JP3750339B2

JP3750339B2 - Method for producing slateol

Info

Publication number: JP3750339B2
Application number: JP07179598A
Authority: JP
Inventors: 磨理原; 智子川口; 誠上田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2018-03-20
Also published as: JPH11266887A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の菌体及び／または該菌体処理物によるエリスリトールからスレイトールの製造に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
スレイトール（Threitol）は医薬あるいは農薬の中間原料として有用な物質であると近年注目されている。
このスレイトールの化学的製造方法として、Ｄ−キシロース（D-Xylose）を原料とて化学的にＤ−スレイトールを製造する方法（J.Organic.Chem. 54(1989)22,5257-5264）、エリスリトールから化学的な異性化によりＤＬ−スレイトールを製造する方法（Carbohydrate.Res.,44(1975)106 ）等が知られているが、収率が低いこと、プロセスが煩雑であること等からいずれも工業的な製造には適した方法ではない。
【０００３】
生物化学的にスレイトールをつくる方法は、Acetobacter suboxydansのエリスリトールの酸化物においてＬ−スレイトールが検出された例（C.L. HU, E,A,McCOMB , and V.V. RENDIG ARCHIVES of BIOCHEM.&BIOPHYSIC. 110 p350-353, 1965 ）が報告されてはいるが、エリスリトールからＬ−スレイトールの工業的な製造方法は全く知られていない。さらにエリスリトールからＤ−スレイトールの微生物的変換は全く報告例がない。
従って、本発明の目的はスレイトールを安価な原料から効率的に工業生産できる方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、スレイトールの工業的製造法を提供するべく鋭意検討した結果、エリスリトールからスレイトールを生成しうる微生物を見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明はエリスリトールからスレイトールに変換する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、エリスリトールに作用させることを特徴とするスレイトールの製造方法に存する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、エリスリトールを変換しスレイトールを生産する能力を持つ微生物であれば、いずれの微生物も使用し得るが、好ましい微生物としては、アルカリゲネス（Alcaligenes ）属、アシネトバクター（Acinetobacter ）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、バクテリジウム（Bacteridium ）属、ボルデテラ（Bordrtella）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属, クレブシエラ（Klebsiella）属、コマモナス（Comamonas ）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium ）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エッシェリティア（Escherichia ）属、エルウィニア（Erwinia ）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、グルコノバクター（Gluconobacter ）属、ハフニア（Hafnia）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、ミクロコッカス（Micrococcus ）属、モラクセラ（Moraxella ）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ラネラ（Rhanella）属、キサントモナス（Xanthomonas ）属、、シュードモナス（Pseudomonas ）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、ロドトルラ（Rhodotorula ）属、ファエノココマイセス（Phaeococcomyces ）属、キャンディダ（Candida ）属、トリグノプシス（Trignopsis）属及びハンセニアスポラ（Hanseniaspora ）属から選ばれる属に属する微生物が挙げられる。
【０００６】
本発明において使用するアルカリゲネス（Alcaligenes ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばAlcaligenes faecalis castellani, Alcaligenes denitrificans sub. denitrificans, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes xylosoxidans ssp. xylosoxidans等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてAlcaligenes faecalis castellani IAM1015, Alcaligenes denitrificans sub. denitrificans IAM12370, Alcaligenes paradoxus Biotype I DSM66, Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162, Alcaligenes xylosoxidans ssp. xylosoxidans IAM12600, Alcaligenes xylosoxidans ssp. xylosoxidans IAM12685 等が挙げられる。
【０００７】
本発明において使用するアシネトバクター（Acinetobacter ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばAcinetobacter calcoaceticus ,Acinetobacter lwoffii等が挙げられる。さらに具体的な菌株としては Acinetobacter calcoaceticus IFO12552, Acinetobacter calcoaceticus ATCC19606, Acinetobacter lwoffii ATCC17910等が挙げられる。
【０００８】
本発明において使用するアルスロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばArthrobacter paraffineus, Arthrobacter crystallopoietes, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter ramousus Arthrobacter citreus, Arthrobacter atrocyaneus, Arthrobacter hystidinolovorans, Arthrobacter sulfureus 等が挙げられる。さらに具体的な菌株としては Arthrobacter paraffineus ATCC15590, Arthrobacter crystallopoietes JCM2522, Arthrobacter oxydans JCM2521, Arthrobacter ramousus JCM1334, Arthrobacter citreus JCM1331, Arthrobacter atrocyaneus JCM1329,Arthrobacter hystidinolovorans JCM2520, Arthrobacter sulfureus JCM1338等が挙げられる。
【０００９】
本発明において使用するアグロバクテリウム（Agrobacterium ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばAgrobacterium radiobacter, Agrobacterium aureum, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium viscosum等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてはAgrobacterium radiobacter NRRL B-11291, Agrobacterium radiobacter IAM12048, Agrobacterium tumefaciens IAM13129, Agrobacterium tumefaciens MAFF03-01224, Agrobacterium tumefaciens MAFF03-01001, Agrobacterium viscosum IFO13652, Agrobacterium aureum IFO13647, Agrobacterium rhizogenes MAFF07-20001, Agrobacterium rhizogenes MAFF03-01724等が挙げられる。
【００１０】
本発明において使用するオーレオバクテリウム（Aureobacterium）属に属する微生物の好ましい種としては、例えば Aureobacterium saperdae, Aureobacterium testaceum等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてAureobacterium saperdae JCM 1352, Aureobacterium testaceum JCM1353等が挙げられる。
本発明において使用するバチルス（Bacillus）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばBacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sphaerium 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてはBacillus licheniformis IFO12200, Bacillus megaterium IFO12108, Bacillus megaterium ATCC13639, Bacillus sphaerium ATCC7055 等が挙げられる。
【００１１】
本発明において使用するバクテリジウム（Bacteridium ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばBacteridium sp等が挙げられる。さらに具体的な代表株としては Bacteridium sp.R340 FERM P-2718等が挙げられる。
本発明において使用するボルデテラ（Bordrtella）属に属する微生物は、例えば Bordrtella bronchiseptica等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてBordrtella bronchiseptica ATCC4617等が挙げられる。
【００１２】
本発明において使用するブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばBrevibacterium ammoniagenes,Brevibacterium butanicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium iodinum 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてはBrevibacterium ammoniagenes JCM1305, Brevibacterium ammoniagenes JCM1306,Brevibacterium butanicum ATCC21196, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium iodinum IFO3558等が挙げられる。
【００１３】
本発明において使用するコマモナス（Comamonas ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばComamonas acidovorans, Comamonas terrigena等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてはComamonas acidovorans NCIMB9289, Comamonas terrigena IFO13299 等が挙げられる。
本発明において使用するコリネバクテリウム（Corynebacterium ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばCorynebacterium glutamicum, Corynebacterium flaccumfaciens, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium hydrocarboclastum 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてCorynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium flaccumfaciens ATCC12813, Corynebacterium flavescens JCM1317, Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC15960 等が挙げられる。
【００１４】
本発明において使用するエンテロバクター（Enterobacter）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばEnterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter taylorae 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてEnterobacter aerogenes IFO13534, Enterobacter aerogenes ATCC13048, Enterobacter cloacae ATCC222, Enterobacter cloacae ATCC13047, Enterobacter cloacae IFO12935, Enterobacter tayloraeJCM3943等が挙げられる。
【００１５】
本発明において使用するエルウィニア（Erwinia ）属に属する微生物の好ましい主としては、例えばErwinia chrysanthemi, Erwinia rhapontici等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてErwinia chrysanthemi MAFF 03-01767, Erwinia rhapontici MAFF 03-01331等が挙げられる。
