JP3845697B2 - 放射線抵抗性細菌／大腸菌シャトルベクター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、デイノコッカス属細菌の細胞内で複製可能な新規ベクター、デイノコッカス属細菌と大腸菌の両方の細胞内で複製可能な新規シャトルベクター、このシャトルベクターを組み込んでなるシャトルベクター、及びこれらシャトルベクターをデイノコッカス属細菌に導入することにより得られた形質転換株に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物の放射線耐性は、生物種によって大きく異なるが、放射線抵抗性細菌と総称される、放射線に抵抗性の微生物群が存在することが知られている。代表的な放射線抵抗性細菌として、デイノコッカス（Deinococcus）属細菌が知られており、現在までに７種類の菌種（D. radiodurans, D. radiopugnans, D. radiophilus, D. grandis, D. proteolyticus, D. geothermalis, D. murrayi）が同定されている（Ferreira et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47: 939-947, 1997）。そして、これらの菌の放射線耐性は、大腸菌の約100倍、ヒトの細胞の1,000倍以上であることも知られている。もしこれらの放射線抵抗性細菌に、難分解性の物質や毒性を持つ物質などを除去する際に使用される外来遺伝子を遺伝子工学的手法により導入して形質転換することができれば、これらの細菌を使用して放射性物質で汚染された廃棄物中に含まれる難分解性の物質や毒性を持つ物質などを除去することができると考えられている。
【０００３】
現在までに外来遺伝子をデイノコッカス属細菌に取り込ませ、異種タンパク質を発現させた例として、デイノコッカス・ラジオデュランスにおいてトルエンジオキシゲナーゼを発現させ、難分解性のトルエンをより分解しやすい物質に変換した例（Lange et al., Nature Biotechnol., 16: 929-933, 1998）、デイノコッカス・ラジオデュランスに2価水銀イオン還元酵素を発現させ、2価水銀イオンをより毒性の低い揮発性金属水銀に還元した例（Brim et al., Nature Biotechnol., 18: 85-90, 2000）が知られている。しかし、これまでに、デイノコッカス・ラジオデュランス以外のデイノコッカス属細菌を、外来遺伝子を含むプラスミドベクターで形質転換した例はない。また、これらの形質転換体の作製においては、デイノコッカス属細菌では自律複製できないインテグレーション型プラスミドが使用されているため、コピー数の制御ができない点、発現するタンパク質が少量である点、培養液に抗生物質の添加が必要である点、などの欠点が存在していた。
【０００４】
これらの欠点を克服すべく、デイノコッカス・ラジオデュランス／大腸菌シャトルベクターpRAD1が、D. radiodurans Sark株由来のプラスミドpUE10のレプリコンと大腸菌ベクターpMTL23を用いて開発された（MeimaおよびLidstrom, Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000）。しかしながら、これまでに、pRAD1を用いて、デイノコッカス・ラジオデュランス以外のデイノコッカス属細菌を形質転換したという報告はない。また、pRAD1の分配安定性が悪いため、pRAD1は抗生物質クロラムフェニコールを含む選択培地では安定に複製できるが、クロラムフェニコールを含まない非選択培地ではpRAD1を含有する細菌の出現頻度を高く維持することができず、したがって安定に存在できないという欠点を有している。この欠点は、外来遺伝子を導入した放射線抵抗性細菌を、野外開放系に放出する場合に特に問題になる。なぜなら、pRAD1を含有する細菌の出現頻度を高く維持するために、放射性物質で汚染された土壌や廃水などの環境中で抗生物質濃度を一定に保つことは非常に難しいばかりではなく、野外に抗生物質を放出することにより、必要のない抗生物質耐性菌の出現の可能性を高めることにもなり、かえって環境を汚染してしまうことにもなりかねないからである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明においては、デイノコッカス属細菌を形質転換するために有用な新規ベクターであって、デイノコッカス属細菌中で抗生物質などの選択圧のない条件において安定に存在できる新規ベクターを提供することを課題とする。本発明はさらに、デイノコッカス属細菌と大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターであって、抗生物質などの選択圧のない条件において安定に存在できる新規シャトルベクターを提供することもまた課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、鋭意研究を進めた結果、放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性プラスミドであるpUE30またはその誘導体を用いることにより、上述した課題を解決することができることを見いだし、本発明の課題を解決できることを示した。
【０００７】
すなわち、本発明は、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）ATCC19172株由来の内在性プラスミドpUE30またはその誘導体であって、デイノコッカス属細菌中で自律複製可能なプラスミドを提供することにより、本発明の上述した課題を解決することができる。
【０００８】
本発明はまた、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）ATCC19172株由来の内在性プラスミドpUE30またはその誘導体と、大腸菌（Escherichia coli）で自律複製可能なプラスミドまたはその誘導体を含み、デイノコッカス属細菌中および大腸菌中で複製可能なシャトルベクターを提供することにより、本発明の上述した課題を解決することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の一態様において、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性プラスミドまたはその誘導体であって、デイノコッカス属細菌中で自律複製可能なプラスミドを提供する。
【００１０】
本発明において、放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）としては、たとえばデイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株、DSM12027株などを使用することができる。本発明においては、デイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株を使用することが好ましい。デイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株は、American Type Culture Collection（P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA）から取得することができる。
【００１１】
本発明のプラスミドは、放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性のプラスミドであり、たとえば、ATCC19172株の場合にはpUE30、pUE31などが含まれる。本発明においては、pUE30を使用することが好ましい。このプラスミドpUE30は、例えば前記デイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株を培養し、得られた菌体から公知のプラスミド調製法、例えば、SambrookおよびRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition （2001））に記載の調製法に基づいて得ることができる。pUE30のDNA塩基配列をSEQ ID NO: 1に示す。なお、pUE30は二本鎖環状DNAであるが、SEQ ID NO: 1に示した塩基配列は、pUE30の制限酵素NdeI認識部位を5'末端として示したものである。
【００１２】
本発明においては、SEQ ID NO: 1に示す塩基配列を有するpUE30そのものの他、その誘導体であって、デイノコッカス属細菌で自律複製可能なプラスミドも含まれる。本発明において使用する場合、プラスミドの「誘導体」とは、いずれかの改変を含むプラスミドであって、少なくとも複製に関わる領域を含むものをいう。改変の例としては、プラスミドのDNA配列中に存在する1またはそれ以上のヌクレオチド変異（たとえば、欠失、置換、または付加）、プラスミドのDNA配列中の特定の領域を含まない改変などが存在するが、これらのものには限定されない。たとえば、pUE30の誘導体としては、実質的にpUE30からその複製に関わる領域のみを含むもの、より具体的には、SEQ ID NO: 1に記載のpUE30のヌクレオチドの693から始まり417までからなる断片（ヌクレオチド693〜2467〜1〜417）や、pUE30またはその一部に他のDNA配列を挿入したもの、などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００１３】
このようにして作製されたプラスミドは、その起源である放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）のみならず、デイノコッカス属細菌において幅広く自律複製することができる。
