JP3845447B2 - Type II treatment method for rheumatoid arthritis with collagen - Google Patents
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Description
本特許出願は、以下のものの一部継続出願である：
Weinerら、米国特許出願第９５１，５６５号、１９９２年９月２５日出願、これもまたWeinerら、米国特許出願第４６０，８５２号、１９９０年２月２１日出願および第５９６，９３６号、１９９０年１０月１５日出願（前者はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１３９号、１９８８年６月２４日出願の各国段階にあり、後者もＰＣＴ／ＵＳ９１／０７５４２号の同じ段階）の一部継続出願であり、これらもまた米国特許出願第０６５，７３４号、１９８７年６月２４日出願、現在放棄、の一部継続出願である；
Weinerら、米国特許出願第４５４，８０６号、１９８９年１２月２０日出願；
Weinerら、米国特許出願第４８７，７３２号、１９９０年３月２日出願；
Weinerら、米国特許出願第８０９，２０６号、１９９１年１２月１３日出願、これはWeinerら、米国特許出願第５５１，６３２号、１９９０年７月１０日出願の一部継続出願であり、これは、米国特許出願第３７９，７７８号、１９８９年７月１４日出願、（現在放棄）の一部継続出願である；
Weinerら、米国特許出願第５９５，４６８号、１９９０年１０月１０日出願；および
Weinerら、米国特許出願第８４３，７５２号、１９９２年２月２８日出願。
前述の出願はここでそのまま文献として記載されている。
発明の分野
本発明は、ヒトにおける自己免疫関節炎の治療に関係している。特に本発明は、リウマチ性およびより一般的には自己免疫関節炎に関与する自己免疫応答特異的抑制を誘導するための、ヒトへのコラーゲンまたはフラグメントまたはアナログの経口、経腸、吸入投与に関している。本発明はまた、全コラーゲン、その関節炎抑制性ペプチドフラグメント、および前述のものの２種以上の組み合わせを含む、ヒトにおける関節炎の治療に有用な治療薬に関する。
発明の背景
コラーゲンはヒトまたは哺乳類の体の構造支持（structural supprot）において最も一般的なタンパク質である。コラーゲンの基本的な構成単位は、トロポコラーゲンである。トロポコラーゲンは、同じサイズの３本のポリペプチド鎖で構成されている。これらの鎖は、互いに巻き付いてスーパーヘリックスのケーブル（superhelical cable）、または３重鎖らせんのロッド（rod）を形成している。トロポコラーゲンの３本の鎖の各々が、約千のアミノ酸残基から構成されている。
５つの異なるタイプのコラーゲンタンパク質が、現在、別々の異なるアミノ酸構成と長さを有するものとして知られている。タイプＩコラーゲンは、２つのアルファ-１（Ｉ）と１つのアルファ-２ポリペプチド鎖から構成されている。タイプＩコラーゲンは、主として、皮膚組織、腱、骨の支持構造中、および眼の角膜中に見いだされる。タイプIIコラーゲンは、アルファ-１（II）タイプの３本のポリペプチド鎖を含み、主に関節の軟骨中、椎間円板内部、眼内部のガラス体中で見いだされる。タイプIIIコラーゲンは、３本のアルファ-１（III）ポリペプチド鎖から構成され、胎児の皮膚、心血管系（cardiovascular system）、および眼中の細網線維（reticular fibers）等の組織中に見いだされる。タイプIVコラーゲンは２つのアルファ-１（IV）と１つのアルファ-２（IV）ポリペプチド鎖の混合物であり、主に基礎膜（basement membranes）中に見いだされる。最後にタイプＶコラーゲンは２つのアルファ-１（Ｖ）と１つのアルファ-２（Ｖ）ポリペプチド鎖を有しており、例えば胎盤や皮膚中に見いだされる。ヒトアルファ-１（II）、ウシアルファ-１（II）、およびウシアルファ-１（Ｉ）アミノ酸配列の比較は、付録Ａに記載されている。ウシ配列は一部のものである。
リウマチ性関節炎は、細胞媒介自己免疫疾患、すなわち免疫システムが誤って自分自身の体の組織を外来のものと認識し、それに対して異常な免疫応答をおこす状態である。リウマチ性関節炎は、軟骨の破壊と骨の侵食を起こし、末梢関節の構造変形を引きおこす、しつこい炎症性の滑膜炎によって特徴づけられる。タイプIIコラーゲンが主要成分である関節軟骨を含む関節は、特に影響されやすい。
リウマチ性関節炎は、関節の腫張、炎症、および特に屈曲の際の（upon flexing）硬直と痛みを伴う。関節炎が進んだ状態では、関節をほんの少し動かしただけで衰弱させる痛みがおこることもある。かなりの割合の患者が、コラーゲンに特異的に反応するＣＤ４＋タイプのＴ細胞を有しており、および／またはコラーゲンに対する異常な体液性反応を有している。
関節炎の現在の治療としては、非特異的細胞毒性の免疫抑制剤の使用がある。これらの薬剤は、全免疫システムを抑制し、異常な自己免疫応答を選択的に抑制することができない。この免疫システムを長期間全体的に抑制することは、感染の危険性を増加させる。そのような免疫抑制剤の非制限的な例としては、メトトレキセート、シクロフォスファミド、イムラン（アザチオプリン）、サイクロスポリンＡ（cyclosporin A）などがある。
また、これらの非特異的細胞毒性の免疫抑制剤による長期治療は有害な副作用を伴い、これには、ある種の悪性腫瘍、腎臓疾患、糖尿病、肝臓機能異常の進展に向かう傾向の増加が含まれる。さらに細胞毒性免疫抑制剤治療は、疾病の進展を単に遅らせるだけであり、治療が中断された後に、加速されたペースで再発する。例えば、そのような薬剤が中断された後約６週間後に、患者は治療が始められる前と同じ状態まで悪化する。さらにこれらの薬剤の効果は、それ自体制限されている。これらは徐々に、約２−５年後に効果を失う。
例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン（これらもまた非特異的免疫抑制性の抗炎症剤である）、などのステロイド化合物もまた症状の軽減に用いられる。ステロイドもまた、その長期間使用に伴って、非常に有害な副作用を有する。
したがって、現在の関節炎の治療は効果が制限されており、非常に有害な副作用を含み、無制限に使用することができない。リウマチ性関節炎は、米国内で毎年ニ百万人が患っている。したがって、上記欠点の１つ以上を受けることのないヒト自己免疫関節炎の新規治療と新規治療用組成物に対する要望が高い。
これに代わる関節炎の治療は、本発明者により提案された経口抗原寛容治療である。これは、特定の自己免疫疾患特異的に関与する自己免疫応答を抑制することができ、したがって他の免疫機能を本質的にそのままに残す、１つ以上の組織特異的抗原（すなわち自己免疫攻撃を受けている組織にのみおこる抗原）の経口、経腸、吸入投与を含む。
このアプローチに一般的に有用な抗原は自己抗原、すなわちそれ自体自己免疫攻撃の原因（subject）である組織特異的抗原を含む。バイスタンダー抗原、これらもまた組織特異的（しかし自己免疫攻撃の標的ではない）であるが、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ-β）の放出によって免疫抑制活性を作用させている患部細胞を標的としているサプレッサーＴ細胞を誘引する能力も有する。ＴＧＦ-βは順に患部細胞の周囲に集中しているすべての免疫細胞をダウンレギュレートし、かくしてその箇所の免疫応答を抑制する。バイスタンダー抗原は自己抗原の制限部分なしに、（ｉ）それ自体自己免疫攻撃の標的ではなく、（ii）サプレッサーＴ細胞の誘引を介する必要な抑制活性を有することを含む。
本発明の研究の前には、関節炎の為の経口抗原寛容治療は、動物における人工的に誘導された関節炎様疾患（アジュバンド関節炎およびコラーゲン誘導関節炎）においてのみ試みられていた。
ヒト自己免疫関節炎とその動物（齧歯動物）モデルとの間に相関性が存在するかも知れないのにもかかわらず、経口、経腸、吸入抗原寛容は、関節炎を患うヒトにおいて試みられていなかった。さらに齧歯動物のモデルでは、コラーゲンは疾患の誘導を防止することだけが示されており、前に誘導された疾患（pre-induced disease）については全くまたは最小限の効果しか示されなかった。
関節炎とそのモデルにおけるコラーゲンの役割は、多くの出版物の対象となっており、いくつかは、齧歯動物モデルにおける疾患誘導を防止するためのコラーゲンの経口用途が記載されている。年代順にまとめた技術の概要は以下の通りである。
人工的に誘導された細胞媒介自己免疫関節炎モデルにおいて、コラーゲンは自己免疫攻撃を受ける組織であることが、Trentham D.E.ら、J.Clin.Invest.,66:1109-1117,Nov.1980によって示された。著者らは、タイプＩとタイプIIコラーゲンに対する体液性と細胞性の両方の自己免疫が、ラットにおけるアジュバント-およびコラーゲン-誘導関節炎の両方の特徴であることを示した。
Schoen,R.T.らJ.Immunol.,128:717-719,１９８２年２月、では、タイプIIコラーゲンと異なり、タイプＩコラーゲンを人工的にネイティブの脾臓細胞に結合し、正常動物に接種したものは、関節炎様疾患の誘導を防止するためには効果がないことを見いだした。
Thompson,H.S.G.らClin.Exp.Immunol.,64:581-586,1986は、可溶性タイプIIコラーゲンタンパク質（２．５または２５μｇ／ｇ体重／５日間）の予防的胃内投与の後の、ラットにおける多発性関節炎モデルの誘導に対する耐性を報告した。最小量、２．５μｇ／ｇ、はやや効果が高かった。
Nagler-Anderson,C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:１９８６年１０月、pp.260-262は、未変性の（undenatured）可溶性タイプIIコラーゲンの予防的胃内投与（５００μｇ／マウス／６週間に１２回）は、アジュバントとコラーゲンの混合物とを用いた挑戦により、DBA/1 Lac Jマウスにおいて関節炎の誘導を抑制することを見いだした。
Myers,L.K.らJ.Immunol.,143:3976-3980，１９８９年１２月、は、タイプＩでなくタイプIIコラーゲンタンパク質の静脈内投与は、動物モデルにおいて実質的に誘導された関節炎様疾患に対する耐性を与えるかも知れないことを報告した。これに続く発表で、同じグルーブは、J.Exp.Med.,170:1999-2010，１９８９年１２月、は同じ主張の他の３つの文献：Schoenら，上記；Cremer,J.Immunol.,87:2995,1983;およびEnglert,Cell.Immunol.,87:357,1984を引用している。
この同じJ.Exp.Med.発表では、著者らは、挑戦の前にマウスへの静脈内投与において、コラーゲン誘導関節炎に対する防御を与えた、ニワトリタイプIIコラーゲンのフラグメント（アミノ酸残基１２２−１４７に対応するＣＢ１１）を同定したと述べている。
要約すると、最も関連する分野の教示は以下のものにすぎない：
− 実験は誘導動物モデルにおいてのみ行われた；
− 試験された動物は、疾患誘導を受けやすい種に制限されていた；
− 治療はすでに誘導された疾患には効果がなかった；
− タイプＩコラーゲンの静脈内投与は治療誘導を防止する効果がなかった；
− マウスへ静脈内投与されたひよこ（chick）タイプIIコラーゲンの１つの免疫抑制エピトープが同定された。
本発明の目的
本発明の目的は、リウマチ性関節炎と多発性軟骨炎を限定されることなく包含するヒトの自己免疫性関節炎のための治療の提供である。
本発明の別な目的は、異常免疫応答での軟骨への攻撃と、その結果として起こる生存するヒト中の部分軟骨（subchondral）の骨の変質を特に抑制することである。
本発明の付加の目的は、通常的な治療と共同される１またはそれ以上と同様、生存するヒトにおける望ましくない副作用なく、自己免疫性関節炎の臨床的な治療を提供することである。
本発明の更なる目的は、哺乳動物、特にヒト中の関節の腫脹、炎症、硬直および疼痛の１またはそれ以上のような関節炎に共同される症状を有意に減じることである。
本発明のまたさらに別な目的は、ヒトのリウマリ性関節炎の治療において有効な製薬の組成物の提供である。
本発明は、ここに添付された図面について更に述べられる：
図１は、腫脹した関節の平均値±登録での標準誤差と、コラーゲン（・）とプラシーボ（placebo）（ｏ）で治療した患者のための各月毎の追跡である。コラーゲンとプラシーボ間の有意な差（ｐ＝0.026）は変動の反復量によって示される。図２は全コラーゲンの抑制能力を示す。
図３はＣＤＰ１が１，１０及び１００μｇで試験されかつ１００μｇで著しい抑制を示す実験の結果を表す。
図４は１μｇと１０μｇでのＣＤＰ２が何らかの、特にＡＡの早期段階での抑制を誘導したことの別な実験を示す。
図５は１および１０μｇでのＣＤＰ３が抑制を誘導したことの第４の実験を示す。
要するに、１００μｇでのＣＤＰ１、１０と１μｇでのＣＤＰ２及び１と１０μｇでのＣＤＰ３は何らかの抑制を明らかに誘導した。
発明の概要
前述した目的の１つまたはそれ以上は、コラーゲンタンパク質またはそれのペプチドフラグメントまたは有効量の共力剤（synergist）を持つまたは持たない前述のもののアナログの少なくとも１種を備えた経口、経腸または吸入での投与のための製薬の組成物の提供によって、かつ有効量の前記組成物の罹患したヒトへの経口、経腸または吸入による投与を備える同様の関節炎を治療する方法の提供によって、ヒトにおける自己免疫性関節炎の治療的処置において達成される。
本発明の詳細な説明
全ての特許出願、特許およびこの明細書中に引用された参考文献はそれらの全体の中で参考によってここに合同される。不一致の場合において、現開示に包含されるその定義と解釈はこの中に説明されるであろうことが含まれる。
定義
この開示中に使用された以下のそれぞれの用語は、以下に定義する意味を持つべきである：
