JP3711296B2

JP3711296B2 - Method for producing L-psicose

Info

Publication number: JP3711296B2
Application number: JP23902495A
Authority: JP
Inventors: 健何森; 桂二津▲崎▼
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2015-08-25
Also published as: JPH0956390A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−プシコースの製造方法に関するものであり、更に詳細には、グルコノバクター属に属し、アリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌を用いて、アリトールからＬ−プシコースを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−プシコースは、ケトヘキソースに分類される単糖類で、自然界には殆ど存在しない希少糖質である。その製造方法としては、原理的には、有機化学的手法によりＬ−アルトロース又はＬ−アロースをカセイソーダ、ピリジンなどのアルカリ性薬剤の共存下で異性化させ、Ｌ−プシコースを製造することが可能である。しかし、実際には、原料となるＬ−アルトロース又はＬ−アロースを得ることが困難であり、Ｌ−プシコースを充分量製造する適当な方法は現在まで報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、生化学工業が急速に発達し、糖質化学の分野においても、新たな糖質の開発が望まれている。Ｌ−プシコースは、大量製造方法が確立されておらず、試薬としても市販されていない。従って、未だ、食品工業、医薬品工業、化学工業などの工業原料として使用されるに至っていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｌ−プシコースを生化学的手段により大量、安価に製造することを目的に鋭意研究した。
【０００５】
その結果、グルコノバクター属に属し、アリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌が、水溶液中のアリトールを、容易にＬ−プシコースに変換することを見出し、これを採取することにより、Ｌ−プシコースが高収率で製造されることを確認して、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明において、アリトールからＬ−プシコースを製造するのに使用される細菌はグルコノバクター属に属し、アリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌である。その一例としては、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＩＦＯ３２５４又は、これの変異株などが有利に利用できる。
【０００７】
本発明でいう、グルコノバクター属に属し、アリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌は、アリトールを含有する水溶液に接触し、アリトールからＬ−プシコースを産生しうる微生物であればよく、例えば、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＩＦＯ３２５４又は、この変異株などの細菌が好適であり、通常、これら細菌をグリセロ−ル、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ソルボースあるいはキシリトール等の炭素源を含有する栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通気攪拌などの好気的条件下で培養し、培養中に、又は得られた細菌（生菌体）を用いて、水溶液中のアリトールをＬ−プシコースに変換させて、生成するＬ−プシコースを採取すればよい。
【０００８】
培養方法としては、グルコノバクター属に属する細菌が必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩などを含有する培地、望ましくは、微酸性乃至微アルカリ性の液体培地に、アリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌を植菌し、温度約２０乃至３５℃で、１乃至１０日間好気的条件下で培養すればよい。とりわけ、炭素源として、例えば、グリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ソルボースあるいはキシリトール等の１種又は２種以上の炭素源とともに他の各種栄養源を含有する液体培地で好気的に培養するのが望ましい。
【０００９】
前述のような培養方法によって得られた細菌（生菌体）を、アリトールを含有する水溶液と接触、望ましくは、振盪、通気攪拌、酸素の圧入などの好気的条件下で接触させ、その糖質を、Ｌ−プシコースに変換させることができる。
【００１０】
この変換に用いられる細菌は、培養液から分離された生菌体そのままの状態に限る必要はなく、例えば、生菌体を半透膜製のホローファイバーに封入した細菌、寒天、ゼラチン、アルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、シート状などの各種形状に固定化した細菌などとして、アリトールからＬ−プシコースへの変換に、繰返し利用することも好都合である。
【００１１】
以上述べた各種の方法により生成、蓄積したＬ−プシコースを含有する水溶液は、適当な分離方法、例えば、遠心分離、濾過などの方法によって細菌と分離され、採取される。
【００１２】
得られたＬ−プシコース水溶液は、必要により、例えば、硫安塩析、水酸化亜鉛吸着などによる除蛋白、活性炭吸着による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの方法で精製し、濃縮してシラップ状のＬ−プシコース製品を採取することができる。更にイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー、例えば、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックス５０ＷＸ４』、『ダウエックスＷＧＲ』、東京有機化学工業株式会社製造の商品名『アンバーライトＸＴ−１００８』、『アンバーライトＩＲＡ４７』、三菱化成工業株式会社製造の商品名『ダイヤイオンＳＫ１０６』、『ダイヤイオンＷＡ１１』などを用いるカラムクロマトグラフィーで分画、精製、濃縮することにより、９９％以上の高純度の標品も容易に得ることができる。
【００１３】
このようにして製造されるＬ−プシコースは、通常、原料のアリトールに対し約７０ｗ／ｗ％以上の収率で得られ、大量、安価に供給する工業的製造方法として好適である。したがって、Ｌ−プシコースは、食品工業、医薬品工業、化学工業などの原料、中間体などとして自由に利用できる。
【００１４】
以下、実施例について述べる。
【００１５】
【実施例１】
トリプトソーヤブイヨン２ｗ／ｖ％、グリセロール１ｗ／ｖ％及び脱イオン水からなる培養液１００ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコ１０本にとり、１２０℃２０分間オートクレーブし、冷却した後、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＩＦＯ３２５４を１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。
【００１６】
培養後、遠心分離により集菌し、得られた生菌体約１０ｇをアリトール５ｗ／ｖ％を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに加え混合し、この混合液１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、３０℃で２０時間振盪し、アリトールをＬ−プシコースに変換させた。次いで遠心分離して細菌を除去した。
【００１７】
得られた上清に２５ｗ／ｖ％硫酸亜鉛を１／１０容加えｐＨ７．６に調整し、遠心分離して上清を採取した。この上清を、常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）及び『ダイヤイオンＷＡ３０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）を用いて脱塩し、減圧濃縮して約６０％の透明なシラップを得た。さらに、『ダウエックス５０ＷＸ４』（カルシウム型のカチオン交換樹脂、ダウケミカル社製造の商品名）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製、濃縮し、Ｌ−プシコースを純粋なシラップとして採取した。Ｌ−プシコースのアリトールに対する収率は、固形物当たり約７０％であった。
【００１８】
このようにして得られた製品を同定するため、実験により理化学的性質を調べ、その性質を文献値と比較、又は、Ｓｉｇｍａ社が標準物質として市販している試薬Ｄ−プシコースの測定値と比較した。
【００１９】
（１）比旋光度の測定
本製品の測定値
［α］²⁰ _D ＝−３．０（ｃ＝１０％、Ｈ₂Ｏ）
Ｄ−プシコースの文献値
［α］²⁰ _D ＝＋３．１（ｃ＝１０％、Ｈ₂Ｏ）
文献：チャップマン・アンド・ホール（ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ）社、『ディクショナリー・オブ・オーガニック・コンパウンズ（ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄｓ）』、第４８１６頁（１９８２年）
【００２０】
（２） ¹³Ｃ−ＮＭＲの測定
本製品の¹³Ｃ−ＮＭＲの測定を、『バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第１３巻、第１４６乃至１５３頁（１９７４年）に記載している方法に準じて行ったところ、その化学シフトは表１に示すごとく、標準Ｄ−プシコースの文献値とよく一致した。
【００２１】
【表１】