本発明において使用するエッシェリティア（Escherichia ）属に属する微生物の好ましい主としては、例えばEscherichia coli等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてEscherichia coli ATCC11775, Escherichia coli IFO3301, Escherichia coli ATCC10798等が挙げられる。
【００１６】
本発明において使用するフラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばFlavobacterium aquatile, Flavobacterium dehydrogenans 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてFlavobacterium aquatile IFO3772, Flavobacterium dehydrogenans ATCC13930 等が挙げられる。
本発明において使用するグルコノバクター（Gluconobacter ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばGluconobacter capsulatus等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてGluconobacter capsulatus IAM1813等が挙げられる。
【００１７】
本発明において使用するハフニア（Hafnia）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばHafnia alvei等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてHafnia alvei ATCC13337等が挙げられる。
本発明において使用するクレブシエラ（Klebsiella）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばKlebsiella planticola, Klebsiella oxytoca , Klebsiella terrigena等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてKlebsiella planticola NCIB11885, Klebsiella oxytoca JCM1665, Klebsiella terrigena JCM1687 等が挙げられる。
【００１８】
本発明において使用するミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばMicrobacterium lacticum, Microbacterium flavum等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてMicrobacterium lacticum IAM1640, Microbacterium flavum JCM1317等が挙げられる。
本発明において使用するミクロコッカス（Micrococcus ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばMicrococcus varians, Micrococcus morrhuae , Micrococcus luteus等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてMicrococcus varians IAM1314, Micrococcus morrhuae IAM1711, Micrococcus luteus ATCC4698, Micrococcus varians IAM1099 等が挙げられる。
【００１９】
本発明において使用するモラクセラ（Moraxella ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばMoraxella nonliquefaciens 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてMoraxella nonliquefaciens FERM-P4348等が挙げられる。
本発明において使用するパラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばParacoccus denitrificans等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてParacoccus denitrificans IFO13301 、Paracoccus denitrificans FERM-P4349 等が挙げられる。
【００２０】
本発明において使用するシュードモナス属（Pseudomonas ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばPseudomonas putida, Pseudomonas oleovolans, Pseudomonas sp. 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてPseudomonas putida NCIMB11924, Pseudomonas oleovolans IFO13583, Pseudomonas sp. ATCC13261 等が挙げられる。
本発明において使用するラネラ（Rhanella）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばRhanella aquatilis等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてRhanella aquatilis JCM1683等が挙げられる。
【００２１】
本発明において使用するキサントモナス（Xanthomonas ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばXanthomonas maltophila等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてXanthomonas maltophila ATCC13637等が挙げられる。
本発明において使用するにセルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばCellulomonas biazotea, Cellulomonas flavigena, Cellulomonas gelida等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてCellulomonas biazotea ATCC486, Cellulomonas flavigena ATCC482, Cellulomonas biazotea JCM1340, Cellulomonas flavigena IFO3754, Cellulomonas gelida IFO3748 等が挙げられる。
【００２２】
本発明において使用するバークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばBurkholderia cepacia等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてBurkholderia cepacia ATCC25416等が挙げられる。
本発明において使用するロドトルラ（Rhodotorula ）属する微生物の好ましい種としては、例えばRhodotorula minuta等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてRhodotorula minuta IFO0387等が挙げられる。
【００２３】
本発明において使用するファエノココマイセス（Phaeococcomyces ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばPhaeococcomyces nigricans 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてPhaeococcomyces nigricans CBS 652.76等が挙げられる。
本発明において使用するキャンディダ（Candida ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばCandida molischiana, Candida terreus, Candida parapsilosis, Candida zeylanoides, Candida maltosa等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてCandida molischiana IFO 10926, Candida terreus IFO 0727, Candida parapsilosis IFO 604, Candida zeylanoides IFO6408, Candida maltosa IFO 1977等が挙げられる。
【００２４】
本発明において使用するトリグノプシス（Trignopsis）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばTrignopsis variabilis 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてTrignopsis variabilis IFO4095 等が挙げられる。
本発明において使用するハンセニアスポラ（Hanseniaspora ）属に属する微生物の好ましい種としては、例えばHanseniaspora uvarum IFO 1755 等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてHanseniaspora uvarum IFO 1755 等が挙げられる。
【００２５】
また、リビトール、ガラクチトールあるいはキシリトールを唯一の炭素源として生育できる菌株の数多くの菌株がエリスリトールからスレイトールへの変換が可能である。よって自然界よりリビトール、ガラクチトールあるいはキシリトールを唯一の炭素源として生育できる菌で、エリスリトールからスレイトールへの変換が可能な菌であればいずれも本反応に使用できる。
【００２６】
また、上記微生物は、変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
また、上記の菌株はいずれも公知の菌株であり、それぞれ、（財）発酵研究所（ＩＦＯ）、セントラルビューローフォーシュメルカルチャーズ（ＣＢＳ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。
【００２７】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、エリスリトールに作用しスレイトールへ変換する能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等を通常の固定化技術を用いて、すなわち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００２８】
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明においては、原料としてエリスリトールを用い、これに上記特定の微生物の菌体又は該菌体処理物を作用させて、スレイトールを製造する。
本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。酵素の誘導剤として、エリスリトール、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類が適宜使用される。培養は、好気的条件下に、ｐＨ約３〜１１、温度約４〜５０℃の適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
【００２９】
エリスリトールからスレイトールを製造する方法として、本微生物を培養し、得られた菌体及び／または該菌体処理物にエリスリトールを添加し反応させスレイトールを得る方法、培地にエリスリトールを添加し培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後、エリスリトールを添加して更に反応を行う方法等を適宜用いることができる。
反応は温度４〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲で行い、ｐＨは２〜１１、好ましくは６〜９のの範囲で行う。エリスリトールの濃度は０．０００１〜８０％、好ましくは０．０１〜５０％の範囲が望ましく、必要ならばエリスリトールは反応の間、追補添加される。
【００３０】
エリスリトール以外の炭水化物が反応液に添加されると著しく反応が促進される場合がある。これらの炭水化物としてはグルコース、フルクトース、サッカロース等の糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のアルコール類、ピルビン酸などの有機酸などが適宜使用される。添加濃度はエリスリトールに対し０．１〜２００％、好ましくは１０〜１００％の範囲で用いられる。
【００３１】
また、必要に応じてコバルトイオン、マグネシウムイオン等の金属イオンを添加することにより反応が促進される場合がある。
微生物によっては反応の中間体物質としてエリスルロースが検出されることもあり、この場合は酸化と還元が微生物内で同時に行われ結果的にスレイトールが蓄積されると推定される。微生物によってはこの中間体がほとんど検出されないものもあり、ある種の異性化酵素である可能性も示唆される。
【００３２】
培養及び反応で得られたスレイトールの採取方法としては、微生物などの固形分を遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置によりを除去した後に、残存するその他の糖質や菌体及び培地由来の物質を通常の方法、すなわちクロマトグラフィーや晶析技術を用いることで除去できる。工業的には、イオン交換樹脂を用いた疑似移動相型クロマトグラフィーにより分離することも可能である。分離精製の工程には、必要に応じて脱塩、脱色など、通常の棟の精製における操作を加えることもできる。さらに低温晶析、有機溶媒を用いた晶析等、通常の晶析技術を用い、スレイトールの結晶を得る事ができる。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１
リビトール１０ｇ／Ｌ、イーストエキス５ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１ｇ／Ｌ（ｐＨ７．１）の組成からなる液体培地１０ｍＬに、第１表に示した各種の菌株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、これにエリスリトール１０ｇ／Ｌ、およびフルクトース５ｇ／Ｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量を１ｍＬとし３０℃で２４時間好気的に反応させた。反応終了後菌体を遠心分離にて除去し上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。
ＨＰＬＣの条件は
カラム：ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８ＥＣ温度：７５度
溶離液：水１００％流速：０．８ml/min.
検出器：ＲＩ検出器およびＵＶ検出器（２１０ｎｍ）
標準サンプルとしてＳｉｇｍａ社の試薬を用いた。結果を第１表に示す。
【００３４】
【表１】