”治療（Treatment）”は、関節炎に包含される生体の自身の軟骨に対して異常な免疫応答の発病と発現の予防と同じく関節炎の発病と発現を予防する予防的測定の両方を含む。その用語はまた、自己免疫性関節炎の発病（例えば臨床的な証明）後の臨床的症状の軽減または消去と同様に生体の自身のコラーゲンまたは通常の軟骨への異常な（細胞及び／又は体液）免疫応答の抑制または鎮静を包含する。
”哺乳動物”は、免疫システムを有しかつ自己免疫疾患に罹り易い何らかの生体である。この用語はヒトを包含する。
”自己免疫疾患”は、哺乳動物の免疫システムの機能不全として表され、ここでその免疫システムは、その哺乳類内部の外来物質および／または自己組織または物質との間の区別する事ができず、その結果自己組織および物質を、それらが外来であるように扱い、それらに対する免疫応答をおこす。
コラーゲン蛋白質のタイプＩ、タイプII又はタイプIIIの”活性フラグメント”はコラーゲン蛋白質の部分的なアミノ酸配列の１またはそれ以上を必須的に備え、かつ経口、経腸または吸入により投与についてのコラーゲンへのＴ細胞を介した又はＴ細胞依存の免疫応答の抑制又は消去する能力を所有する何れかの合成ペプチドまたはポリペプチド構造体と特徴付けられる。この定義は、インビトロでの、例えばリンパ球増殖アッセイにおける、またはインビボ、例えば齧歯動物モデルまたはヒトにおける自己免疫応答の抑制をもたらすことがないコラーゲン蛋白質のフラグメントは除外する。
コラーゲン蛋白質のタイプＩ、タイプII又はタイプIIIの”活性アナログ（Active analogs）フラグメント”は、コラーゲン蛋白質のタイプＩ、タイプII又はタイプIIIまたはそれらのフラグメントに構造的に関連した化合物を包含する。同様に、その用語は、経口、経腸または吸入により投与についてのコラーゲンへのＴ細胞を介した又はＴ細胞依存の免疫応答の抑制又は消去する能力を所有するアルファ１（ＩまたはII）とアルファ２（Ｉ）トロポコラーゲンポリペプチド鎖またはそれのフラグメントの何れかに限定されることのない組み合わせを包含する。その用語”アナログ”はまた、関節炎の免疫応答を抑制するための実質的に等価の能力を保持しているまでの時間、１またはそれ以上のアミノ酸によってアルファ１（Ｉ、IIまたはIII）および／またはアルファ２（Ｉ）トロポコラーゲンポリペプチド鎖のアミノ酸配列とは異なる何らかのポリペプチドをも包含する。
”共力剤”は、コラーゲン蛋白質または少なくとも１種の活性フラグメントまたはそれらのアナログの投与と連係して経口、経腸または吸入により投与される時に、関節炎の臨床的及び／又は組織学的な明示の抑制の発揚または増大する物質として表される。先の文章中で使用され、かつこの明細書中のそれ以外に”と共同して”（また、合同して、もこの中に係わる）はコラーゲン蛋白質または少なくとも１種の活性フラグメントまたはそれらのアナログの投与と実質的に同時に又はその後までを意味する。当然、共同された物質の投与は、最初に使いきった投与された物質の適切な効果の時間の間隔となることによってコラーゲンの投与が先立つことなくあるいは後続することなくすべきである。それ故、共力剤はコラーゲン蛋白質またはそれの生物学的な活性ペプチドフラグメントの約２４時間以前または以後、好適には約１週間以内に通例は投与されるべきである。
”経口”投与は、経口、経腸または胃内投与を包含する。胃を迂回することのない経口投与は好ましい。
本発明は、タイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲンまたはそれの生物学的に活性なペプチドフラグメントの少量の経口、経腸または吸入による投与がＴ細胞を介しまたはＴ細胞依存の自己免疫の抑制、殊にヒトにおけるリウマチ性関節炎に特に有効であることの発見と確証に基づく。かくて、以下に例示した如く、本発明に教示されたように、タイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲンまたは活性フラグメントまたはそれらの少なくとも１種のアナログのうちの少なくとも１種の経口、経腸または吸入による投与の簡単な方法は、関節炎の進展を抑制する治療に有効である。さらに、本発明の組成物と方法は、上述した欠点を有することなく、かつ従来技術の治療または一時的鎮静化の薬剤と技法と共同される。
経口、経腸または経吸入で誘導された寛容は、経口、経腸と吸入投薬量の広い範囲にわたって投薬量に依存する。しかしながら有効な投薬量の最小値と最大値がある。当業者によって理解されるように、このことは、全蛋白質あるいは分断ペプチドフラグメントまたはアナログであるかという、投与されるコラーゲン蛋白質のタイプの機能によって、そのペプチドまたはポリペプチドの溶解性と純度と同様に、変化する特有な投薬範囲内で、関節炎の臨床的及び病理的な症状の両方の抑制が起こることを意味する。さらに、患者の年齢、性別と身体的条件、同じく別な兼用する治療では、治療のためのコラーゲン蛋白質の有効な投薬量に挙動を有するように投与される。その結果、投薬の使用と投与予定の調整および改良はこれらのファクターに基づいて決定される必要があり、かつ実験的に決定する必要があるであろう。そのような決定は、しかしながら通常的な実験以下のものが要求される。タイプIIコラーゲンとそのフラグメントは最も好ましい。
一般に、関節炎におけるヒト体内コラーゲンに対する免疫応答の抑制を達成する好適な手段は、精製された又は高度に精製された水溶性の全部のタイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲン蛋白質またはその生物学的に活性なペプチドフラグメントを約０．０５から約１０ｍｇ／１日の量、経口、経腸または吸入による投与である。コラーゲンまたはそれの生物学的に活性なペプチドフラグメントの投与は、単一投薬形態または複数投薬形態で達成して良い。好適には、その全体のコラーゲン蛋白質は１日あたり０．１から１ミリグラムの投薬量で投与され、かつこの投薬は殊に好適にはタイプIIコラーゲンである。上述の投薬は、他のタイプのコラーゲン、同じくそのフラグメントとアナログでも容易に行われ、現記載に照らして、かつ３マイクログラム／１日のような少量のタイプIIコラーゲン量でのラットにおける免疫抑制の事実に照らして、その好適な量は３０マイクログラム／１日であり、１日あたり３００マイクログラムの量は有効性を欠くとして高過ぎる。Z.J.Zhangら、J.Immunol. 145:2489-2493,1990。
加えて、共力剤は、上述の有効性を増強するために治療において共同させることができる。本発明において使用される共力剤の限定されない実例は、大腸菌（E.Coli）とサルモネラ菌（Salmonella）の各種サブタイプのようなグラム陰性菌の広い種類からの細菌性リポポリサッカリド（LPS,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;Difco,Detroit,MI;BIOMOL Res.Labs.,Plymouth,PA）、リピドＡ（Lipid A,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;ICN Biochemicals,Cleveland,OH;Polysciences,Inc.,Warrington,PA）と、ブラウンの文献（Braun,V.,Biochim.Biophys.Acta 435:335-337,1976）の開示から得ることのできるトリパルミトイル-Ｓ-グリカリルシステイニル-セリル-セリン（Ｐ3Ｃ５５）に共有結合されるペプチドのような免疫調整性（immunoregulatory）リポプロテイン、を包含する。ＬＰＳが好適であり、リピドＡが殊に好適である。リピドＡは、全体のＬＰＳ分子よりも毒性が小さいことから本発明に用いるために特に好適である。本発明で用いるＬＰＳは、グラム陰性菌から抽出し、Galanesら（Eur.J.Biochem.9:245,1969）とSkelly,R.R.,ら（Infect.Immun.23:287,1979）の方法を用いて精製することができる。
処方（formulations）
別な態様において、本発明はまた、関節炎の動物モデルの自己免疫性関節炎を抑制する有効な量のコラーゲンプロテイン全部または生物学的に活性なペプチドフラグメント（以下に開示されるような）またはアナログを備えた、関節炎に罹った哺乳動物を治療するための経口製薬処方を提供する。その処方は、1990年3月2日提出の同時継続米国特許出願第487,732号に開示されているような共力剤（本発明の寛容抗原に共同される）を、関節炎の臨床的症状を治療するのに有効な量で、任意に更に備えている。タイプＩまたはタイプIIまたはタイプIIIコラーゲン蛋白質全体またはそれの活性ペプチドフラグメントまたはアナログと共同して投与される時、共力剤は、免疫攻撃下でコラーゲン組織の付近においてサイトキンＰＧＥ（プロスタグランジン-Ｅ）とＩＬ-４（インターロイキン-４）の増加の原因となる。可溶性コラーゲン、好適にはタイプIIまたはタイプIII、最も好ましくは酸性ｐＨ（例えば０．０１Ｍ酢酸）と一緒のタイプIIを含む液体水性処方が好適である。そのｐＨ調整薬はなんらかの製薬上許容される酸性物質とすることができ、また緩衝剤を含んでいて良い。好適なｐＨの範囲は４から５である。固体組成物はまた、０．０１Ｍ酢酸のような酸性の水性媒質で溶解した後に投与するのが好ましい。
この検討を通して、本発明の治療に従う関節炎の一様な１つの症状のなんらかの臨床的または統計学的に有意な希薄化（attenuation）は本発明の範囲内であるということが理解されるであろう。そのような症状は、関節圧痛、関節腫脹、ＡＭ硬直、握力低下、歩行力低下を含む。通常の個人において、上述した最初の３つの症状はなく、５０フィート歩行は９秒以下であり、成人の握力は２００ｍｍＨｇ以上である（年齢、性別および身体的条件の各種でのそれぞれの強度）。臨床的に有意な希薄化とは、患者により認識されるもの（圧痛または一般的な健康状態（well-being）のケースなど）及び／又は医師により認識されるもの（関節腫張のケースなど）を意味する。例えば、関節炎の関節に一様な腫脹または圧痛の認識の相違は有意差がある。それらのパラメータのために、５０フィート歩行のケースでの１秒、または握力のケースでの５ｍｍＨｇ、ＡＭ硬直の１５分の差は有意であるとして測定され得る。
加えて、細胞毒性薬または他の抗炎症薬の投与からの抑制能力もまた有意である。即ち、たとえ患者が改善されなくとも、彼／彼女がもし細胞毒性薬及び／又は抗炎症薬投与を再開する必要が無いならば有意な恩恵を亨受されているとさらに思うし、またその患者はこれらの通常薬剤とともに同一な状態または進展する疾患段階が保たれる。
本発明による経口、経腸または吸入の各組成物は、当該分野で周知であるような製薬上許容される媒質、希釈剤、充填剤、可溶化または乳化剤および塩類を包含する不活性な成分を任意に含んで良い。例えば錠剤は当該分野で周知の固体媒質を用いて通常の作製法に従って組成物として良い。本発明において用いられるカプセルは、ゼラチン、またはセルロース誘導体のようななんらかの製薬上許容される材料から作製して良い。徐放性経口デリバリーシステム（sustained release oral delivery systems）及び／又は経口投与投薬形態のための腸溶性コーティング（enteric coatings）は、例えば1985年12月3日付で発行された米国特許第4,556,552号；1982年1月5日付で発行された米国特許第4,309,404号；及び1982年1月5日付で発行された米国特許第4,309,406号のそれらに記載された事項が考慮される。
固体媒質の実例は、デンプン、糖、ベントナイト、シリカ及び他の慣用される媒質が包含される。本発明の組成物において使用して良い媒質と希釈剤の更なる非限定的な実例は、塩類溶液、シロップ、デキストロースおよび水を含む。
必要とされる有効量が投薬ユニット（カプセルまたは錠剤またはそれらの組み合わせのような）の複数の投与によって到達可能であることから、活性な成分、それ自身の有効量中で必要でない各投薬形態の個別投薬量が含まれる、コラーゲンの全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログのユニット含有量は判断されるであろう。有効な投薬量の投与は単一投薬形態または複数投薬形態として良く、またそれは退化マトリックス（degradable matrix）またはレザバー（reservoir）のような腸溶性コーティング及び／又は徐放性メカニズムとともに提供して良い。
コラーゲン蛋白質の全体またはそれの生物学的に活性なペプチドフラグメントが経口または経腸で導入される場合、それらを別な摂取可能な形態とともに混合しかつ固体、半固体溶液、懸濁液、または乳化形態中に存在させても良い。それにはまた、製薬上許容される媒質、フレーバー増強剤、水、懸濁化剤、および乳化剤を共同し又は代替的に混合して良い。
共力剤、例えば、タイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲンの全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログと共同して投与して良い、ＬＰＳまたはリピドＡ、の共力剤の量は、１日あたり約０．０１から１００ｍｇの範囲内とされ、かつ１日あたり０．１ｍｇから１０ｍｇの間が好ましい。
本発明の代替される好適な実施態様において、本発明での製薬組成物または投薬形態は、吸入、好ましくはエアゾール形態によって関節炎に罹患したヒトに対して投与することも可能である。投与の吸入モードは、好ましくは鼻粘膜を透過せずに気管支及び肺粘膜を通る。本発明のコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログのより低い量は、1989年12月20日付提出の同時継続の米国特許出願第454,486号に記載されたようなコラーゲンとともにアジュバント関節炎（aduvant arthritis）で処置する時に見出されているような関節炎治療のためのエアゾール投与を用いることが望ましいだろうことが予期される。エアゾール投薬形態において投与しても良い本発明のコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログの量は、１日あたり約０．０１ｍｇから約５ｍｇの間（好ましくは１日あたり０．０１から０．５ｍｇ）とされ、かつ１日あたり約０．０１から約１００ｍｇの間の範囲の量の共力剤を任意に含めて良く、かつ単一投薬形態または複数投薬形態で投与して良い。投与されるべき正確な量は患者の病気の状態と重さ及び患者の身体的条件とによって変更して良い。
