JP3751480B2

JP3751480B2 - Histamine sensor

Info

Publication number: JP3751480B2
Application number: JP24082599A
Authority: JP
Inventors: 勝義林; 修丹羽; 勉堀内; 慶一鳥光; 僚二栗田; 一隆前山; 克行谷澤
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2019-08-27
Also published as: JP2001061497A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食肉、鮮魚などの食品検査や、脳脊髄液などの生体試料の測定において試料中に含まれるヒスタミンを高感度、かつ連続的に定量分析するためのヒスタミンセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒスタミンは生体アミンの一種であり、消化液の分泌やアレルギー反応に関係するのみならず、脳内の伝達物質として働く分子である。また、魚介類や食肉中のヒスチジンが微生物と反応することにより生じるため、食品衛生上、食品中の濃度を迅速に測定する方法が求められている。
【０００３】
食品中のヒスタミンについては、北米食品薬品局（ＦＤＡ）が１９８２年に蛍光法によるヒスタミンの測定法を定めている。蛍光法はヒスタミンとクロマトグラフィにおける誘導体化試薬としても良く使用されている蛍光試薬である o-フタルアルデヒドとの反応により蛍光物質を合成し、その蛍光強度より濃度を求めるものである。しかしながら、蛍光法は妨害物質の影響を受けやすく、前もって妨害物質を除去する必要があることや、蛍光試薬が必要であるなどといった問題があり、試薬の反応時に正確な時間と温度の制御が必要である。
【０００４】
一方、液体クロマトグラフィによるヒスタミンの定量方法も数多く報告されている。例えば、本願発明者の内の１名は脳などの生体組織に含まれるヒスタミンとメチルヒスタミンの濃度を高速液体クロマトグラフィにより感度良く検出している (K. Alam、M. Sasaki、T. Watanabe and K.Maeyama、Analytical Biochemistry、229巻、26-34頁 (1995年) 参照）。この方法ではカラムによって数種類のアミンを分離した後、ジアミン酸化酵素が固定化された酵素カラムによりヒスタミンを酸化して過酸化水素を発生させ、これに蛍光試薬であるルミノールとフェリシアン化カリウムを混合して化学発光を起こし、その発光強度から定量を行っている。
【０００５】
液体クロマトグラフィ法では極めて低い検出限界（即ち高感度）が得られるが、分離プロセスのみで１０分以上の時間がかかるため、汎用性、迅速性が損なわれる。また、細胞からのヒスタミンの放出挙動など、より短い時間分解能が必要な場合には不都合である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
一方、近年、酵素反応と電気化学検出器あるいは酸素センサを組み合わせることによりヒスタミンを検出する方法が提案されている。モノアミン酸化酵素膜を修飾した酸素電極を用いて溶存酸素の変化よりヒスタミンを定量する方法が提案されている（I. Karube et al.、Enzyme Microb. Technol.、2巻、117-120頁 (1980年) 参照）。また、被測定液にヒスタミン酸化酵素を混合し、被測定液の酸素消費量を測定することによりヒスタミンを迅速に定量する方法が提案されている（寄藤他、特開平５−２３６９５２号公報、大橋他、特開平１０−１７４５９９号公報参照）。
【０００７】
しかしながら、前者の方法では、大橋らにより（大橋他、特開平１０−１７４５９９号公報記載のように）修飾膜の作製法や反応温度により特性が変動することなど多くの問題点が指摘されている。一方、後者では被測定液に含まれるヒスタミン全量を酵素反応により酸化するため、化学量論関係が成立し、測定精度が高い。しかしながら、被測定液に高価な酵素を添加するため費用がかかること、近年、医学生理学の測定で要求されている細胞レベルへのヒスタミンの測定などマイクロリットル、ナノリットルレベルの微少量試料の測定では測定系の酸素濃度をコントロールするのが困難であり、またヒスタミン濃度が低い場合には酸素のわずかな減少量を測定する必要があり、酵素反応生成物を測定する方式に較べて、低濃度での定量性に劣るなどの問題があった。
【０００８】
一方、酵素反応生成物を測定する方法として、ジアミン酸化酵素を修飾した白金電極を利用するアンペロメトリックなセンサも報告されている（例えば、S. Tombelli et al.、Anal. Chim. Acta、358巻、3号、277-284頁、(1998年）参照）。この方法では、酸素濃度が基質濃度より充分大きい場合、酵素反応生成物である過酸化水素を再現性良く測定できる。特にヒスタミン濃度が低い場合、酸素消費量が少ないため、試料内の酸素濃度を調整する必要がなく、酸素減少量を測定する方法に比べて簡便である。また、センサも容易に微小化できる。しかしながら、過酸化水素を酸化して測定を行うには白金電極の電位を 500 mV 以上（銀／塩化銀参照電極に対して）にする必要があり、試料中に共存し電気化学的に酸化されやすいＬ-アスコルビン酸、尿酸などの妨害を受けやすい問題点があった。また、ジアミン酸化酵素は多くのジアミン類と反応するため、ヒスタミンを選択性良く測定することができなかった。一方、過酸化水素を、ペルオキシダーゼ系の酵素を用い、電子伝導性の膜を介して電極反応により還元する方法が提案されている（例えば、M. Vreeke、R. Maidan、A. Heller、Analytical Chemistry、64巻、 3084-3090頁、(1998年）参照)。発明者らはポリビニルピリジンのオスミウム錯体に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した膜とヒスタミン酸化酵素膜を２層に修飾した電極を用いることにより 0 V 付近の低い電位でヒスタミンを高感度に測定できることを報告した（丹羽、栗田、堀内、鳥光、前山、谷沢、日本分析化学会第４７年会要旨集、51頁参照）。この方法では低い検出限界が得られるものの、膜に固定された酵素の量や膜厚により信号の絶対値が変化する問題があった。
【０００９】
本発明の目的は、試料中のヒスタミン濃度を測定するための電気化学センサにおける上記課題を解決し、簡便な方法で、低い濃度まで高感度に、選択性および再現性良く、ヒスタミン濃度を測定するセンサを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、請求項１に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビーズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の高分子膜、あるいはＬ - アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項２に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビーズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、Ｌ - アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項３に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるいは高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の高分子膜、あるいはＬ - アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項４に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるいは高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、Ｌ - アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項５に記載のように、
請求項１乃至４のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記電極が絶縁性基板上に形成された薄膜電極であることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項６に記載のように、
請求項１乃至４のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜がペルオキシダーゼ系の酵素を含有する膜であることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項７に記載のように、
請求項１乃至６のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、電気化学的に酸化されやすい物質を酸化するための電極を有することを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
【００１１】
この構成においては、ヒスタミンをほぼ完全に酸化するために十分な量のヒスタミン酸化酵素を用いることができるので、上記のポリビニルピリジンのオスミウム錯体に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した膜とヒスタミン酸化酵素膜を２層に修飾した電極を用いる場合における問題点、すなわち固定された酵素の量や膜厚により信号の絶対値が変化する問題を解消することができる。
【００１２】
