JP3826426B2

JP3826426B2 - Process for producing 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside

Info

Publication number: JP3826426B2
Application number: JP09831196A
Authority: JP
Inventors: 守須賀; 芳和亀園
Original assignee: 株式会社エーピーアイコーポレーション
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2006-09-27
Anticipated expiration: 2016-04-19
Also published as: JPH09275995A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα−アミラーゼの活性測定用基質として有用な式（２）
【０００２】
【化３】

【０００３】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、式（２）の化合物と称することもある）の新規なの製造方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
【０００５】
従来より、膵液や尿など体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断が行われて、多くのα−アミラーゼ活性測定用基質が用いられている。
【０００６】
その中で、特開平６−３１５３９９号公報には、追随酵素を必要としない、高感度なα−アミラーゼ活性測定用基質として、式（２）の化合物が記載されている。
【０００７】
一方、特開平３−２６４５９６号公報には、式（４）
【０００８】
【化４】

【０００９】
（式中、Ｘ¹およびＸ²の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）で表されるｎが２以上の、ガラクトシル基にグルコース基が４個以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の製造に関して、ラクトースなどのガラクトシル残基をもつ糖と、式（５）
【００１０】
【化５】

【００１１】
（式中、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）で表されるｎが２以上でグルコース基が４個以上結合したマルトオリゴ糖誘導体とに、α−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを作用させる方法が記載されている。
【００１２】
さらに、特開平６−８６６８３号公報には、特開平３−２６４５９６号公報に記載の製造方法を改良することを目的として、式（４）
【００１３】
【化６】

【００１４】
（式中、Ｘ¹およびＸ²の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは１〜５の整数である。）で表されるグルコース基が３つ以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関して、マルトオリゴ糖とガラクトース残基を有する糖に、β−ガラクトシダーゼを作用させて、式（６）
【００１５】
【化７】

【００１６】
（式中、Ｘ¹およびＸ²の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、ｎは１〜５の整数を示す。）で表されるｎが１以上の、ガラクトシル基にグルコース残基が３個以上結合したガラクトシルマルトオリゴ糖を製造した後、さらに、水と親水性有機溶媒との混合溶液中で、このガラクトシルマルトオリゴ糖と、式（７）
【００１７】
【化８】

【００１８】
（式中、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体の混合物に、α−アミラーゼを作用させる方法が示されている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ところで、特開平６−３１５３９９号公報によると、式（２）の化合物は、新規化合物であるにもかかわらず、その製造実施例がなく、化学的な物性データの開示もない。本公報には、式（２）の化合物を含むマルトオリゴ糖誘導体は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができると記載されているのみであり、有機化学的合成法および酵素を用いた合成法が概念的に示されているにすぎない。
【００２１】
すなわち、特開平６−３１５３９９号公報によると、「マルトオリゴ糖誘導体（ａ）
【００２２】
【化９】

【００２３】
は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができる。例えば、還元末端のグルコースに２−クロロ−４−ニトロフェノールを結合したマルトオリゴ糖誘導体（ｂ）
【００２４】
【化１０】

【００２５】
（式中、ｎは０〜２の整数を示す。）とラクトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマルトオリゴ糖誘導体（ｂ）の非還元末端にβ−ガラクトピラノシル基を導入することにより製造することができる。
【００２６】
また、別法としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖およびラクトースを用いてβ−ガラクトシダーゼによりマルトオリゴ糖の非還元末端にガラクトピラノシル基を導入して合成したガラクトピラノシルマルトオリゴ糖に、塩基触媒（ピリジンもしくは酢酸ナトリウムなど）の存在下、無水酢酸中で室温あるいは加温してアセチル化し、ガラクトピラノシルマルトオリゴ糖保護体とする。次いで無機溶媒の存在下、もしくは無溶媒下、アルカリおよび無水酢酸およびフェノール類、例えば２−クロロ−４−ニトロフェノールとともに加熱して還元性末端をフェノール類により修飾し、最後にメタノール中、触媒量のナトリウムメチラートによる公知の脱保護反応により、目的であるガラクトピラノシルマルトオリゴ糖誘導体を製造する方法がある。」と記載されている。
【００２７】
ここで、特開平６−３１５３９９号公報に記載されているような有機化学的方法で式（２）の目的化合物を製造しようとする場合、式（３）
【００２８】
【化１１】

【００２９】
で表される高価で、工業的に入手困難なガラクトシルマルトースを原料として用いなければならないといった問題がある。
【００３０】
ここで、本発明者らは、特開平３−２６４５９６号公報に記載のある製造方法を準用して、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造を試みたところ、アミラーゼ基質としては非常に感度の低い（β−１，４結合した化合物の１／２０程度）ガラクトシル基が式（８）
【００３１】
【化１２】