本発明のエアゾール製薬組成物は、任意な成分として、製薬上許容される媒質、希釈剤、可溶化剤と乳化剤、及び当該分野で周知であるタイプの塩類を包含して良い。そのような物質の限定されない実例は、生理的に緩衝化した塩類溶液、及び水のような通常の塩溶液を包含する。
本発明のこの代替される実施態様によるコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログの投与のルートは、エアゾールまたは吸入形態である。共力剤を持つ又は持たないコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントは、乾燥粉末粒子または好適にはキャリアガス（例えば空気またはＮ2）中に懸濁した霧化された水溶液として投与することができる。好適なエアゾール製薬組成物は、例えば、本発明によるコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログを約０．０１ミリグラムから約５（好適には約０．５まで）ミリグラムの間で含んでいる生理的に許容される緩衝化された塩溶液を備えて良い。
液体中に溶解または懸濁されていないコラーゲン全体またはその生物学的に活性なペプチドフラグメントの固体粒子を細かく分散した形態のドライエアゾール（dry aerosol）は、本発明の実践においてまた有用である。コラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログは、散布される粉末の形態において１から５ミクロン、好ましくは２から３ミクロンの平均粒径を有する細かく分散された粒子を含んでいて良い。細かく分散された粒子は、当該分野で周知の技法を用いた粉末化とスクリーンろ過によって調製して良い。その粒子は、粉末の形態とすることができる、細かく分散された材料の予定された量を吸入することによって投与して良い。
本発明のエアゾール製薬組成物において有用である媒質及び／又は希釈剤の特有な限定されない実例は、水と、ｐＨ７．０−８．０のリン酸塩緩衝溶液のような生理学的に許容される緩衝塩溶液とを包含する。本発明のエアゾール製薬組成物または投薬形態において使用される適当な媒質または希釈剤の任意な限定されない実例は、1987年4月21日付で発行された米国特許第4,659,696号；1989年9月5日付で発行された同第4,863,720号；及び1987年10月6日付で発行された同第4,698,332号中に開示されている。
本発明の製薬組成物は、例えば、1986年11月25日付で発行された米国特許第4,624,251号；1972年11月21日付発行の同第3,703,173号；1971年2月9日付発行の同第3,561,444号及び1971年1月13日発行の同第4,635,627号中に開示されたようなネブライザーを用いたエアゾールスプレーの形態において投与して良い。そのエアゾール材料は治療されるべき患者によって吸入される。Newman,S.P.in Aerosols and the Lung、Clarke,S.W.とDavia,D.,eds.,pp.197-224,Butterworths,London,England,1984、中に開示されたような加圧計量投薬吸入器（pressurized metered dose inhaler;MDI）と乾燥粉末吸入器（dry powder inhaler）のような他のエアゾールデリバリーシステムが、本発明を実践する際に用いることができる。
ここに開示されたタイプのエアゾールデリバリーシステムは、Fisons Corporation(Bedford,MA)、Schering Corp.(Kenilworth,NJ）及びAmerican Pharmoseal Co.（Valencia,CA）を含む各種市販品が用いられる。
本発明ではまた、経口投与した時に動物モデルにおける関節炎の抑制を誘発する、タイプIIコラーゲン蛋白質の生物学的に活性なペプチドフラグメントを発見している。これらのペプチドフラグメントの大部分は本発明以前には記載され又は示唆されておらず、かつ以前の経口寛容剤として使用されたものはない。経口寛容活性をもつペプチドの経口、経腸又は吸入による投与は、コラーゲン蛋白質の自己免疫応答を誘導する部分に対する哺乳動物の感作の危険の無い完全なコラーゲン蛋白質の投与よりも、より好都合であり及び／又は自己免疫抑制を引出すことにおいて特異的であることが予見される。任意な免疫抑制ペプチドは、本明細書、特許請求の範囲および図面に照して通例の実験によって検証することができる。
リウマチ性関節炎に罹患したヒトからのＴ細胞は、例えば末梢の血液と分離されかつクローン化が可能なＣＤ8+タイプのＴ細胞、から収集することができる。コラーゲン全体に応答するＴＧＦ-βを分泌するそれらのＣＤ8+Ｔ細胞は、分離され、クローン化され、かつコラーゲンペプチドフラグメントによって（その存在中）刺激された時、ＴＧＦ-βを分泌するそれらの能力のための試験をするインビトロアッセイに用いる。これら細胞のＴＧＦ-β分泌の能力は、例えばコラーゲン全体の存在中、例えばトランスウェルシステム（transwell system）中、のＣＤ4+コラーゲン-反応Ｔ細胞の増殖の抑制のモニタリングによって評価することができる。ＴＧＦ-βを分泌するＣＤ8+Ｔ細胞を刺激するコラーゲン ペプチドフラグメントは経口的に免疫寛容を生じるであろう。そのような実験が、1992年2月28日付で提出された米国特許出願第843,752号中に開示されている。ヒトのＴ細胞の分離とクローン化のための方法は、1990年3月30日付で提出された米国特許出願第502,559号とAllegretta,M.ら,Science ２４７:718-721,1990中に開示されている。
以下は、その範囲を限定することなく本発明を説明することを意図した実施例である。
実施例
下記に示す３つの研究のために、患者の関節炎の状態を、主観的な痛み、全体の解剖学的な観察、身体的動作の時間測定、および患者によって記述された主観的な健康状態といった、異なる数種の基準を用いて測定した。全体の解剖学的な観察は、ＡＭ硬直（ＡＭ stiffness）、握力、および腫張した関節の数を含み、医師による月々の試験において行った。この試験はタイプＩコラーゲン治療前および治療中の、関節炎を生じている関節について行い、同じ関節の治療前の状態と比較した。
主観的な痛みを測定した月々のデータは、医師が、関節炎を生じている関節のそれぞれに対して、順次静かに圧力を加え、患者に痛みを感じたかどうかを知らせてもらうことによって得た。
朝方の硬直（morning stiffness)のデータは、患者の経験と、関節が身体的に柔軟になるのにどれくらいの時間がかかったかの報告に基づいて得た。また、それぞれの手の握力は、２０ｍｍＨｇに膨らませたカフ（cuff）を備えた標準水銀血圧計を用いて、毎月測定した。最後に、各患者に対して、５０フィート歩くのに何秒必要であったかを時間計測した。
総合的な評価（Ｐ＝劣る、Ｆ＝まあまあ、Ｇ＝良い、ＶＧ＝たいへん良い、およびＶＰ＝たいへん劣る）は、看護をしている医師によって、主観的になされたものである。経過も同様に主観的に評価した（Ｂ＝良い、Ｗ＝悪い、ＭＢ＝やや良い、ＭＷ＝やや悪い、Ｓ＝同じ）。
ＮＳＡＩＤは「非ステロイド性抗炎症剤」を表し、ＲＦは「リウマチ性因子」を表し、ＥＳＲは「血沈速度」を表し、ＨＣＴは「ヘマトクリット値」を表し、ｂｉｄは「１日に２回」を表し、ｑｉｄおよびｑｄは「１日につき」を表し、ＩＡは「関節内」を表す。
全タイプIIひよこ（chick）コラーゲンタンパク質の１日の服用量は、治療の第１月めが０．１ミリグラムで、その後の各月は０．５ミリグラムとした。
実施例１：
水溶性の精製された全ひよこタイプIIコラーゲンタンパク質を、発売元から得た（Genzyme,Boston,MA）；あるいはトレンサム，ディー．等による手法（Trentham,D.et al.,J.Exp.Med.146:857,1977）に従って精製した。関節炎に苦しむ患者ＬＳ、ＭＦ、ＮＳおよびＣＯに、０．０１Ｍの酢酸に０．１または０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを溶解した全タイプIIコラーゲンタンパク質溶液を投与した。患者は、毎日空腹時に、治療の第１月めが０．１ミリグラムで、その後の月はすべて０．５ミリグラムに相当する、前もって決められた量を服用するように指示された。患者のほとんどは、前もって決められた量のタイプIIコラーゲンタンパク質をオレンジジュースに加えて溶解性を保ち、すぐに（shortly）その混合物を飲んだ。
患者が大幅な改善を報告したならば（そして医師が同意したならば）、コラーゲン治療は３カ月後に中止した。しかしながら、患者が関節炎の再発を報告した場合は、その後タイプIIコラーゲン治療を再び続けた。上記患者のそれぞれについて集められた月々のデータを、表１〜４に要約して示す。
表１は、患者１、ＬＳ、３０歳女性の、関節炎の病状を測定して集められたデータの要約である。この研究の間、従来のオーラノフィンの薬剤治療は中止した。コラーゲン治療の第２月めに関節炎の驚くべき回復がみられたため、さらなる治療は中止した、コラーゲン治療開始後８および９カ月め（during months 8 and 9）に、フェルデン（ピロキシカム）（Feldene(piroxicam)）が投与された。
全タイプIIコラーゲンタンパク質を用いた治療の第１月めの後、大幅な改善が観察された。完全な回復は、治療の第２月めに観察されたが、握力試験においては依然としていくらかの弱さがみられた。この筋肉の弱さは、関節炎による関節の痛みから、長い間筋肉を使わず、筋肉が萎縮したことによって起こり得るものである。治療の第３カ月めには、右手の関節の１つが依然として腫張しており、関節炎が残っているのが観察された。この関節炎は、わずかな圧力にも敏感で、朝方の硬直の根源であり、右手の握りの弱さの理由となっていた。しかしながら、左手の関節には、相変わらず関節炎はなく、５０フィート歩行は正常であった。
治療は３カ月半の間中止されたが、７カ月めに、患者ＬＳが両手の６つの関節に軽い関節炎の再発を体験したときから再開された。この再発による歩行動作への影響はなかった。患者は５０フィート歩行を正常時間内で行なうことができた。
治療は、１日の服用量が０．５ミリグラムの通常の状態に戻した。１カ月以内には、右手の１つの関節に依然として関節炎が残っているだけで、再び、関節炎を患った状態からの顕著な回復が観察された。握力は、再発中に観察された値から２倍にもなった。
治療はさらに１カ月続けられ、患者ＬＳは、左手に関節炎の関節を残すものの、研究中観察されたなかで、両手の握力の最高値を示した。再発に対して３カ月コラーゲン治療を行った後、さらに治療を行なうのは止めた。現在まで、患者ＬＳは、右手の１つの関節の限られた症状の他には、関節炎の臨床的な症状に倒れることも、あるいは症状を表すこともなく４カ月が過ぎた。両手の握力はわずかに減った。
表２は、患者ＬＳと同様の研究に参加している女性の患者、ＭＦ（２３）の経過の要約である。従来のメトトレキサートを用いた薬剤治療は中止した。患者ＭＳは、全タイプIIコラーゲンタンパク質を１日０．１ミリグラムの服用量で１カ月間投与し、その後１日０．５ミリグラムの服用量で２カ月間投与する治療の、第１カ月めの後に、症状からの驚くべき開放を経験するのが観察された。完全な回復は、治療の第２カ月めの後に観察された。その後１１カ月の間、関節炎の再発は観察されなかった。
表３は、この研究における３人目の患者、女性、ＮＳ（５０）についてのデータを要約したものである。この研究の間、メトトレキサートを用いた薬剤治療は中止した。コラーゲンタンパク質を用いた治療の第１カ月めの間に、症状の顕著な低減が観察された。腫張した関節の数は５から１へ減り、一方、すべての圧痛のある関節は完全な回復を示した。朝方の硬直は１２０分から１５分へ減少したが、握力は、左手の握力だけがわずかな改善を示した。右手の１つの関節に腫張が残っているのが観察されたが、他の前から患っていた関節すべてにおいては完全な回復が観察された。完全な回復はコラーゲン治療の第３カ月めの間に達成され、ときどき関節炎が突発するものの、さらに治療を行なうのは止めた。
表４は、この研究の最後の参加者である患者ＣＯ（女性、４２）からのデータをまとめたものである。他の患者に比べて、より漸次に関節炎から回復するのが観察された。患っていた関節の半分は、コラーゲン治療の第１カ月めの後に、関節炎による腫張、および圧痛から回復したが、朝方の硬直、両手の握力、および５０フィート歩行にかかる時間は、だいたいにおいて病気の状態と変わらないままであった。顕著な回復は治療の第２カ月めに記録され、１つの圧痛のある関節と５０フィート歩行試験においてある種のわずかな歩行の弱さがみられるのを除いて、ほとんど完全な回復は第３カ月めに観察された。翌２カ月は、治療を中止したが、第５カ月めの間に、患者ＣＯが部分的な再発を経験的に認知したときから再開した。さらなる治療をさらに３カ月行った後、患者ＣＯもまた、関節炎から完全に回復し、現在に至っている。
実施例１と同様の調剤量およびプロトコールを用いた。リウマチ様の関節炎に苦しむ患者ＭＬ、ＭＴ、ＲＢ、ＬＭ、ＤＨおよびＳＨに、実施例１と同様にひよこタイプIIコラーゲンを投与し、実施例１と同様にして観察した。これらのすべての患者もまた、シングルブラインド法で治療された；彼らの症状は実施例１における患者よりも悪く、彼らの平均年齢は約９歳も上であった。一人の女性の患者（ＤＨ）は、向上がみられず、旅行に不便だという理由で中止した。
表５〜１０は、全タイプＩコラーゲンタンパク質を関節炎の抑制または治療に経口投与する効果についての、第２の実施中の研究に係わる、６人の追加の個々の患者（女性５人、男性１人）に関して集められたデータを要約したものである。患者ＲＢ（表７）だけが完全な回復を経験した。２番目の患者はこの研究を中止した。その他の患者は、表１〜４に示される第１の研究に係わる患者のような、顕著な回復はまだ経験していない。関節炎からの大幅な改善はあるが、回復の速度はより漸次である。この第２の研究の効果を有効に評価するにはさらに時間が必要である。しかし第２の研究の患者はすべて、第１の研究における患者よりもかなり重い病状を有していたものである。さらに、第２の患者のグループは、第１の患者よりも、概して歳上である（歳は２３，３６，５２，５５，５５，および６５である）。それにもかかわらず、患者５および７はかなり有益な効果が得られており、患者８および１０でさえも細胞毒性の薬剤の使用を中止することができた。