この構成のヒスタミンセンサを用い、センサ内に導入されるヒスタミンを酵素反応によりほとんど完全に酸化し、その酵素反応において生成した過酸化水素を、電極反応を介し、低い電位で還元して、その時に流れる電流を測定することにより、ヒスタミン濃度を、高い精度と高い感度と良好な選択性で測定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明に関わるヒスタミンセンサの基本的な構造図である。センサはシリンジポンプ１や高速液体クロマトグラフィに用いるプランジャーポンプ２によりキャリア液３をヒスタミンセンサに送液し、その途中で、インジェクター４により試料を一定量のみ導入する。試料は前電解用電極５に接触した後にヒスタミン酸化酵素が固定化された反応器６に入る。前電解用電極５の役割は、試料中に多量のＬ-アスコルビン酸が含まれるような場合に、それを電極酸化して、ヒスタミンの定量に影響を与えないようにすることにある。反応器６に導入された溶液に含まれるヒスタミンは、反応器６内に固定化されたヒスタミン酸化酵素によってほぼ完全に酸化され、この酸化反応によって生成した過酸化水素はフローセル７に入って、作用電極８上の電極反応により検出される。フローセル７には、作用電極８に対する対向電極９と参照電極１０とが配置されている。各電極への電圧の印加および電極電流の計測はポテンシオスタット１１により行われ、計測の結果はレコーダ１２によって記録される。電極反応後の液は廃液１３としてフローセル７外に排出される。
【００１４】
図２は図１におけるフローセル７の拡大断面図を示す。図２に示したように、グラッシーカーボン電極上に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含有するオスミウムポリビニルピリジン誘導体の修飾膜（図中、Ｏｓ-ｇｅｌ-ＨＲＰフィルムと表示）を形成したものである。作用電極と対向電極との間の間隔はガスケットによって一定に保たれ、両電極間の間隙が流路の一部となって、液中の過酸化水素はここで電極反応によって還元される。
【００１５】
本発明に関わるヒスタミンセンサを用いてヒスタミンを測定する際の反応式を次に示す。
【００１６】
【化１】

【００１７】
ヒスタミンは、酵素反応器に固定化されたヒスタミン酸化酵素により、式１に示すように酸化され、１分子のヒスタミンから１分子の過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）が生成する。生成した過酸化水素は電極上のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により還元されるが、その際にペルオキシダーゼ自身は酸化体となり、電極とペルオキシダーゼとの間の電子移動を仲介する膜を酸化する（式２）。その後、膜が、式３に示すように、電極により還元されることにより電極に電流（還元電流）が流れ、それがポテンシオスタットによって測定される。これらの反応式から明らかなように、酸化されたヒスタミンの量と、電極より供給される電子の量とは比例するために、電極を流れる還元電流値を時間について積分して電子の量を求めることによりヒスタミンを定量することができる。
【００１８】
ペルオキシダーゼの膜を介した還元反応は、銀／塩化銀参照電極に対して 0 mV 以下の低い電位で行うことができる。このように、電極反応に還元反応を用いることにより、妨害物質の影響の少ない低い電位での測定が可能になる。一方、培養細胞から放出される試料を連続的に測定する場合においては、センサの廃液側をシリンジポンプなどで吸引して試料を導入することもできる。また、試料量を減らすために反応器と検出器を集積化した微小化センサをマイクロマシン技術を用いてガラスやシリコン基板に作製して用いることもできる。
【００１９】
本発明に関わるセンサの製造工程においては、まず、ヒスタミン酸化酵素の流路への固定化を行う。
【００２０】
図３はヒスタミン酸化酵素の固定化の方法を説明する図である。すなわち、ヒスタミン酸化酵素の固定化の方法としてはビーズに酵素を固定化し、それを直接あるいは、図３（ａ）に示すように、カラムに充填した形で反応器内に設置する方法や、図３（ｂ）に示すように、流路の内壁へ酵素を固定化して中空の反応器を作製する方法等をあげることができる。なお、酵素を固定化する方法としては、後述の実施例１におけるように、共有結合による固定化方法、あるいは、後述の実施例４におけるように、高分子膜内に取り込む形で固定化する方法などがある。
【００２１】
一方、検出用のフローセルは、高速液体クロマトグラフィやフローインジェクション分析に用いる市販の電気化学フローセルを使用する方法やホトリソグラフィとスパッタ、蒸着、ＣＶＤ（化学気相堆積法）などの薄膜形成技術を用いて作製した電極と流路を組みあわせることにより得られる。電極の上には過酸化水素を還元し電極から電子を受け取る性質を有する膜を形成する。具体的には例えば導電性高分子に過酸化水素を還元するペルオキシダーゼを複合した膜などが利用可能である。
【００２２】
更に、試料溶液にＬ-アスコルビン酸などの電気化学測定の妨害となる物質を含む場合は、膜中に更にＬ-アスコルビン酸酸化酵素を複合するか、あるいは、最上層にアニオン性の高分子膜を修飾し、膜の静電的な反発作用によりＬ-アスコルビン酸等の妨害物質の影響を除くことができる。
【００２３】
導電性高分子膜としては、ポリピロールやその誘導体、ポリアニリンやその誘導体が挙げられる。これらの膜はペルオキシダーゼ、あるいはペルオキシダーゼとそれぞれの高分子のモノマーを塩化カリウムなどの電解質と共に溶解させた水溶液にセンサ用の電極を参照電極、対向電極と共に浸した後、各電極をポテンシオスタットの対応する端子に繋ぎ、センサ用の電極に電位を印加することにより酵素を取り込んだ膜を形成することができる。あるいはペルオキシダーゼを含むポリビニルフェロセン膜やオスミウム-ポリビニルピリジン膜などの酸化還元性の高分子も使用することができる。最上層へ修飾するアニオン性の膜としてはナフィオン等をあげることができる。
【００２４】
すでに述べたように、本発明に関わるヒスタミンセンサにおいては、電極還元反応を、銀／塩化銀参照電極に対して 0 mV 以下の低い電位で行う。このため、肥満細胞や脳神経細胞のヒスタミンを計測する際に共存する電気化学的に活性なＬ-アスコルビン酸が電極で直接酸化されない電位で測定を行うことができ、高い選択性を実現することができる。一方、ペルオキシダーゼが過酸化水素を還元する際に、多量のＬ-アスコルビン酸が存在すると、酸化状態にあるペルオキシダーゼや導電性高分子がＬ-アスコルビン酸により還元される（ R. Maidan and A. Heller、Amalytical Chemistry、64巻、2889-2896頁、(1992年) 参照）。このため、ヒスタミンが酸化されて生成する過酸化水素の量が一定の場合でも、Ｌ-アスコルビン酸の膜内濃度が増加すると、電極上で観測される還元電流は減少する。この反応は、修飾電極最上部にナフィオンなどのアニオン性の膜をコーティングするか、あるいは酵素反応器の上流に電極（図１の前電解用電極５）を組み込み、前電解により試料に含まれるＬ-アスコルビン酸をほとんど酸化することにより防ぐことができる。
【００２５】
以下に、本発明の実施の形態について、実施例を用いて、更に詳しく説明する。
【００２６】
（実施例１）
上記において説明した本願発明の電気化学検出器を用いて次のような実験を行った。
【００２７】
図４に、ヒスタミン酸化酵素をガラスビーズに固定化する工程を示す。
【００２８】
（ａ）
ガラスビーズ（直径 20μｍ）を約 1ｇ、３-アミノプロピルトリエトキシシラン 1％を溶解させたアセトン中にけん濁させ、70℃で３時間反応させた。この反応（シランとビーズ表面との反応）により、ビーズの表面が末端にアミノ基（−ＮＨ₂）をもつ分子で修飾される。
【００２９】
（ｂ）
反応後、ガラスビーズが沈降するのを待ち、上澄み液を捨て、再度アセトンを加えてその操作を３回くり返すことにより洗浄した。アセトンを蒸発させた後、今度は 2％のグルタルアルデヒド水溶液にビーズをけん濁させ１時間反応させた。この反応により、ビーズの表面が末端にアルデヒド基（−ＣＨＯ）をもつ分子で修飾された形になる。
【００３０】
（ｃ）
反応後、ビーズをフィルターによりろ過回収し、水洗を行って未反応のグルタルアルデヒドを完全に除いた。次にヒスタミン酸化酵素を溶解させた 100ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ 7.0、酵素濃度：10 ユニット／ｍリットル）にビーズを溶解させ、３時間以上放置し酵素をビーズ上のグルタルアルデヒドと反応させて、酵素をビーズに固定化した。図中、酵素を、Ｅと表示した正方形で示す。
【００３１】
（ｄ）
酵素固定化後、 1％グリシン水溶液で洗浄して未反応のアルデヒド残基をグリシンと反応させて、分子の末端を化学的に比較的安定なカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とし、ヒスタミン酸化酵素の固定化工程を終了した。
【００３２】
次に高速液体クロマトグラフイの配管に使用するピークチューブ（内径 0.5 ｍｍ、長さ 4ｃｍ）の一方の出口に円筒型のフェルト（外径 0.5ｍｍ、長さ 3 ｍｍ）を挿入し、フィルタとした。次にもう一方の出口よりシリンジを用いて緩衝溶液にけん濁させた酵素固定化ビーズを充填した。充填後、もう一方の出口も円筒型のフェルトで塞ぎ、酵素反応器を得た。
【００３３】
次にグラッシーカーボン電極（直径 6ｍｍ：ビーエ一エス社製）上に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含むオスミウムポリビニルピリジン誘導体溶液（Bioanalytical Systems 社製）を 2μリットル塗布し乾燥させて高分子膜を形成した。この電極をフローセル中にセットし、上流側にヒスタミン酸化酵素を固定化したビーズを充填したカラムを挿入し、ポンプや前電解用電極をセットして図１に示したセンサを構成した。
【００３４】
センサの作用電極（図１の８）、前電解用の白金円管電極（図１の５）、銀／塩化銀参照電極（図１の１０）および対向電極（ステンレスブロック製、図１の９）をポテンシオスタットＬＣ４Ｃ（Bioanalytical Systems 社製、図１のポテンシオスタット１１）のそれぞれに対応する端子に接続した。またセンサは高速液体クロマトグラフィ用のポンプを用いて送液し、ヒスタミン酸化酵素固定化カラム（図１の反応器６）とポンプの間にはサンプルインジェクター（図１の４）を組み込んだ。