【００３５】
【表２】

【００３６】
実施例２
マンニトール２ｇ／Ｌ、リビトール５ｇ／Ｌ、硫安３ｇ／Ｌ、リン酸２ナトリウム１３．５ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄５ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）の組成からなる液体培地1 ０ｍＬにEnterobacter aerogenes IFO13534, Enterobacter aerogenes ATCC13048, Enterobacter cloacae ATCC222, Enterobacter cloacae ATCC13047, Enterobacter cloacae IFO12935, Enterobacter tayloraeJCM3943をそれぞれ接種し、３０℃で３０時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。
【００３７】
この菌体に１ｍｌの１％エリスリトール溶液（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０））と蒸留水９ｍｌを加え３０℃で４日間反応させた。反応開始１日目にピルビン酸を１０マイクロリットル添加して反応を続けた。反応終了後菌体を遠心分離にて除去し上清をＨＰＬＣにて分析した。結果を第２表に示す。
【００３８】
【表３】

【００３９】
実施例３
リビトール 10ｇ／Ｌ、イーストエキス 10ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム 1.4 ｇ／Ｌ、リン酸２ナトリウム３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、ＮａＣＬ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ（ｐＨ６．３）の組成からなる液体培地１０ｍＬに、第３表に示した各種の菌株を接種し、３０℃で４８〜７２時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、これにエリスリトール１５ｇ／Ｌ、およびフルクトース５ｇ／Ｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5 ）を加え、全量を1 ｍＬとし３０℃で２４時間好気的に反応させた。反応終了後菌体を遠心分離にて除去し上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。結果を第３表に示す。
【００４０】
【表４】

【００４１】
実施例４
グルコース１０ｇ／Ｌ、イーストエキス１０ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１ｇ／Ｌ、エリスリトール２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト１０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２００ｍＬに、Agrobacterium radiobacter NRRL B-11291を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養し種培養とした。同組成の培地２０Ｌを３０Ｌジャーファーメンターに仕込み、１２０℃２０分殺菌後、３１℃に温度を設定し、種培養を植菌して、１５時間培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、全量１Ｌになるように水に懸濁した。この懸濁液５００ｍＬと水１２５０ｍＬ、さらにエリスリトール１９０ｇ、およびフルクトース３７．５ｇを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬを加え１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬ加え、５Ｌのミニジャーファーメンターにて３０℃、６００ｒｐｍ、１ｖｖｍで６日間反応させた。反応終了後ＨＰＬＣにて分析したところ、スレイトール１５２ｇ、エリスリトール８ｇ含まれていた。
（収率８０．３％）（変換率９５．７％）
【００４２】
実施例５
実施例４の反応終了液を遠心分離にかけ菌体を除いた。さらにその上清を透析膜にて高分子物質を除き、濃縮後エタノールを加えて結晶を析出させた。
この結晶２０ｍｇとりテトラヒドロフラン０．２ｍＬと無水トリフルオロ酢酸を０．０２ｍＬ加え、さらにピリジンを５μｌ加え室温で撹拌し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にて光学純度の分析した。光学純度は１００％Ｄ体であった。ＧＣの条件は以下の通りである。
Column :β-DEX325 （Superco, 30m*0.25mmID*0.25μm ）
Carrier : He 1.5ml/min（1.2KG ）, Oven : 100℃, Det : FID, 300℃
Inj : 1 μｌ, split （50:1）, 220 ℃
尚、ＴＦＡ化エリスリトールは7.3 分に、ＴＦＡ化Ｌ−スレイトールは10.1分に、ＴＦＡ化Ｄ−スレイトールは9.3 分に検出される。
【００４３】
実施例６
リビトール１０ｇ／Ｌ、イーストエキス５ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１ｇ／Ｌ（ｐＨ７．１）の組成からなる液体培地５０ｍＬに、Agrobacterium tumefaciens IAM 13129, Enterobacter aerogenes IFO13534, Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162 をそれぞれ接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、これにエリスリトール８０ｇ／Ｌ、およびマンニトール４０ｇ／Ｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量を５ｍＬとし３０℃で２４時間好気的に反応させた。反応終了後菌体を遠心分離にて除去し上清を得た。この上清を濃縮乾固し、実施例５と同様にＧＣにて光学純度の分析を行った。結果、Agrobacterium tumefaciens IAM 13129 及び, Enterobacter aerogenes IFO13534 はＬ−スレイトール由来のピークは認められず、１００％Ｄ体のスレイトールであった。 Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162は９６．７％の光学純度であった。
【００４４】
実施例７
グルセロール１０ｇ／Ｌ、イーストエキス１０ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１ｇ／Ｌ、エリスリトール２ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、Agrobacterium radiobacter NRRL B-11291を接種し、３０℃で２４時間好気的に１７時間培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、全量２ｍＬになるように水に懸濁した。この懸濁液１００μＬと１０％エリスリトール２００μＬ、および第４表に示した各種の炭水化物１０％濃度液を１００μＬ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）６００μＬを加え、２７℃で２０時間好気的に反応させた。反応終了後ＨＰＬＣにて分析して炭水化物の影響を調べた。
結果を第４表に示すが、何も入れないときに比べて特に、フルクトースにもっとも生産性を高める効果があった。
【００４５】
【表５】

【００４６】
実施例８
リビトール１０ｇ／Ｌ、イーストエキス５ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１ｇ／Ｌ（ｐＨ７．１）の組成からなる液体培地１０ｍＬに、第５表に示した各種の菌株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、これにエリスリトール８０ｇ／Ｌ、およびフルクトース３０ｇ／Ｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量を1 ｍＬとし３０℃で２４時間好気的に反応させた。反応終了後菌体を遠心分離にて除去し上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。結果を第５表に示す。
【００４７】
【表６】