【００１４】
本発明の別の一態様において、デイノコッカス属細菌とそれ以外の細菌との両方で自律複製することができるシャトルベクターを提供する。より具体的には、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性プラスミドpUE30またはその誘導体と、大腸菌（Escherichia coli）で自律複製可能なプラスミドまたはその誘導体とを含み、デイノコッカス属細菌中および大腸菌中で複製可能なシャトルベクターを提供する。
【００１５】
当該技術分野において、一般的にシャトルベクターとは、2種の生物のDNA複製機構を含み、場合によりさらに選択マーカーを含む、その2種の生物のどちらの細胞中でも自律複製することができるベクターをいう。したがって、本発明においては、デイノコッカス属細菌中で機能するDNA複製機構と、それ以外の細菌中で機能するDNA複製機構とを連結することにより、デイノコッカス属細菌およびそれ以外の細菌の両方で自律複製可能なシャトルベクターを作製することができる。このようなDNA複製機構としては、自律複製機能を有するプラスミドの全体、または複製機能を有するその誘導体を使用することができ、また、デイノコッカス属細菌以外の細菌としては、たとえば大腸菌が挙げられる。
【００１６】
本発明のデイノコッカス属細菌／大腸菌シャトルベクターを構築するために使用される、デイノコッカス属細菌中で機能するDNA複製機構としては、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性のプラスミドpUE30由来の配列、pUE31由来の配列、デイノコッカス・ラジオフィルス（Deinococcus radiophilus）由来の内在性プラスミドpUE1由来の配列などを使用することができる。好ましくは、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性のプラスミドpUE30またはその誘導体を使用する。
【００１７】
シャトルベクターの構築に用いるpUE30は、SEQ ID NO: 1に示す塩基配列すべてを用いてもよく、その一部を用いてもよい。一部を用いる場合は、pUE30の複製に関わる領域が含まれていることが必要であるが、複製に不要な領域は除いて用いてもよい。シャトルベクターに有用な外来遺伝子を組込んで使用する場合を考慮すると、複製に関わる領域以外の部分を除き、シャトルベクターの大きさをなるべく小さくすることが望ましい。pUE30を制限酵素で切断して得られる断片を、たとえば大腸菌で自律複製可能なプラスミドに連結し、得られる組換えプラスミドでデイノコッカス属細菌を形質転換し、デイノコッカス属細菌の形質転換体中に前記の組換えプラスミドが保持されていることを確認することによって、複製に必要な領域を決定することができる。適当な制限酵素部位が存在しない場合には、本発明の技術分野で公知の部位特異的変異生成法（Site-directed Mutagenesis）を用いて、特定の部位に新たな制限酵素切断部位を導入してもよい。また、SEQ ID NO: 1に示す塩基配列の一部を含む合成DNAをプライマーとし、pUE30を鋳型とするPCR法によって増幅したpUE30の部分断片を用いて、他の細菌で複製可能なプラスミドとの連結に使用してもよい。たとえば、そのような合成DNAプライマーの一例としては、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 3で示した塩基配列をもつ合成DNA、あるいはSEQ ID NO: 4およびSEQ ID NO: 5で示した塩基配列をもつ合成DNAなどが挙げられる。
【００１８】
また、上述したシャトルベクターを構築するため、大腸菌中で機能するDNA複製機構として、本発明の技術分野で通常用いられているプラスミドベクターなどのいずれをも使用することができ、特に限定されるものではない。具体的には、たとえば、pUC18、pUC19、pHSG298、pHSG299、pBR322、pSC101、pGBM5等を使用することができる。これらのプラスミドベクターは、市場で購入することもできるし、当業者であれば国立遺伝子学研究所のクローニングベクターコレクション（〒411-8540静岡県三島市谷田1111）から入手することも可能である。これらのプラスミドについても、その全体を用いてもよく、あるいはその一部を用いてもよい。一部を用いる場合は、大腸菌中におけるプラスミドの複製に関わる領域が含まれている必要があるが、不要な領域は除いて使用してもよい。
【００１９】
本発明のプラスミドおよびシャトルベクターは、さらに、場合により選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子を使用することができる。これらの抗生物質耐性遺伝子は、たとえば上述した大腸菌プラスミドベクターに含まれており、たとえば、pUC18はアンピシリン耐性遺伝子、pHSG298はカナマイシン耐性遺伝子を有している。これらの抗生物質耐性遺伝子を、複製に必要な領域と共に、シャトルベクターの構築に用いることができる。
【００２０】
これらの選択マーカー遺伝子は、その上流にデイノコッカス属細菌で機能するプロモーター配列を連結することにより、シャトルベクター導入によるデイノコッカス属細菌の形質転換体取得の際のマーカー遺伝子として機能させることもできる。デイノコッカス属細菌で機能するプロモーター配列の例としては、Smith等（Plasmid, 22: 132-142, 1989）、Funayama等（Mutat. Res., 435: 151-161, 1999）、Meima等（J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001）に記載される、既知プロモーター配列等を挙げることができる。なお、得られたデイノコッカス属細菌の形質転換体の中で、抗生物質を含まない環境下においても、シャトルベクターが安定に存在することを確認できる場合には、その後の形質転換体の培養に抗生物質を添加する必要はない。
【００２１】
このようなシャトルベクターに、レポーター遺伝子をさらに組み込んだシャトルベクターを構築することもできる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、lacZ遺伝子、cat遺伝子などを使用できることが、当該技術分野において知られている。本発明においては、ルシフェラーゼ遺伝子として、たとえば北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）の宿主DNA由来のルシフェラーゼ遺伝子luxを使用する。レポーター遺伝子は、シャトルベクター中の適当な制限酵素部位に組み込むことができる。適当な制限酵素部位が存在しない場合には、大腸菌プラスミドベクター由来のマルチクローニング部位をシャトルベクターに挿入してもよい。本発明のデイノコッカス属細菌／大腸菌シャトルベクターには、大腸菌プラスミドベクター由来のマルチクローニング領域、またはその一部が挿入されているので、適当な制限酵素を使用して、ルシフェラーゼ遺伝子（もしくは、その他の外来遺伝子）を挿入することができる。レポーター遺伝子（もしくは、その他の外来遺伝子）がデイノコッカス属細菌中でうまく発現しない場合には、上記したようなデイノコッカス属細菌で機能するプロモーター配列を発現させたい遺伝子の上流に連結してもよい。
【００２２】
このようにして調製される本発明のシャトルベクターは、増殖速度の速い大腸菌を用いて大量に生産することができる。本発明のシャトルベクターによる大腸菌の形質転換法としては、たとえば、SambrookおよびRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition（2001））などに詳細に記載されている形質転換法を用いることができる。具体的には、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが含まれるが、これらのものには限定されない。また、本発明のシャトルベクターをデイノコッカス属細菌に導入して形質転換体を得るには、たとえばKitayama等（J. Bacteriol. 155: 1200-1207, 1983）、Meima等（Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000）記載の塩化カルシウム法を用いた自然形質転換法等を用いることができるが、これに限定されるものではない。シャトルベクターを導入するデイノコッカス属細菌としては、デイノコッカス・グランディス（D. grandis）、デイノコッカス・ラジオデュランス（D. radiodurans）ATCC13939株、デイノコッカス・ラジオデュランスATCC35073株（Sark株）などを使用することができる。より好ましくは、デイノコッカス・グランディス（D. grandis）ATCC43672株を使用する。デイノコッカス・グランディス（D. grandis）ATCC43672株は、上述したAmerican Type Culture Collectionから取得することができる。
【００２３】
【実施例】
本明細書の以下に、実施例を記載するが、以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためにのみ提供され、そして本発明の範囲をこれらの実施例により限定することを意図するものではない。
【００２４】
実施例 1 ：プラスミドの調製
（1）プラスミドの分離精製