【００３５】
センサの作用電極の電位を銀／塩化銀参照電極に対して 0Ｖに保持し、ポンプにより流速 10μリットル／分で送液しながらサンプルインジェクターより一定量のサンプルを注入した。その結果を図５に示す。
【００３６】
濃度 1μＭのヒスタミン溶液を 10μリットル注入すると 25ｎＡのピークが得られた。一方、メチルヒスタミンを濃度 1μＭで注入すると、電流値は 3.5ｎＡ程度であった。一方、ジアミンであるプトレシンやカダベリンを加えると応答は数百分の１となり、高い選択性が得られることが分かった。
【００３７】
図６にヒスタミン濃度と電流の関係を示す。図が示すように、きわめて広いヒスタミン濃度範囲において、濃度と電流値の直線関係が得られていることが分かる。このような実用上好ましい直線関係が得られる理由は、本発明に関わるヒスタミンセンサにおいて、試料中のヒスタミンがヒスタミン酸化酵素によってほとんど完全に酸化されていることにある。この酸化が不完全であると、特にヒスタミン濃度が高い範囲において、電流値が比例計算で求められる値よりも小さくなり、その分だけ測定誤差を生じる。また、ヒスタミンの濃度を 10ｎＭまで減らしても測定を行うことができ、低い検出限界を達成することができた。一方、図４のピークを時間に関して積分すると、最も高濃度である 100μＭのヒスタミンを 10μリットル注入した場合、1.9×10^-4Ｃの電荷が観測され、化学量論的数値計算によって、注入したヒスタミンがほぼ 100％反応していることが分かった。次に、電極電位を -50ｍＶ（銀／塩化銀参照電極に対して）にしてＬ-アスコルビン酸（10μＭ、10μリットル）を注入すると、0.4ｎＡの酸化電流が観測されるのみであり、Ｌ-アスコルビン酸単独ではほとんど電流が流れないことが分かった。しかしながら、1μＭのヒスタミンとＬ-アスコルビン酸を両方含む溶液を 10μリットル注入すると、還元電流は 4.7ｎＡに減少した。これは、ヒスタミン酸化酵素の反応で発生した過酸化水素がＨＲＰで還元されＨＲＰにオスミウム-ポリビニルピリジン膜を通して電極から電子が供給される際に、ＨＲＰや高分子がＬ-アスコルビン酸により還元され、電極から供給される電子が減少するためである。そこで、図１に示した前電解用電極５に 700ｍＶの電位を印加し、Ｌ-アスコルビン酸が反応器６に入る前に酸化されるような処置を講じてから、同一の試料を注入すると、電流値は 24.3ｎＡまで回復し、Ｌ-アスコルビン酸の影響をほぼ完全に除去できることが分かった。
【００３８】
試料として、常温で５日間放置したハマチ切り身と解凍直後のハマチの切り身をホモジナイザーですり潰し、ろ過した液を各 10μリットルずつセンサに注入した。その結果、前者では 21(±0.5、n = 5)ｎＡ、後者では 0.02ｎＡのピークが得られ、鮮度の測定に十分便用可能であることが分かった。ここに、n = 5 は、データの個数が５であることを示している。
【００３９】
（実施例２）
実施例１と同様な方法で作製した電極をセットしたフローセルと、ヒスタミンを固定化したビーズを充填したカラムを用いた測定系を図７に示す。図７において、フローセルの廃液側をシリンジポンプに接続し、カラムをテフロン細管を介して、先端を熱で延伸したキャピラリーに接続した。センサの作用、参照、対向電極を実施例１と同じポテンシオスタットに接続し、作用電極に銀／塩化銀対向電極に対して -50ｍＶの電位を印加した。ガラス管を顕微鏡用のマイクロポジショナーに取り付けた。顕微鏡観察下にラットＲＢＬ-２Ｈ３培養細胞を入れたシャーレを置き、顕微鏡観察下でガラス管の先端を細胞のコロニーに 1μｍの距離まで近接させた。ＲＢＬ-２Ｈ３セルはあらかじめ１０時間前に培養液中にイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）を加えて置いたものを使用した。細胞近傍液を流速 4μリットル／分で吸引しながら、細胞を牛血清アルブミンにジニトロフェノールを結合させたもの（ＢＳＡ-ＤＮＰ）を含む緩衝溶液を加えると、還元電流の増加が観測された。一方、ＢＳＡ-ＤＮＰを含んでいない溶液では電流値の増加は全く観測されず、抗原抗体反応に伴うヒスタミン放出をセンサによりリアルタイム検出することができた。
【００４０】
（実施例３）
図８は、本発明に関わるヒスタミンセンサの一実施例におけるセンサの構造を示す。図８において、８１はシリンジポンプ、８２はＨＲＰを含オスミウム-ポリビニルピリジン膜を修飾した作用電極、８３は銀参照電極、８４は対向電極、８５は前電解用電極、８６はヒスタミン酸化酵素を充填した微少量反応器、８７はサンプリング用ガラスキャピラリー、８８は電極が形成された基板、８９は微小流路が形成された基板、９０は微小流路である。ここで、電極が形成された基板８８は絶縁性基板であり、その上に各電極が薄膜電極の形で形成されている。
【００４１】
図８において、サンプリング用ガラスキャピラリー８７より連続的に採取されたヒスタミンは微少量反応器８６中で酵素反応し、生成した過酸化水素は作用電極８２上でＨＲＰを含むオスミウム-ポリビニルピリジン膜を介して電極還元される。
【００４２】
センサは微小流路が形成された基板８９と電極が形成された基板８８とを貼り合わせて作製されている。このセンサの作製工程を以下に示す。
【００４３】
まず、微小な矩形断面の流路を有する基板を次のようにして作製した。すなわち、パイレックスガラスウェハ（３インチ）上にポリイミド（東レ製）を厚さ 20μｍになるようスピンコート（回転塗布）した。次に、シリコン系反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）用フォトレジスト（ＮＴＴ-ＡＴ社製）をスピナー（回転塗布機、ミカサ社製）により 2000回転／分で回転塗布した。その後、流路パタンが描かれたフォトマスクをウェハに重ね、マスクアライナーＰＬＡ-５０１（キヤノン製）を用いて流路のパタンを露光した。露光後、アルカリ現像液中で現像を行い、水洗、乾燥してレジストパタンを形成した。現像後のウェハでは流路以外の部分がシリコン系レジストパタンに覆われているので、このレジスト付き基板を反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）に入れ、シリコン系レジストパタンをマスクにして酸素プラズマによりレジストに覆われていない部分のポリイミド膜を除去した。エッチング条件は、圧力 5Ｐａ、パワー 100Ｗ、酸素流量 100ＳＣＣＭで時間は 110分とした。ポリイミドパタンを形成後、基板を別の反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）に入れ、ポリイミドをマスクにしてＣ₂Ｆ₆ガスのプラズマによりガラスをエッチングした。条件は圧力 2Ｐａ、パワー 500Ｗ、流量 100ＳＣＣＭ、時間 120分とし、深さを 22μｍとした。ガラス流路を形成後、酸素の反応性イオンエッチング装置により、残ったポリイミド膜を取り除きガラス流路を得た。その後、流路の両端から約 7ｍｍ程ダイシングソー（ディスコ社製）により、端から 1ｍｍが 400μｍの深さになるように、幅 400μｍカットしキャピラリー接続用の溝とした。
【００４４】
一方、薄膜電極を有する基板を次のようにして作製した。すなわち、まず、３インチのパイレックスガラスウェハを用い、熱ＣＶＤ法により炭素薄膜（膜厚： 100 ｎｍ）を形成した。ＣＶＤ法は、石英基板をガラス管内において 1000℃に加熱し、出発物質としてフタロシアニンを用い、400℃で昇華、ウェハ上で熱分解させる方法を用いた。炭素膜が形成されたウェハ上にシリコン系反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）用フォトレジスト（ＮＴＴ-ＡＴ社製）をスピナー（ミカサ社製）により 4000回転／分で回転塗布した。その後、電極パタンが描かれたフォトマスクをウェハに重ね、マスクアライナーＰＬＡ-５０１（キヤノン製）を用いて４電極のパタンを露光した。露光後、アルカリ現像液中で現像を行い、水洗、乾燥してレジストパタンを形成した。現像後のウェハでは電極パタンの部分のみがレジストパタンに覆われているので、このレジスト付き基板を反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）に入れ、レジストパタンをマスクにして酸素プラズマによりレジストに覆われていない部分の炭素膜を除去した。エッチング条件は、パワー70Ｗ、圧力 2Ｐａ、酸素流量 100ＳＣＣＭとした。その後、アセトン中で、レジストを剥離し電極パタンを得た。電極はサンプリング用のキャピラリーが接続されている側から前電解用電極、作用電極、参照電極、対向電極として用いた。作用電極上にはＨＲＰを含むオスミウムポリビニルピリジン誘導体溶液（Bioanalytical Systems 社製）を塗布し、膜を形成した。また、参照電極用基板上には参照物質として銀ペーストを薄く塗布した。
【００４５】
その後、キャピラリーを接続した矩形断面流路が形成された基板と酵素／高分子修飾薄膜電極が形成された基板とを両方の流路が向かい合うように押しあて位置合わせ後、光硬化性の接着剤を周りから浸み込ませた。接着剤が浸みこんだ後、高圧水銀ランプを用いて光を照射し、基板を接着し、センサチップを完成させた。
【００４６】
図９は上記のようにして作製したヒスタミンセンサの流路の上からの見取り図である。流路は酵素を充填するための幅の広い部分とその下流側に酵素を押さえるためのグレーティング状のフィルターが形成された構造を有している。溶融石英キャピラリー（サイズ、外径 375μｍ、内径 150μｍ、ＧＬサイエンス社製）をフィルタを挟んで幅の広い流路がある反対側の出口（図９における右側斜線部分）に埋め込み接着剤により固定し、その末端をシリンジポンプに接続した。実施例１で使用したヒスタミン酸化酵素を固定化したビーズをけん濁させた液に、センサチップのキャピラリーを接続していない側（図９における左側斜線部分）を浸し、液をマグネットスターラで撹拌しながら、シリンジで吸引するとビーズが流路内に導入され、反応器部分に充填された。その後、先端を熱で延伸して細くしたキャピラリー（図８中の８７）をセンサの流路（図９における左側斜線部分）に挿入し、光硬化性樹脂により接着した。
