水性環境での薬物の安定性に依存する。更に、検定物質または対照に予想される条件ならびに特定の測定のパラメーターも、組成物が安定を保つ期間を決定するのに考慮すべきである。本発明の組成物は、ここで述べたような結合性蛋白質の非存在下における薬物組成物より少なくとも１日長く薬物を安定化するのに効果的である。高温でも同様により長い期間にわたって薬物の安定性を維持することが望ましく好ましい。この点で、本発明の好ましい組成物は、３７℃で少なくとも７日間薬物を安定にする。本発明の最も好ましい組成物は、ｐＨ６．１で貯蔵した場合３７℃で少なくとも３０日間タクロリムスを安定にする。
不安定な薬物に特異的に結合する結合性蛋白質の使用が、水性媒体中の薬物分子に長期安定性を付与することが発見されたが、結合性蛋白質および薬物が相互作用してこの結果を成し遂げるメカニズムは確実には分かっていない。しかしながら、このような組成物の長期安定性は、下記で更に詳細に述べるように十分に示された。更に、本発明の組成物中での貯蔵後、タクロリムスの構造的に完全な状態が、ＨＰＬＣにより確認された（データは示さず）。
本発明のマトリックスまたは組成物は、その中に含まれる生理学的に活性な部分の長期安定性を達成することが望ましいいかなる用途にも好適である。いずれの意図の用途でも、それを用いるシステムに対する結合性蛋白質の影響を考慮する必要があることは当然である。好ましくは、本発明の組成物は、その中に含まれる薬物の診断用測定の標準、即ち、患者試料の量を定量化することのできる検量線を作るのに用いる複数の試薬の１成分として有用である。
実施例１
この実施例は、ＦＫＢＰ１２を用いた本発明の水性組成物の調製法を具体的に説明する。ＦＫＢＰ１２の調製法は、Edalji等, J. Prot. Chem. 11:213(1992)に述べられている。基本マトリックスは、１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＴＷＥＥＮ２０（Sigma Chemical Co.）および抗−微生物剤（０．０５％（ｗ／ｖ）フルオロキノロン（Abbott Laboratorise）を含有する５０ｍＭのピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス［２−エタンスルホン酸］（ＰＩＰＥＳ）；０．０５％（ｗ／ｖ）ナトリウムアルキルパラベン（NIPASEPT,Nipa Laboratories）ならびに０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（Sigma）（以後、Ｐ／Ｂ／Ｔと称する）ｐＨ６．１または７．４である。ＦＫＢＰ１２をＰ／Ｂ／Ｔに１μｇ／ｍＬの濃度で加える。マトリックスをストック溶液（−２０℃でメタノール中で貯蔵１０μｇ／ｍＬ）から得たＦＫ−５０６でスパイクし、２−８℃、３７℃、または４５℃でインキュベートする。指示された時点で、インキュベートした試料の一部を取り出し、製造元のプロトコールに従い市販のタクロリムス測定キット（IMx^▲Ｒ▲ Tacrolimus assay, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）を用いてＦＫ−５０６の存在を測定する。
結果（表１に示す）から、とちらのｐＨでも１μｇ／ｍＬでのＦＫＢＰのマトリックスへの添加は、分析物の明白な損失を防止して、ＦＫ−５０６を安定にする。
実施例２