American Type Culture Collectionから入手したデイノコッカス・ラジオプクナンスATCC19172株を、TGY培地（トリプトン-ペプトン0.5％、酵母エキス0.3％、グルコース0.1％）で24時間培養した後、遠心分離を行って菌体を集めた。QIAfilter Plasmid kit（Qiagen社製）を用いて、この菌体からプラスミド画分を抽出し、さらにアガロースゲル電気泳動によってプラスミドを分離精製した。その結果、約2.5 kbのプラスミドが見いだされた。Mackayら（Arch. Microbiol., 141: 91-94, 1985）は、デイノコッカス・ラジオプクナンスを電子顕微鏡観察し、大きさが約2.5 kbのプラスミドpUE30の存在を報告している。そこで、今回分離精製した2.5 kbのプラスミドをpUE30とした。
【００２５】
（2）塩基配列の決定
上記のように精製したpUE30の制限酵素地図を作製し、pUE30にはHincII部位が一カ所、Aor51HI部位が一カ所存在することを確認した。次に、pUE30をHincII（New England Biolabs, Inc.社製）で消化した2.5 kb断片、またはAor51HI（Takara Shuzo社製）で消化した2.5 kb断片を、上述のクローニングベクターコレクションから入手した大腸菌ベクタープラスミドpGBM5のマルチクローニング部位に連結したプラスミドを作製した。さらに、Kilo-sequence用Deletion kit（Takara Shuzo社製）を用いて、上記プラスミドの一部を段階的に欠失させたクローン（nested deletion clone）を作製した。続いて、これらの段階的に欠失させたクローンをテンプレートとして、市販のユニバーサルプライマーを用いて、ダイデオキシ・ターミネーション法によって、pUE30挿入部位の全DNA塩基配列を決定した。シークエンス反応は、BigDye Terminator Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社製）を用いて行い、電気泳動は、DNA Sequencer ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて行った。決定された全塩基配列をSEQ ID NO: 1に示す。
【００２６】
得られたヌクレオチド配列をさらに詳細に解析したところ、pUE30は全長で2467 bpを有し、267ヌクレオチドと1068ヌクレオチドの2つのオープンリーディングフレーム（ORF）を有していることがわかり、それぞれをrepCおよびrepDと命名した。repCにコードされるタンパク質RepCは、α-プロテオバクテリア（proteobacteria）のrepABC型プラスミドに見られるRepCと25.8〜31.6％のアミノ酸同一性を有し、またrepDにコードされるタンパク質RepDは、Thermus sp. YS45株のプラスミドpTsp45sのRepT、Thermus sp. ATCC27737株由来のプラスミドpMY1のRepA、デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）Sark株のプラスミドpUE10のRepUと、それぞれ26.6％、24.6％、26.8％のアミノ酸同一性を有していた。
【００２７】
実施例 2 ： シャトルベクターの構築
（1）pZT15の構築
pUE30を鋳型とし、SEQ ID NO: 2及びSEQ ID NO: 3に示した塩基配列をもつ合成DNAをプライマーとして、AmpliTaq Gold DNA polymerase（Applied Biosystems社製）を用いてPCR反応を行い、ヌクレオチド789から始まるpUE30の全塩基配列を含み、さらにその両末端に制限酵素SphI部位が付加されたPCR産物を得た。
【００２８】
続いて、大腸菌ベクターpUC19の複製開始領域、大腸菌中で機能するアンピシリン耐性遺伝子、デイノコッカス・ラジオデュランス中で機能するクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つプラスミドpKatCAT（Funayama et al., Mutat. Res., 435: 151-161, 1999）をSphIで消化し、上記PCR産物のSphI消化物と混合し、DNAリガーゼ（Takara社製）で連結した。
【００２９】
このように調製したプラスミドを、大腸菌JM109株にエレクトロポレーション法により導入し、大腸菌を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、pUE30とpKatCATが連結したプラスミド（約6.1 kb）を持つ株を選択し、該プラスミドをシャトルベクターpZT15と命名した。pZT15の構造を図1に示す。
【００３０】
（2）pZT17の構築
pUE30を鋳型として、SEQ ID NO: 4及びSEQ ID NO: 5に示した塩基配列をもつ合成DNAをプライマーとして、（1）と同様にPCR反応を行い、pUE30の塩基配列の一部（約2.3 kb、SEQ ID NO: 1のヌクレオチドの693から始まり417までからなる断片、ヌクレオチド693〜2467〜1〜417）を含み、さらにその両末端に制限酵素SphI部位が付加されたPCR産物を得た。
【００３１】
続いて、（1）と同様に、プラスミドpKatCATと連結したものを用いて、大腸菌JM109株を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、pUE30の一部とpKatCATが連結したプラスミド（約5.8 kb）を持つ株を選択し、該プラスミドをシャトルベクターpZT17と命名した。pZT17の構造を図2に示す。
【００３２】
（3）シャトルベクターを用いたデイノコッカス属細菌の形質転換
デイノコッカス・グランディスATCC43672株およびデイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株を、上述したシャトルベクターpZT15又はpZT17で形質転換した。形質転換法は、Kitayama等の方法（J. Bacteriol., 155: 1200-1207, 1983）に準拠して、塩化カルシウム法にて行った。pZT15、pZT17のいずれのシャトルベクターを用いた場合も、クロラムフェニコール耐性株が得られた。これらの株より、QIAprep Miniprep Plasmid kit（Qiagen社製）を用いてプラスミド画分を抽出し、アガロースゲル電気泳動で解析して、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうか確認した。
【００３３】
結果を図3に示す。この図において、レーン1〜3はデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン4〜6はデイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株に由来するプラスミドをそれぞれ示しており、レーン1および4は無傷の細菌に由来するプラスミドを、レーン2および5はpZT15で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、そしてレーン3および6はpZT17で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、それぞれ示している。レーン1〜3において共通して見られるプラスミドは、デイノコッカス・グランディスATCC43672株の内在性プラスミド（約8 kb）を示す。これらの結果から、シャトルベクターであるpZT15およびpZT17はともに、デイノコッカス属細菌中において安定的に保持されていることが示された。
【００３４】
（4）シャトルベクターのデイノコッカス・グランディス中での安定性
pZT15又はpZT17を含むデイノコッカス・グランディスをクロラムフェニコール含有TGY培地で一夜培養した。続いて、上記培養液を256倍希釈して、クロラムフェニコールを含まないTGY培地に接種し、30℃で培養した。8世代分裂後の培養液を再度256倍希釈してクロラムフェニコールを含まないTGY培地に接種し、30℃で培養した。この操作を繰り返し、非選択培地で40世代まで分裂させた。
【００３５】
8世代分裂毎に、培養液の一部を取り、TGY平板培地ならびにクロラムフェニコール含有TGY平板培地に塗布し、培養液中の全生菌数に対するクロラムフェニコール耐性菌数の割合を測定した。対照として、MeimaおよびLidstrom（Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000）記載のデイノコッカス・大腸菌シャトルベクターpRAD1をデイノコッカス・グランディスに導入して得られた形質転換株中でのpRAD1の安定性についても同様に調べた。
【００３６】
結果を図4に示す。この結果によれば、pRAD1は、非選択培地中で安定に存在することが出来ないのに対して、pZT15およびpZT17は、非選択培地中においてもデイノコッカス・グランディス中で安定に保持されることが確認された。
【００３７】
実施例 3 ： ルシフェラーゼ遺伝子を持つシャトルベクターの構築
（1）pZTGL2およびpZTGL4の構築
デイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株のゲノムDNAを鋳型とし、SEQ ID NO: 6およびSEQ ID NO: 7に示した合成DNAをプライマーとして、Pfu Turbo DNA polymerase（Stratagene社製）を用いたPCR反応により、Meima等（J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001）記載のデイノコッカス・ラジオデュランスで機能する既知groELプロモーター領域（131 bp）を増幅した。続いて、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSP-lux+（Promega社製）をNcoIで消化後、T4 DNA polymerase （Takara社製）でDNA断片末端の平滑化を行った。さらに、上記のPCR産物を平滑化したpSP-lux+と連結し、pGroE-lux+2およびpGroE-lux+4（4,235 bp）を得た。