【００４７】
センサの前電解用電極、ヒスタミンを測定するための作用電極、参照及び対向電極（それぞれ、図８中の８５、８２、８３及び８４）をポテンシオスタットＬＣ４Ｃのそれぞれに対応する端子に接続した。測定はシリンジポンプを用いてサンプリング用のキャピラリーから溶液を吸引しながら、作用電極に -50ｍＶの電位を印加して行った。流速 1μリットル／分で溶液を吸引し、試料として 1μＭのヒスタミンを吸引すると 5.2ｎＡの還元電流が観測され、吸引されたヒスタミンがほぼ 100％反応していることが分かった。
【００４８】
一方、同一濃度のメチルヒスタミンを測定すると 0.8ｎＡの還元電流が観測された。また、ジアミンであるプトレシンやカダベリンを加えると応答は数百分の１であり、高い選択性が確認された。ヒスタミン濃度を下げていくと、20ｎＭの試料を注入してもＳ／Ｎ比が２以上で電流値の増加を観測することができた。また、流速 8μリットル／分で測定を行うと、試料導入開始後、約 20秒以内に定常状態に達し、これまで提案されているヒスタミンの酵素反応に伴う酸素消費を測定する方法に比較して優れた応答性が確認された。応答性は流速を上げると更に向上させることができた。
【００４９】
センサをマニピュレータに接続し、培養したラットＲＢＬ-２Ｈ３セルのコロニー（直径 100μｍ以下）に、顕微鏡観察下で、センサのサンプリングキャピラリー先端を 1μｍまで近接させた。ＲＢＬ-２Ｈ３セルはあらかじめ１０時間まえに培養液中にイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）を加えて置いたものを使用した。細胞近傍液を流速 1μリットル／分で吸引しながら、細胞を牛血清アルブミンにジニトロフェノールを結合させたもの（ＢＳＡ-ＤＮＰ）を加えると、図１０に示すように還元電流が増加し、僅かな量の細胞試料からのヒスタミンの放出をリアルタイムに近い形で高感度に測定することができた。
【００５０】
（実施例４）
実施例３と同様な方法により、微小流路が加工されたガラス基板と、炭素薄膜電極が形成された基板を作製した。微小流路が加工された基板の流路両端には実施例３と同様に２本の溶融石英キャピラリーを接続した。両基板の見取り図を図１１に示す。図中、作用電極を、銀／塩化銀参照電極、対向電極と共にポテンシオスタットＢＡＳ１００Ｂ（Bioanalytical Systems 社製）に接続し、80000ユニット／リットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、0.05Ｍの塩化カリウム、0.05Ｍのピロールを含む水溶液を入れた容器に浸した。銀／塩化銀電極に対して 1Ｖの電位を 20秒間印加してポリピロール／酵素複合膜で修飾された電極を得た。更にこの電極をアニオン性高分子であるナフィオンを３％含む溶液（アルドリッチ社製）に一瞬浸漬した後乾燥しヒスタミンセンサを作製した。次にヒスタミン酸化酵素 2重量％、牛血清アルブミン 2％、グルタルアルデヒド 0.2％含む水溶液を微小流路が加工された基板の流路幅が太い部分と、電極が形成された基板の、前電解用電極とポリピロール／ＨＲＰ複合膜の間に塗布し、乾燥させた。乾燥後、両基板を位置合わせをした後、紫外線硬化樹脂により張り合わせ、センサを得た。このセンサを実施例３と同様にヒスタミン溶液（濃度 1μＭ）を連続的に吸引注入すると、流速 8μリットル／分では 18.0ｎＡ（±1.7ｎＡ、n = 5）の還元電流が得られ、反応率が約７０％で、くり返し測定におけるばらつきも大きかった。
【００５１】
一方、流速 4μリットル／分で測定を行うと、12.7ｎＡ（±0.5ｎＡ、n = 5）の値が得られ、センサに導入されたヒスタミンが全て反応していることが分かった。また、100％反応時ではくり返し測定によるデータのばらつきが小さいことが分かった。一方、作用電極上がアニオン性高分子であるナフィオン膜により被覆されているため、前電解電極に電位を印加せずとも、Ｌ-アスコルビン酸の影響を抑制することができた。同様の効果は、ヒスタミン酸化酵素と共にＬ-アスコルビン酸酸化酵素を固定化した時や、電極上のポリピロール膜に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素をＨＲＰと共に固定化した時にも観測された。
【００５２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は下記の効果を有する。すなわち、
１．試料より不純物などを分離することなく、直接、ヒスタミンの測定を行うことができる。
【００５３】
２．基質であるヒスタミンを完全に酵素反応させ、それによって生成する過酸化水素を完全に電極反応させることにより、高い測定精度でヒスタミンの測定を行うことができる。
【００５４】
３．細胞から放出されるヒスタミンなどのマイクロリットル以下の微少量試料中のヒスタミンの測定に使用することができる。
【００５５】
４．極めて感度が高く、20ｎＭ（0.01ｍｇ／1000ｇ）以下の検出限界が得られる。
【００５６】
５．微細化が容易なため、応答性が極めて速いセンサが得られ、30秒以下で応答を得ることができる。
【００５７】
本発明に関わるヒスタミンセンサは、上記の優れた特徴を有するので、従来、ヒスタミンセンサの有力な応用分野とされてきた食肉、鮮魚などの食品検査の分野のみならず、上記の優れた特徴を活かして、細胞計測など医学や生理学分野においても応用される可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の構成を説明する図である。
【図２】本発明に関わるヒスタミンセンサのフローセルの構成を説明する断面図である。
【図３】本発明に関わるヒスタミンセンサにおけるヒスタミン酸化酵素の固定化の方法を説明する図である。
【図４】本発明に関わるヒスタミンセンサの構成要素であるヒスタミン酸化酵素固定化ビーズの作製工程を説明する図である。
【図５】実施例１における測定結果を示す図である。
【図６】実施例１における測定結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例２に示したヒスタミンセンサの構造と使用方法とを説明する模式図である。
【図８】実施例３におけるヒスタミンセンサの構造を説明する模式図である。
【図９】実施例３におけるヒスタミンセンサの流路の上からの見取り図である。
【図１０】実施例３における測定結果を示す図である。
【図１１】実施例４におけるヒスタミンセンサの構成を説明する図である。
【符号の説明】
１…シリンジポンプ、２…プランジャポンプ、３…キャリア液、４…インジェクタ、５…前電解用電極、６…反応器、７…フローセル、８…作用電極、９…対向電極、１０参照電極、１１…ポテンシオスタット、１２…レコーダ、１３…廃液、８１…シリンジポンプ、８２…作用電極、８３…銀参照電極、８４…対向電極、８５…前電解用電極、８６…微少量反応器、８７…サンプリング用ガラスキャピラリー、８８…電極が形成された基板、８９…微小流路が形成された基板、９０…微小流路。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a histamine sensor for highly sensitive and continuous quantitative analysis of histamine contained in a sample in food inspection of meat, fresh fish and the like and measurement of a biological sample such as cerebrospinal fluid.
[0002]
[Prior art]
Histamine is a kind of biogenic amine, which is not only related to digestive fluid secretion and allergic reaction, but also serves as a transmitter substance in the brain. Further, since histidine in seafood and meat reacts with microorganisms, a method for quickly measuring the concentration in food is required for food hygiene.
[0003]
As for histamine in food, the North American Food and Drug Administration (FDA) established a method for measuring histamine by the fluorescence method in 1982. In the fluorescence method, a fluorescent substance is synthesized by the reaction of histamine with o-phthalaldehyde, which is a fluorescent reagent often used as a derivatization reagent in chromatography, and the concentration is obtained from the fluorescence intensity. However, the fluorescence method is easily affected by interfering substances, and there are problems such as the need to remove interfering substances in advance and the need for fluorescent reagents, and precise time and temperature control is required during the reaction of the reagents. It is.