【００３２】
で表されるβ−１，６結合した２−クロロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを７０％前後も生成し、選択性が逆転してしまうことが判明した。
【００３３】
また、β−１，４結合した化合物と、β−１，６結合した化合物との混合物より、目的物であるβ−１，４結合した化合物を得ようとしても、工業的に単離することは極めて困難である。
【００３４】
したがって、特開平６−３１５３９９号公報に記載のある特開平３−２６４５９４号公報を準用する製造方法では、グルコースの繰り返し単位が異なるだけの類似化合物であるものの、式（２）の目的化合物を満足に合成することはできない。
【００３５】
また、酵素の起源によっては、たとえβ−ガラクトシダーゼであっても目的物質であるβ−１，４結合した化合物を優先的に生成することはなく、β−１，６結合した化合物を優先的に生成することもある。上記のようなβ−ガラクトシダーゼ転移能の位置選択性の制御に関する問題については、これまで何ら認識されたことはなかった。
【００３６】
このように従来の製造方法によると、α−アミラーゼ活性測定基質としては極めて感度の低い式（８）
【００３７】
【化１３】

【００３８】
で表されるβ−１，６結合した２−クロロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドが、副生物として生成し、それを工業的に除去精製することは極めて困難であり、また、このような副生物が高純度品が要求される臨床診断用の基質に混入することは好ましくないことから、ガラクトシル基を高位置選択的に導入する技術が求められていた。
【００３９】
この点に関し、特開平６−８６６８３号公報によると、β−１，６結合したガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の副生を抑えるため、第２段階の反応としてマルトオリゴ糖誘導体に、α−アミラーゼを作用させる方法を採用している。
【００４０】
しかしながら、同法ではガラクトシル基の導入に関して、その位置選択性を向上させることは可能となったものの、転移率が１０％〜２０％程度と大変低い酵素転移反応を２段階も用いる同法は、非常に収率および生産効率が低いといった問題を生じてしまい、工業的製法としては不十分なものであった。
【００４１】
【発明の課題を解決するための手段】
【００４２】
本発明者らは、各種疾患の診断に用いられるα−アミラーゼ活性測定試薬測定用基質である式（２）の化合物を、安価な原料を用い、一段階の酵素反応で、高収率、かつ高位置選択的に製造することを目的として鋭意検討を行い、本発明方法を完成するに至った。
【００４３】
すわなち、本発明は、ラクトースと、式（１）
【００４４】
【化１４】

【００４５】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドとを、β−ガラクトシダーゼの共存下に反応させることを特徴とする式（２）で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法に関する。
【００４６】
【発明の実施の形態】
【００４７】
本発明の製造方法にて用いられる式（１）の化合物は、市販のマルトースより特開平８−６７６９１号公報、特開平８−６７６９２号公報などに記載の方法で製造される。
【００４８】
転移反応において、ラクトースの基質濃度は、反応溶液に対して、３〜４０％、好ましくは５〜２０％とし、式（１）の化合物の基質濃度は、反応溶液に対して、１〜４０％、好ましくは１〜２０％、さらに好ましくは２〜９％である。
【００４９】
β−ガラクトシダーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の酵素がよく、たとえば、市販品として入手できる大和化成株式会社製の商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼＩＩ」があげられる。また、公知の固定化酵素法を用いても本発明方法により、目的物を生成することができる。
【００５０】
β−ガラクトシダーゼの濃度は、ガラクトシル基を高位置選択的に導入するために、反応溶液１ｍｌあたり０．０１〜０．８ｍｇ、好ましくは０．０１〜０．４ｍｇ、さらに好ましくは、０．０１〜０．１ｍｇである。
【００５１】
反応時間は、酵素を添加したのち１分〜３０時間から選択することができる。
【００５２】
反応温度は２０〜７０℃の範囲から選択することができる。
【００５３】
反応溶媒は、水、または水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロプロピルアルコール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンまたはこれらの混合物を挙げることができる。
【００５４】
親水性有機溶媒の含有率は１０〜９０％、好ましくは４０〜７０％が適当である。また、これらの親水性有機溶媒は単独あるいは混合しての使用も可能である。
【００５５】
反応溶媒は、ｐＨを５〜８の範囲で調整されるのがよく、このために公知の緩衝溶液などが使用できる。
【００５６】
反応終了後、反応液を加熱または反応液のｐＨを低下あるいは上昇させることで酵素反応を停止させる。次いでカラムクロマトグラフィーなどにより精製し、目的物質を得ることができる。
【００５７】
【実施例】
【００５８】
実験例中に記載された略号は、以下の通りを意味する。
酵素Ａ：Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製；商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼＩＩ」）。
酵素Ｂ：Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ（フナコシ株式会社製；商品番号「ＦＴ−００５２−０９」）。
酵素Ｃ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．由来のβ−ガラクトシダーゼ（フナコシ株式会社製；商品番号「ＦＴ−００５２−０１」）。
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール。
ＡＮ：アセトニトリル。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド。
６７ｍＭリン酸緩衝溶液：規定濃度のリン酸水溶液（ｐＨ７．０）。
【００５９】
実験例１：比較例１〜６
ラクトース一水和物６００．０ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシド３００．０ｍｇを、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドの何れかの親水性有機溶媒と、６７ｍＭリン緩衝溶液とを、下記に示した割合で混合した混合溶媒５．０ｍｌに投入後、酵素Ａを、混合溶媒１ｍｌあたり１．０ｍｇの割合で添加し、４０℃で、３時間または１０時間反応させた。１００℃に加温することにより反応を終了させた。反応終了後、ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体（以下に示したβ−１−４体とβ−１−６体の混合物である）を分離し、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドに対するガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の収率（以下、糖誘導体収率と示す。）を測定したところ、いずれも１５〜２０％であった。反応終了後、ＯＤＳカラムで精製する前の反応生成物について、式（２）
【００６０】
【化１５】