【００４８】
【発明の効果】
本発明によって、微生物を利用してエリスリトールからスレイトールを簡便に製造することが可能になった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to the production of thritol from erythritol using microorganism cells and / or treated cells.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
In recent years, Threitol has attracted attention as a useful substance as an intermediate material for pharmaceuticals or agricultural chemicals.
As a chemical production method of this thritol, a method of chemically producing D-threitol using D-Xylose as a raw material (J. Organic. Chem. 54 (1989) 22,5257-5264), erythritol A method for producing DL-threitol by chemical isomerization from carbon (Carbohydrate. Res., 44 (1975) 106), etc. is known, but all of them are low in yield and complicated in process. It is not a suitable method for industrial production.
[0003]
A method for biochemically producing thritol is an example in which L-threitol is detected in the erythritol oxide of Acetobacter suboxydans (CL HU, E, A, McCOMB, and VV RENDIG ARCHIVES of BIOCHEM. & BIOPHYSIC. 110 p350-353, 1965) has been reported, but no industrial method for producing L-threitol from erythritol is known. Furthermore, there is no report of microbial conversion of erythritol to D-threitol.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method by which thritol can be efficiently industrially produced from inexpensive raw materials.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to provide an industrial production method of thritol, the present inventors have found a microorganism capable of producing thritol from erythritol, and completed the present invention.
That is, the present invention resides in a method for producing thritol characterized by allowing a microbial cell having the ability to convert erythritol to thritol and / or a treated product of the microbial cell to act on erythritol.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, any microorganism can be used as long as it has the ability to convert erythritol and produce threitol. Preferred microorganisms include the genus Alcaligenes, the genus Acinetobacter, and the Agrobacterium. (Agrobacterium) genus, Arthrobacter genus, Aureobacterium genus, Bacillus genus, Bacteridium genus, Bordrtella genus, Brevibacterium genus, Klebsiella (Klebsiella), Comamonas genus, Corynebacterium genus, Enterobacter genus, Escherichia genus, Erwinia genus, Flavobacterium genus, glucono Bacter (Gluconobacter) genus, Hafnia genus, Microbacterium genus, Micrococcus genus, Moraxella genus, Paracoccus genus, Rhanella genus, Xanthomonas genus, Pseudomonas Genus, Cellulomonas genus, Burkholderia genus, Rhodotorula genus, Phaeococcomyces genus, Candida genus, Trignopsis genus and Hansenispora genus Examples include microorganisms belonging to a selected genus.
[0006]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Alcaligenes used in the present invention include, for example, Alcaligenes faecalis castellani, Alcaligenes denitrificans sub. Denitrificans, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes xylosoxidans ssp. Xylosoxidans and the like. More specific representative strains include Alcaligenes faecalis castellani IAM1015, Alcaligenes denitrificans sub.denitrificans IAM12370, Alcaligenes paradoxus Biotype I DSM66, Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162, Alcaligenes xylosoxidans ssp. Xylosoxidans IAM12600, Alcaligenes
[0007]
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Acinetobacter used in the present invention include, for example, Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwoffii. More specific strains include Acinetobacter calcoaceticus IFO12552, Acinetobacter calcoaceticus ATCC19606, Acinetobacter lwoffii ATCC17910, and the like.
[0008]
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Arthrobacter used in the present invention include, for example, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter crystallopoietes, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter ramousus Arthrobacter citreus, Arthrobacter atrocyaneus, Arthrobacter sulfur Arteub, More specific strains include Arthrobacter paraffineus ATCC15590, Arthrobacter crystallopoietes JCM2522, Arthrobacter oxydans JCM2521, Arthrobacter ramousus JCM1334, Arthrobacter citreus JCM1331, Arthrobacter atrocyaneus JCM1329, Arthrobacter hystactor Jurbaricum JB
[0009]
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Agrobacterium used in the present invention include, for example, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium aureum, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium viscosum and the like. More specific representative strains include Agrobacterium radiobacter NRRL B-11291, Agrobacterium radiobacter IAM12048, Agrobacterium tumefaciens IAM13129, Agrobacterium tumefaciens MAFF03-01224, Agrobacterium tumefaciens MAFF03-01001, Agrobacterium viscosum IFO13652, Agrobacterium aureum IFO13iz, AFF rhizogenes MAFF03-01724 and the like.
[0010]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Aureobacterium used in the present invention include, for example, Aureobacterium saperdae, Aureobacterium testaceum and the like. More specific representative strains include Aureobacterium saperdae JCM 1352, Aureobacterium testaceum JCM1353 and the like.
Preferred species of microorganisms belonging to the genus Bacillus used in the present invention include, for example, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sphaerium and the like. More specific representative strains include Bacillus licheniformis IFO12200, Bacillus megaterium IFO12108, Bacillus megaterium ATCC13639, Bacillus sphaerium ATCC7055 and the like.
[0011]
A preferable species of the microorganism belonging to the genus Bacteridium used in the present invention includes, for example, Bacteridium sp. More specific representative strains include Bacteridium sp. R340 FERM P-2718.
Examples of the microorganism belonging to the genus Bordrtella used in the present invention include Bordrtella bronchiseptica. More specific representative strains include Bordrtella bronchiseptica ATCC4617.
[0012]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Brevibacterium used in the present invention include, for example, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium iodinum and the like. More specific representative strains include Brevibacterium ammoniagenes JCM1305, Brevibacterium ammoniagenes JCM1306, Brevibacterium butanicum ATCC21196, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium iodinum IFO3558, and the like.
[0013]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Comamonas used in the present invention include, for example, Comamonas acidovorans, Comamonas terrigena and the like. More specific representative strains include Comamonas acidovorans NCIMB9289, Comamonas terrigena IFO13299 and the like.
