JP3706890B2 - 試料中の生物を検出する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明は、試料中に生物又は有機体が存在するかどうかを検出又は分析するための、改良された試料分析方法に関する。より詳しくは、本発明は非常に低レベル、即ち、約１個の細胞の存在まで低レベルで、微生物やウィルスなどの生物又は有機体を検出することを可能とする、試料中の生物又は有機体の検出又は分析の為の改良方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
微生物やウィルスなどの生物又は有機体（明細書中単に生物と述べる）は、種々の理由のため、植物、動物及び人の生命に対し重大な役割を行い得る。例えば、細菌微生物は、肉、ワイン、野菜及び乳製品の腐敗に関与し、これらの食物を食べられなくするか又は危険なものにまでしてしまい、スタフェロコッカスオーレウス（黄色ブトウ球菌）又はクロストリジウムボツリナム（ボツリヌス菌）によって生じるような食物毒を引き起こす。他方、細菌は醗酵能力の為、種々の産業に於て重要でもあり得る。特に重大なことは約２００種の細菌が人に対し病原性であるという事実である。例えば侵入性の細菌は幾つかの形態の肺炎、ジフテリア、癩病、ペスト、赤痢、結核、コレラ、破傷風（lockjaw）、破傷風（tetanus）、梅毒、淋病、腸チフス等の人の病気の原因となる。
【０００３】
同様に、ウィルスは感染症で重大な役割をなし得る。例えば人のウィルスによって生じる多くの病気の中で風邪、狂犬病、灰白髄炎、黄色熱、脳脊髄炎、出血熱、インフルエンザ及び他の呼吸病、肝炎、イボ、水痘、帯状膨疹、急性の下痢、発熱性の水泡（単純膨疹）、おたふく風邪、麻疹、風疹、後天的免疫不全症候群（エイズ）、ある種の癌、クロイツフェルトヤコブ病、乳児の胃腸炎等をあげることができる。また、例えばカブ黄班モザイクウィルス、タバコモザイクウィルス、ポテトエックスウィルス等のウィルスは種々の植物病を生じ得る。
【０００４】
同様に、菌類(fungi)は人又は植物に於ける健康問題にとっての重大な原因であり得る。マデュレラ ミセトニ(Madurella mycetoni)黴は足菌腫又は他の足感染を生じ得るものであり、そして多くの菌類型のきのこは、それらの人の命にかかわる結果を生じてしまうことで知られている。
【０００５】
従って、理由は望ましい結果に対する場合も望ましくない結果に対する場合もあるが、種々の環境中の例えば細菌、菌類又はウィルスなどの微生物等の生物の存在を検出できることは非常に重要である。
【０００６】
試料中の微生物又はウィルスの存在の検出のための、培養等を含む色々な種類の検出技術が、何年にもわたって用いられてきた。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）はポリヌクレオチド増幅の為の最近開発された重要かつ強力な技術である。この技術は、例えば米国特許４６８３１９５、４６８３２０２、４８００１５９及び４９６５１８８に開示されている。ＰＣＲは一般に以下のように記載され得る。この技術は、試料中の特定の標的ポリヌクレオチド配列を複製又は増幅するためのインビトロの合成法である。この技術では、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三燐酸、及び２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。それらのオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリヌクレオチド試料の相対する鎖にハイブリダイズし、そして標的ポリヌクレオチド配列中の問題の領域をフランキングするものである。標的配列の実験的な増幅は、鋳型（テンプレート）の変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長（これはサーマルサイクリングステップと一般に呼ばれている）、からなる一連の繰り返される段階によってなされる。そのようなＰＣＲ技術は、約１０⁹倍までもの標的配列の増幅を生じることができ、それにより増幅したものを標的配列に適した検定手順に供することが出来る。しかしながら、ＰＣＲでさえも、必要とされる時間、即ち増幅と複製の為に必要とされる繰り返される段階サイクルの約２時間の為、時間がかかるものである。
【０００７】
従って、微生物又はウィルス等の生物の存在の可能性を測定する為の易しい且つ迅速な試料分析を提供する方法が非常に望まれる。そのような方法が、試料あたり１０００又はそれ以下の生物の水準、より好ましくは約１００又はそれ以下の水準、そしてより好ましくは試料あたり単一の生物の水準を検出出来ることがより望ましい。更に別の目的は、生物のどんな成分も増幅又は複製する必要がなく、従って数多くの場所で迅速に実施出来る検定方法が提供されることである。本発明の更に別の目的は、実施するのが単純であり、複雑な装置を必要とせず、従って現場での使用に適している迅速で簡単な検定手順を提供することである。
【０００８】
【発明のまとめ】
本発明は図面に示される装置に関連づけてある具体例を用いて記載される。
本発明の方法に従うと、試料から標的生物を適当なアフィニティマトリックスによって単離し、単離された標的生物の細胞（セル）を破裂させて全核酸を放出させ、全核酸を加水分解又は消化してモノヌクレオチド又は個々の遊離核酸塩基及び無機ホスフェート（無機燐酸）を形成して検定溶液を形成し、そしてこの検定溶液を遊離核酸塩基又は無機ホスフェートの少なくとも一つの存在について検定し、それによって生物が試料中に存在するかどうかを決定することにより、試料中の標的生物の存在又は非存在が検出される。本発明の好ましい形態では、標的生物は、セル（細胞）の破裂及び加水分解又は消化が起きる前にアフェニティマトリックスからまず解放される。
【０００９】
生物の全核酸を個々の成分に加水分解すること、即ち、核酸塩基と無機ホスフェートにすることは、検定に対し利用出来る分子数を大きく増加する。例えば単一の大腸菌細菌はdsＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の単一分子を含有し、これはおよそ１５ｘ１０⁶分子の個々の核酸塩基と無機ホスフェートに加水分解できる。同様に大腸菌中の無数のＲＮＡ分子はおよそ１００ｘ１０⁶分子の個々の核酸塩基と無機ホスフェートに加水分解出来る。従って単一の大腸菌細菌はおよそ１億１千５００万分子を測定の為にあたえる。