【００６１】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、β−１−４体と示す。）と、式（８）
【００６２】
【化１６】

【００６３】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（以下、β−１−６体と示す。）との生成比（以下、１−４／１−６生成比と示す。）を、高速液体クロマトグラフィーを用いて求めた。これらの結果を以下に示した。
【００６４】
試験例酵素酵素濃度溶媒組成 1-4/1-6 生成比反応時間
比較例１Ａ１．００ＤＭＳＯ：水＝２：８２８：７２１０時間
比較例２Ａ１．００ＩＰＡ：水＝５：５３４：６６１０時間
比較例３Ａ１．００ＡＮ：水＝５：５３６：６４１０時間
比較例４Ａ１．００ＤＭＳＯ：水＝２：８４７：５３３時間
比較例５Ａ１．００ＩＰＡ：水＝５：５５１：４９３時間
比較例６Ａ１．００ＡＮ：水＝５：５５４：４６３時間
【００６５】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ａを用いた実験例１において、β−１，４体は選択的に得られず、β−１，６体の方がより多く生成した例もあった。
【００６６】
実験例２：比較例７〜１２
実験例１と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いて、同様の実験を行った。
これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００６７】
試験例酵素酵素濃度溶媒組成 1-4/1-6 生成比反応時間
比較例７Ｂ１．００ＤＭＳＯ：水＝２：８０：１００１０時間
比較例８Ｂ１．００ＩＰＡ：水＝５：５０：１００１０時間
比較例９Ｂ１．００ＩＰＡ：水＝２：８０：１００１０時間
比較例１０Ｂ１．００ＤＭＳＯ：水＝２：８０：１００３時間
比較例１１Ｂ１．００ＩＰＡ：水＝５：５０：１００３時間
比較例１２Ｂ１．００ＩＰＡ：水＝２：８０：１００３時間
【００６８】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ｂを用いた実験例２において、β−１，４体は得られず、β−１，６体のみが生成した。
【００６９】
実験例３：比較例１３〜１６
実験例１と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００７０】
試験例酵素酵素濃度溶媒組成 1-4/1-6 生成比反応時間
比較例１３Ｃ１．００ＤＭＳＯ：水＝２：８３：９７１０時間
比較例１４Ｃ１．００ＩＰＡ：水＝５：５５：９５１０時間
比較例１５Ｃ１．００ＤＭＳＯ：水＝２：８１２：８８３時間
比較例１６Ｃ１．００ＩＰＡ：水＝５：５１０：９０３時間
【００７１】
文献に記載されていた方法を準用し、β−ガラクトシダーゼとして酵素Ｃを用いた実験例３において、β−１，４体はほとんど得られず、むしろβ−１，６体が選択的に生成した。
【００７２】
実験例４：実施例１〜２４
ラクトース一水和物６００．０ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシド３００．０ｍｇを、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、またはジメチルスルホキシドの何れかの親水性有機溶媒と、６７ｍＭリン緩衝溶液とを、下記に示した割合で混合した混合溶媒５．０ｍｌに投入後、酵素Ａを、混合溶媒１ｍｌあたり下記に示した割合で添加し、４０℃で、３時間または１０時間反応させた。１００℃に加温することにより反応を終了させた。糖誘導体収率は、いずれも１５〜２０％であった。反応終了後、ＯＤＳカラムで精製する前の反応生成物について、実験例１と同様に、１−４／１−６生成比を求めた。
【００７３】
試験例酵素酵素濃度溶媒組成 1-4/1-6 生成比反応時間
実施例１Ａ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５９２：８１０時間
実施例２Ａ０．１０ＩＰＡ：水＝５：５８２：１８１０時間
実施例３Ａ０．３０ＩＰＡ：水＝５：５６７：３３１０時間
実施例４Ａ０．０４ＩＰＡ：水＝２：８７６：２４１０時間
実施例５Ａ０．１０ＩＰＡ：水＝２：８６７：３３１０時間
実施例６Ａ０．０４ＡＮ：水＝５：５９２：８１０時間
実施例７Ａ０．１０ＡＮ：水＝５：５８０：２０１０時間
実施例８Ａ０．３０ＡＮ：水＝５：５６８：３２１０時間
実施例９Ａ０．０４ＤＭＳＯ：水＝５：５８９：１１１０時間
実施例１０Ａ０．１０ＤＭＳＯ：水＝５：５８２：１８１０時間
実施例１１Ａ０．３０ＤＭＳＯ：水＝５：５６３：３７１０時間
実施例１２Ａ０．０４ＤＭＳＯ：水＝２：８７９：２１１０時間
実施例１３Ａ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５９０：１０３時間
実施例１４Ａ０．１０ＩＰＡ：水＝５：５９１：９３時間
実施例１５Ａ０．３０ＩＰＡ：水＝５：５８０：２０３時間
実施例１６Ａ０．０４ＩＰＡ：水＝２：８７４：２６３時間
実施例１７Ａ０．１０ＩＰＡ：水＝２：８８３：１７３時間
実施例１８Ａ０．０４ＡＮ：水＝５：５９０：１０３時間
実施例１９Ａ０．１０ＡＮ：水＝５：５８７：１３３時間
実施例２０Ａ０．３０ＡＮ：水＝５：５８２：１８３時間
実施例２１Ａ０．０４ＤＭＳＯ：水＝５：５８６：１４３時間
実施例２２Ａ０．１０ＤＭＳＯ：水＝５：５７５：２５３時間
実施例２３Ａ０．３０ＤＭＳＯ：水＝５：５７７：２３３時間
実施例２４Ａ０．０４ＤＭＳＯ：水＝２：８８７：１３３時間
【００７４】
実験例４により、酵素Ａを用いて、β−ガラクトシダーゼの濃度を、混合溶媒１ｍｌあたり０．０４ｍｇ、０．１ｍｇ、または０．３ｍｇとしたところ、β−１，４体が選択的に得られることがわかった。
【００７５】
実施例１について、反応終了後、ＯＤＳカラムを用いて分離精製し、凍結乾燥して、β−１，４体である２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド７２ｍｇを得た。
【００７６】
実験例５：比較例１７〜２８
実験例４と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００７７】
試験例酵素酵素濃度溶媒組成 1-4/1-6 生成比反応時間
比較例１７Ｂ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５０：１００１０時間
比較例１８Ｂ０．１０ＩＰＡ：水＝５：５０：１００１０時間
比較例１９Ｂ０．３０ＩＰＡ：水＝５：５０：１００１０時間
比較例２０Ｂ０．０４ＡＮ：水＝５：５０：１００１０時間
比較例２１Ｂ０．０４ＤＭＳＯ：水＝２：８０：１００１０時間
比較例２２Ｂ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５０：１００１０時間
比較例２３Ｂ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５０：１００３時間
比較例２４Ｂ０．１０ＩＰＡ：水＝５：５０：１００３時間
比較例２５Ｂ０．３０ＩＰＡ：水＝５：５０：１００３時間
比較例２６Ｂ０．０４ＡＮ：水＝５：５０：１００３時間
比較例２７Ｂ０．０４ＤＭＳＯ：水＝２：８０：１００３時間
比較例２８Ｂ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５０：１００３時間
【００７８】
酵素Ａの代わりに酵素Ｂを用いたところ、β−１，４体は得られず、β−１，６体のみが生成した。
【００７９】
実験例６：比較例２９〜３２
実験例４と同様に、酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いて、同様の実験を行った。これら結果、糖誘導体収率は、１５〜２０％であった。また、１−４／１−６生成比を以下に示した。
【００８０】
試験例酵素酵素濃度溶媒組成 1-4/1-6 生成比反応時間
比較例２９Ｃ０．０４ＤＭＳＯ：水＝２：８５：９５１０時間
比較例３０Ｃ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５７：９３１０時間
比較例３１Ｃ０．０４ＤＭＳＯ：水＝２：８７：９３３時間
比較例３２Ｃ０．０４ＩＰＡ：水＝５：５９：９１３時間
【００８１】
酵素Ａの代わりに酵素Ｃを用いたところ、β−１，４体はほとんど得られず、むしろβ−１，６体が選択的に生成した。
【００８２】
上記の実験例１〜６により、β−ガラクトシダーゼの濃度と種類を選択することにより、本発明の目的であるβ−１，４体を選択的に製造することができることが、確認された。
【００８３】
【発明の効果】
【００８４】
本発明の式（２）
【００８５】
【化１７】