[0004]
On the other hand, many methods for quantifying histamine by liquid chromatography have been reported. For example, one of the inventors of the present application detects the histamine and methylhistamine concentrations in biological tissues such as the brain with high sensitivity by high performance liquid chromatography (K. Alam, M. Sasaki, T. Watanabe and K Maeyama, Analytical Biochemistry, 229, 26-34 (1995)). In this method, several types of amines are separated by a column, then histamine is oxidized by an enzyme column in which diamine oxidase is immobilized to generate hydrogen peroxide, and this is mixed with luminol and potassium ferricyanide, which are fluorescent reagents. Chemiluminescence is caused, and quantification is performed from the luminescence intensity.
[0005]
In liquid chromatography, a very low detection limit (that is, high sensitivity) can be obtained, but since the separation process alone takes 10 minutes or more, versatility and rapidity are impaired. Moreover, it is inconvenient when shorter time resolution is required, such as histamine release behavior from cells.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
On the other hand, in recent years, a method for detecting histamine by combining an enzyme reaction with an electrochemical detector or an oxygen sensor has been proposed. A method for quantifying histamine from changes in dissolved oxygen using an oxygen electrode modified with a monoamine oxidase membrane has been proposed (I. Karube et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 2, pp. 117-120 (1980). Year)). In addition, a method for rapidly quantifying histamine by mixing histamine oxidase into the solution to be measured and measuring the oxygen consumption of the solution to be measured has been proposed (Yoto et al., Japanese Patent Laid-Open No. 5-236852, (See Ohashi et al., JP-A-10-174599).
[0007]
However, in the former method, many problems have been pointed out by Ohashi et al. (As described in Ohashi et al., Japanese Patent Laid-Open No. 10-174599). . On the other hand, in the latter, since the total amount of histamine contained in the liquid to be measured is oxidized by an enzymatic reaction, a stoichiometric relationship is established and measurement accuracy is high. However, it is expensive to add an expensive enzyme to the solution to be measured. In recent years, it has been necessary to measure microliter and nanoliter level samples such as histamine to the cellular level, which is required in the measurement of medical physiology. It is difficult to control the oxygen concentration of the measurement system, and when the histamine concentration is low, it is necessary to measure a slight decrease in oxygen, which is lower than the method of measuring enzyme reaction products. There was a problem such as inferiority in quantitativeness.
[0008]
On the other hand, an amperometric sensor using a platinum electrode modified with a diamine oxidase has also been reported as a method for measuring an enzyme reaction product (for example, S. Tombelli et al., Anal. Chim. Acta, 358). Vol. 3, No. 3, pp. 277-284 (1998)). In this method, when the oxygen concentration is sufficiently higher than the substrate concentration, hydrogen peroxide as an enzyme reaction product can be measured with good reproducibility. In particular, when the histamine concentration is low, the oxygen consumption is small, so there is no need to adjust the oxygen concentration in the sample, which is simpler than the method of measuring the amount of oxygen decrease. In addition, the sensor can be easily miniaturized. However, in order to perform measurement by oxidizing hydrogen peroxide, the potential of the platinum electrode must be 500 mV or more (relative to the silver / silver chloride reference electrode), and it coexists in the sample and is oxidized electrochemically. Easy There was a problem that L-ascorbic acid, uric acid, etc. are easily disturbed. Moreover, since diamine oxidase reacts with many diamines, histamine could not be measured with good selectivity. On the other hand, a method for reducing hydrogen peroxide by an electrode reaction through an electron conductive membrane using a peroxidase enzyme has been proposed (for example, M. Vreeke, R. Maidan, A. Heller, Analytical Chemistry). 64, 3084-3090, (1998)). The inventors have reported that histamine can be measured with high sensitivity at a low potential around 0 V by using an electrode in which horseradish peroxidase is combined with an osmium complex of polyvinylpyridine and a histamine oxidase membrane modified in two layers. (See Niwa, Kurita, Horiuchi, Tomitsu, Maeyama, Tanizawa, 47th Annual Meeting of the Analytical Society of Japan, page 51). Although this method can provide a low detection limit, there is a problem that the absolute value of the signal varies depending on the amount and thickness of the enzyme immobilized on the membrane.
[0009]
The object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in an electrochemical sensor for measuring the histamine concentration in a sample, and to measure the histamine concentration with high sensitivity, selectivity and reproducibility to a low concentration by a simple method. It is to provide a sensor.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
  In order to achieve the above object, the present invention providesAs claimed in claim 1,
  A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a membrane having a reducing property, wherein the immobilized histamine oxidase is a histamine oxidase immobilized on a bead, and is passed through the electrode reaction. An electrode modified with a film having the property of reducing hydrogen oxide is further an anionic polymer film, or L - It is modified with a membrane containing ascorbate oxidaseConstructs a histamine sensor.
  Further, the present invention provides the following, as described in claim 2.
  A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a membrane having a reducing property, wherein the immobilized histamine oxidase is a histamine oxidase immobilized on beads, and the immobilization of the flow path L upstream of the position of the histamine oxidase - A histamine sensor having a film containing ascorbate oxidase is configured.
  Further, the present invention provides a method as claimed in claim 3.
  A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a membrane having a reducing property, wherein the immobilized histamine oxidase is immobilized on the inner wall of the flow path by a covalent bond or a polymer membrane An electrode that is a histamine oxidase immobilized in a form incorporated therein and is modified with a film having the property of reducing hydrogen peroxide through the electrode reaction, an anionic polymer film, or L - A histamine sensor is characterized by being modified with a film containing ascorbate oxidase.
  Further, the present invention provides the following, as described in claim 4.
  A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a membrane having a reducing property, wherein the immobilized histamine oxidase is immobilized on the inner wall of the flow path by a covalent bond or a polymer membrane Is a histamine oxidase immobilized in a form incorporated therein, and L is located upstream of the position of the immobilized histamine oxidase in the channel. - A histamine sensor having a film containing ascorbate oxidase is configured.
  Further, the present invention provides the following, as described in claim 5.
  5. The histamine sensor according to claim 1, wherein the electrode is a thin film electrode formed on an insulating substrate.
  Further, the present invention provides the following, as described in claim 6.
  5. The histamine sensor according to claim 1, wherein the film having the property of reducing hydrogen peroxide through the electrode reaction is a film containing a peroxidase-based enzyme. Constitute.
  Further, the present invention provides the following, as described in claim 7.
  The histamine sensor according to any one of claims 1 to 6, wherein an electrode for oxidizing an electrochemically oxidizable substance is provided upstream of the position of the immobilized histamine oxidase in the flow path. A histamine sensor is provided.
[0011]
In this configuration, since a sufficient amount of histamine oxidase can be used to oxidize histamine almost completely, two membranes obtained by binding horseradish peroxidase to the above-mentioned osmium complex of polyvinylpyridine and two histamine oxidase membranes are used. The problem in the case of using a modified electrode for the layer, that is, the problem that the absolute value of the signal changes depending on the amount and film thickness of the immobilized enzyme can be solved.
[0012]
Using this configuration of the histamine sensor, histamine introduced into the sensor is almost completely oxidized by an enzyme reaction, and hydrogen peroxide generated in the enzyme reaction is reduced at a low potential via an electrode reaction. By measuring the flowing current, the histamine concentration can be measured with high accuracy, high sensitivity and good selectivity.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
FIG. 1 is a basic structural diagram of a histamine sensor according to the present invention. The sensor feeds the carrier liquid 3 to the histamine sensor by the syringe pump 1 or the plunger pump 2 used for high performance liquid chromatography, and introduces only a certain amount of the sample by the injector 4 in the middle. The sample contacts the pre-electrolysis electrode 5 and then enters the reactor 6 in which histamine oxidase is immobilized. The role of the pre-electrolysis electrode 5 is to prevent the histamine determination from being affected by electrode oxidation when a large amount of L-ascorbic acid is contained in the sample. The histamine contained in the solution introduced into the reactor 6 is almost completely oxidized by the histamine oxidase immobilized in the reactor 6, and the hydrogen peroxide generated by this oxidation reaction enters the flow cell 7 to act. It is detected by an electrode reaction on the electrode 8. In the flow cell 7, a counter electrode 9 and a reference electrode 10 with respect to the working electrode 8 are arranged. Application of voltage to each electrode and measurement of the electrode current are performed by a potentiostat 11, and the measurement result is recorded by a recorder 12. The liquid after the electrode reaction is discharged out of the flow cell 7 as waste liquid 13.
[0014]
FIG. 2 shows an enlarged cross-sectional view of the flow cell 7 in FIG. As shown in FIG. 2, a modified film of an osmium polyvinylpyridine derivative containing horseradish peroxidase (HRP) (shown as an Os-gel-HRP film in the figure) is formed on a glassy carbon electrode. The distance between the working electrode and the counter electrode is kept constant by the gasket, and the gap between the electrodes becomes a part of the flow path, and the hydrogen peroxide in the liquid is reduced here by the electrode reaction.