Preferred examples of the microorganism belonging to the genus Corynebacterium used in the present invention include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium flaccumfaciens, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium hydrocarboclastum and the like. More specific representative strains include Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium flaccumfaciens ATCC12813, Corynebacterium flavescens JCM1317, Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC15960 and the like.
[0014]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Enterobacter used in the present invention include, for example, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter taylorae and the like. More specific representative strains include Enterobacter aerogenes IFO13534, Enterobacter aerogenes ATCC13048, Enterobacter cloacae ATCC222, Enterobacter cloacae ATCC13047, Enterobacter cloacae IFO12935, Enterobacter taylorae JCM3943 and the like.
[0015]
Preferred examples of microorganisms belonging to the genus Erwinia used in the present invention include Erwinia chrysanthemi and Erwinia rhapontici. More specific representative strains include Erwinia chrysanthemi MAFF 03-01767, Erwinia rhapontici MAFF 03-01331, and the like.
Preferred examples of the microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention include, for example, Escherichia coli. More specific representative strains include Escherichia coli ATCC 11775, Escherichia coli IFO 3301, Escherichia coli ATCC 10798, and the like.
[0016]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Flavobacterium used in the present invention include, for example, Flavobacterium aquatile, Flavobacterium dehydrogenans and the like. More specific representative strains include Flavobacterium aquatile IFO3772, Flavobacterium dehydrogenans ATCC13930 and the like.
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Gluconobacter used in the present invention include, for example, Gluconobacter capsulatus. More specific representative strains include Gluconobacter capsulatus IAM1813.
[0017]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Hafnia used in the present invention include, for example, Hafnia alvei. More specific representative strains include Hafnia alvei ATCC13337.
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Klebsiella used in the present invention include, for example, Klebsiella planticola, Klebsiella oxytoca, Klebsiella terrigena and the like. More specific representative strains include Klebsiella planticola NCIB11885, Klebsiella oxytoca JCM1665, Klebsiella terrigena JCM1687 and the like.
[0018]
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Microbacterium used in the present invention include, for example, Microbacterium lacticum, Microbacterium flavum and the like. More specific representative strains include Microbacterium lacticum IAM1640, Microbacterium flavum JCM1317, and the like.
Preferred examples of the microorganism belonging to the genus Micrococcus used in the present invention include Micrococcus varians, Micrococcus morrhuae, Micrococcus luteus and the like. More specific representative strains include Micrococcus varians IAM1314, Micrococcus morrhuae IAM1711, Micrococcus luteus ATCC4698, Micrococcus varians IAM1099 and the like.
[0019]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Moraxella used in the present invention include, for example, Moraxella nonliquefaciens. More specific representative strains include Moraxella nonliquefaciens FERM-P4348.
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Paracoccus used in the present invention include, for example, Paracoccus denitrificans. More specific representative strains include Paracoccus denitrificans IFO13301, Paracoccus denitrificans FERM-P4349 and the like.
[0020]
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Pseudomonas used in the present invention include, for example, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovolans, Pseudomonas sp. More specific representative strains include Pseudomonas putida NCIMB11924, Pseudomonas oleovolans IFO13583, Pseudomonas sp. ATCC13261 and the like.
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Rhanella used in the present invention include, for example, Rhanella aquatilis. More specific representative strains include Rhanella aquatilis JCM1683.
[0021]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Xanthomonas used in the present invention include, for example, Xanthomonas maltophila. More specific representative strains include Xanthomonas maltophila ATCC13637 and the like.
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Cellulomonas for use in the present invention include, for example, Cellulomonas biazotea, Cellulomonas flavigena, Cellulomonas gelida and the like. Specific representative strains include Cellulomonas biazotea ATCC486, Cellulomonas flavigena ATCC482, Cellulomonas biazotea JCM1340, Cellulomonas flavigena IFO3754, Cellulomonas gelida IFO3748, and the like.
[0022]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Burkholderia used in the present invention include, for example, Burkholderia cepacia. More specific representative strains include Burkholderia cepacia ATCC25416.
Preferred species of the microorganism belonging to Rhodotorula used in the present invention include, for example, Rhodotorula minuta. More specific representative strains include Rhodotorula minuta IFO0387.
[0023]
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Phaeococcomyces used in the present invention include, for example, Phaeococcomyces nigricans. More specific representative strains include Phaeococcomyces nigricans CBS 652.76.
Preferable species of microorganisms belonging to the genus Candida used in the present invention include, for example, Candida molischiana, Candida terreus, Candida parapsilosis, Candida zeylanoides, Candida maltosa and the like. More specific representative strains include Candida molischiana IFO 10926, Candida terreus IFO 0727, Candida parapsilosis IFO 604, Candida zeylanoides IFO 6408, Candida maltosa IFO 1977 and the like.
[0024]
Preferred species of the microorganism belonging to the genus Trignopsis used in the present invention include, for example, Trignopsis variabilis. More specific representative strains include Trignopsis variabilis IFO4095.
As a preferable species of the microorganism belonging to the genus Hanseniaspora used in the present invention, for example, Hanseniaspora uvarum IFO 1755 and the like can be mentioned. More specific representative strains include Hanseniaspora uvarum IFO 1755 and the like.
[0025]
In addition, many strains of strains that can grow using ribitol, galactitol or xylitol as the sole carbon source can convert erythritol into threitol. Therefore, any bacteria can be used in this reaction as long as it is capable of growing from the natural world using ribitol, galactitol, or xylitol as the sole carbon source and capable of converting erythritol into threitol.