【００８６】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法は、高価な式（３）
【００８７】
【化１８】

【００８８】
で表されるガラクトシル−マルトースを用いることなく大変安価なラクトースと、式（１）
【００８９】
【化１９】

【００９０】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトシドとを出発原料にし、非常に高い選択性でβ−１，４結合を生成させることを可能にしたことで、一段階のみの酵素転移反応で、目的物質を純度よく生成し得る非常に効率の良い工業的製造法として極めて有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is a formula (2) useful as a substrate for measuring the activity of α-amylase.
[0002]
[Chemical 3]

[0003]
The present invention relates to a novel process for producing 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside represented by the following formula (2).
[0004]
[Prior art]
[0005]
Conventionally, various diseases are diagnosed by measuring the activity of α-amylase contained in body fluids such as pancreatic juice and urine, and many substrates for measuring α-amylase activity have been used.
[0006]
Among them, JP-A-6-315399 describes a compound of the formula (2) as a highly sensitive substrate for measuring α-amylase activity that does not require a following enzyme.
[0007]
On the other hand, Japanese Patent Laid-Open No. 3-264596 discloses a formula (4).
[0008]
[Formula 4]

[0009]
(In the formula, at least one of X ¹ and X ² is a galactosyl group, the other is a hydrogen atom, R represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted phenyl group, and n represents an integer of 2 to 5. In the production of a galactosyl maltooligosaccharide derivative in which n is 2 or more and 4 or more glucose groups are bonded to each other, a sugar having a galactosyl residue such as lactose, and a formula (5)
[0010]
[Chemical formula 5]