これらの公開投薬研究（open-dosing studies)において、１０人のうち６人の患者は、臨床的症状のほとんどが低減または除去されたことからわかるように、ひよこタイプIIコラーゲンの経口投与によりかなりの有益な効果を得ることができた。１０人のうち３人は、さらに治療を行なうことなく、改善された状態を保ち続けている。他の２人の患者は再発を経験したが、コラーゲン治療再開始の１カ月後には、改善された状態に回復した。第６番めの患者は、第１の３人と同様に改善しつつあるようにみえるが、追跡できなかった。７番めの患者は緩やかな改善のみを経験し、他の２人の患者は改善を経験しなかったが、依然として細胞毒性の薬剤の使用を中止することができていた。１０番めの患者は、初期症状が思わしくなく、改善がみられず、また研究センターから場所が遠いという理由でこの研究を中止した。これらの好ましい結果に基づいて、ダブルブラインド研究を試みた。
実施例３
米国リウマチ協会（American Rheumatism Association）の定義による重篤な活性関節炎（active arthritis）にかかった６０人の患者が、ダブル・ブラインド・スタディ（double blind study）に参加した。これらの患者は、免疫抑制薬は中止していたが、３カ月の試験期間中、ＮＳＡＩＤ及び／またはプレドニゾン投与（≦１０ｍｇ／日）を維持していた。患者は任意に、実施例１及び２に記載した患者と同じもしくはプラシーボのいずれかの処理を受けた。このプラシーボは、メンブラン・フィルターを通した０．１Ｍの整数倍の酢酸１．０ｍｌからなる。すべての試験は、処理の開始時と同じ試験者によって行われ、１、２及び３カ月の試験は、１日のうちの同じ時間に行った。Weinblatt,M.E.ら,N.Engl.J.Med.312:818(1985)及びSewell,K.L.ら,Arthritis Rheum.in pressに記載されたような従来からの手法を、関節炎活性を測定するために使用した。歩行時間測定のために補助的な装置が用いられた。試験の間、臨床的試験者が患者を注視し、安全なモニタリングの責任をもった。実験室安全試験は、ランダム化の直前、及びその２、４、６、８及び１２週間後に行った。
完全な血液カウント、ディフェレンシャル（differential）及び血小板カウント、肝臓及び腎臓機能試験、プロトロンビン及び部分的トロンボプラスチン時間、尿分析、及びＥＳＲを測定した。ＨＬＡ類別は、Kammer,G.M.及びTrentham,D.E.Artiritis Rheum.,27:489(1984)に記載されたように、対立因子Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ／Ｑｌｏｃｉに対して行った。血清ＩｇＭリウマチ性因子（rheumatoid factor）力価は比濁法によって、タイプIIコラーゲンに対するＩｇＧ抗体力価は（Helfgott,S.M.ら,Lancet 337:387(1991)に記載されたように）ＥＬＩＳＡによって、コラーゲンまたはプラシーボ投与の直前及び終了時に決定した。
試験の結論においては、６０人のうち５９人の患者を評価した。一人の患者は病気ではなく、４０日後に試験を中止した。この患者はコラーゲンを受けていた。他に、４人の患者には、３カ月の処理の終了に先立って、その薬物治療試験を中止した。これらの患者は、残りの試験に対して最も悪いスコアに帰しており、分析には含めた。この４人すべてはプラシーボを受けていた。表１１は、試験を開始するに当たって、統計学的臨床及び実験室的パラメーターが、両グループ間で類似していることを示す。コラーゲン処理患者及びプラシーボ処理患者の間の比較は、腫張した関節の数のような連続的な測定に対するウィルコクソン・ランク・サム（Wilcoxon rank-sum）試験、麻酔薬使用のような対生した測定に対するフィッシャー・エグザクト（Fisher exact）試験、及び、機能分類（Function Class）に対するカイ自乗トレンド（trend）試験を用いて行われた。報告したＰ-値は２-面である。２８人の患者がコラーゲンを受け、３１人の患者がプラシーボを受けた。
他の関節炎試験で見られるものに似たプラシーボ効果が観察された。Williams,H.T.ら,Arthritis Rheum 31:702(1988)。プラシーボグループで機能分類Ｉのランクに達したのは４人の患者（１３％）であった。しかし、コラーゲン処理患者での相対的改善は有意なものであった。
有意な副作用や変化は観察されなかった。タイプIIコラーゲンに対する抗体の存在、ＨＬＡハプロタイプや性別を含むいかなる基本特性もコラーゲンに対する応答性に関連していない。コラーゲングループのすべての患者は、３カ月後にコラーゲンを中止した。
この制御された試験は、少量の可溶化した天然異種のタイプIIコラーゲンの経口投与が、活性ＲＡの臨床的顕現を改善し、それが安全であるという証拠を提供する。６４％のコラーゲン処理患者が免疫抑制薬（通常はメトトレキサートまたは６-メルカプトプリン）を受け、コラーゲン処理でさらなる改善が生ずる一方、
基本の値が獲得されているので、経口コラーゲンは、免疫抑制治療と比較して同等またはそれ以上に有効である。さらに重要なことには、経口コラーゲンは毒性を持たないために好ましい治療法である。疾患の激化または経口抗原に対するアレルギーが、理論的には進行するかもしれないが、これらの実験及び動物実験では観察されなかった。
パイロット（pilot）研究の４人の患者で、改善が見られたが治療の中止後約３カ月にぶり返したものは、コラーゲンの再開の恩恵を受けた。動物では、経口寛容の防御効果が、抗原供餌の中止後２または３カ月に結局現れた。経口トララーゲン（toleragen）の中止後の疾患の再発は、多発性硬化症及びブドウ膜炎患者に生じた。従って、経口寛容の臨床的効果を維持するには、さらなる投与が必要であることが明らかになった。
これらの実験は、経口コラーゲンの臨床的有効性を示している。疾患の長期間の制御のための最適投与量及びレジメント（regiments）は、熟練した実施者によりよく知られた技術に従って決定される。
実施例４：コラーゲン由来ペプチド
周知の技術を用いてイン・ハウス（in-house）で合成したコラーゲン由来ペプチドは、特に（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）からの）ペプチド合成装置を用い、供給者の装置に引き継いだ。このペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
１．ＮＨ2-Ｇ-Ｐ-Ｒ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｌ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｓ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｋ-ＣＯＯＨ
２．ＮＨ2-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ａ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ａ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-ＣＯＯＨ
３．ＮＨ2-Ｇ-Ｅ-Ｅ-Ｇ-Ｌ-Ｒ-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-Ｒ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｑ-Ｇ-Ａ-Ｒ-ＣＯＯＨ
上記には、標準的な一文字略語を用い、ＨＰはヒドロキシプロリンを表している。
前記のペプチド１−３は、以下のように設計された。
ヒトのタイプIIコラーゲンのアミノ酸配列を、繰り返す傾向にある（一致または保存的置換を有する）アミノ酸トリプレットに分けた。トリプレットを生ずる周期は、バイスタンダー抑制（Bystander Suppression）の概念（米国特許出願番号８４３，７５２）と一致する免疫抑制Ｔ細胞エピトープの形成に類似していると仮定した。ペプチドの長さは、ＭＨＣクレフト（creft）に制限されたクラスＩは９アミノ酸長さであり、ＭＨＣクレフトに制限されたクラスIIは１５アミノ酸長さであるという事実に基づいている。次いで、トリプレットが生ずる周期が選択され、それらを含むペプチドが合成され試験された。ヒドロキシプロリンは、合成の便宜のためプロリンに置換された。
他の第４番目のペプチドも合成した。このペプチドは、Myers,L.K.ら,J.Exp.Med.,1989,同上、に開示され、次の配列を有している。
４．Ｈ2Ｎ-Ｐ-Ｔ-Ｇ-Ｐ-Ｌ-Ｇ-Ｐ-Ｋ-Ｇ-Ｑ-Ｔ-Ｇ-Ｅ-Ｌ-Ｇ-Ｉ-Ａ-Ｇ-Ｆ-Ｋ-Ｇ-Ｅ-Ｑ-Ｇ-Ｐ-Ｋ-ＣＯＯＨ
上記のペプチドは、以下のようにして寛容活性が試験された（ペプチド１−３はＣＤＰ１−ＣＤＰ３と記し、ペプチド４はＣＢ１１Ｐと記す）。
ルイスラットに、１、１０、１００マイクログラムの特別なペプチドまたは可溶性ニワトリタイプIIコラーゲンを種々に供餌した。天然の対照動物には、同量のＪＧＢバッファー（１２７ｍＭ二塩基性硫酸カリウム、１８．４ｍＭ一塩基性硫酸カリウム、ｐＨは７．６に調整）を供餌した。
ペプチド、コラーゲン、またはバッファーの供餌は、１０ｍｇ／ｍｌのヒト結核菌を含む０．１ｍｌの完全フロイントアジュバントの対抗によるアジュバント関節炎（ＡＡ）の誘発に先立って、７、５、及び２日前に行った。関節炎の重篤度は、標準的な方法論（Trentham,D.E.ら,1977,同上）に従い、４つの膝の観察によって、以下の尺度で等級づけて評価した。０＝通常、１＝発赤のみ、２＝発赤と腫張、３＝重度の腫張、４＝関節奇形。全関節炎スコアは、各膝のスコアの合計とした。最大関節炎スコアは、疾患の進行に渡って、一匹の動物での最高スコアである。この等級づけ方法によると、可能な最大のスコアは１６（４つの膝×１つの膝当たり４スコア）である。
結果を図２−５に要約した。
図２は、全コラーゲンの抑制能力を示す。
図３は、ＣＤＰ１を１、１０、及び１００μｇで試験した実験結果を示し、１００μｇでの顕著な抑制を表している。
図４は、他の実験での１μｇ及び１０μｇのＣＤＰ２が、特にＡＡの初期において幾分かの抑制を誘発したことを示す。
図５は、第４の実験での１及び１０μｇのＣＤＰ３が、抑制を誘発したことを示す。
要約すれば、１００μｇのＣＤＰ１、１０及び１μｇのＣＤＰ２、１及び１０μｇのＣＤＰ３は、明らかに抑制を誘発した。
また一般に、ペプチド供餌ラットのＡＡ初期には抑制がみられ、あるペプチド及び投与量に対して、疾患の重篤度はより早く”ピーク”となり、即ち緩和される。
この実験の技術的課題は、バッファー供餌ラットが、多くの技術的要因により重い疾患にかからないことである。それにもかかわらず、ＣIIを必要としない抑制が見られた。
下記の表１４は、各ペプチドの最適な投与量、即ち、１００μｇのＣＤＰ１、１μｇのＣＤＰ２、及び１μｇのＣＤＰ３が用いられた同種の実験において、関節炎スコアで表した結果を示す。ミヤー（Myers）らのペプチドのＣＢ１１も１０μｇで試験した。
付録Ａ
Weiner et al., U.S. Patent Application No. 951,565, filed September 25, 1992, also Weiner et al., U.S. Patent Application No. 460,852, filed February 21, 1990 and No. 596,936, 1990. Is a continuation-in-part of the application filed on October 15th (the former is the PCT application PCT / US88 / 02139, in the national phase of the application on June 24, 1988, and the latter is the same stage of PCT / US91 / 07542) These are also continuation-in-part of US Patent Application No. 065,734, filed June 24, 1987, now abandoned;
Weiner et al., US Patent Application No. 454,806, filed December 20, 1989;
Weiner et al., US Patent Application No. 487,732, filed March 2, 1990;
Weiner et al., US Patent Application No. 809,206, filed December 13, 1991, which is a continuation-in-part of Weiner et al., US Patent Application No. 551,632, filed July 10, 1990, which Is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 379,778, filed July 14, 1989, (currently abandoned);
Weiner et al., US Patent Application No. 595,468, filed October 10, 1990; and
Weiner et al., US Patent Application No. 843,752, filed February 28, 1992.
The aforementioned application is described here as it is.