[0026]
Further, the microorganism may be any strain such as a mutant strain or a recombinant strain induced by a genetic technique such as cell fusion or gene recombination.
The above strains are all known strains and can be easily obtained from the Fermentation Research Institute (IFO), Central Bureau Forschmel Cultures (CBS), and American Type Culture Collection (ATCC), respectively. it can.
[0027]
In the production method of the present invention, one type or two or more types of the above-mentioned microorganisms are used as cells and / or treated cells. Specifically, the cells obtained by culturing the above microorganisms as they are, or those obtained by culturing the cells obtained by culturing by a known method, that is, those treated with acetone, those obtained by freeze-drying, Processed microbial cells such as those obtained by physically or enzymatically disrupting microbial cells can be used. Moreover, it is also possible to take out the enzyme fraction which has the capability to act on erythritol and convert into thritol from these microbial cells or microbial cell processed products as a crude product or a purified product. Furthermore, the cells obtained in this manner, the treated cells, the enzyme fraction, etc., are used by using a general immobilization technique, that is, those immobilized on a carrier such as polyacrylamide or carrageenan gel. It is also possible. Therefore, in the present specification, the term “bacteria and / or treated product thereof” is used as a concept containing all of the above-mentioned cells, treated product, enzyme fraction, and their immobilized products.
[0028]
Next, the production method of the present invention will be specifically described.
In the present invention, erythritol is used as a raw material, and the microbial cells of the specific microorganism or the treated microbial cells are allowed to act on the erythritol to produce thritol.
In the production method of the present invention, the microorganism is usually used after being cultured, but this culture can be carried out as usual. The medium used for culturing the microorganism includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and the like that can be assimilated by the microorganism. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose and saccharose, polyalcohols such as glycerol, mannitol, xylitol and ribitol, organic acids and the like are appropriately used. As the nitrogen source, organic nitrogen sources such as NZ amine, tryptose, yeast extract, polypeptone, meat extract and soybean extract, or inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium nitrate, and the like are appropriately used. As the inorganic ions, phosphate ions, magnesium ions, iron ions, manganese ions, molybdenum ions and others are appropriately used as necessary. Furthermore, it is effective to add inositol, pantothenic acid, nicotinamide and other vitamins as necessary. As an enzyme inducer, polyalcohols such as erythritol, glycerol, mannitol, xylitol, ribitol are appropriately used. Cultivation is carried out for 1 to 100 hours under aerobic conditions while controlling the pH within a suitable range of about 3 to 11 and a temperature of about 4 to 50 ° C.
[0029]
As a method for producing threitol from erythritol, the present microorganism is cultured, erythritol is added to and reacted with the obtained bacterial cells and / or treated cells, and erythritol is added to the medium. A method of performing simultaneously, or a method of further reacting by adding erythritol after completion of culture can be appropriately used.
The reaction is carried out at a temperature of 4 to 70 ° C., preferably 20 to 50 ° C., and at a pH of 2 to 11, preferably 6 to 9. The concentration of erythritol is desirably in the range of 0.0001 to 80%, preferably 0.01 to 50%. If necessary, erythritol is supplemented during the reaction.
[0030]
When carbohydrates other than erythritol are added to the reaction solution, the reaction may be significantly accelerated. As these carbohydrates, sugars such as glucose, fructose and saccharose, alcohols such as ethanol, glycerol, mannitol, xylitol and ribitol, organic acids such as pyruvic acid and the like are appropriately used. The addition concentration is 0.1 to 200%, preferably 10 to 100%, based on erythritol.
[0031]
Moreover, reaction may be accelerated | stimulated by adding metal ions, such as cobalt ion and magnesium ion, as needed.
Depending on the microorganism, erythrulose may be detected as an intermediate substance of the reaction, and in this case, it is presumed that oxidation and reduction are simultaneously performed in the microorganism and thritol is accumulated as a result. Some microorganisms rarely detect this intermediate, suggesting the possibility of being a kind of isomerase.
[0032]
As a method of collecting thritol obtained by culturing and reaction, solids such as microorganisms are removed by a normal separation device such as centrifugation, filter press, ultrafiltration, etc. In addition, the medium-derived substance can be removed by a usual method, that is, using chromatography or a crystallization technique. Industrially, it can also be separated by pseudo mobile phase chromatography using an ion exchange resin. In the separation and purification process, operations in the normal ridge purification such as desalting and decolorization can be added as necessary. Further, thritol crystals can be obtained using ordinary crystallization techniques such as low-temperature crystallization and crystallization using an organic solvent.
[0033]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, ordinary changes in the technical field of the present invention can be made without departing from the gist thereof.
Example 1
It is shown in Table 1 in 10 mL of a liquid medium having a composition of ribitol 10 g / L, yeast extract 5 g / L, polypeptone 5 g / L, dipotassium phosphate 3 g / L, and potassium phosphate 1 g / L (pH 7.1). The various strains were inoculated and aerobically cultured at 30 ° C. for 24 hours. Centrifugation of the obtained culture broth collects the cells, and 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing erythritol 10 g / L and fructose 5 g / L is added thereto to make the total volume 1 mL at 30 ° C. The reaction was aerobic for 24 hours. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).
HPLC conditions were: Column: MCIGEL CK08EC Temperature: 75 degrees Eluent: Water 100% Flow rate: 0.8 ml / min.
Detector: RI detector and UV detector (210 nm)
Sigma reagent was used as a standard sample. The results are shown in Table 1.
[0034]
[Table 1]