[0011]
(Wherein R represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted phenyl group, and n represents an integer of 2 to 5). A maltooligosaccharide derivative in which n is 2 or more and 4 or more glucose groups are bonded. And a method of allowing α-galactosidase or β-galactosidase to act.
[0012]
Furthermore, Japanese Patent Laid-Open No. 6-86683 discloses a formula (4) for the purpose of improving the production method described in Japanese Patent Laid-Open No. 3-264596.
[0013]
[Chemical 6]

[0014]
(Wherein at least one of X ¹ and X ² is a galactosyl group, the other is a hydrogen atom, R represents a substituted or unsubstituted phenyl group, and n is an integer of 1 to 5). In connection with a method for producing a galactosyl maltooligosaccharide derivative having three or more glucose groups bonded thereto, β-galactosidase is allowed to act on the maltooligosaccharide and a saccharide having a galactose residue to obtain a compound of formula (6)
[0015]
[Chemical 7]

[0016]
(In the formula, at least one of X ¹ and X ² is a galactosyl group, the other is a hydrogen atom, and n represents an integer of 1 to 5.) After producing a galactosyl malto-oligosaccharide having 3 or more residues bonded thereto, this galactosyl malto-oligosaccharide and the formula (7) in a mixed solution of water and a hydrophilic organic solvent.
[0017]
[Chemical 8]

[0018]
(Wherein n represents an integer of 0 to 3 and R represents a substituted or unsubstituted phenyl group). A method of allowing α-amylase to act on a mixture of maltooligosaccharide derivatives represented by: .
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
[0020]
By the way, according to Japanese Patent Laid-Open No. 6-315399, although the compound of formula (2) is a novel compound, there is no production example and no disclosure of chemical property data. This publication only describes that a maltooligosaccharide derivative containing a compound of formula (2) can be produced by various known methods such as the method described in JP-A-3-264596. Only organic chemical synthesis methods and enzymatic synthesis methods are conceptually shown.
[0021]
That is, according to JP-A-6-315399, “malto-oligosaccharide derivative (a)
[0022]
[Chemical 9]

[0023]
Can be produced by various known methods such as the method described in JP-A-3-264596. For example, a maltooligosaccharide derivative (b) in which 2-chloro-4-nitrophenol is bound to glucose at the reducing end
[0024]
[Chemical Formula 10]

[0025]
(Wherein n represents an integer of 0 to 2) and lactose are reacted in the presence of β-galactosidase to introduce a β-galactopyranosyl group at the non-reducing end of the maltooligosaccharide derivative (b). Can be manufactured.
[0026]
As another method, galactopyrano synthesized by introducing a galactopyranosyl group into the non-reducing end of maltooligosaccharide with β-galactosidase using maltooligosaccharide such as maltose, maltotriose and maltotetraose and lactose. Silmaltooligosaccharide is acetylated in the presence of a base catalyst (such as pyridine or sodium acetate) in acetic anhydride at room temperature or with heating to obtain a protected galactopyranosyl maltooligosaccharide. The reducing end is then modified with phenols by heating with alkali and acetic anhydride and phenols, such as 2-chloro-4-nitrophenol, in the presence or absence of an inorganic solvent, and finally a catalytic amount in methanol. There is a method for producing a target galactopyranosyl maltooligosaccharide derivative by a known deprotection reaction with sodium methylate. Is described.
[0027]
Here, when an objective compound of formula (2) is to be produced by an organic chemical method as described in JP-A-6-315399, formula (3)
[0028]
Embedded image

[0029]
There is a problem that galactosyl maltose, which is expensive and difficult to obtain industrially, must be used as a raw material.
[0030]
Here, the present inventors apply the production method described in JP-A-3-264596, and apply 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α- Attempts to produce maltoside revealed that a galactosyl group having a very low sensitivity as an amylase substrate (about 1/20 of a β-1,4-linked compound) has the formula (8)
[0031]
Embedded image

[0032]
The β-1,6-linked 2-chloro-4-nitrophenyl 6-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside represented by the formula is generated as much as 70%, and the selectivity is reversed. It has been found.
[0033]
Moreover, even if it is going to obtain the target β-1,4-bonded compound from a mixture of a β-1,4-bonded compound and a β-1,6-bonded compound, it is industrially isolated. Is extremely difficult.
[0034]
Therefore, in the production method applying Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-264594 described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-315399, the target compound of the formula (2) is satisfied although it is a similar compound only having a different glucose repeating unit. Cannot be synthesized.
[0035]
In addition, depending on the origin of the enzyme, even if it is β-galactosidase, it does not preferentially produce the target β-1,4 linked compound, and β-1,6 linked compound preferentially. It may be generated. The problems related to the control of the regioselectivity of β-galactosidase transfer ability as described above have never been recognized.
[0036]
Thus, according to the conventional production method, the formula (8), which has extremely low sensitivity as an α-amylase activity measurement substrate.
[0037]
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[0038]
A β-1,6-linked 2-chloro-4-nitrophenyl 6-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside represented by the following formula is produced as a by-product, which is industrially removed and purified: Since it is not preferable that such a by-product is mixed with a substrate for clinical diagnosis that requires a high-purity product, there is a technique for introducing a galactosyl group with high regioselectivity. It was sought after.
[0039]
In this regard, according to Japanese Patent Laid-Open No. 6-86683, a method of allowing α-amylase to act on a malto-oligosaccharide derivative as a second-stage reaction in order to suppress the by-product of β-1,6-linked galactosyl malto-oligosaccharide derivative. Is adopted.
[0040]
However, although it has become possible to improve the regioselectivity of the galactosyl group introduced by this method, the method using a two-stage enzyme transfer reaction with a transfer rate as low as about 10% to 20%, The problem was that the yield and production efficiency were very low, which was insufficient as an industrial production method.
[0041]
[Means for Solving the Problems of the Invention]
[0042]
The inventors of the present invention have used a compound of formula (2), which is a substrate for measuring an α-amylase activity measuring reagent used for diagnosis of various diseases, at a high yield in a one-step enzymatic reaction using an inexpensive raw material. Intensive study was conducted for the purpose of highly selective production, and the method of the present invention was completed.
[0043]
That is, the present invention relates to lactose and formula (1)
[0044]
Embedded image