[0015]
The reaction formula for measuring histamine using the histamine sensor according to the present invention is shown below.
[0016]
[Chemical 1]

[0017]
Histamine is oxidized as shown in Formula 1 by histamine oxidase immobilized in the enzyme reactor, and one molecule of histamine is converted to one molecule of hydrogen peroxide (H₂O₂) Is generated. The generated hydrogen peroxide is reduced by peroxidase (HRP) on the electrode. At that time, the peroxidase itself becomes an oxidant, and oxidizes the membrane that mediates the electron transfer between the electrode and the peroxidase (Formula 2). Thereafter, as shown in Equation 3, the membrane is reduced by the electrode, whereby a current (reduction current) flows through the electrode, which is measured by a potentiostat. As is clear from these reaction equations, since the amount of oxidized histamine is proportional to the amount of electrons supplied from the electrode, the amount of electrons is obtained by integrating the reduction current value flowing through the electrode with respect to time. Thus, histamine can be quantified.
[0018]
The reduction reaction through the peroxidase membrane can be performed at a low potential of 0 mV or less with respect to the silver / silver chloride reference electrode. Thus, by using a reduction reaction for the electrode reaction, measurement at a low potential with little influence of interfering substances becomes possible. On the other hand, when continuously measuring a sample released from cultured cells, the sample can be introduced by sucking the waste liquid side of the sensor with a syringe pump or the like. Further, in order to reduce the amount of sample, a miniaturized sensor in which a reactor and a detector are integrated can be produced on a glass or silicon substrate using micromachine technology.
[0019]
In the manufacturing process of the sensor according to the present invention, first, histamine oxidase is immobilized on the flow path.
[0020]
FIG. 3 is a diagram illustrating a method for immobilizing histamine oxidase. That is, as a method for immobilizing histamine oxidase, an enzyme is immobilized on beads and directly or directly as shown in FIG. 3 (a), the column is packed in a reactor, As shown in FIG. 3 (b), a method of preparing a hollow reactor by immobilizing an enzyme on the inner wall of the channel can be exemplified. As the method for immobilizing the enzyme, a covalent immobilization method as in Example 1 described later, or a method of immobilizing in the form of incorporation into a polymer membrane as in Example 4 described later. and so on.
[0021]
On the other hand, the detection flow cell uses a method using a commercially available electrochemical flow cell used for high-performance liquid chromatography or flow injection analysis, or a thin film forming technique such as photolithography and sputtering, vapor deposition, or CVD (chemical vapor deposition). It is obtained by combining the produced electrode and the flow path. A film having the property of reducing hydrogen peroxide and receiving electrons from the electrode is formed on the electrode. Specifically, for example, a film in which a conductive polymer is combined with a peroxidase that reduces hydrogen peroxide can be used.
[0022]
Further, when the sample solution contains a substance that interferes with electrochemical measurement, such as L-ascorbic acid, L-ascorbic acid oxidase is further combined in the membrane, or an anionic polymer membrane is used as the uppermost layer. And the influence of interfering substances such as L-ascorbic acid can be eliminated by electrostatic repulsion of the membrane.
[0023]
Examples of the conductive polymer film include polypyrrole and derivatives thereof, and polyaniline and derivatives thereof. These membranes are composed of peroxidase or a solution of peroxidase and each polymer monomer together with an electrolyte such as potassium chloride. After immersing the sensor electrode with the reference and counter electrodes, each electrode is a potentiostat. The membrane incorporating the enzyme can be formed by applying a potential to the sensor electrode and applying a potential to the sensor electrode. Alternatively, a redox polymer such as a polyvinyl ferrocene membrane or an osmium-polyvinylpyridine membrane containing peroxidase can also be used. Nafion etc. can be mention | raise | lifted as an anionic film | membrane modified to the uppermost layer.
[0024]
As described above, in the histamine sensor according to the present invention, the electrode reduction reaction is performed at a low potential of 0 mV or less with respect to the silver / silver chloride reference electrode. Therefore, it is possible to perform measurement at a potential at which electrochemically active L-ascorbic acid coexisting when measuring histamine in mast cells and brain neurons is not directly oxidized by the electrode, and to realize high selectivity. it can. On the other hand, when peroxidase reduces hydrogen peroxide, if a large amount of L-ascorbic acid is present, the oxidized peroxidase or conductive polymer is reduced by L-ascorbic acid (R. Maidan and A. Heller Amalytical Chemistry, 64, 2889-2896, (1992)). For this reason, even when the amount of hydrogen peroxide produced by oxidation of histamine is constant, the reduction current observed on the electrode decreases as the concentration of L-ascorbic acid in the film increases. In this reaction, an anionic membrane such as Nafion is coated on the top of the modified electrode, or an electrode (pre-electrolysis electrode 5 in FIG. 1) is incorporated upstream of the enzyme reactor, and L contained in the sample by pre-electrolysis. -It can be prevented by almost oxidizing ascorbic acid.
[0025]
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0026]
(Example 1)
The following experiment was conducted using the electrochemical detector of the present invention described above.
[0027]
FIG. 4 shows a process of immobilizing histamine oxidase on glass beads.
[0028]
(A)
About 1 g of glass beads (diameter 20 μm) was suspended in acetone in which 1% of 3-aminopropyltriethoxysilane was dissolved and reacted at 70 ° C. for 3 hours. By this reaction (reaction between silane and the bead surface), the bead surface is terminated with an amino group (—NH₂).
[0029]
(B)
After the reaction, the glass beads were allowed to settle, the supernatant was discarded, and acetone was added again, and the operation was repeated 3 times. After evaporating acetone, the beads were suspended in a 2% glutaraldehyde aqueous solution and reacted for 1 hour. By this reaction, the surface of the bead is modified with a molecule having an aldehyde group (—CHO) at the end.
[0030]
(C)
After the reaction, the beads were collected by filtration through a filter and washed with water to completely remove unreacted glutaraldehyde. Next, the beads are dissolved in a 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0, enzyme concentration: 10 units / ml) in which histamine oxidase is dissolved. The beads are allowed to stand for 3 hours or more to react with the glutaraldehyde on the beads. The enzyme was immobilized on the beads. In the figure, the enzyme is indicated by a square labeled E.
[0031]
(D)
After enzyme immobilization, wash with 1% glycine aqueous solution to react unreacted aldehyde residues with glycine to make the end of the molecule a chemically relatively stable carboxyl group (-COOH) and immobilize histamine oxidase The chemical conversion process was completed.
[0032]
Next, a cylindrical felt (outer diameter: 0.5 mm, length: 3 mm) was inserted into one outlet of a peak tube (inner diameter: 0.5 mm, length: 4 cm) used for high-performance liquid chromatographic piping to obtain a filter. . Next, the enzyme-immobilized beads suspended in the buffer solution were filled from the other outlet using a syringe. After filling, the other outlet was closed with a cylindrical felt to obtain an enzyme reactor.
[0033]
Next, 2 μL of an osmium polyvinylpyridine derivative solution (manufactured by Bioanalytical Systems) containing horseradish peroxidase (HRP) was applied onto a glassy carbon electrode (diameter 6 mm: manufactured by BIS Co.) and dried to form a polymer film. . This electrode was set in a flow cell, a column filled with beads immobilized with histamine oxidase was inserted upstream, and a pump and a pre-electrolysis electrode were set to constitute the sensor shown in FIG.
[0034]
Working electrode of sensor (8 in FIG. 1), platinum tube electrode for pre-electrolysis (5 in FIG. 1), silver / silver chloride reference electrode (10 in FIG. 1) and counter electrode (made of stainless steel block, 9 in FIG. 1) ) Were connected to terminals corresponding to each of the potentiostat LC4C (manufactured by Bioanalytical Systems, potentiostat 11 in FIG. 1). The sensor was fed using a high performance liquid chromatography pump, and a sample injector (4 in FIG. 1) was incorporated between the histamine oxidase immobilized column (reactor 6 in FIG. 1) and the pump.
[0035]
The potential of the working electrode of the sensor was kept at 0 V with respect to the silver / silver chloride reference electrode, and a constant amount of sample was injected from the sample injector while feeding the liquid at a flow rate of 10 μl / min. The result is shown in FIG.
[0036]
When 10 μl of a 1 μM histamine solution was injected, a peak of 25 nA was obtained. On the other hand, when methylhistamine was injected at a concentration of 1 μM, the current value was about 3.5 nA. On the other hand, when putrescine and cadaverine, which are diamines, were added, the response became one hundredth, indicating that high selectivity was obtained.