【００３８】
これらのプラスミドをHindIIIで消化し、切断末端を平滑化処理後、さらにEcoRVで消化し、groELプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を含むDNA断片を得た。続いて、このDNA断片をシャトルベクターpZT17のEcoRV部位に挿入し、pZTGL2およびpZTGL4（7,618 bp）を構築した。pZTGL2およびpZTGL4の構築の概要を図5に示す。構築したプラスミドでデイノコッカス・グランディスを形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。
【００３９】
（2）シャトルベクターを用いたデイノコッカス属細菌の形質転換
デイノコッカス・グランディスATCC43672株を、上述したシャトルベクターpZTGL2又はpZTGL4で形質転換した。形質転換法は、実施例2（3）の場合と同様にKitayama等の方法（J. Bacteriol., 155: 1200-1207, 1983）に準拠して、塩化カルシウム法にて行った。pZTGL2、pZTGL4のいずれのシャトルベクターを用いた場合も、クロラムフェニコール耐性株が得られた。これらの株より、QIAprep Miniprep Plasmid kit（Qiagen社製）を用いてプラスミド画分を抽出し、アガロースゲル電気泳動で解析して、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうか確認した。
【００４０】
結果を図6に示す。この図において、レーン2は無傷のデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン3はpZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、そしてレーン4はpZTGL4で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、それぞれ示している。レーン2〜4において共通して見られるプラスミドは、デイノコッカス・グランディスATCC43672株の内在性プラスミド（約8 kb）を示す。この結果から、シャトルベクターであるpZTGL2およびpZTGL4はともに、デイノコッカス属細菌中において安定的に保持されていることが示された。
【００４１】
（3）ルシフェラーゼ活性の検出
上記のようにして得た形質転換体をTGY培地中、30℃で培養した。24時間後、培養液10μlを等量のBright-Glo Luciferase Assay Solution（Promega社製）と混合し、1分後にその化学発光活性をLumi Imager F1（Roche Molecular Biochemicals社製）によって1分間測定した。測定結果を図7に示す。この測定により、groELプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が順向きに配置されたpZTGL2を含む形質転換体がルシフェラーゼを発現しており、プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が逆向きに配置されたpZTGL4を含む形質転換体はルシフェラーゼ活性を持たないことが確認された。
【００４２】
（4）pZTGL2のデイノコッカス・グランディス中での安定性
pZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスを、実施例2（4）と同様の操作により、クロラムフェニコールを含まないTGY培地で、40世代まで培養し、これを試料Aとした。また、この形質転換体をクロラムフェニコール含有TGY培地で40世代培養した試料も同時に作成し、これを試料Bとした。
【００４３】
試料Aおよび試料Bから抽出したプラスミドの電気泳動像を、図8に示す。レーン1は試料Aを示し、そしてレーン2は試料Bを示す。それぞれのレーンにおいて、上のバンドはデイノコッカス・グランディスATCC43672株の内在性のプラスミド（約8 kbのサイズ）を示し、下のバンドはpZTGL2（約7.6 kbのサイズ）を示している。試料Aから抽出したプラスミドのコピー数は、試料Bから抽出したプラスミドのコピー数と同程度であった。
【００４４】
次に、実施例3（3）と同様の操作で、試料Aおよび試料Bのルシフェラーゼ活性を測定したところ、試料Bのルシフェラーゼ活性に対する試料Aのルシフェラーゼ活性は、85±0.4％であった。この結果は、pZTGL2のデイノコッカス・グランディスにおける非選択培地中での安定性が、図4で示した、pZT17のデイノコッカス・グランディス中における安定性と同等であることを示している。したがって、pZT17に1.8 kbの外来遺伝子が挿入された構造を有するpZTGL2が、pZT17と同様に、非選択培地中において、デイノコッカス・グランディス中で安定に保持されることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、デイノコッカス属細菌由来の新規プラスミドおよび該プラスミドを用いたシャトルベクターが提供される。該シャトルベクターは、デイノコッカス属細菌および大腸菌の細胞内で自律複製できるため、ベクターDNAの組換え操作およびデイノコッカス属細菌への遺伝子導入に有用である。特に、放射性物質を含む廃棄物からの難分解性物質や毒性物質の除去、放射性重金属の捕集技術への応用が可能である。本発明のシャトルベクターは、非選択培地で宿主に安定に保持されるため、上記応用分野において、開放系、閉鎖系を問わず使用可能である。また、本発明のルシフェラーゼ遺伝子を持つシャトルベクターは、形質転換体の生育分布や環境へ及ぼす影響をモニタリングする際に有用である。
【００４６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、本発明のシャトルベクターpZT15の制限酵素地図である。
【図２】 図2は、本発明のシャトルベクターpZT17の制限酵素地図である。
【図３】 図3は、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうかを示す、アガロースゲル電気泳動像である。ここにおいて、レーン1〜3はデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン4〜6はデイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株に由来するプラスミドをそれぞれ示しており、レーン1および4は無傷の細菌に由来するプラスミドを、レーン2および5はpZT15で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、そしてレーン3および6はpZT17で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、それぞれ示す。
【図４】 図4は、デイノコッカス・グランディスATCC43672株におけるシャトルベクターの安定性を調べた結果を示す。○はpZT15で形質転換した株、●はpZT17で形質転換した株、▲はpRAD1で形質転換した株を示す。縦軸は全生菌数に対するクロラムフェニコール耐性菌数の割合、横軸は増殖世代をそれぞれ表す。
【図５】 図5は、本発明のルシフェラーゼ遺伝子を含むシャトルベクターpZTGL2およびpZTGL4の構築手順の概要を示す図である。
【図６】 図6は、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうかを示す、アガロースゲル電気泳動像である。ここにおいて、レーン2は無傷のデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン3はpZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、そしてレーン4はpZTGL4で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、それぞれ示す。レーン1は、マーカーである。
【図７】 図7は、pZTGL2およびpZTGL4で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株のルシフェラーゼ活性の測定結果を示す。ルシフェラーゼ活性の単位は、106個の菌における1秒間でのRLU（Relative Light Unit）で表示されている。
【図８】 図8は、pZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株中でのプラスミドの安定性を示す、当該細菌から抽出したプラスミドの電気泳動像である。レーン1は、非選択培地で40世代培養した形質転換体から抽出したプラスミド（試料A）を示し、そしてレーン2は、選択培地で40世代培養した形質転換体から抽出したプラスミド（試料B）を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、デイノコッカス属細菌の細胞内で複製可能な新規ベクター、デイノコッカス属細菌と大腸菌の両方の細胞内で複製可能な新規シャトルベクター、このシャトルベクターを組み込んでなるシャトルベクター、及びこれらシャトルベクターをデイノコッカス属細菌に導入することにより得られた形質転換株に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物の放射線耐性は、生物種によって大きく異なるが、放射線抵抗性細菌と総称される、放射線に抵抗性の微生物群が存在することが知られている。代表的な放射線抵抗性細菌として、デイノコッカス（Deinococcus）属細菌が知られており、現在までに７種類の菌種（D. radiodurans, D. radiopugnans, D. radiophilus, D. grandis, D. proteolyticus, D. geothermalis, D. murrayi）が同定されている（Ferreira et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47: 939-947, 1997）。そして、これらの菌の放射線耐性は、大腸菌の約100倍、ヒトの細胞の1,000倍以上であることも知られている。もしこれらの放射線抵抗性細菌に、難分解性の物質や毒性を持つ物質などを除去する際に使用される外来遺伝子を遺伝子工学的手法により導入して形質転換することができれば、これらの細菌を使用して放射性物質で汚染された廃棄物中に含まれる難分解性の物質や毒性を持つ物質などを除去することができると考えられている。