Field of Invention
The present invention relates to the treatment of autoimmune arthritis in humans. In particular, the present invention relates to oral, enteral, inhalation administration of collagen or fragments or analogs to humans to induce rheumatic and more generally autoimmune response specific inhibition involved in autoimmune arthritis. The invention also relates to therapeutic agents useful for the treatment of arthritis in humans, including total collagen, its arthritis inhibitory peptide fragments, and combinations of two or more of the foregoing.
Background of the Invention
Collagen is the most common protein in the structural supprot of the human or mammalian body. The basic structural unit of collagen is tropocollagen. Tropocollagen is composed of three polypeptide chains of the same size. These strands wrap around one another to form a superhelical cable, or a triple-stranded helical rod. Each of the three chains of tropocollagen is composed of about a thousand amino acid residues.
Five different types of collagen proteins are now known as having different and different amino acid configurations and lengths. Type I collagen is composed of two alpha-1 (I) and one alpha-2 polypeptide chains. Type I collagen is found primarily in skin tissue, tendons, bone support structures, and in the cornea of the eye. Type II collagen contains three polypeptide chains of alpha-1 (II) type, and is mainly found in the cartilage of the joint, in the intervertebral disc, and in the vitreous body in the eye. Type III collagen is composed of three alpha-1 (III) polypeptide chains and is found in tissues such as fetal skin, cardiovascular system, and reticular fibers in the eye. . Type IV collagen is a mixture of two alpha-1 (IV) and one alpha-2 (IV) polypeptide chains and is found primarily in basement membranes. Finally, type V collagen has two alpha-1 (V) and one alpha-2 (V) polypeptide chains and is found, for example, in the placenta and skin. A comparison of human alpha-1 (II), bovine alpha-1 (II), and bovine alpha-1 (I) amino acid sequences is described in Appendix A. The bovine sequence is partial.
Rheumatoid arthritis is a cell-mediated autoimmune disease, that is, a condition in which the immune system mistakenly recognizes its own body tissue as foreign and produces an abnormal immune response thereto. Rheumatoid arthritis is characterized by persistent inflammatory synovitis that causes cartilage destruction and bone erosion and causes structural deformation of the peripheral joints. Joints containing articular cartilage, in which type II collagen is a major component, are particularly susceptible.
Rheumatoid arthritis is associated with joint swelling, inflammation, and stiffness and pain, especially upon flexing. In advanced arthritis, a slight movement of the joint can cause debilitating pain. A significant proportion of patients have CD4 + type T cells that react specifically with collagen and / or have an abnormal humoral response to collagen.
Current treatments for arthritis include the use of nonspecific cytotoxic immunosuppressive agents. These drugs suppress the entire immune system and cannot selectively suppress abnormal autoimmune responses. Suppressing the immune system as a whole for a long time increases the risk of infection. Non-limiting examples of such immunosuppressants include methotrexate, cyclophosphamide, imran (azathioprine), cyclosporin A, and the like.
In addition, long-term treatment with these nonspecific cytotoxic immunosuppressive agents has deleterious side effects, including an increased tendency towards the development of certain malignancies, kidney disease, diabetes, and abnormal liver function. It is. Furthermore, cytotoxic immunosuppressant treatment simply delays disease progression and recurs at an accelerated pace after treatment is discontinued. For example, about six weeks after such medication is discontinued, the patient will worsen to the same condition as before treatment began. Furthermore, the effects of these drugs are limited in themselves. These gradually lose their effectiveness after about 2-5 years.
For example, steroidal compounds such as prednisone and methylprednisolone (which are also non-specific immunosuppressive anti-inflammatory agents) are also used to reduce symptoms. Steroids also have very harmful side effects with their long-term use.
Therefore, current arthritis treatments are limited in their effectiveness, contain very harmful side effects and cannot be used indefinitely. Rheumatoid arthritis affects two million people every year in the United States. Accordingly, there is a great need for new treatments and new therapeutic compositions for human autoimmune arthritis that do not suffer from one or more of the above disadvantages.
An alternative treatment for arthritis is the oral antigen tolerance treatment proposed by the inventor. This can suppress an autoimmune response that is specifically involved in a particular autoimmune disease, thus leaving one or more tissue-specific antigens (ie, autoimmune attacks), leaving other immune functions essentially intact. Including oral, enteral, and inhalation administration of antigens that occur only in the receiving tissue.
Antigens generally useful for this approach include autoantigens, ie tissue-specific antigens that are themselves the subject of autoimmune attacks. Bystander antigens, which are also tissue-specific (but not a target for autoimmune attack), but target affected cells that are acting on immunosuppressive activity by the release of transforming growth factor beta (TGF-β) It also has the ability to attract existing suppressor T cells. TGF-β, in turn, down-regulates all immune cells concentrated around the affected cell, thus suppressing the immune response at that location. Bystander antigens include (i) not a target of autoimmune attack per se, but (ii) have the necessary suppressive activity through the attraction of suppressor T cells, without the restriction part of the autoantigen.
Prior to the study of the present invention, oral antigen tolerance treatment for arthritis has been attempted only in artificially induced arthritis-like diseases (adjuvant arthritis and collagen-induced arthritis) in animals.