この実施例は、タクロリムスモノクローナル抗体を用いた本発明の水性組成物の調製法を具体的に説明する。この抗体は、公開された技法に従い、タクロリムス−蛋白質免疫原で免疫感作したマウスの脾臓細胞から調製したハイブリドーマから誘導する。３種の抗体（ＡｂＡ、ＡｂＢ、およびＡｂＣと命名）を、５μｇ／ｍＬの濃度でＰ／Ｂ／Ｔ（ｐＨ６．１および７．４）に加え、その結果できた溶液を、実施例１で述べたストック溶液から希釈により２０μｇ／ｍＬの濃度になるようにタクロリムスでスパイクする。対照として、タクロリムスと反応しないモノクローナル抗体（ＡｂＤ）を５μｇ／ｍＬでＰ／Ｂ／Ｔ中にスパイクする。更なる比較として、Ｐ／Ｂ／Ｔを、１μｇ／ｍＬのＦＫＢＰと共に調製し、２０ｎｇ／ｍＬのタクロリムスでスパイクする。薬物を含有する溶液を２−８、３７および４５℃でインキュベートし、指示した時間および温度でのインキュベーション後に残存するタクロリムスの濃度を測定するため市販の測定キットにより測定する。結果を図２ａから２ｆに示す。ｐＨ６．１および７．４の両方で、非常に僅かな質の低下が２−８℃で見られる。３７および４５℃の高温では、測定したタクロリムス濃度の減少は、未強化および対照（ＡｂＤ）のマトリックスで劇的である。ＦＫＢＰ、ＡｂＡ、またはＡｂＣの添加は、指示した温度でのインキュベーション中の薬物に対し明らかに安定化作用がある。すべての抗体がこの保護能力において同等というわけではないこと、タクロリムス安定化にＡｂＡおよびＡｂＣがＡｂＢよりも効果的であることも注記する。従って、ここで概説した促進安定性研究は、抗体の安定化作用、即ち保護能力の増大にも有用である。
実施例３
この実施例は、タクロリムス検定物質の機能寿命を長くする添加物としてタクロリムスモノクローナル抗体およびＦＫＢＰを用いた本発明の水性組成物の調製法を具体的に説明する。０、１０、２０および３０ｎｇ／ｍＬのタクロリムス濃度を有する検定物質を、ｐＨ６．１のＰ／Ｂ／Ｔ中のタクロリムスストック溶液（実施例１）の希釈により調製する。これらの検定物質は、１μｇ／ｍＬのＦＫＢＰまたは５μｇ／ｍＬの抗−タクロリムス抗体のいずれかで強化する。検定物質を０．２μｍの濾紙で濾過する。ＦＫＢＰまたは抗−タクロリムスを含有しない同様の一連の検定物質（０、１０、２０および３０ｎｇ／ｍＬのタクロリムス）を、タクロリムス測定用全血希釈剤（Abbott）中に調製する。全検定物質を２−８℃または３７℃で使用するまで貯蔵する。一連のタクロリムス試料を、市販のタクロリムス希釈緩衝液（Abbott）中に１２（試料Ａ）、１８（試料Ｂ）および２４（試料Ｃ）ｎｇ／ｍＬで調製し、使用するまで−２０℃で貯蔵する。指示された日に、Ａ、ＢおよびＣの試料を解凍し、４種の各希釈剤で強化した検定物質を用いて市販の測定キットで濃度を測定する。それぞれの温度でそれぞれのセットの検定物質で、標準曲線を作成し、試料中のタクロリムスの濃度を、二地点間データ整理を用いてコンピューター処理する。結果を図３に示す。
１セットの検定物質の機能寿命を決定する重要な特徴は、検定物質セットを用いて測定した試料の濃度は変化すべきでないということである。図３に示すように、３７℃で延長された貯蔵下で１セットの検定物質中のタクロリムスの質が低下することから、そのセットの検定物質を用いて測定した試料中の薬物の見掛けの濃度は、増加する。観察することができるように、ＦＫＢＰおよび抗−タクロリムス抗体の両者で強化した本発明の検定物質組成物は、この促進安定性研究においてより長い機能寿命を提供する。
実施例４
この実施例は、ラパマイシンの機能寿命を長くする添加物として結合蛋白質を用いた本発明の水性組成物の調製法を具体的に説明する。Ｐ／Ｂ／Ｔを、３μｇ／ｍＬのＦＫＢＰ、５μｇ／ｍＬの抗−ラパマイシンモノクローナル抗体（ＡｂＡ）、または５μｇ／ｍＬの対照の抗体（ＡｂＢ）で強化する。市販の測定キット由来の全血標準物質マトリックスを比較に用いる。マトリックスを、ストック溶液（メタノール中で１０μｇ／ｍＬ、−２０℃で貯蔵）から得たラパマイシンで４０ｎｇ／ｍＬになるようにスパイクし、２−８℃、３７℃、および室温で貯蔵する。それぞれの日の測定用検定物質は、メタノールストックからＰ／Ｂ／Ｔ中への希釈により新たに調製し氷上で保存する。測定プロトコールは、測定用微粒子を抗−ラパマイシンモノクローナル抗体から調製し、測定用結合物がラパマイシン−ＣＭＯ−アルカリホスファターゼ結合物であることを除いては、市販の測定キットで用いたものと同様である。抽出試薬は、４０％水性メタノール中の１％ＺｎＳＯ₄である。