[0045]
2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltoside represented by the formula (2) is reacted in the presence of β-galactosidase. The present invention relates to a method for producing —O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside.
[0046]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0047]
The compound of formula (1) used in the production method of the present invention is produced from commercially available maltose by the method described in JP-A-8-67691, JP-A-8-67692, and the like.
[0048]
In the transfer reaction, the lactose substrate concentration is 3 to 40%, preferably 5 to 20%, and the compound concentration of the compound of formula (1) is 1 to 40% with respect to the reaction solution. , Preferably 1 to 20%, more preferably 2 to 9%.
[0049]
As β-galactosidase, an enzyme derived from Bacillus circulans is often used, and examples thereof include a trade name “β-1,4-galactosidase II” manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd., which is commercially available. In addition, the target product can be produced by the method of the present invention using a known immobilized enzyme method.
[0050]
The concentration of β-galactosidase is 0.01 to 0.8 mg, preferably 0.01 to 0.4 mg, and more preferably 0.01 to 0.4 mg / ml of the reaction solution in order to introduce a galactosyl group with high regioselectivity. 0.1 mg.
[0051]
The reaction time can be selected from 1 minute to 30 hours after the enzyme is added.
[0052]
The reaction temperature can be selected from the range of 20 to 70 ° C.
[0053]
As the reaction solvent, water or a mixed solvent of water and a hydrophilic organic solvent can be used. Examples of hydrophilic organic solvents include methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-propyl alcohol, acetone, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, ethylene glycol, propylene glycol, acetonitrile, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, 1,3-dimethyl- Mention may be made of 2-imidazolidinone or mixtures thereof.
[0054]
The content of the hydrophilic organic solvent is 10 to 90%, preferably 40 to 70%. These hydrophilic organic solvents can be used alone or in combination.
[0055]
The reaction solvent is preferably adjusted to a pH in the range of 5 to 8, and a known buffer solution can be used for this purpose.
[0056]
After completion of the reaction, the enzyme reaction is stopped by heating the reaction solution or lowering or raising the pH of the reaction solution. Subsequently, the target substance can be obtained by purification by column chromatography or the like.
[0057]
【Example】
[0058]
The abbreviations described in the experimental examples mean as follows.
Enzyme A : β-galactosidase derived from Bacillus circulans (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd .; trade name “β-1,4-galactosidase II”).
Enzyme B : E.I. Β-galactosidase derived from Coli (manufactured by Funakoshi Co., Ltd .; product number “FT-0052-09”).
Enzyme C : Aspergillus sp. Β-galactosidase (manufactured by Funakoshi Co., Ltd .; product number “FT-0052-01”).
IPA : isopropyl alcohol.
AN : acetonitrile.
DMSO : Dimethyl sulfoxide.
67 mM phosphate buffer solution : An aqueous phosphate solution (pH 7.0) with a specified concentration.
[0059]
Experimental Example 1: Comparative Examples 1-6
600.0 mg of lactose monohydrate, 300.0 mg of 2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltoside, a hydrophilic organic solvent of either isopropyl alcohol, acetonitrile, or dimethyl sulfoxide, and a 67 mM phosphorus buffer solution Was added to 5.0 ml of the mixed solvent mixed at the ratio shown below, and then enzyme A was added at a rate of 1.0 mg per 1 ml of the mixed solvent and reacted at 40 ° C. for 3 hours or 10 hours. The reaction was terminated by heating to 100 ° C. After completion of the reaction, a galactosyl malto-oligosaccharide derivative (which is a mixture of β-1-4 and β-1-6 shown below) was separated and galactosylmalto-oligo against 2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltoside was isolated. When the yield of the sugar derivative (hereinafter referred to as sugar derivative yield) was measured, it was 15 to 20% in all cases. After completion of the reaction, the reaction product before purification on the ODS column is represented by formula (2)
[0060]
Embedded image

[0061]
2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside (hereinafter referred to as β-1-4 isomer) represented by formula (8)
[0062]
Embedded image