【００２２】
（３）高速液体クロマトグラフィーによる分析
本製品を高速液体クロマトグラフィー（日本分光工業社製８８０−ＰＵ；カラム、日立製作所ＧＬ−Ｃ６１１；溶離液、１０^-4Ｍ水酸化ナトリウム、６０℃；流速、１ｍｌ／ｍｉｎ；検出、島津製作所ＲＩＤ−６Ａ）で分析したところ、その溶出位置は、試薬Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ソルボースなどのケトヘキソースとは異なり、試薬Ｄ−プシコースと同一の２８．６分であった。
【００２３】
以上の結果から明らかなように、¹³Ｃ−ＮＭＲの測定については、その化学シフトがＤ−プシコースの文献値とよく一致し、高速液体クロマトグラフィーについては試薬Ｄ−プシコースの値とよく一致し、しかも比旋光度については、Ｄ−プシコースの文献値とその絶対値がよく一致するものの＋、−逆であったことから、本発明の方法で得られた製品は、Ｌ−プシコースであると判断される。
【００２４】
本製品は、希少糖質としての試薬用途のみならず、食品工業、医薬品、化学工業などの原料、中間体などとしても有利に利用できる。
【００２５】
【発明の効果】
上記したことから明らかなように、本発明は、従来得ることの極めて困難であったＬ−プシコースを、生化学的方法により容易に製造する方法を確立するものである。特に、グルコノバクター属に属する微生物を用いて、アリトールという糖アルコールを原料としてＬ−プシコースを生産できることを見出したことは、Ｌ−プシコースの製造方法にとって極めて有利である。すなわち、原料となるアリトールはＤ−プシコースの還元反応によって容易に得られるので大量のＬ−プシコースの生産に有利に利用できる。
【００２６】
したがって、本発明の方法は、Ｌ−プシコースの工業的製造方法として好適であり、大量、安価な供給を容易にし、希少糖質としての試薬用途のみならず、従来予想すらできなかった食品工業、医薬品工業、化学工業などへの利用の道を拓くものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing L-psicose, and more specifically, a method for producing L-psicose from allitol using a bacterium belonging to the genus Gluconobacter and capable of producing L-psicose from allitol. It is about.
[0002]
[Prior art]
L-psicose is a monosaccharide classified as a ketohexose, and is a rare carbohydrate hardly existing in nature. In principle, L-psicose can be produced by isomerizing L-altrose or L-allose in the presence of an alkaline agent such as caustic soda or pyridine by an organic chemical method. is there. However, in practice, it is difficult to obtain L-altrose or L-allose as a raw material, and no suitable method for producing a sufficient amount of L-psicose has been reported so far.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In recent years, the biochemical industry has developed rapidly, and the development of new carbohydrates is also desired in the field of carbohydrate chemistry. L-psicose has not been established as a mass production method and is not commercially available as a reagent. Therefore, it has not yet been used as an industrial raw material for food industry, pharmaceutical industry, chemical industry and the like.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have intensively studied for the purpose of producing L-psicose in large quantities and at low cost by biochemical means.
[0005]
As a result, it was found that a bacterium belonging to the genus Gluconobacter and capable of producing L-psicose from allitol easily converts allitol in an aqueous solution into L-psicose, and by collecting this, L-psicose Was produced with a high yield, and the present invention was completed.
[0006]
That is, in the present invention, the bacterium used to produce L-psicose from allitol belongs to the genus Gluconobacter and has the ability to produce L-psicose from allitol. As an example thereof, Gluconobacter frateuri IFO3254 or a mutant thereof can be advantageously used.
[0007]
As used herein, the bacterium belonging to the genus Gluconobacter and having the ability to produce L-psicose from allitol may be any microorganism that can be brought into contact with an aqueous solution containing allitol and produce L-psicose from allitol. Bacteria such as Gluconobacter frateurii IFO 3254 or mutants thereof are preferred, and these bacteria are usually treated with a carbon source such as glycerol, D-mannitol, D-fructose, L-sorbose or xylitol. Culturing in the nutrient medium contained, preferably cultivating under aerobic conditions such as shaking, aeration and agitation, and using the obtained bacteria (viable cells) during the cultivation, -What is necessary is just to extract | collect L-psicose to convert into a psicose and to produce | generate.
[0008]
As a culture method, a nutrient source required by bacteria belonging to the genus Gluconobacter, for example, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, etc., preferably a slightly acidic to slightly alkaline liquid medium from allitol. A bacterium having L-psicose-producing ability may be inoculated and cultured at a temperature of about 20 to 35 ° C. for 1 to 10 days under aerobic conditions. In particular, as a carbon source, for example, aerobic in a liquid medium containing one or more carbon sources such as glycerol, D-mannitol, D-fructose, L-sorbose or xylitol together with other various nutrient sources. It is desirable to culture.
[0009]
Bacteria (viable cells) obtained by the culture method as described above are brought into contact with an aqueous solution containing allitol, preferably under aerobic conditions such as shaking, agitation and oxygen injection, and the sugar The quality can be converted to L-psicose.