【０００３】
現在までに外来遺伝子をデイノコッカス属細菌に取り込ませ、異種タンパク質を発現させた例として、デイノコッカス・ラジオデュランスにおいてトルエンジオキシゲナーゼを発現させ、難分解性のトルエンをより分解しやすい物質に変換した例（Lange et al., Nature Biotechnol., 16: 929-933, 1998）、デイノコッカス・ラジオデュランスに2価水銀イオン還元酵素を発現させ、2価水銀イオンをより毒性の低い揮発性金属水銀に還元した例（Brim et al., Nature Biotechnol., 18: 85-90, 2000）が知られている。しかし、これまでに、デイノコッカス・ラジオデュランス以外のデイノコッカス属細菌を、外来遺伝子を含むプラスミドベクターで形質転換した例はない。また、これらの形質転換体の作製においては、デイノコッカス属細菌では自律複製できないインテグレーション型プラスミドが使用されているため、コピー数の制御ができない点、発現するタンパク質が少量である点、培養液に抗生物質の添加が必要である点、などの欠点が存在していた。
【０００４】
これらの欠点を克服すべく、デイノコッカス・ラジオデュランス／大腸菌シャトルベクターpRAD1が、D. radiodurans Sark株由来のプラスミドpUE10のレプリコンと大腸菌ベクターpMTL23を用いて開発された（MeimaおよびLidstrom, Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000）。しかしながら、これまでに、pRAD1を用いて、デイノコッカス・ラジオデュランス以外のデイノコッカス属細菌を形質転換したという報告はない。また、pRAD1の分配安定性が悪いため、pRAD1は抗生物質クロラムフェニコールを含む選択培地では安定に複製できるが、クロラムフェニコールを含まない非選択培地ではpRAD1を含有する細菌の出現頻度を高く維持することができず、したがって安定に存在できないという欠点を有している。この欠点は、外来遺伝子を導入した放射線抵抗性細菌を、野外開放系に放出する場合に特に問題になる。なぜなら、pRAD1を含有する細菌の出現頻度を高く維持するために、放射性物質で汚染された土壌や廃水などの環境中で抗生物質濃度を一定に保つことは非常に難しいばかりではなく、野外に抗生物質を放出することにより、必要のない抗生物質耐性菌の出現の可能性を高めることにもなり、かえって環境を汚染してしまうことにもなりかねないからである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明においては、デイノコッカス属細菌を形質転換するために有用な新規ベクターであって、デイノコッカス属細菌中で抗生物質などの選択圧のない条件において安定に存在できる新規ベクターを提供することを課題とする。本発明はさらに、デイノコッカス属細菌と大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターであって、抗生物質などの選択圧のない条件において安定に存在できる新規シャトルベクターを提供することもまた課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、鋭意研究を進めた結果、放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性プラスミドであるpUE30またはその誘導体を用いることにより、上述した課題を解決することができることを見いだし、本発明の課題を解決できることを示した。
【０００７】
すなわち、本発明は、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）ATCC19172株由来の内在性プラスミドpUE30またはその誘導体であって、デイノコッカス属細菌中で自律複製可能なプラスミドを提供することにより、本発明の上述した課題を解決することができる。
【０００８】
本発明はまた、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）ATCC19172株由来の内在性プラスミドpUE30またはその誘導体と、大腸菌（Escherichia coli）で自律複製可能なプラスミドまたはその誘導体を含み、デイノコッカス属細菌中および大腸菌中で複製可能なシャトルベクターを提供することにより、本発明の上述した課題を解決することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の一態様において、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性プラスミドまたはその誘導体であって、デイノコッカス属細菌中で自律複製可能なプラスミドを提供する。
【００１０】
本発明において、放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）としては、たとえばデイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株、DSM12027株などを使用することができる。本発明においては、デイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株を使用することが好ましい。デイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株は、American Type Culture Collection（P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA）から取得することができる。
【００１１】
本発明のプラスミドは、放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性のプラスミドであり、たとえば、ATCC19172株の場合にはpUE30、pUE31などが含まれる。本発明においては、pUE30を使用することが好ましい。このプラスミドpUE30は、例えば前記デイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172株を培養し、得られた菌体から公知のプラスミド調製法、例えば、SambrookおよびRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition （2001））に記載の調製法に基づいて得ることができる。pUE30のDNA塩基配列をSEQ ID NO: 1に示す。なお、pUE30は二本鎖環状DNAであるが、SEQ ID NO: 1に示した塩基配列は、pUE30の制限酵素NdeI認識部位を5'末端として示したものである。
【００１２】
本発明においては、SEQ ID NO: 1に示す塩基配列を有するpUE30そのものの他、その誘導体であって、デイノコッカス属細菌で自律複製可能なプラスミドも含まれる。本発明において使用する場合、プラスミドの「誘導体」とは、いずれかの改変を含むプラスミドであって、少なくとも複製に関わる領域を含むものをいう。改変の例としては、プラスミドのDNA配列中に存在する1またはそれ以上のヌクレオチド変異（たとえば、欠失、置換、または付加）、プラスミドのDNA配列中の特定の領域を含まない改変などが存在するが、これらのものには限定されない。たとえば、pUE30の誘導体としては、実質的にpUE30からその複製に関わる領域のみを含むもの、より具体的には、SEQ ID NO: 1に記載のpUE30のヌクレオチドの693から始まり417までからなる断片（ヌクレオチド693〜2467〜1〜417）や、pUE30またはその一部に他のDNA配列を挿入したもの、などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００１３】
このようにして作製されたプラスミドは、その起源である放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）のみならず、デイノコッカス属細菌において幅広く自律複製することができる。
【００１４】
本発明の別の一態様において、デイノコッカス属細菌とそれ以外の細菌との両方で自律複製することができるシャトルベクターを提供する。より具体的には、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性プラスミドpUE30またはその誘導体と、大腸菌（Escherichia coli）で自律複製可能なプラスミドまたはその誘導体とを含み、デイノコッカス属細菌中および大腸菌中で複製可能なシャトルベクターを提供する。
【００１５】