[0037]
FIG. 6 shows the relationship between histamine concentration and current. As can be seen from the figure, a linear relationship between concentration and current value is obtained in a very wide histamine concentration range. The reason that such a practically preferable linear relationship is obtained is that, in the histamine sensor according to the present invention, histamine in the sample is almost completely oxidized by histamine oxidase. If this oxidation is incomplete, the current value becomes smaller than the value obtained by proportional calculation, particularly in the range where the histamine concentration is high, resulting in a measurement error. Moreover, even if the concentration of histamine was reduced to 10 nM, the measurement could be performed and a low detection limit could be achieved. On the other hand, when the peak in FIG. 4 is integrated with respect to time, when 10 μl of the highest concentration of 100 μM histamine is injected, 1.9 × 10^-FourThe charge of C was observed, and it was found by stoichiometric numerical calculation that the injected histamine was almost 100% reacted. Next, when L-ascorbic acid (10 μM, 10 μl) was injected at an electrode potential of −50 mV (relative to the silver / silver chloride reference electrode), only an oxidation current of 0.4 nA was observed. It was found that almost no current flows with ascorbic acid alone. However, when 10 μl of a solution containing both 1 μM histamine and L-ascorbic acid was injected, the reduction current decreased to 4.7 nA. This is because when hydrogen peroxide generated by the reaction of histamine oxidase is reduced by HRP and electrons are supplied to the HRP from the electrode through the osmium-polyvinylpyridine film, HRP and the polymer are reduced by L-ascorbic acid, This is because electrons supplied from the electrodes are reduced. Therefore, when a potential of 700 mV is applied to the pre-electrolysis electrode 5 shown in FIG. 1 and L-ascorbic acid is oxidized before entering the reactor 6, the same sample is injected. The current value recovered to 24.3 nA, and it was found that the influence of L-ascorbic acid can be almost completely eliminated.
[0038]
As a sample, a slice of hamachi left for 5 days at room temperature and a slice of hamaki just after thawing were crushed with a homogenizer, and 10 μl each of the filtered solution was injected into the sensor. As a result, a peak of 21 (± 0.5, n = 5) nA was obtained in the former, and 0.02 nA in the latter, and it was found that this was sufficiently useful for measuring freshness. Here, n = 5 indicates that the number of data is 5.
[0039]
(Example 2)
FIG. 7 shows a measurement system using a flow cell in which an electrode prepared by the same method as in Example 1 is set and a column packed with beads in which histamine is immobilized. In FIG. 7, the waste liquid side of the flow cell was connected to a syringe pump, and the column was connected via a Teflon capillary to a capillary whose tip was extended with heat. The sensor action, reference and counter electrode were connected to the same potentiostat as in Example 1, and a potential of -50 mV was applied to the working electrode with respect to the silver / silver chloride counter electrode. The glass tube was attached to a micropositioner for a microscope. A petri dish containing rat RBL-2H3 cultured cells was placed under the microscope, and the tip of the glass tube was brought close to the cell colony to a distance of 1 μm under the microscope. The RBL-2H3 cell was prepared by adding immunoglobulin E (IgE) to the culture medium 10 hours ago in advance. An increase in reduction current was observed when a buffer solution containing bovine serum albumin bound to dinitrophenol (BSA-DNP) was added while aspirating near-cell fluid at a flow rate of 4 μl / min. On the other hand, no increase in the current value was observed in the solution containing no BSA-DNP, and histamine release accompanying the antigen-antibody reaction could be detected in real time by the sensor.
[0040]
(Example 3)
FIG. 8 shows a sensor structure in one embodiment of the histamine sensor according to the present invention. In FIG. 8, 81 is a syringe pump, 82 is a working electrode obtained by modifying an HRP-containing osmium-polyvinylpyridine film, 83 is a silver reference electrode, 84 is a counter electrode, 85 is a pre-electrolysis electrode, and 86 is filled with histamine oxidase. , 87 is a sampling glass capillary, 88 is a substrate on which electrodes are formed, 89 is a substrate on which microchannels are formed, and 90 is a microchannel. Here, the substrate 88 on which the electrodes are formed is an insulating substrate, and each electrode is formed in the form of a thin film electrode.
[0041]
In FIG. 8, the histamine continuously collected from the sampling glass capillary 87 undergoes an enzyme reaction in the microreactor 86, and the produced hydrogen peroxide passes through the osmium-polyvinylpyridine membrane containing HRP on the working electrode 82. Electrode reduction.
[0042]
The sensor is manufactured by bonding a substrate 89 on which a minute flow path is formed and a substrate 88 on which an electrode is formed. The manufacturing process of this sensor is shown below.
[0043]
First, a substrate having a flow path with a small rectangular cross section was produced as follows. That is, a polyimide (manufactured by Toray Industries, Inc.) was spin-coated (rotated) on a Pyrex glass wafer (3 inches) to a thickness of 20 μm. Next, a photoresist for silicon-based reactive ion etching (RIE) (manufactured by NTT-AT) was spin-coated at 2000 rpm with a spinner (rotary coating machine, manufactured by Mikasa). Thereafter, a photomask on which a flow path pattern was drawn was superimposed on the wafer, and the flow path pattern was exposed using a mask aligner PLA-501 (manufactured by Canon Inc.). After the exposure, development was performed in an alkali developer, washed with water, and dried to form a resist pattern. Since the developed wafer is covered with a silicon-based resist pattern except for the flow path, this resist-coated substrate is placed in a reactive ion etching apparatus (DEM-451, manufactured by Anelva) and the silicon-based resist pattern is used as a mask. The portion of the polyimide film not covered with the resist was removed by oxygen plasma. Etching conditions were a pressure of 5 Pa, a power of 100 W, an oxygen flow rate of 100 SCCM, and a time of 110 minutes. After forming the polyimide pattern, the substrate is put into another reactive ion etching apparatus (DEM-451, manufactured by Anelva), and polyimide is used as a mask.₂F₆The glass was etched with a gas plasma. The conditions were a pressure of 2 Pa, a power of 500 W, a flow rate of 100 SCCM, a time of 120 minutes, and a depth of 22 μm. After the glass channel was formed, the remaining polyimide film was removed by an oxygen reactive ion etching apparatus to obtain a glass channel. Thereafter, a dicing saw (manufactured by Disco Corporation) about 7 mm from both ends of the flow path was cut into a width of 400 μm so that 1 mm from the end had a depth of 400 μm to form a capillary connection groove.
[0044]
On the other hand, a substrate having a thin film electrode was produced as follows. That is, first, a carbon thin film (film thickness: 100 nm) was formed by a thermal CVD method using a 3-inch Pyrex glass wafer. In the CVD method, a quartz substrate was heated to 1000 ° C. in a glass tube, phthalocyanine was used as a starting material, sublimated at 400 ° C., and thermally decomposed on a wafer. Photoresist for silicon-based reactive ion etching (RIE) (manufactured by NTT-AT) was spin-coated at 4000 rpm with a spinner (manufactured by Mikasa) on the wafer on which the carbon film was formed. Thereafter, a photomask on which electrode patterns were drawn was superimposed on the wafer, and a 4-electrode pattern was exposed using a mask aligner PLA-501 (manufactured by Canon Inc.). After the exposure, development was performed in an alkali developer, washed with water, and dried to form a resist pattern. Since only the electrode pattern portion is covered with the resist pattern in the developed wafer, this resist-coated substrate is put into a reactive ion etching apparatus (DEM-451, manufactured by Anelva), and oxygen plasma is used with the resist pattern as a mask. The portion of the carbon film not covered with the resist was removed. Etching conditions were a power of 70 W, a pressure of 2 Pa, and an oxygen flow rate of 100 SCCM. Thereafter, the resist was peeled off in acetone to obtain an electrode pattern. The electrodes were used as a pre-electrolysis electrode, working electrode, reference electrode, and counter electrode from the side where the sampling capillary was connected. An osmium polyvinylpyridine derivative solution (manufactured by Bioanalytical Systems) containing HRP was applied on the working electrode to form a film. Also, a thin silver paste was applied as a reference material on the reference electrode substrate.
[0045]
Then, after aligning the substrate on which the rectangular cross-section flow channel connected with the capillary and the substrate on which the enzyme / polymer-modified thin film electrode is formed so that both flow channels face each other, a photo-curing adhesive Soaked in from around. After the adhesive soaked in, light was irradiated using a high-pressure mercury lamp, the substrates were bonded, and the sensor chip was completed.
[0046]
FIG. 9 is a sketch from above of the flow path of the histamine sensor produced as described above. The flow path has a structure in which a wide portion for filling the enzyme and a grating-like filter for holding the enzyme downstream are formed. A fused silica capillary (size, outer diameter: 375 μm, inner diameter: 150 μm, manufactured by GL Sciences Inc.) is fixed with an adhesive by embedding it in the outlet on the opposite side (the right hatched portion in FIG. 9) with a wide flow path across the filter, The end was connected to a syringe pump. The side where the capillaries of the sensor chip are not connected (the shaded area on the left in FIG. 9) is immersed in the suspension of the beads immobilized with histamine oxidase used in Example 1, and the liquid is stirred with a magnetic stirrer. However, when sucked with a syringe, the beads were introduced into the flow path and filled in the reactor portion. After that, a capillary (87 in FIG. 8) whose tip was elongated by heat was inserted into the sensor flow path (the hatched portion on the left side in FIG. 9) and adhered with a photocurable resin.