[0035]
[Table 2]

[0036]
Example 2
Mannitol 2g / L, Ribitol 5g / L, Ammonium sulfate 3g / L, Disodium phosphate 13.5g / L, Potassium phosphate 1.5g / L, Magnesium sulfate heptahydrate 0.2g / L, Second sulfate Enter 10 mL of liquid medium consisting of 5 mg / L of iron (pH 7.2) with Enterobacter aerogenes IFO13534, Enterobacter aerogenes ATCC13048, Enterobacter cloacae ATCC222, Enterobacter cloacae ATCC13047, Enterobacter cloacae IFO12935, Enterobacter taylorae for 30 hours, Cultured aerobically. The obtained culture broth was centrifuged to collect microbial cells.
[0037]
1 ml of 1% erythritol solution (100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0)) and 9 ml of distilled water were added to the cells and reacted at 30 ° C. for 4 days. On the first day of the reaction, 10 microliters of pyruvic acid was added and the reaction was continued. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 2.
[0038]
[Table 3]

[0039]
Example 3
Ribitol 10 g / L, yeast extract 10 g / L, 1 potassium phosphate 1.4 g / L, disodium phosphate 3 g / L, ammonium sulfate 5 g / L, NaCL 0.5 g / L, magnesium sulfate 0.5 g / L (pH 6.3) The various strains shown in Table 3 were inoculated into 10 mL of a liquid medium having the composition of) and cultured aerobically at 30 ° C. for 48 to 72 hours. The obtained culture broth is centrifuged to collect the cells, and 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 15 g / L of erythritol and 5 g / L of fructose is added thereto to make a total volume of 1 mL at 30 ° C. For 24 hours. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 3.
[0040]
[Table 4]