当該技術分野において、一般的にシャトルベクターとは、2種の生物のDNA複製機構を含み、場合によりさらに選択マーカーを含む、その2種の生物のどちらの細胞中でも自律複製することができるベクターをいう。したがって、本発明においては、デイノコッカス属細菌中で機能するDNA複製機構と、それ以外の細菌中で機能するDNA複製機構とを連結することにより、デイノコッカス属細菌およびそれ以外の細菌の両方で自律複製可能なシャトルベクターを作製することができる。このようなDNA複製機構としては、自律複製機能を有するプラスミドの全体、または複製機能を有するその誘導体を使用することができ、また、デイノコッカス属細菌以外の細菌としては、たとえば大腸菌が挙げられる。
【００１６】
本発明のデイノコッカス属細菌／大腸菌シャトルベクターを構築するために使用される、デイノコッカス属細菌中で機能するDNA複製機構としては、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性のプラスミドpUE30由来の配列、pUE31由来の配列、デイノコッカス・ラジオフィルス（Deinococcus radiophilus）由来の内在性プラスミドpUE1由来の配列などを使用することができる。好ましくは、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）由来の内在性のプラスミドpUE30またはその誘導体を使用する。
【００１７】
シャトルベクターの構築に用いるpUE30は、SEQ ID NO: 1に示す塩基配列すべてを用いてもよく、その一部を用いてもよい。一部を用いる場合は、pUE30の複製に関わる領域が含まれていることが必要であるが、複製に不要な領域は除いて用いてもよい。シャトルベクターに有用な外来遺伝子を組込んで使用する場合を考慮すると、複製に関わる領域以外の部分を除き、シャトルベクターの大きさをなるべく小さくすることが望ましい。pUE30を制限酵素で切断して得られる断片を、たとえば大腸菌で自律複製可能なプラスミドに連結し、得られる組換えプラスミドでデイノコッカス属細菌を形質転換し、デイノコッカス属細菌の形質転換体中に前記の組換えプラスミドが保持されていることを確認することによって、複製に必要な領域を決定することができる。適当な制限酵素部位が存在しない場合には、本発明の技術分野で公知の部位特異的変異生成法（Site-directed Mutagenesis）を用いて、特定の部位に新たな制限酵素切断部位を導入してもよい。また、SEQ ID NO: 1に示す塩基配列の一部を含む合成DNAをプライマーとし、pUE30を鋳型とするPCR法によって増幅したpUE30の部分断片を用いて、他の細菌で複製可能なプラスミドとの連結に使用してもよい。たとえば、そのような合成DNAプライマーの一例としては、SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO: 3で示した塩基配列をもつ合成DNA、あるいはSEQ ID NO: 4およびSEQ ID NO: 5で示した塩基配列をもつ合成DNAなどが挙げられる。
【００１８】
また、上述したシャトルベクターを構築するため、大腸菌中で機能するDNA複製機構として、本発明の技術分野で通常用いられているプラスミドベクターなどのいずれをも使用することができ、特に限定されるものではない。具体的には、たとえば、pUC18、pUC19、pHSG298、pHSG299、pBR322、pSC101、pGBM5等を使用することができる。これらのプラスミドベクターは、市場で購入することもできるし、当業者であれば国立遺伝子学研究所のクローニングベクターコレクション（〒411-8540静岡県三島市谷田1111）から入手することも可能である。これらのプラスミドについても、その全体を用いてもよく、あるいはその一部を用いてもよい。一部を用いる場合は、大腸菌中におけるプラスミドの複製に関わる領域が含まれている必要があるが、不要な領域は除いて使用してもよい。
【００１９】
本発明のプラスミドおよびシャトルベクターは、さらに、場合により選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子を使用することができる。これらの抗生物質耐性遺伝子は、たとえば上述した大腸菌プラスミドベクターに含まれており、たとえば、pUC18はアンピシリン耐性遺伝子、pHSG298はカナマイシン耐性遺伝子を有している。これらの抗生物質耐性遺伝子を、複製に必要な領域と共に、シャトルベクターの構築に用いることができる。
【００２０】
これらの選択マーカー遺伝子は、その上流にデイノコッカス属細菌で機能するプロモーター配列を連結することにより、シャトルベクター導入によるデイノコッカス属細菌の形質転換体取得の際のマーカー遺伝子として機能させることもできる。デイノコッカス属細菌で機能するプロモーター配列の例としては、Smith等（Plasmid, 22: 132-142, 1989）、Funayama等（Mutat. Res., 435: 151-161, 1999）、Meima等（J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001）に記載される、既知プロモーター配列等を挙げることができる。なお、得られたデイノコッカス属細菌の形質転換体の中で、抗生物質を含まない環境下においても、シャトルベクターが安定に存在することを確認できる場合には、その後の形質転換体の培養に抗生物質を添加する必要はない。
【００２１】
このようなシャトルベクターに、レポーター遺伝子をさらに組み込んだシャトルベクターを構築することもできる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、lacZ遺伝子、cat遺伝子などを使用できることが、当該技術分野において知られている。本発明においては、ルシフェラーゼ遺伝子として、たとえば北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）の宿主DNA由来のルシフェラーゼ遺伝子luxを使用する。レポーター遺伝子は、シャトルベクター中の適当な制限酵素部位に組み込むことができる。適当な制限酵素部位が存在しない場合には、大腸菌プラスミドベクター由来のマルチクローニング部位をシャトルベクターに挿入してもよい。本発明のデイノコッカス属細菌／大腸菌シャトルベクターには、大腸菌プラスミドベクター由来のマルチクローニング領域、またはその一部が挿入されているので、適当な制限酵素を使用して、ルシフェラーゼ遺伝子（もしくは、その他の外来遺伝子）を挿入することができる。レポーター遺伝子（もしくは、その他の外来遺伝子）がデイノコッカス属細菌中でうまく発現しない場合には、上記したようなデイノコッカス属細菌で機能するプロモーター配列を発現させたい遺伝子の上流に連結してもよい。
【００２２】
このようにして調製される本発明のシャトルベクターは、増殖速度の速い大腸菌を用いて大量に生産することができる。本発明のシャトルベクターによる大腸菌の形質転換法としては、たとえば、SambrookおよびRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition（2001））などに詳細に記載されている形質転換法を用いることができる。具体的には、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが含まれるが、これらのものには限定されない。また、本発明のシャトルベクターをデイノコッカス属細菌に導入して形質転換体を得るには、たとえばKitayama等（J. Bacteriol. 155: 1200-1207, 1983）、Meima等（Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000）記載の塩化カルシウム法を用いた自然形質転換法等を用いることができるが、これに限定されるものではない。シャトルベクターを導入するデイノコッカス属細菌としては、デイノコッカス・グランディス（D. grandis）、デイノコッカス・ラジオデュランス（D. radiodurans）ATCC13939株、デイノコッカス・ラジオデュランスATCC35073株（Sark株）などを使用することができる。より好ましくは、デイノコッカス・グランディス（D. grandis）ATCC43672株を使用する。デイノコッカス・グランディス（D. grandis）ATCC43672株は、上述したAmerican Type Culture Collectionから取得することができる。
【００２３】
【実施例】
本明細書の以下に、実施例を記載するが、以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためにのみ提供され、そして本発明の範囲をこれらの実施例により限定することを意図するものではない。
【００２４】
実施例 1 ：プラスミドの調製
（1）プラスミドの分離精製
American Type Culture Collectionから入手したデイノコッカス・ラジオプクナンスATCC19172株を、TGY培地（トリプトン-ペプトン0.5％、酵母エキス0.3％、グルコース0.1％）で24時間培養した後、遠心分離を行って菌体を集めた。QIAfilter Plasmid kit（Qiagen社製）を用いて、この菌体からプラスミド画分を抽出し、さらにアガロースゲル電気泳動によってプラスミドを分離精製した。その結果、約2.5 kbのプラスミドが見いだされた。Mackayら（Arch. Microbiol., 141: 91-94, 1985）は、デイノコッカス・ラジオプクナンスを電子顕微鏡観察し、大きさが約2.5 kbのプラスミドpUE30の存在を報告している。そこで、今回分離精製した2.5 kbのプラスミドをpUE30とした。
【００２５】
（2）塩基配列の決定