[0047]
A pre-electrolysis electrode of the sensor, a working electrode for measuring histamine, a reference electrode and a counter electrode (85, 82, 83 and 84 in FIG. 8, respectively) were connected to terminals corresponding to the potentiostat LC4C. The measurement was performed by applying a potential of -50 mV to the working electrode while sucking the solution from the sampling capillary using a syringe pump. When the solution was aspirated at a flow rate of 1 μl / min and 1 μM histamine was aspirated as a sample, a reduction current of 5.2 nA was observed, and it was found that the aspirated histamine reacted almost 100%.
[0048]
On the other hand, when the same concentration of methylhistamine was measured, a reduction current of 0.8 nA was observed. Moreover, when the putrescine and cadaverine which are diamines were added, the response was 1/100, and the high selectivity was confirmed. As the histamine concentration was lowered, an increase in current value could be observed with an S / N ratio of 2 or more even when a 20 nM sample was injected. In addition, when the measurement is performed at a flow rate of 8 μl / min, a steady state is reached within about 20 seconds after the start of sample introduction. Compared with the method of measuring oxygen consumption associated with the enzymatic reaction of histamine proposed so far. Excellent responsiveness was confirmed. The responsiveness could be further improved by increasing the flow rate.
[0049]
The sensor was connected to a manipulator, and the tip of the sampling capillary of the sensor was brought close to 1 μm to the cultured rat RBL-2H3 cell colony (diameter of 100 μm or less) under a microscope. The RBL-2H3 cell used was prepared by adding immunoglobulin E (IgE) to the culture medium 10 hours ago in advance. When the cells were aspirated at a flow rate of 1 μl / min and the cells were added with bovine serum albumin combined with dinitrophenol (BSA-DNP), the reduction current increased as shown in FIG. The release of histamine from a quantity of cell samples could be measured with high sensitivity in near real time.
[0050]
(Example 4)
By the same method as in Example 3, a glass substrate on which a microchannel was processed and a substrate on which a carbon thin film electrode was formed were produced. In the same manner as in Example 3, two fused silica capillaries were connected to both ends of the substrate on which the microchannel was processed. A sketch of both substrates is shown in FIG. In the figure, the working electrode was connected to a potentiostat BAS100B (manufactured by Bioanalytical Systems) together with a silver / silver chloride reference electrode and a counter electrode, and 80000 units / liter of horseradish peroxidase (HRP), 0.05 M potassium chloride, 0.05 It was immersed in a container containing an aqueous solution containing M pyrrole. An electrode modified with a polypyrrole / enzyme composite film was obtained by applying a potential of 1 V to the silver / silver chloride electrode for 20 seconds. Furthermore, this electrode was dipped for a moment in a solution containing 3% of Nafion, an anionic polymer (manufactured by Aldrich), and then dried to produce a histamine sensor. Next, for the pre-electrolysis of the substrate where the microchannels were processed with an aqueous solution containing 2% by weight of histamine oxidase, 2% bovine serum albumin, and 0.2% glutaraldehyde, and the substrate on which the electrodes were formed It was applied between the electrode and the polypyrrole / HRP composite film and dried. After drying, the two substrates were aligned and then bonded with an ultraviolet curable resin to obtain a sensor. When this sensor was continuously sucked and injected with a histamine solution (concentration 1 μM) as in Example 3, a reduction current of 18.0 nA (± 1.7 nA, n = 5) was obtained at a flow rate of 8 μl / min, and the reaction rate was It was about 70%, and the variation in repeated measurement was also large.
[0051]
On the other hand, when the measurement was performed at a flow rate of 4 μl / min, a value of 12.7 nA (± 0.5 nA, n = 5) was obtained, and it was found that all histamine introduced into the sensor had reacted. In addition, it was found that the variation in data due to repeated measurement was small at the time of 100% reaction. On the other hand, since the working electrode was covered with a Nafion membrane, which is an anionic polymer, the influence of L-ascorbic acid could be suppressed without applying a potential to the pre-electrolysis electrode. Similar effects were observed when L-ascorbate oxidase was immobilized together with histamine oxidase, or when L-ascorbate oxidase was immobilized together with HRP on the polypyrrole film on the electrode.
[0052]
【The invention's effect】
As described above, the present invention has the following effects. That is,
1. Histamine can be measured directly without separating impurities from the sample.
[0053]
2. It is possible to measure histamine with high measurement accuracy by completely reacting histamine as a substrate with an enzyme and completely reacting hydrogen peroxide produced thereby.
[0054]
3. It can be used to measure histamine in microliter samples of microliter or less such as histamine released from cells.
[0055]
4). The sensitivity is extremely high, and a detection limit of 20 nM (0.01 mg / 1000 g) or less is obtained.
[0056]
5). Since miniaturization is easy, a sensor with extremely fast response can be obtained, and a response can be obtained in 30 seconds or less.
[0057]
Since the histamine sensor according to the present invention has the above-mentioned excellent characteristics, it has been utilized not only in the field of food inspection such as meat and fresh fish, which has been regarded as a major application field of histamine sensors, but also by utilizing the above-mentioned excellent characteristics. Therefore, it is highly likely to be applied in the medical and physiological fields such as cell measurement.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating a configuration of the present invention.
FIG. 2 is a cross-sectional view illustrating the configuration of a flow cell of a histamine sensor according to the present invention.
FIG. 3 is a diagram for explaining a method of immobilizing histamine oxidase in the histamine sensor according to the present invention.
FIG. 4 is a diagram for explaining a process for producing histamine oxidase-immobilized beads that are constituent elements of a histamine sensor according to the present invention.
5 is a diagram showing measurement results in Example 1. FIG.
6 is a diagram showing measurement results in Example 1. FIG.
FIG. 7 is a schematic diagram illustrating the structure and usage of the histamine sensor shown in Example 2 of the present invention.
8 is a schematic diagram illustrating the structure of a histamine sensor in Example 3. FIG.
FIG. 9 is a plan view from above of the flow path of the histamine sensor in the third embodiment.
10 is a diagram showing measurement results in Example 3. FIG.
11 is a diagram illustrating a configuration of a histamine sensor in Example 4. FIG.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Syringe pump, 2 ... Plunger pump, 3 ... Carrier liquid, 4 ... Injector, 5 ... Pre-electrolysis electrode, 6 ... Reactor, 7 ... Flow cell, 8 ... Working electrode, 9 ... Counter electrode, 10 reference electrode, 11 DESCRIPTION OF SYMBOLS ... Potentiostat, 12 ... Recorder, 13 ... Waste liquid, 81 ... Syringe pump, 82 ... Working electrode, 83 ... Silver reference electrode, 84 ... Counter electrode, 85 ... Pre-electrolysis electrode, 86 ... Micro-reactor, 87 ... Sampling glass capillary, 88... Substrate on which electrodes are formed, 89... Substrate on which microchannels are formed, 90.

Claims

A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a film having a reducing property ,
The immobilized histamine oxidase is a histamine oxidase immobilized on beads,
The electrode modified with the film having the property of reducing hydrogen peroxide through the electrode reaction is further modified with an anionic polymer film or a film containing L - ascorbate oxidase. A characteristic histamine sensor.

A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a film having a reducing property,
The immobilized histamine oxidase is a histamine oxidase immobilized on beads,
A histamine sensor comprising a membrane containing L - ascorbate oxidase at a portion upstream of the position of the immobilized histamine oxidase in the flow path .

A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a film having a reducing property,
The immobilized histamine oxidase is immobilized on the inner wall of the flow channel by covalent bonding or in a form incorporated into a polymer membrane,
The electrode modified with the film having the property of reducing hydrogen peroxide through the electrode reaction is further modified with an anionic polymer film or a film containing L - ascorbate oxidase. A characteristic histamine sensor.

A portion of the channel through which the sample solution flows has immobilized histamine oxidase, and hydrogen peroxide is added to the downstream portion of the channel from the position of the immobilized histamine oxidase via an electrode reaction. A histamine sensor having an electrode modified with a film having a reducing property,
The immobilized histamine oxidase is immobilized on the inner wall of the flow channel by covalent bonding or in a form incorporated into a polymer membrane,
A histamine sensor comprising a membrane containing L - ascorbate oxidase at a portion upstream of the position of the immobilized histamine oxidase in the flow path .

The histamine sensor according to any one of claims 1 to 4, wherein the electrode is a thin film electrode formed on an insulating substrate .

5. The histamine sensor according to claim 1, wherein the film having a property of reducing hydrogen peroxide through the electrode reaction is a film containing a peroxidase enzyme .

The histamine sensor according to any one of claims 1 to 6 , wherein an electrode for oxidizing an electrochemically oxidizable substance is provided upstream of the position of the immobilized histamine oxidase in the flow path. histamine sensor characterized in that it comprises.