測定前に、試料および検定物質を、５０％全血検定物質用希釈剤の最終濃度になるように同容量の全血検定物質用希釈剤またはＰ／Ｂ／Ｔで希釈し、次いで、抽出試薬で１：１で抽出する。抽出物を遠心分離し、上澄を装置の試料ウェルに加え、前述のように測定する。二地点間データ整理を用いて作成した標準曲線から試料の濃度を読み取る。結果を図４ａから４ｃに示す。室温および３７℃でのＰ／Ｂ／Ｔ中のラパマイシンおよびＰ／Ｂ／Ｔ＆対照Ａｂの急速な質の低下は明白である。ＦＫＢＰ−１２または抗−ラパマイシン抗体のいずれかの保護作用も明白であり、タクロリムス全血希釈組成物のそれと類似している。また、この実施例は、この研究の２６日および３６日目の２−８℃でのラパマイシンを安定化する結合性蛋白質の有効性を示す。
実施例５
以下の実施例は、測定におけるラパマイシン検定物質を安定化する結合性蛋白質ＦＫＢＰ−１２を用いた水性組成物の調製法を示す。ｐＨ７．４のＰ／Ｂ／Ｔ（マトリックスＡ）または１μｇ／ｍＬのＦＫＢＰ−１２で強化したｐＨ７．４のＰ／Ｂ／Ｔ（マトリックスＢ）を用いて０、１０および２０ｎｇ／ｍＬのラパマイシンから成る検定物質セットを調製する。４ｎｇ／ｍＬでラパマイシン対照を全血検定物質用希釈剤中に調製し、−２０℃で貯蔵する。検定物質セットを、２−８℃、室温、または３７℃で貯蔵する。指示された日に対照のバイアルを解凍し、実施例４で述べたように測定する。それぞれの検定物質セットから得た標準曲線から二地点間データ整理により対照の濃度を決定する。
図５に示す結果は、２−８℃で１２日以内、室温で２日以内および３７℃で１日以内でのラパマイシン検定物質の質の低下を示す。検定物質基質へのＦＫＢＰ−１２の添加は、３つの温度全てで検定物質の質の低下を著しく遅らせ、従って、水性ラパマイシン検定物質マトリックスにおける結合性蛋白質の有用性を示す。

Claims (6)

1. タクロリムスを含む水性組成物を安定化させる方法であって、ＦＫＢＰ類および抗−タクロリムス抗体からなる群から選ばれるタクロリムスに対する結合性蛋白質を前記水性組成物に加えるステップを含む方法。
2. ラパマイシンを含む水性組成物を安定化させる方法であって、ＦＫＢＰ類および抗−ラパマイシン抗体からなる群から選ばれるラパマイシンに対する結合性蛋白質を前記水性組成物に加えるステップを含む方法。
3. 組成物のｐＨが７．４である、請求項１または２に記載の方法。
4. ＦＫＢＰ類および抗−タクロリムス抗体からなる群から選ばれるタクロリムスに対する結合性蛋白質を添加することにより安定化されたタクロリムスの水性検定組成物のイムノアッセイを行うステップを含む、患者試料中のタクロリムスのイムノアッセイにおける標準として使用するための検量線を作成する方法。
5. ＦＫＢＰ類および抗−ラパマイシン抗体からなる群から選ばれるラパマイシンに対する結合性蛋白質を添加することにより安定化されたラパマイシンの水性検定組成物のイムノアッセイを行うステップを含む、患者試料中のラパマイシンのイムノアッセイにおける標準として使用するための検量線を作成する方法。
6. 結合性蛋白質がＦＫＢＰ１２である請求項１〜５に記載の方法。

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