Although there may be a correlation between human autoimmune arthritis and its animal (rodent) model, oral, enteral, and inhaled antigen tolerance has not been attempted in humans with arthritis It was. Furthermore, in rodent models, collagen has only been shown to prevent the induction of disease, with no or minimal effect on pre-induced disease.
The role of collagen in arthritis and its models has been the subject of many publications, and some have described the oral use of collagen to prevent disease induction in rodent models. The following is an overview of the technologies summarized in chronological order.
Trentham DE et al., J. Clin. Invest., 66: 1109-1117, Nov. 1980 show that collagen is an autoimmune attacked tissue in an artificially induced cell-mediated autoimmune arthritis model It was. The authors have shown that both humoral and cellular autoimmunity against type I and type II collagen is characteristic of both adjuvant- and collagen-induced arthritis in rats.
In Schoen, RT et al. J. Immunol., 128: 717-719, February 1982, unlike type II collagen, type I collagen was artificially bound to native spleen cells and inoculated into normal animals It was found to be ineffective in preventing the induction of arthritic diseases.
Thompson, HSG et al. Clin. Exp. Immunol., 64: 581-586, 1986, in rats after prophylactic intragastric administration of soluble type II collagen protein (2.5 or 25 μg / g body weight / 5 days). We reported resistance to induction of multiple arthritis model. The minimum amount, 2.5 μg / g, was slightly more effective.
Nagler-Anderson, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: October 1986, pp. 260-262 is a prophylactic intragastric administration of undenatured soluble type II collagen (500 μg). / Mouse / 6 times per week) was found to suppress the induction of arthritis in DBA / 1 Lac J mice by challenge with a mixture of adjuvant and collagen.
Myers, LK et al., J. Immunol., 143: 3976-3980, December 1989, shows that intravenous administration of type II but not type II collagen protein is resistant to arthritis-like diseases induced substantially in animal models. Reported that might give. In subsequent announcements, the same groove is J. Exp. Med., 170: 1999-2010, December 1989, and three other documents of the same claim: Schoen et al., Supra; Cremer, J. Immunol., 87: 2995, 1983; and Englert, Cell. Immunol., 87: 357, 1984.
In this same J.Exp.Med. Announcement, the authors said to the mouse before the challengeIntravenousThe administration states that a fragment of chicken type II collagen (CB11 corresponding to amino acid residues 122-147) that gave protection against collagen-induced arthritis was identified.
In summary, the teachings of the most relevant areas are only:
-Experiments were conducted only in induced animal models;
-The animals tested were restricted to species susceptible to disease induction;
-Treatment had no effect on the disease already induced;
-Intravenous administration of type I collagen did not prevent treatment induction;
-One immunosuppressive epitope of chick type II collagen administered intravenously to mice was identified.
Object of the present invention
It is an object of the present invention to provide a treatment for human autoimmune arthritis including, without limitation, rheumatoid arthritis and polychondritis.
Another object of the present invention is to specifically inhibit the attack of cartilage with an abnormal immune response and the resulting bone degeneration of subchondral in living humans.
An additional object of the present invention is to provide a clinical treatment of autoimmune arthritis without undesirable side effects in living humans, as well as one or more associated with conventional treatments.
It is a further object of the present invention to significantly reduce symptoms associated with arthritis such as joint swelling, inflammation, stiffness and pain in mammals, particularly humans.
Yet another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition effective in the treatment of human rheumatoid arthritis.
The invention will be further described with reference to the drawings attached hereto:
FIG. 1 is the mean value of swollen joints ± standard error in enrollment and monthly follow-up for patients treated with collagen (•) and placebo (o). A significant difference (p = 0.026) between collagen and placebo is indicated by the repeated amount of variation. FIG. 2 shows the inhibitory capacity of total collagen.
FIG. 3 represents the results of experiments where CDP1 was tested at 1, 10 and 100 μg and showed significant inhibition at 100 μg.
FIG. 4 shows another experiment that CDP2 at 1 μg and 10 μg induced some suppression, particularly at an early stage of AA.
FIG. 5 shows a fourth experiment in which CDP3 at 1 and 10 μg induced inhibition.
In summary, 100 μg CDP1, 10 and 1 μg CDP2 and 1 and 10 μg CDP3 clearly induced some inhibition.
Summary of the Invention
One or more of the above-mentioned objectives are oral, enteral or inhalation with at least one analog of the foregoing with or without collagen protein or peptide fragment thereof or an effective amount of synergist In humans by providing a pharmaceutical composition for administration at the same time and by providing a method for treating similar arthritis comprising oral, enteral or inhalation administration of an effective amount of said composition to an affected human. Achieved in therapeutic treatment of autoimmune arthritis.
Detailed Description of the Invention
All patent applications, patents and references cited in this specification are hereby incorporated by reference in their entirety. In the case of inconsistencies, it is included that its definition and interpretation that is encompassed by the present disclosure will be explained herein.
Definition
Each of the following terms used in this disclosure should have the meaning defined below:
“Treatment” includes both prophylactic measures to prevent the onset and development of arthritis as well as the prevention and development of abnormal immune responses against the body's own cartilage encompassed by arthritis. The term also refers to abnormalities (cells and / or body fluids) in the body's own collagen or normal cartilage as well as the reduction or elimination of clinical symptoms after the onset of autoimmune arthritis (eg clinical evidence). Includes suppression or sedation of the immune response.
A “mammal” is any living organism that has an immune system and is susceptible to autoimmune diseases. The term includes humans.
An “autoimmune disease” is represented as a malfunction of the mammalian immune system, where the immune system cannot distinguish between foreign substances and / or self tissues or substances within the mammal, As a result, the self-organizations and substances are treated as if they were foreign and produce an immune response against them.
A type I, type II or type III “active fragment” of a collagen protein essentially comprises one or more of the partial amino acid sequences of the collagen protein, and to the collagen for administration by oral, enteral or inhalation. Characterized as any synthetic peptide or polypeptide construct possessing the ability to suppress or eliminate T cell mediated or T cell dependent immune responses. This definition excludes fragments of collagen proteins that do not result in suppression of the autoimmune response in vitro, for example in lymphocyte proliferation assays, or in vivo, for example in rodent models or humans.
Collagen protein type I, type II or type III "active analogs fragments" include compounds structurally related to collagen protein type I, type II or type III or fragments thereof. Similarly, the terms include alpha 1 (I or II) and alpha possessing the ability to suppress or eliminate T cell mediated or T cell dependent immune responses to collagen for administration by oral, enteral or inhalation. 2 (I) Tropocollagen polypeptide chains or combinations thereof are not limited to any fragment thereof. The term “analog” also refers to the time until one retains a substantially equivalent ability to suppress an arthritic immune response, alpha 1 (I, II or III) and / or by one or more amino acids. Or any polypeptide that differs from the amino acid sequence of the alpha2 (I) tropocollagen polypeptide chain.
A “synergist” is a clinical and / or histological manifestation of arthritis when administered orally, enterally or by inhalation in conjunction with administration of a collagen protein or at least one active fragment or analog thereof. Expressed as a substance that elevates or increases the inhibition. As used in the previous text, and elsewhere in this specification, “in collaboration with” (and also jointly and within this context) is a collagen protein or at least one active fragment or analog thereof. Means substantially at the same time as or after administration. Of course, the administration of the combined substance should not precede or follow the administration of the collagen by becoming the time interval of the appropriate effect of the first used administered substance. Therefore, the synergist should typically be administered before or after about 24 hours, preferably within about one week, of the collagen protein or biologically active peptide fragment thereof.
“Oral” administration includes oral, enteral or intragastric administration. Oral administration without bypassing the stomach is preferred.
The present invention provides for the suppression of small orally, enteral or inhalation administration of type I, type II or type III collagen or biologically active peptide fragments thereof via T cells or T cell dependent autoimmunity, It is based on the discovery and confirmation that it is particularly effective against rheumatoid arthritis, especially in humans. Thus, as exemplified below, as taught in the present invention, at least one of the type I, type II or type III collagen or active fragment or at least one analog thereof, oral, enteral or A simple method of administration by inhalation is effective for treatment to suppress the development of arthritis. Furthermore, the compositions and methods of the present invention do not have the disadvantages described above and are combined with prior art therapeutic or temporary sedation agents and techniques.
Tolerance induced by oral, enteral or inhalation depends on dosage over a wide range of oral, enteral and inhalation dosages. However, there are minimum and maximum effective dosages. As will be appreciated by those skilled in the art, this depends on the function of the type of collagen protein being administered, whether it is a whole protein or a fragmented peptide fragment or analog, as well as the solubility and purity of the peptide or polypeptide. It means that within the changing specific dosage range, suppression of both clinical and pathological symptoms of arthritis occurs. In addition, the patient's age, sex and physical condition, as well as other combined therapies, are administered to behave in an effective dosage of collagen protein for treatment. As a result, adjustments and improvements in dosing use and dosing schedule need to be determined based on these factors and will need to be determined experimentally. Such a determination, however, requires less than routine experimentation. Type II collagen and its fragments are most preferred.
In general, suitable means to achieve suppression of immune response to human body collagen in arthritis are purified or highly purified water-soluble all type I, type II or type III collagen proteins or biologically Administration of the active peptide fragment in an amount of about 0.05 to about 10 mg / day, orally, enterally or by inhalation. Administration of collagen or biologically active peptide fragments thereof may be accomplished in a single dosage form or multiple dosage forms. Preferably, the total collagen protein is administered at a dosage of 0.1 to 1 milligram per day, and this dosage is particularly preferably type II collagen. The dosing described above is easily performed with other types of collagen, as well as fragments and analogs thereof, in light of the current description and with immunosuppression in rats with small amounts of type II collagen, such as 3 micrograms / day. In light of this fact, the preferred amount is 30 micrograms / day, and the amount of 300 micrograms per day is too high to be ineffective. Z.J.Zhang et al.J.Immunol. 145: 2489-2493,1990.
In addition, synergists can be combined in therapy to enhance the effectiveness described above. Non-limiting examples of synergists used in the present invention include E. coli (E.Coli) And Salmonella (SalmonellaBacterial lipopolysaccharides (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Difco, Detroit, MI; BIOMOL Res. Labs., Plymouth, PA) ), Lipid A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; ICN Biochemicals, Cleveland, OH; Polysciences, Inc., Warrington, Pa.) And Brown (Braun, V.,Biochim.Biophys.Acta 435: 335-337,1976), which can be obtained from the disclosure of tripalmitoyl-S-glycalylcysteinyl-seryl-serine (PThreeAnd immunoregulatory lipoproteins such as peptides covalently linked to C55). LPS is preferred, and lipid A is particularly preferred. Lipid A is particularly suitable for use in the present invention because it is less toxic than the entire LPS molecule. LPS used in the present invention is extracted from Gram-negative bacteria, and Galanes et al. (Eur.J.Biochem.9: 245,1969) and Skelly, R.R., et al. (Infect. Immun. 23: 287, 1979).
Formulations
In another aspect, the invention also provides an effective amount of all collagen protein or biologically active peptide fragment (as disclosed below) or analog that inhibits autoimmune arthritis in an animal model of arthritis. An oral pharmaceutical formulation for treating a mammal suffering from arthritis is provided. Its prescription is a synergistic agent (jointly associated with the tolerant antigen of the present invention) as disclosed in co-pending US patent application No. 487,732 filed March 2, 1990 to treat clinical symptoms of arthritis An amount effective to do, optionally further provided. When administered in combination with a whole type I or type II or type III collagen protein or an active peptide fragment or analog thereof, the synergist is cytokin PGE (prostaglandin − in the vicinity of collagen tissue under immune attack. E) and increase in IL-4 (interleukin-4). Liquid aqueous formulations containing soluble collagen, preferably type II or type III, most preferably type II with acidic pH (eg 0.01 M acetic acid) are preferred. The pH adjuster can be any pharmaceutically acceptable acidic substance and can include a buffer. The preferred pH range is 4 to 5. The solid composition is also preferably administered after dissolving in an acidic aqueous medium such as 0.01M acetic acid.