[0063]
And a production ratio (hereinafter referred to as 1--6) of 2-chloro-4-nitrophenyl 6-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside (hereinafter referred to as β-1-6 isomer). 4 / 1-6 production ratio) was determined using high performance liquid chromatography. These results are shown below.
[0064]
Test Example Enzyme Enzyme Concentration Solvent Composition 1-4 / 1-6 Production Ratio Reaction Time Comparative Example 1 A 1.00 DMSO: Water = 2: 8 28: 72 10 hours Comparative Example 2 A 1.00 IPA: Water = 5: 5 34: 66 10 hours comparative example 3 A 1.00 AN: water = 5: 5 36: 64 10 hours comparative example 4 A 1.00 DMSO: water = 2: 8 47: 53 3 hours comparative example 5 A 00 IPA: Water = 5: 5 51: 49 3 hours Comparative Example 6 A 1.00 AN: Water = 5: 5 54: 46 3 hours
In Experimental Example 1 using the method described in the literature and using enzyme A as β-galactosidase, β-1,4 isomers were not selectively obtained, and β-1,6 isomers were more There was also an example that was generated.
[0066]
Experimental Example 2: Comparative Examples 7-12
Similar to Experimental Example 1, the same experiment was performed using enzyme B instead of enzyme A.
As a result, the sugar derivative yield was 15 to 20%. Moreover, the 1-4 / 1-6 production | generation ratio was shown below.
[0067]
Test Example Enzyme Enzyme Concentration Solvent Composition 1-4 / 1-6 Production Ratio Reaction Time Comparison Example 7 B 1.00 DMSO: Water = 2: 80 0: 100 10 Hours Comparison Example 8 B 1.00 IPA: Water = 5: 5 0: 100 10 hours comparative example 9 B 1.00 IPA: water = 2: 8 0: 100 10 hours comparative example 10 B 1.00 DMSO: water = 2: 8 0: 100 3 hours comparative example 11 B1. 00 IPA: Water = 5: 5 0: 100 3 hours Comparative Example 12 B 1.00 IPA: Water = 2: 80 0: 100 3 hours
In Experimental Example 2 using the method described in the literature and using enzyme B as β-galactosidase, β-1,4 bodies were not obtained, and only β-1,6 bodies were produced.
[0069]
Experimental Example 3: Comparative Examples 13-16
Similar to Experimental Example 1, the same experiment was performed using enzyme C instead of enzyme A. As a result, the sugar derivative yield was 15 to 20%. Moreover, the 1-4 / 1-6 production | generation ratio was shown below.
[0070]
Test example Enzyme Enzyme concentration Solvent composition 1-4 / 1-6 Production ratio Reaction time comparison example 13 C 1.00 DMSO: water = 2: 8 3:97 10 hour comparison example 14 C 1.00 IPA: water = 5: 5 5:95 10 hours comparative example 15 C 1.00 DMSO: water = 2: 8 12:88 3 hours comparative example 16 C 1.00 IPA: water = 5: 5 10:90 3 hours
In Experimental Example 3 in which the method described in the literature was applied and enzyme C was used as β-galactosidase, β-1,4 isomers were hardly obtained, but rather β-1,6 isomers were selectively produced. .
[0072]
Experimental Example 4: Examples 1 to 24
600.0 mg of lactose monohydrate, 300.0 mg of 2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltoside, a hydrophilic organic solvent of either isopropyl alcohol, acetonitrile, or dimethyl sulfoxide, and a 67 mM phosphorus buffer solution Was added to 5.0 ml of the mixed solvent mixed at the ratio shown below, and then enzyme A was added at the ratio shown below per 1 ml of the mixed solvent and reacted at 40 ° C. for 3 hours or 10 hours. The reaction was terminated by heating to 100 ° C. The sugar derivative yield was 15-20% in all cases. After the reaction, the 1-4 / 1-6 production ratio of the reaction product before purification on the ODS column was determined in the same manner as in Experimental Example 1.
[0073]
Test Example Enzyme Enzyme Concentration Solvent Composition 1-4 / 1-6 Production Ratio Reaction Time Example 1 A 0.04 IPA: Water = 5: 5 92: 8 10 hours Example 2 A 0.10 IPA: Water = 5: 5 82: 18 10 hours Example 3 A 0.30 IPA: water = 5: 5 67: 33 10 hours Example 4 A 0.04 IPA: water = 2: 8 76: 24 10 hours Example 5 A 0. 10 IPA: water = 2: 8 67:33 10 hours Example 6 A 0.04 AN: water = 5: 5 92: 8 10 hours Example 7 A 0.10 AN: water = 5: 5 80:20 10 Time Example 8 A 0.30 AN: Water = 5: 5 68: 32 10 hours Example 9 A 0.04 DMSO: Water = 5: 5 89: 11 10 hours Example 10 A 0.10 DMSO: Water = 5: 5 82:18 10 hours Example 11 A 0.30 DMSO: water = : 5 63:37 10 hours Example 12 A 0.04 DMSO: water = 2: 8 79:21 10 hours Example 13 A 0.04 IPA: water = 5: 5 90:10 3 hours Example 14 A 0 .10 IPA: water = 5: 5 91: 9 3 hours Example 15 A 0.30 IPA: water = 5: 5 80:20 3 hours Example 16 A 0.04 IPA: water = 2: 8 74:26 3 hours Example 17 A 0.10 IPA: Water = 2: 8 83: 17 3 hours Example 18 A 0.04 AN: Water = 5: 5 90: 10 3 hours Example 19 A 0.10 AN: Water = 5: 5 87: 13 3 hours Example 20 A 0.30 AN: water = 5: 5 82: 18 3 hours Example 21 A 0.04 DMSO: water = 5: 5 86: 14 3 hours Example 22 A 0.10 DMSO: water = 5: 5 75:25 3:00 Example 23 A 0.30 DMSO: water = 5: 5 77:23 3 hours Example 24 A 0.04 DMSO: water = 2: 8 87:13 3 hours