[0010]
The bacteria used for this conversion need not be limited to the state of viable cells isolated from the culture solution. For example, bacteria, agar, gelatin, alginate in which viable cells are enclosed in a semipermeable membrane hollow fiber. It is also convenient to repeatedly use it for the conversion from allitol to L-psicose as bacteria or the like that are included in various shapes such as beads and sheets.
[0011]
The aqueous solution containing L-psicose produced and accumulated by the various methods described above is separated from bacteria and collected by an appropriate separation method, for example, a method such as centrifugation or filtration.
[0012]
The obtained L-psicose aqueous solution is purified by a method such as desulfurization by ammonium sulfate salting-out, zinc hydroxide adsorption, deproteinization by activated carbon adsorption, H-type, OH-type ion exchange resin, if necessary, The syrup-like L-psicose product can be collected by concentration. Further, column chromatography using an ion exchange resin, for example, trade names “Dawex 50WX4” and “Dawex WGR” manufactured by Dow Chemical Company, “Amberlite XT-1008” and “Amberlite XT-1008” manufactured by Tokyo Organic Chemical Industry Co., Ltd. High purity standards of 99% or higher by fractionation, purification, and concentration by column chromatography using Amberlite IRA 47, trade names “Diaion SK106”, “Diaion WA11” manufactured by Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd. Goods can also be obtained easily.
[0013]
The L-psicose produced in this way is usually obtained in a yield of about 70 w / w% or more based on the raw material allitol, and is suitable as an industrial production method for supplying a large amount at a low cost. Therefore, L-psicose can be freely used as a raw material, an intermediate or the like in the food industry, pharmaceutical industry, chemical industry and the like.
[0014]
Examples will be described below.
[0015]
[Example 1]
100 ml each of a culture solution consisting of 2 w / v% tryptosome broth, 1 w / v% glycerol and deionized water was placed in 10 500 ml shake flasks, autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes, cooled, and Gluconobacter frateurii) IFO 3254 was inoculated by one platinum loop, and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days.
[0016]
After culturing, the cells are collected by centrifugation, and about 10 g of the obtained viable cells are added to and mixed with 100 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 5 w / v% allitol. Aliquots were converted to L-psicose by dispensing into 500 ml shake flasks and shaking at 30 ° C. for 20 hours. The bacteria were then removed by centrifugation.
[0017]
The resulting supernatant was adjusted to pH 7.6 by adding 1/10 volume of 25 w / v% zinc sulfate, and centrifuged to collect the supernatant. The supernatant was decolorized using activated carbon according to a conventional method, and then “Diaion SK1B” (H type, trade name manufactured by Mitsubishi Chemical Industries) and “Diaion WA30” (OH type, Mitsubishi Chemical Industries). The product was desalted using a product name of Co., Ltd. and concentrated under reduced pressure to obtain about 60% of transparent syrup. Furthermore, L-psicose was collected as pure syrup by purification and concentration by column chromatography using “Dawex 50WX4” (calcium-type cation exchange resin, trade name manufactured by Dow Chemical Company). The yield of L-psicose to allitol was about 70% per solid.
[0018]
In order to identify the product obtained in this way, the physicochemical properties were examined by experiment, and the properties were compared with literature values, or compared with the measured values of the reagent D-psicose commercially available as a standard substance by Sigma. did.
[0019]
(1) Measurement of specific rotation Measured value of this product [α] ²⁰ _D = −3.0 (c = 10%, H ₂ O)
Literature value of D-psicose [α] ²⁰ _D = + 3.1 (c = 10%, H ₂ O)
Literature: Chapman and Hall, "Dictionary of Organic Compounds", page 4816 (1982)
[0020]
(2) ¹³ to measure the ¹³ C-NMR measurement of this product C-NMR, "Biochemistry (Biochemistry)", Vol. 13, according to the methods described in Section 146 to page 153 (1974) As a result, the chemical shift was in good agreement with the standard D-psicose literature values as shown in Table 1.
[0021]
[Table 1]