上記のように精製したpUE30の制限酵素地図を作製し、pUE30にはHincII部位が一カ所、Aor51HI部位が一カ所存在することを確認した。次に、pUE30をHincII（New England Biolabs, Inc.社製）で消化した2.5 kb断片、またはAor51HI（Takara Shuzo社製）で消化した2.5 kb断片を、上述のクローニングベクターコレクションから入手した大腸菌ベクタープラスミドpGBM5のマルチクローニング部位に連結したプラスミドを作製した。さらに、Kilo-sequence用Deletion kit（Takara Shuzo社製）を用いて、上記プラスミドの一部を段階的に欠失させたクローン（nested deletion clone）を作製した。続いて、これらの段階的に欠失させたクローンをテンプレートとして、市販のユニバーサルプライマーを用いて、ダイデオキシ・ターミネーション法によって、pUE30挿入部位の全DNA塩基配列を決定した。シークエンス反応は、BigDye Terminator Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社製）を用いて行い、電気泳動は、DNA Sequencer ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて行った。決定された全塩基配列をSEQ ID NO: 1に示す。
【００２６】
得られたヌクレオチド配列をさらに詳細に解析したところ、pUE30は全長で2467 bpを有し、267ヌクレオチドと1068ヌクレオチドの2つのオープンリーディングフレーム（ORF）を有していることがわかり、それぞれをrepCおよびrepDと命名した。repCにコードされるタンパク質RepCは、α-プロテオバクテリア（proteobacteria）のrepABC型プラスミドに見られるRepCと25.8〜31.6％のアミノ酸同一性を有し、またrepDにコードされるタンパク質RepDは、Thermus sp. YS45株のプラスミドpTsp45sのRepT、Thermus sp. ATCC27737株由来のプラスミドpMY1のRepA、デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）Sark株のプラスミドpUE10のRepUと、それぞれ26.6％、24.6％、26.8％のアミノ酸同一性を有していた。
【００２７】
実施例 2 ： シャトルベクターの構築
（1）pZT15の構築
pUE30を鋳型とし、SEQ ID NO: 2及びSEQ ID NO: 3に示した塩基配列をもつ合成DNAをプライマーとして、AmpliTaq Gold DNA polymerase（Applied Biosystems社製）を用いてPCR反応を行い、ヌクレオチド789から始まるpUE30の全塩基配列を含み、さらにその両末端に制限酵素SphI部位が付加されたPCR産物を得た。
【００２８】
続いて、大腸菌ベクターpUC19の複製開始領域、大腸菌中で機能するアンピシリン耐性遺伝子、デイノコッカス・ラジオデュランス中で機能するクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つプラスミドpKatCAT（Funayama et al., Mutat. Res., 435: 151-161, 1999）をSphIで消化し、上記PCR産物のSphI消化物と混合し、DNAリガーゼ（Takara社製）で連結した。
【００２９】
このように調製したプラスミドを、大腸菌JM109株にエレクトロポレーション法により導入し、大腸菌を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、pUE30とpKatCATが連結したプラスミド（約6.1 kb）を持つ株を選択し、該プラスミドをシャトルベクターpZT15と命名した。pZT15の構造を図1に示す。
【００３０】
（2）pZT17の構築
pUE30を鋳型として、SEQ ID NO: 4及びSEQ ID NO: 5に示した塩基配列をもつ合成DNAをプライマーとして、（1）と同様にPCR反応を行い、pUE30の塩基配列の一部（約2.3 kb、SEQ ID NO: 1のヌクレオチドの693から始まり417までからなる断片、ヌクレオチド693〜2467〜1〜417）を含み、さらにその両末端に制限酵素SphI部位が付加されたPCR産物を得た。
【００３１】
続いて、（1）と同様に、プラスミドpKatCATと連結したものを用いて、大腸菌JM109株を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換株の中から、pUE30の一部とpKatCATが連結したプラスミド（約5.8 kb）を持つ株を選択し、該プラスミドをシャトルベクターpZT17と命名した。pZT17の構造を図2に示す。
【００３２】
（3）シャトルベクターを用いたデイノコッカス属細菌の形質転換
デイノコッカス・グランディスATCC43672株およびデイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株を、上述したシャトルベクターpZT15又はpZT17で形質転換した。形質転換法は、Kitayama等の方法（J. Bacteriol., 155: 1200-1207, 1983）に準拠して、塩化カルシウム法にて行った。pZT15、pZT17のいずれのシャトルベクターを用いた場合も、クロラムフェニコール耐性株が得られた。これらの株より、QIAprep Miniprep Plasmid kit（Qiagen社製）を用いてプラスミド画分を抽出し、アガロースゲル電気泳動で解析して、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうか確認した。
【００３３】
結果を図3に示す。この図において、レーン1〜3はデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン4〜6はデイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株に由来するプラスミドをそれぞれ示しており、レーン1および4は無傷の細菌に由来するプラスミドを、レーン2および5はpZT15で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、そしてレーン3および6はpZT17で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、それぞれ示している。レーン1〜3において共通して見られるプラスミドは、デイノコッカス・グランディスATCC43672株の内在性プラスミド（約8 kb）を示す。これらの結果から、シャトルベクターであるpZT15およびpZT17はともに、デイノコッカス属細菌中において安定的に保持されていることが示された。
【００３４】
（4）シャトルベクターのデイノコッカス・グランディス中での安定性
pZT15又はpZT17を含むデイノコッカス・グランディスをクロラムフェニコール含有TGY培地で一夜培養した。続いて、上記培養液を256倍希釈して、クロラムフェニコールを含まないTGY培地に接種し、30℃で培養した。8世代分裂後の培養液を再度256倍希釈してクロラムフェニコールを含まないTGY培地に接種し、30℃で培養した。この操作を繰り返し、非選択培地で40世代まで分裂させた。
【００３５】
8世代分裂毎に、培養液の一部を取り、TGY平板培地ならびにクロラムフェニコール含有TGY平板培地に塗布し、培養液中の全生菌数に対するクロラムフェニコール耐性菌数の割合を測定した。対照として、MeimaおよびLidstrom（Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000）記載のデイノコッカス・大腸菌シャトルベクターpRAD1をデイノコッカス・グランディスに導入して得られた形質転換株中でのpRAD1の安定性についても同様に調べた。
【００３６】
結果を図4に示す。この結果によれば、pRAD1は、非選択培地中で安定に存在することが出来ないのに対して、pZT15およびpZT17は、非選択培地中においてもデイノコッカス・グランディス中で安定に保持されることが確認された。
【００３７】
実施例 3 ： ルシフェラーゼ遺伝子を持つシャトルベクターの構築
（1）pZTGL2およびpZTGL4の構築
デイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株のゲノムDNAを鋳型とし、SEQ ID NO: 6およびSEQ ID NO: 7に示した合成DNAをプライマーとして、Pfu Turbo DNA polymerase（Stratagene社製）を用いたPCR反応により、Meima等（J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001）記載のデイノコッカス・ラジオデュランスで機能する既知groELプロモーター領域（131 bp）を増幅した。続いて、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSP-lux+（Promega社製）をNcoIで消化後、T4 DNA polymerase （Takara社製）でDNA断片末端の平滑化を行った。さらに、上記のPCR産物を平滑化したpSP-lux+と連結し、pGroE-lux+2およびpGroE-lux+4（4,235 bp）を得た。
【００３８】
これらのプラスミドをHindIIIで消化し、切断末端を平滑化処理後、さらにEcoRVで消化し、groELプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を含むDNA断片を得た。続いて、このDNA断片をシャトルベクターpZT17のEcoRV部位に挿入し、pZTGL2およびpZTGL4（7,618 bp）を構築した。pZTGL2およびpZTGL4の構築の概要を図5に示す。構築したプラスミドでデイノコッカス・グランディスを形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。
【００３９】