Through this discussion, it will be understood that any clinically or statistically significant attenuation of a uniform symptom of arthritis following the treatment of the present invention is within the scope of the present invention. . Such symptoms include joint tenderness, joint swelling, AM stiffness, decreased grip strength, decreased walking ability. In normal individuals, the first three symptoms described above are absent, 50-foot walking is 9 seconds or less, and adult grip strength is 200 mmHg or more (respective strengths in various age, gender, and physical conditions). Clinically significant dilution is perceived by the patient (such as the case of tenderness or general well-being) and / or recognized by the physician (such as the case of joint swelling) Means. For example, the difference in perception of uniform swelling or tenderness in arthritic joints is significantly different. Because of these parameters, a difference of 1 second in the case of a 50 foot walk, or 15 minutes of 5 mmHg, AM stiffness in the case of grip strength can be measured as significant.
In addition, the ability to suppress from administration of cytotoxic drugs or other anti-inflammatory drugs is also significant. That is, even if the patient does not improve, I further believe that he / she has received significant benefits if he / she does not need to resume the administration of cytotoxic drugs and / or anti-inflammatory drugs, and the patient Maintain the same state or develop disease stage with these conventional drugs.
Oral, enteral or inhalation compositions according to the present invention contain inert ingredients including pharmaceutically acceptable media, diluents, fillers, solubilizing or emulsifying agents and salts as is well known in the art. Optionally included. For example, a tablet may be formed into a composition according to a usual production method using a solid medium well known in the art. The capsules used in the present invention may be made from any pharmaceutically acceptable material such as gelatin or cellulose derivatives. Sustained release oral delivery systems and / or enteric coatings for oral dosage forms are described, for example, in US Pat. No. 4,556,552 issued Dec. 3, 1985; The matters described in those of US Pat. No. 4,309,404 issued on Jan. 5, 1985; and US Pat. No. 4,309,406 issued on Jan. 5, 1982 are considered.
Examples of solid media include starch, sugar, bentonite, silica and other conventional media. Additional non-limiting examples of media and diluents that may be used in the compositions of the present invention include saline, syrup, dextrose and water.
Since the effective amount required is reachable by multiple administrations of dosage units (such as capsules or tablets or combinations thereof), the active ingredient, for each dosage form not required in its own effective amount The total collagen content, or the active fragment or analog unit content thereof, including individual dosages, will be determined. Administration of an effective dosage may be in a single dosage form or multiple dosage forms, which may be provided with an enteric coating and / or sustained release mechanism such as a degradable matrix or reservoir.
When the entire collagen protein or biologically active peptide fragment thereof is introduced orally or enterally, they are mixed together with another ingestible form and solid, semi-solid solution, suspension, or emulsification It may be present in the form. It may also be combined or alternatively mixed with a pharmaceutically acceptable medium, flavor enhancer, water, suspending agent, and emulsifier.
The amount of synergist, such as LPS or lipid A, that may be administered in combination with synergists, eg, type I, type II or type III collagen in whole or active fragments or analogs thereof, is about It is preferably in the range of 0.01 to 100 mg and preferably between 0.1 mg and 10 mg per day.
In an alternative preferred embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition or dosage form of the present invention can be administered to humans suffering from arthritis by inhalation, preferably by aerosol form. The inhalation mode of administration preferably passes through the bronchial and pulmonary mucosa without penetrating the nasal mucosa. Lower amounts of the entire collagen of the present invention or active fragments or analogs thereof can be obtained in adjuvant arthritis with collagen as described in co-pending US Patent Application No. 454,486 filed December 20, 1989. It is expected that it would be desirable to use aerosol administration for the treatment of arthritis as found at the time of treatment. The amount of the entire collagen of the invention or an active fragment or analog thereof, which may be administered in an aerosol dosage form, is between about 0.01 mg to about 5 mg per day (preferably 0.01 to 0.5 mg per day). ) And in an amount in the range between about 0.01 and about 100 mg per day may optionally be included, and may be administered in single or multiple dosage forms. The exact amount to be administered may vary depending on the condition and severity of the patient's illness and the physical condition of the patient.
The aerosol pharmaceutical composition of the present invention may include, as optional ingredients, pharmaceutically acceptable media, diluents, solubilizers and emulsifiers, and salts of the type well known in the art. Non-limiting examples of such materials include physiologically buffered saline solutions and normal salt solutions such as water.
The route of administration of whole collagen or an active fragment or analog thereof according to this alternative embodiment of the invention is an aerosol or inhalation form. The whole collagen or its active fragments with or without a synergist are dried powder particles or preferably a carrier gas (eg air or N2) And can be administered as an atomized aqueous solution suspended in water. Suitable aerosol pharmaceutical compositions contain, for example, between about 0.01 milligrams and about 5 (preferably up to about 0.5) milligrams of whole collagen according to the invention or an active fragment or analog thereof. May be provided with an acceptable buffered salt solution.
A dry aerosol in the form of a finely dispersed solid particle of whole collagen or biologically active peptide fragment thereof not dissolved or suspended in a liquid is also useful in the practice of the present invention. The whole collagen or active fragment or analog thereof may comprise finely dispersed particles having an average particle size of 1 to 5 microns, preferably 2 to 3 microns, in the form of a powder to be spread. Finely dispersed particles may be prepared by powdering and screen filtration using techniques well known in the art. The particles may be administered by inhaling a predetermined amount of finely dispersed material that may be in the form of a powder.
Specific non-limiting examples of media and / or diluents useful in the aerosol pharmaceutical compositions of the present invention are physiologically acceptable, such as water and phosphate buffer solutions at pH 7.0-8.0. Buffered salt solution. Any non-limiting example of a suitable medium or diluent used in the aerosol pharmaceutical composition or dosage form of the present invention is described in US Pat. No. 4,659,696, issued April 21, 1987; dated September 5, 1989. No. 4,863,720 issued on October 6, 1987; and US Pat. No. 4,698,332 issued Oct. 6, 1987.
The pharmaceutical composition of the present invention is disclosed, for example, in US Pat. No. 4,624,251 issued on November 25, 1986; 3,703,173 issued on November 21, 1972; and 3,561,444 issued on February 9, 1971. And may be administered in the form of an aerosol spray using a nebulizer as disclosed in US Pat. No. 4,635,627 issued Jan. 13, 1971. The aerosol material is inhaled by the patient to be treated. Newman, S.P.inAerosols and the LungPressurized metered dose inhaler (MDI) and drying as disclosed in Clarke, SW and Davia, D., eds., Pp. 197-224, Butterworths, London, England, 1984. Other aerosol delivery systems, such as dry powder inhalers, can be used in practicing the present invention.
Various types of aerosol delivery systems of the type disclosed herein are used, including Fisons Corporation (Bedford, MA), Schering Corp. (Kenilworth, NJ) and American Pharmoseal Co. (Valencia, CA).
The present invention has also discovered a biologically active peptide fragment of type II collagen protein that induces arthritis suppression in animal models when administered orally. Most of these peptide fragments have not been described or suggested prior to the present invention, and none have been used as previous oral tolerants. Oral, enteral or inhalation administration of peptides with oral tolerance activity is more convenient than administration of complete collagen protein without the risk of mammalian sensitization to the portion of collagen protein that induces autoimmune response And / or is expected to be specific in eliciting autoimmune suppression. Any immunosuppressive peptide can be verified by routine experimentation in light of the specification, claims and drawings.
T cells from humans suffering from rheumatoid arthritis can be collected from, for example, CD8 + type T cells that are isolated from peripheral blood and can be cloned. Those CD8 + T cells that secrete TGF-β in response to whole collagen are their ability to secrete TGF-β when isolated, cloned, and stimulated (in their presence) by collagen peptide fragments. Used in in vitro assays to test for. The ability of these cells to secrete TGF-β can be assessed, for example, by monitoring the suppression of proliferation of CD4 + collagen-reactive T cells in the presence of whole collagen, eg, in a transwell system. Collagen peptide fragments that stimulate CD8 + T cells that secrete TGF-β will orally produce tolerance. Such an experiment is disclosed in US Patent Application No. 843,752, filed February 28, 1992. Methods for isolation and cloning of human T cells are described in US Patent Application No. 502,559 filed March 30, 1990 and Allegretta, M. et al.Science 247: 718-721,1990.
The following are examples intended to illustrate the present invention without limiting its scope.
Example
For the three studies shown below, the patient's arthritic status was determined by subjective pain, overall anatomical observation, physical movement timing, and subjective health status described by the patient. Measurements were made using several different criteria. Overall anatomical observations included AM stiffness, grip strength, and number of swollen joints, and were performed in a monthly examination by a physician. This study was performed on arthritic joints before and during type I collagen treatment and compared to the pre-treatment state of the same joint.
Monthly data for measuring subjective pain was obtained by a doctor applying pressure to each of the arthritic joints in sequence, and letting the patient know if they felt pain.
Morning stiffness data were based on patient experience and a report of how long it took the joint to become physically flexible. The grip strength of each hand was measured monthly using a standard mercury sphygmomanometer equipped with a cuff inflated to 20 mmHg. Finally, each patient was timed to see how many seconds it took to walk 50 feet.
The overall rating (P = poor, F = soak, G = good, VG = very good, and VP = very poor) was made subjectively by the nursing physician. The progress was also subjectively evaluated (B = good, W = bad, MB = somewhat good, MW = somewhat bad, S = same).
NSAID represents “non-steroidal anti-inflammatory agent”, RF represents “rheumatic factor”, ESR represents “blood sedimentation rate”, HCT represents “hematocrit value”, and bid “twice a day” Qid and qd represent “per day” and IA represents “intra-joint”.
The daily dose of all type II chick collagen protein was 0.1 milligrams in the first month of treatment and 0.5 milligrams in each subsequent month.
Example 1:
Water-soluble purified whole chick type II collagen protein was obtained from the vendor (Genzyme, Boston, Mass.); Or Trentham, Dee. (Trentham, D. et al., J. Exp. Med. 146: 857, 1977). Patients LS, MF, NS and CO suffering from arthritis were administered a whole type II collagen protein solution with 0.1 or 0.5 mg / ml collagen dissolved in 0.01 M acetic acid. Patients were instructed to take a pre-determined dose on an empty stomach daily, corresponding to 0.1 milligrams in the first month of treatment and 0.5 milligrams in all subsequent months. Most patients added a pre-determined amount of type II collagen protein to orange juice to stay soluble and drank the mixture shortly.
If the patient reported significant improvement (and the physician agreed), collagen treatment was discontinued after 3 months. However, if the patient reported a recurrence of arthritis, then type II collagen treatment was continued again. Monthly data collected for each of the above patients is summarized in Tables 1-4.
Table 1 is a summary of data collected by measuring the pathology of arthritis for Patient 1, LS, a 30 year old female. During this study, conventional auranofin drug therapy was discontinued. Due to the surprising recovery of arthritis in the second month of collagen treatment, further treatment was discontinued, and during the
Significant improvements were observed after the first month of treatment with all type II collagen proteins. Although full recovery was observed in the second month of treatment, there was still some weakness in the grip strength test. This muscle weakness can be caused by joint atrophy caused by arthritis due to atrophy of the muscle without using it for a long time. By the third month of treatment, it was observed that one of the right hand joints was still swollen and arthritis remained. This arthritis was sensitive to slight pressure, was the root of morning stiffness and was the reason for the weakness of the right hand grip. However, the left hand joint was still free of arthritis and walking 50 feet was normal.
Treatment was discontinued for three and a half months, but resumed at the seventh month when patient LS experienced a recurrence of mild arthritis in the six joints of both hands. This recurrence had no effect on walking behavior. The patient was able to walk 50 feet within normal time.
Treatment returned to normal with a daily dose of 0.5 milligrams. Within one month, only one arthritis remained in one joint of the right hand and again a significant recovery from the arthritic condition was observed. Grip strength doubled from that observed during recurrence.