[0022]
(3) Analysis by high performance liquid chromatography This product was subjected to high performance liquid chromatography (880-PU manufactured by JASCO Corporation; column, Hitachi GL-C611; eluent, 10 ⁻⁴ M sodium hydroxide, 60 ° C .; flow rate, 1 ml / min; detection, Shimadzu RID-6A), the elution position is 28, which is the same as that of reagent D-psicose, unlike ketohexose such as reagent D-tagatose, D-fructose, and D-sorbose. 6 minutes.
[0023]
As is clear from the above results, for the measurement of ¹³ C-NMR, the chemical shift agrees well with the literature value of D-psicose, and for high performance liquid chromatography, it agrees well with the value of reagent D-psicose, Moreover, although the absolute value of the specific rotation of the D-psicose is in good agreement with the positive and negative values, the product obtained by the method of the present invention is determined to be L-psicose. Is done.
[0024]
This product can be advantageously used not only as a reagent as a rare carbohydrate, but also as a raw material and an intermediate for food industry, pharmaceuticals, chemical industry and the like.
[0025]
【The invention's effect】
As is clear from the above, the present invention establishes a method for easily producing L-psicose, which has been extremely difficult to obtain in the past, by a biochemical method. In particular, it has been found that L-psicose can be produced using a sugar alcohol called allitol using a microorganism belonging to the genus Gluconobacter as a raw material, which is extremely advantageous for a method for producing L-psicose. That is, since allitol as a raw material can be easily obtained by the reduction reaction of D-psicose, it can be advantageously used for production of a large amount of L-psicose.
[0026]
Therefore, the method of the present invention is suitable as an industrial production method of L-psicose, facilitates large-scale and inexpensive supply, and is not only used as a reagent as a rare carbohydrate, but also in the food industry, which could not be predicted in the past, It opens the way for use in the pharmaceutical and chemical industries.

Claims

A method for producing L-psicose, characterized in that L-psicose is produced by bringing a bacterium belonging to the genus Gluconobacter and having an ability to produce L-psicose from allitol into contact with an aqueous solution containing allitol. .

The method for producing L-psicose according to claim 1, wherein the bacterium belonging to the genus Gluconobacter is Gluconobacter frateurii IFO3254.