（2）シャトルベクターを用いたデイノコッカス属細菌の形質転換
デイノコッカス・グランディスATCC43672株を、上述したシャトルベクターpZTGL2又はpZTGL4で形質転換した。形質転換法は、実施例2（3）の場合と同様にKitayama等の方法（J. Bacteriol., 155: 1200-1207, 1983）に準拠して、塩化カルシウム法にて行った。pZTGL2、pZTGL4のいずれのシャトルベクターを用いた場合も、クロラムフェニコール耐性株が得られた。これらの株より、QIAprep Miniprep Plasmid kit（Qiagen社製）を用いてプラスミド画分を抽出し、アガロースゲル電気泳動で解析して、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうか確認した。
【００４０】
結果を図6に示す。この図において、レーン2は無傷のデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン3はpZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、そしてレーン4はpZTGL4で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、それぞれ示している。レーン2〜4において共通して見られるプラスミドは、デイノコッカス・グランディスATCC43672株の内在性プラスミド（約8 kb）を示す。この結果から、シャトルベクターであるpZTGL2およびpZTGL4はともに、デイノコッカス属細菌中において安定的に保持されていることが示された。
【００４１】
（3）ルシフェラーゼ活性の検出
上記のようにして得た形質転換体をTGY培地中、30℃で培養した。24時間後、培養液10μlを等量のBright-Glo Luciferase Assay Solution（Promega社製）と混合し、1分後にその化学発光活性をLumi Imager F1（Roche Molecular Biochemicals社製）によって1分間測定した。測定結果を図7に示す。この測定により、groELプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が順向きに配置されたpZTGL2を含む形質転換体がルシフェラーゼを発現しており、プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が逆向きに配置されたpZTGL4を含む形質転換体はルシフェラーゼ活性を持たないことが確認された。
【００４２】
（4）pZTGL2のデイノコッカス・グランディス中での安定性
pZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスを、実施例2（4）と同様の操作により、クロラムフェニコールを含まないTGY培地で、40世代まで培養し、これを試料Aとした。また、この形質転換体をクロラムフェニコール含有TGY培地で40世代培養した試料も同時に作成し、これを試料Bとした。
【００４３】
試料Aおよび試料Bから抽出したプラスミドの電気泳動像を、図8に示す。レーン1は試料Aを示し、そしてレーン2は試料Bを示す。それぞれのレーンにおいて、上のバンドはデイノコッカス・グランディスATCC43672株の内在性のプラスミド（約8 kbのサイズ）を示し、下のバンドはpZTGL2（約7.6 kbのサイズ）を示している。試料Aから抽出したプラスミドのコピー数は、試料Bから抽出したプラスミドのコピー数と同程度であった。
【００４４】
次に、実施例3（3）と同様の操作で、試料Aおよび試料Bのルシフェラーゼ活性を測定したところ、試料Bのルシフェラーゼ活性に対する試料Aのルシフェラーゼ活性は、85±0.4％であった。この結果は、pZTGL2のデイノコッカス・グランディスにおける非選択培地中での安定性が、図4で示した、pZT17のデイノコッカス・グランディス中における安定性と同等であることを示している。したがって、pZT17に1.8 kbの外来遺伝子が挿入された構造を有するpZTGL2が、pZT17と同様に、非選択培地中において、デイノコッカス・グランディス中で安定に保持されることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、デイノコッカス属細菌由来の新規プラスミドおよび該プラスミドを用いたシャトルベクターが提供される。該シャトルベクターは、デイノコッカス属細菌および大腸菌の細胞内で自律複製できるため、ベクターDNAの組換え操作およびデイノコッカス属細菌への遺伝子導入に有用である。特に、放射性物質を含む廃棄物からの難分解性物質や毒性物質の除去、放射性重金属の捕集技術への応用が可能である。本発明のシャトルベクターは、非選択培地で宿主に安定に保持されるため、上記応用分野において、開放系、閉鎖系を問わず使用可能である。また、本発明のルシフェラーゼ遺伝子を持つシャトルベクターは、形質転換体の生育分布や環境へ及ぼす影響をモニタリングする際に有用である。
【００４６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、本発明のシャトルベクターpZT15の制限酵素地図である。
【図２】 図2は、本発明のシャトルベクターpZT17の制限酵素地図である。
【図３】 図3は、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうかを示す、アガロースゲル電気泳動像である。ここにおいて、レーン1〜3はデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン4〜6はデイノコッカス・ラジオデュランスATCC13939株に由来するプラスミドをそれぞれ示しており、レーン1および4は無傷の細菌に由来するプラスミドを、レーン2および5はpZT15で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、そしてレーン3および6はpZT17で形質転換した細菌に由来するプラスミドを、それぞれ示す。
【図４】 図4は、デイノコッカス・グランディスATCC43672株におけるシャトルベクターの安定性を調べた結果を示す。○はpZT15で形質転換した株、●はpZT17で形質転換した株、▲はpRAD1で形質転換した株を示す。縦軸は全生菌数に対するクロラムフェニコール耐性菌数の割合、横軸は増殖世代をそれぞれ表す。
【図５】 図5は、本発明のルシフェラーゼ遺伝子を含むシャトルベクターpZTGL2およびpZTGL4の構築手順の概要を示す図である。
【図６】 図6は、導入したプラスミドが形質転換株中に保持されているかどうかを示す、アガロースゲル電気泳動像である。ここにおいて、レーン2は無傷のデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミド、レーン3はpZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、そしてレーン4はpZTGL4で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株に由来するプラスミドを、それぞれ示す。レーン1は、マーカーである。
【図７】 図7は、pZTGL2およびpZTGL4で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株のルシフェラーゼ活性の測定結果を示す。ルシフェラーゼ活性の単位は、106個の菌における1秒間でのRLU（Relative Light Unit）で表示されている。
【図８】 図8は、pZTGL2で形質転換したデイノコッカス・グランディスATCC43672株中でのプラスミドの安定性を示す、当該細菌から抽出したプラスミドの電気泳動像である。レーン1は、非選択培地で40世代培養した形質転換体から抽出したプラスミド（試料A）を示し、そしてレーン2は、選択培地で40世代培養した形質転換体から抽出したプラスミド（試料B）を示す。
Claims (7)
- デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）ATCC19172由来の内在性プラスミドpUE30の断片であり、かつSEQ ID NO: 1の693〜2467〜1〜417番目の塩基配列からなるpUE30の複製に関与するpUE30の断片を含み、ただしデイノコッカス・ラジオプグナンスATCC19172由来の内在性プラスミドpUE30を除く、デイノコッカス属細菌中で自律複製可能なプラスミド。
- 形質転換したデイノコッカス属細菌中で、外来遺伝子を発現する、請求項1に記載のプラスミド。
- （1）デイノコッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）ATCC19172由来の内在性プラスミドpUE30断片で、かつSEQ ID NO: 1の693〜2467〜1〜417番目の塩基配列からなるpUE30のDNA複製領域の断片と、（2）大腸菌（Escherichia coli）で自律複製可能なプラスミドの両者のDNA複製領域配列を含み、デイノコッカス属細菌中および大腸菌中で複製可能なシャトルベクター。
- 大腸菌で自律複製可能なプラスミドが、pUC18、pUC19、pHSG298、pHSG299、pBR322、pSC101、およびpGBM5からなる群から選択される、請求項3に記載のシャトルベクター。
- さらにルシフェラーゼ酵素遺伝子を含む、請求項3または4に記載のシャトルベクター。
- 形質転換したデイノコッカス属細菌中で、外来遺伝子を発現することができる、請求項3〜5のいずれか1項に記載のシャトルベクター。
- 請求項3〜6のいずれか1項に記載のシャトルベクターを含む形質転換体。
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