Treatment continued for another month, and patient LS showed the highest grip strength of both hands, as observed during the study, while leaving the arthritic joint in the left hand. After 3 months of collagen treatment for recurrence, further treatment was stopped. To date, patient LS has passed 4 months without falling to or manifesting the clinical symptoms of arthritis in addition to the limited symptoms of one joint in the right hand. The grip strength of both hands decreased slightly.
Table 2 is a summary of the course of a female patient, MF (23), participating in a study similar to patient LS. Conventional drug treatment with methotrexate was discontinued. Patient MS received the first month of treatment with all type II collagen protein administered at a dose of 0.1 milligrams per day for 1 month followed by 0.5 milligrams per day for 2 months. Later, it was observed to experience a surprising release from symptoms. Full recovery was observed after the second month of treatment. During the next 11 months, no recurrence of arthritis was observed.
Table 3 summarizes the data for the third patient, female, NS (50) in this study. During this study, drug treatment with methotrexate was discontinued. A significant reduction in symptoms was observed during the first month of treatment with collagen protein. The number of swollen joints decreased from 5 to 1, while all tender joints showed full recovery. Although morning stiffness decreased from 120 minutes to 15 minutes, grip strength showed only a slight improvement in the grip strength of the left hand. Although swelling was observed in one joint of the right hand, full recovery was observed in all previously affected joints. Complete recovery was achieved during the third month of collagen treatment, with occasional arthritis occurring, but further treatment stopped.
Table 4 summarizes data from patient CO (female, 42), the last participant in this study. A more gradual recovery from arthritis was observed compared to other patients. Half of the affected joints recovered from arthritic swelling and tenderness after the first month of collagen treatment, but morning stiffness, grip strength of both hands, and the time taken to walk 50 feet are mostly ill. It remained unchanged. Significant recovery was recorded in the second month of treatment, with almost complete recovery in the third month except for one tender joint and some slight gait weakness in the 50 foot walk test. Observed. The next two months, treatment was discontinued, but resumed when patient CO empirically recognized partial recurrence during the fifth month. After further 3 months of further treatment, patient CO has also fully recovered from arthritis and is now.
The same dosage and protocol as in Example 1 were used. Chick type II collagen was administered to patients ML, MT, RB, LM, DH and SH suffering from rheumatoid arthritis in the same manner as in Example 1 and observed in the same manner as in Example 1. All these patients were also treated with the single blind method; their symptoms were worse than those in Example 1 and their average age was about 9 years above. One female patient (DH) was discontinued because it was not improving and was inconvenient to travel.
Tables 5-10
In these open-dosing studies, 6 out of 10 patients received a significant amount of oral administration of chick type II collagen, as can be seen from the reduction or elimination of most of the clinical symptoms. A beneficial effect was obtained. Three out of ten continue to improve without further treatment. The other two patients experienced a recurrence but recovered to an improved state one month after restarting collagen treatment. The sixth patient appeared to be improving as did the first three, but could not be followed. The seventh patient experienced only moderate improvement and the other two patients did not experience improvement, but were still able to stop using cytotoxic drugs. The tenth patient discontinued the study because the initial symptoms did not appear to be good, no improvement was seen, and the location was far from the research center. Based on these favorable results, a double blind study was attempted.
Example 3
Sixty patients with severe active arthritis as defined by the American Rheumatism Association participated in the double blind study. These patients had discontinued immunosuppressive drugs, but maintained NSAID and / or prednisone administration (≦ 10 mg / day) during the 3-month study period. Patients optionally received either the same or placebo treatment as the patients described in Examples 1 and 2. This placebo consists of 1.0 ml of 0.1 M integer multiple acetic acid through a membrane filter. All tests were performed by the same tester at the beginning of the treatment, and the 1, 2 and 3 month tests were performed at the same time of day. Conventional techniques such as those described in Weinblatt, ME et al., N. Engl. J. Med. 312: 818 (1985) and Sewell, KL et al., Arthritis Rheum. In press are used to measure arthritic activity. did. An auxiliary device was used to measure walking time. During the study, the clinical investigator watched the patient and was responsible for safe monitoring. Laboratory safety tests were performed immediately prior to randomization and 2, 4, 6, 8 and 12 weeks after that.
Complete blood counts, differential and platelet counts, liver and kidney function tests, prothrombin and partial thromboplastin times, urine analysis, and ESR were measured. HLA categorization was performed against alleles A, B, C and D / Qloci as described in Kammer, G.M. and Trentham, D.E. Artiritis Rheum., 27: 489 (1984). Serum IgM rheumatoid factor titers are determined by turbidimetry, IgG antibody titers against type II collagen are determined by ELISA (as described in Helgott, SM et al., Lancet 337: 387 (1991)), collagen. Alternatively, it was determined immediately before and at the end of placebo administration.
In the conclusion of the study, 59 patients out of 60 were evaluated. One patient was not ill and the study was stopped after 40 days. This patient had received collagen. In addition, 4 patients were discontinued from the drug treatment study prior to the end of the 3-month treatment. These patients returned to the worst score for the rest of the study and were included in the analysis. All four received a placebo. Table 11 shows that at the start of the study, statistical clinical and laboratory parameters are similar between both groups. Comparison between collagen-treated patients and placebo-treated patients is for Wilcoxon rank-sum test for continuous measurements, such as the number of swollen joints, versus a reciprocal measurement, such as anesthetic use It was performed using the Fisher exact test and the chi-square trend test for the Function Class. The reported P-value is 2-plane. 28 patients received collagen and 31 patients received placebo.
A placebo effect similar to that seen in other arthritis studies was observed. Williams, H.T. et al., Arthritis Rheum 31: 702 (1988). Four patients (13%) reached the functional category I rank in the placebo group. However, the relative improvement in collagen treated patients was significant.
No significant side effects or changes were observed. None of the basic characteristics, including the presence of antibodies to type II collagen, HLA haplotypes and gender, are associated with responsiveness to collagen. All patients in the collagen group discontinued collagen after 3 months.
This controlled test provides evidence that oral administration of a small amount of solubilized native heterologous type II collagen improves the clinical manifestation of active RA and is safe. While 64% of collagen-treated patients receive immunosuppressive drugs (usually methotrexate or 6-mercaptopurine), further improvement in collagen treatment occurs,
Oral collagen is as effective or better than immunosuppressive therapy since the baseline value has been obtained. More importantly, oral collagen is the preferred treatment because it is not toxic. Disease exacerbations or allergies to oral antigens may theoretically progress, but were not observed in these and animal experiments.
Four patients in the pilot study that improved but returned approximately 3 months after discontinuing treatment benefited from resuming collagen. In animals, the protective effect of oral tolerance eventually emerged 2 or 3 months after cessation of antigen feeding. The recurrence of the disease after withdrawal of oral toleragen occurred in patients with multiple sclerosis and uveitis. Thus, it became clear that further administration was necessary to maintain the clinical effect of oral tolerance.
These experiments show the clinical effectiveness of oral collagen. Optimal dosages and regimens for long-term control of the disease are determined according to techniques well known by the skilled practitioner.
Example 4: Collagen-derived peptide
Collagen-derived peptides synthesized in-house using well-known techniques were handed over to the supplier's equipment, particularly using peptide synthesizers (from Applied Biosystems). This peptide has the following amino acid sequence:
1. NH2-G-P-R-G-P-HP-GP-HP-GP-A-G-L-HP-GP-SS-GE-HP-GP-K-COOH
2. NH2-G-E-HP-G-A-HP-G-P-A-G-P-HP-G-E-HP-GA-HP-GP-P-A-GP-HP-G -COOH
3. NH2-G-E-G-L-R-G-A-R-G-E-HP-G-E-R-G-P-HP-GP-Q-GA-R-COOH
Above, standard single letter abbreviations are used, where HP stands for hydroxyproline.
The peptides 1-3 were designed as follows.
The amino acid sequence of human type II collagen was divided into amino acid triplets that tend to repeat (with matching or conservative substitutions). The cycle of generating triplets was postulated to be similar to the formation of immunosuppressive T cell epitopes consistent with the concept of Bystander Suppression (US Patent Application No. 843,752). The length of the peptides is based on the fact that class I restricted to MHC clefts is 9 amino acids long and class II restricted to MHC clefts is 15 amino acids long. The cycle in which triplets occur was then selected and peptides containing them were synthesized and tested. Hydroxyproline was replaced with proline for convenience of synthesis.
Another fourth peptide was also synthesized. This peptide is disclosed in Myers, L.K. et al., J. Exp. Med., 1989, ibid. And has the following sequence:
4). H2N-P-T-G-P-L-G-P-K-G-Q-T-G-E-L-G-I-A-G-F-K-G-E-Q-G- P-K-COOH
The above peptides were tested for tolerance activity as follows (peptide 1-3 is designated CDP1-CDP3 and
Lewis rats were fed variously with 1, 10, 100 micrograms of special peptide or soluble chicken type II collagen. Natural control animals were fed the same amount of JGB buffer (127 mM dibasic potassium sulfate, 18.4 mM monobasic potassium sulfate, pH adjusted to 7.6).
Peptide, collagen, or buffer feeding was performed 7, 5 and 2 days prior to induction of adjuvant arthritis (AA) by challenge with 0.1 ml complete Freund's adjuvant containing 10 mg / ml of Mycobacterium tuberculosis. It was. The severity of arthritis was assessed according to standard methodologies (Trentham, D.E. et al., 1977, ibid) and graded on the following scale by observation of four knees. 0 = normal, 1 = redness only, 2 = redness and swelling, 3 = severe swelling, 4 = joint malformation. The total arthritis score was the sum of the scores for each knee. The maximum arthritis score is the highest score in one animal over the course of the disease. According to this grading method, the maximum possible score is 16 (4 knees x 4 scores per knee).
The results are summarized in Fig. 2-5.
FIG. 2 shows the inhibitory capacity of total collagen.
FIG. 3 shows the experimental results of testing CDP1 at 1, 10, and 100 μg, representing significant inhibition at 100 μg.
FIG. 4 shows that 1 μg and 10 μg CDP2 in other experiments induced some inhibition, especially in the early stages of AA.
FIG. 5 shows that 1 and 10 μg CDP3 in the fourth experiment induced suppression.
In summary, 100 μg CDP1, 10 and 1 μg CDP2, 1 and 10 μg CDP3 clearly induced suppression.
Also, in general, inhibition is seen in early AA of rats fed with peptides, and for a given peptide and dose, the severity of the disease “peaks” earlier, ie, is alleviated.
The technical challenge of this experiment is that buffer fed rats do not suffer from severe disease due to a number of technical factors. Nevertheless, a suppression that did not require CII was seen.
Table 14 below shows the results expressed in arthritic scores in the same type of experiment using the optimal dose of each peptide, ie, 100 μg CDP1, 1 μg CDP2, and 1 μg CDP3. The peptide CB11 of Myers et al. Was also tested at 10 μg.
Appendix A
Claims (6)
ＮＨ２-Ｇ-Ｅ-Ｅ-Ｇ-Ｌ-Ｒ-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-Ｒ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｑ-Ｇ-Ａ-Ｒ-ＣＯＯＨ；
（ここで“ＨＰ”はヒドロキシプロリンを示す）
からなる群から選択される少なくとも一つのペプチドフラグメントを含む、リウマチ性関節炎を抑制するための吸入用薬学的組成物。 NH2-GE-HP-GA-HP-GP-A-GP-HP-GE-HP-GA-HP-GP-AA-GP-HP- G-COOH; and
NH2-G-E-E-G-L-R-G-A-R-G-E-HP-G-E-R-G-P-HP-GP-P-Q-GA-R- COOH;
(Where “HP” represents hydroxyproline)
A pharmaceutical composition for inhalation for inhibiting rheumatoid arthritis, comprising at least one peptide fragment selected from the group consisting of:
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