According to Experimental Example 4, when the concentration of β-galactosidase was 0.04 mg, 0.1 mg, or 0.3 mg per ml of the mixed solvent using enzyme A, β-1,4 bodies were selectively obtained. I understood it.
[0075]
About Example 1, it isolate | separates and refines using an ODS column after completion | finish of reaction, It freeze-dris, 2-chloro- 4-nitrophenyl 4-O- (beta) -D-galactopyrano which is (beta) -1,4 body. 72 mg of sil-α-maltoside was obtained.
[0076]
Experimental Example 5: Comparative Examples 17 to 28
Similar to Experimental Example 4, the same experiment was performed using enzyme B instead of enzyme A. As a result, the sugar derivative yield was 15 to 20%. Moreover, the 1-4 / 1-6 production | generation ratio was shown below.
[0077]
Test Example Enzyme Enzyme Concentration Solvent Composition 1-4 / 1-6 Production Ratio Reaction Time Comparison Example 17 B 0.04 IPA: Water = 5: 5 0: 100 10 hours Comparison Example 18 B 0.10 IPA: Water = 5: 5 0: 100 10 hour comparative example 19 B 0.30 IPA: Water = 5: 5 0: 100 10 hour comparative example 20 B 0.04 AN: Water = 5: 5 0: 100 10 hour comparative example 21 B 0. 04 DMSO: water = 2: 8 0: 100 10 hours comparative example 22 B 0.04 IPA: water = 5: 5 0: 100 10 hours comparative example 23 B 0.04 IPA: water = 5: 5 0: 100 3 Time Comparison Example 24 B 0.10 IPA: Water = 5: 5 0: 100 3 hours Comparison Example 25 B 0.30 IPA: Water = 5: 5 0: 100 3 hours Comparison Example 26 B 0.04 AN: Water = 5: 5 0: 100 3 hours comparative example 27 B 0.04 DMS : Water = 2: 8 0: 100 3 hours Comparative Example 28 B 0.04 IPA: water = 5: 5 0: 100 3 hours [0078]
When enzyme B was used instead of enzyme A, β-1,4 bodies were not obtained, and only β-1,6 bodies were produced.
[0079]
Experimental Example 6: Comparative Examples 29 to 32
Similar to Experimental Example 4, the same experiment was performed using enzyme C instead of enzyme A. As a result, the sugar derivative yield was 15 to 20%. Moreover, the 1-4 / 1-6 production | generation ratio was shown below.
[0080]
Test example Enzyme Enzyme concentration Solvent composition 1-4 / 1-6 Production ratio Reaction time comparison example 29 C 0.04 DMSO: water = 2: 8 5:95 10 hour comparison example 30 C 0.04 IPA: water = 5: 5 7:93 10 hours comparative example 31 C 0.04 DMSO: water = 2: 8 7:93 3 hours comparative example 32 C 0.04 IPA: water = 5: 5 9:91 3 hours
When enzyme C was used instead of enzyme A, β-1,4 bodies were hardly obtained, but rather, β-1,6 bodies were selectively produced.
[0082]
According to the above experimental examples 1 to 6, it was confirmed that by selecting the concentration and type of β-galactosidase, the β-1,4 form, which is the object of the present invention, can be selectively produced.
[0083]
【The invention's effect】
[0084]
Formula (2) of the present invention
[0085]
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[0086]
The method for producing 2-chloro-4-nitrophenyl 4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside represented by formula (3) is expensive.
[0087]
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[0088]
A very inexpensive lactose without using the galactosyl-maltose represented by the formula (1)
[0089]
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[0090]
It is possible to produce a β-1,4 bond with very high selectivity using 2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltoside represented by The transfer reaction is extremely useful as an extremely efficient industrial production method capable of producing a target substance with high purity.

Claims

In the presence of β-galactosidase, which is an enzyme derived from Bacillus circulans, at a concentration of 0.04 to 0.30 mg per ml of the solution in a mixed solution of water or water and a hydrophilic organic solvent, Formula (1)

Formula (2) characterized by reacting 2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltoside represented by the formula (2)

The manufacturing method of 2-chloro- 4-nitrophenyl 4-O- (beta) -D-galactopyranosyl- (alpha) -maltoside represented by these.

The production method according to claim 1, wherein the concentration of β-galactosidase is 0.04 to 0.10 mg per 1 ml of a solution obtained by mixing water or water and a hydrophilic organic solvent.