[0041]
Example 4
Glucose 10 g / L, yeast extract 10 g / L, dipotassium phosphate 3 g / L, monopotassium phosphate 1 g / L, erythritol 2 g / L, magnesium sulfate 0.5 g / L, manganese sulfate 10 mg / L, cobalt chloride 10 mg / L Agrobacterium radiobacter NRRL B-11291 was inoculated into 200 mL of a liquid medium having a composition of L (pH 7.0), and aerobically cultured at 30 ° C. for 24 hours to form a seed culture. A 20 L medium having the same composition was charged into a 30 L jar fermenter, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, set at 31 ° C., inoculated with a seed culture, and cultured for 15 hours. The obtained culture solution was centrifuged, and the cells were collected and suspended in water so that the total amount became 1 L. 500 mL of this suspension, 1250 mL of water, and 190 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 190 g of erythritol and 37.5 g of fructose were added, and 100 mL of 1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) was added. The reaction was carried out for 6 days at 30 ° C., 600 rpm, and 1 vvm using a mini jar fermenter. When analyzed by HPLC after completion of the reaction, 152 g of threitol and 8 g of erythritol were contained.
(Yield 80.3%) (Conversion 95.7%)
[0042]
Example 5
The reaction-terminated solution of Example 4 was centrifuged to remove the cells. Further, the supernatant was freed from the polymer substance by a dialysis membrane, concentrated, and ethanol was added to precipitate crystals.
20 mg of this crystal was added, 0.2 mL of tetrahydrofuran and 0.02 mL of trifluoroacetic anhydride were added, 5 μl of pyridine was further added and stirred at room temperature, and the optical purity was analyzed by gas chromatography (GC). The optical purity was 100% D form. The GC conditions are as follows.
Column: β-DEX325 (Superco, 30m * 0.25mmID * 0.25μm)
Carrier: He 1.5ml / min (1.2KG), Oven: 100 ℃, Det: FID, 300 ℃
Inj: 1 μl, split (50: 1), 220 ℃
TFA-modified erythritol is detected at 7.3 minutes, TFA-modified L-threitol is detected at 10.1 minutes, and TFA-modified D-threitol is detected at 9.3 minutes.
[0043]
Example 6
Agrobacterium tumefaciens IAM 13129, 10 ml / L, yeast extract 5 g / L, polypeptone 5 g / L, dipotassium phosphate 3 g / L, 1 potassium phosphate 1 g / L (pH 7.1) Enterobacter aerogenes IFO13534 and Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162 were inoculated and cultured aerobically at 30 ° C. for 24 hours. Centrifugation of the obtained culture solution was performed, and the cells were collected. To this, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing erythritol 80 g / L and mannitol 40 g / L was added to make a total volume of 5 mL at 30 ° C. The reaction was aerobic for 24 hours. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation to obtain a supernatant. The supernatant was concentrated and dried, and optical purity was analyzed by GC in the same manner as in Example 5. As a result, Agrobacterium tumefaciens IAM 13129 and Enterobacter aerogenes IFO13534 were 100% D-form thritol with no peak derived from L-threitol. Alcaligenes paradoxus Biotype II DSM30162 had an optical purity of 96.7%.
[0044]
Example 7
Agrobacterium radiobacter NRRL B- is added to 20 mL of a liquid medium having a composition of 10 g / L of glycerol, 10 g / L of yeast extract, 3 g / L of dipotassium phosphate, 1 g / L of potassium phosphate 1 g, and 2 g / L of erythritol (pH 7.0). 11291 was inoculated and cultured aerobically for 17 hours at 30 ° C. for 24 hours. The obtained culture solution was centrifuged, and the cells were collected and suspended in water so that the total amount was 2 mL. 100 μL of this suspension, 200 μL of 10% erythritol, and 100 μL of various 10% carbohydrate solutions shown in Table 4 and 600 μL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) were added and aerobic at 27 ° C. for 20 hours. Reaction. After completion of the reaction, the effect of carbohydrate was examined by HPLC analysis.
The results are shown in Table 4. Fructose was most effective in increasing productivity, especially when nothing was added.
[0045]
[Table 5]

[0046]
Example 8
Table 5 shows 10 mL of a liquid medium having a composition of 10 g / L ribitol, 5 g / L yeast extract, 5 g / L polypeptone, 3 g / L potassium phosphate, and 1 g / L potassium phosphate (pH 7.1). The various strains were inoculated and aerobically cultured at 30 ° C. for 24 hours. Centrifugation of the obtained culture solution was carried out, and the cells were collected. To this, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing erythritol 80 g / L and fructose 30 g / L was added to make the total volume 1 mL, and 30 ° C. For 24 hours. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 5.
[0047]
[Table 6]

[0048]
【The invention's effect】
According to the present invention, thritol can be easily produced from erythritol using microorganisms.

Claims

A microbial cell having an ability to convert erythritol selected from the group consisting of Agrobacterium, Enterobacter and Alkaligenes into D-threitol and / or a treated product of the microbial cell, which acts on erythritol A method for producing D-threitol .

A microorganism belonging to the genus Agrobacterium, which has the ability to convert erythritol into D-threitol, and / or a treated product of the microorganism, which acts on erythritol, and a method for producing D-threitol .

When microbial cells and / or treated cells are allowed to act on erythritol, ribitol, xylitol, arabinose, ribose, sorbitol, mannitol, inositol, glucose, fructose, sorbose, lactitol, myo-inositol, saccharose, ethanol, glycerol And a compound selected from the group consisting of pyruvic acid is allowed to coexist, The method for producing D-threitol according to claim 1 or 2.