【００１０】
本発明の改良された検定手順によれば人は試料あたり単一の細菌を検出できるか又は試料あたり１００〜１００００個のウィルスの少なさまで検出することが出来る。
【００１１】
【発明の詳細な記載】
本発明の改良された検定手順は、広範囲の生物、特に微生物やウィルスの検出に用いられる。細菌、菌類(fungi)、酵母及びかび(molds)等の微生物は本発明の手順によって検出できる。また、ウィルスは本発明の改良手順によって検出出来る。
【００１２】
本発明に従って検出され得る細菌の単なる例示として次のものが挙げられる。エアロバクター クロアカエ（Aerobacter cloacae汚物好気菌)、サルモネラ コレラエスイス(Salmonella choleraesuis豚コレラ菌)、サルモネラ ティフォーサ(Salmonella typhosa腸チフス菌)、スタフィロコッカス オーレウス(Staphylococcus aureus黄色葡萄球菌)、クロストリジウム ボツリナム(Clostridium botulinumボツリヌス菌)、クロストリジウム シャウボエイ(Clostridium chauvoeiショーボ菌)、クロストリジウム パーフリンゲンス(Clostridium perfringensウェルチ菌)、クロストリジウム テタニイ(Clostridium tetanii破傷風菌)、トレポネーマ パリダム(Treponema pallidum梅毒トレポネーマ)、ブンガラス マルティシンクラス(Bungarus multicinclus雨がさ蛇)、ナイセリア ゴノレイヤ(Neisseria gonorrhea淋菌)、ナジャ ナジャアトラ(Naja naja atraインドコブラ)、ナジャ ニグリコリス(Naja nigricollis)、ビブリオ コレラ(Vibrio choleraeコレラ菌)、コナス ゲオグラファス(Conus geographus)、コナス マグナス(Conus magnus)、ボルデテラ ペルツシス(Bordetella pertussis)、ラクトバシルス ビフィダス(Lactobacillus bifidus)、アルコリゲンネス ファエカレス(Alcoligenes faecales)、フサリウム スポロトリクロイデス(Fusarium sporotricloides)、アネモニア サルカタ(Anemonia sulcata)、デントロアスピス アングスティセプス(Dentroaspis angusticeps)、ストレプトマイセス ベルティシラス(Streptomyces Verticillus)、エセリキア コリ(Escherichia coli大腸菌)など。
【００１３】
本発明の検定手順に従って検出出来るウィルスの単なる例として次のものが挙げられる。ポリオウィルス(polioviruses)、ポリオマウィルス(polyomaviruses)、ポックスウィルス(poxviruses)、コクサッキウィルス(coxsackieviruses)、ロイコウィルス(leukoviruses)、パラインフルエンザウィルス(parainfluenza virus)、細菌ウィルス(bacterial viruses)、脳心筋炎ウィルス(encephalomyocarditis viruses)、リノウィルス(rhinoviruses)、ロタウィルス(rotaviruses)、エボラウィルス、エプスタイン・バールウィルス、アルボウィルス、肝炎ウィルス、感染性いぼウィルス、単純膨疹ウィルス、ラッサ熱ウィルス、呼吸器シンシティアルウィルス、アデノウィルス、ＨＴＬＶ、レトロウィルス、パピロマウィルス、株黄斑モザイクウィルス、ポテトエックスウィルス、タバコモザイクウィルス等。
【００１４】
本発明の検定手順は人、植物又は動物からの生物試料又は環境試料等の広範囲の試料からの生物を検出するために用いることが出来る。生物を含有又は含有すると思われる適当な生物的又は環境的な物質の任意のものを、試料を提供するために用いることが出来る。生物試料の例として、次のものを挙げることができる。限定されるものではないが、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、有機物、腫瘍類及びインビトロ細胞培養液を含めた、個々の動物又は人から単離された組織又は体液。
【００１５】
環境試料として水、排水、土壌、スラッジ廃棄物又は沈降物等であって生物が存在すると疑われているものがあげられる。
【００１６】
試料が提供された後にその試料は他の存在し得る試料中の生物から標的生物を単離するために処理される。この単離は標的生物に対する任意のアフィニティー試薬又は抗体の使用によって達成される。例えば生物の存在について分析されるべき水試料は、標的生物を単離するためにその微生物に対するアフィニティー試薬又は抗体を結合させている、クロマトグラフィーカラム又はフィルター媒体などのアフィニティー（親和性の）マトリックスにかけることができる。当業者は標的生物を試料から単離するために、適当なアフィニティー試薬及びマトリックス又は抗体又はハイブリダイゼーション用のプローブを選択することができることが認められるであろう。適当な親和性の膜（アフィニティー膜）については後に記載する。
【００１７】
次に、単離された標的生物は、知られた方法によってアフィニティーマトリックスから解放又は溶出され、生物の細胞の溶離液が提供され、そしてまた細胞が破裂させられて全（ＤＮＡ及びＲＮＡ）核酸が放出される。生物の細胞の破裂は任意の適当な方法、例えば凍結解凍サイクル、ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）等の洗剤の使用によって、又はＳＤＳの緩衝溶液及び酵素プロテイナーゼＫによって、又は洗剤と共に若しくは洗剤無しにリゾチームによって、又は任意の他の適当な方法によって達成することができるが、多くがこの分野で文献に記載されている。
【００１８】
放出された全核酸は個々の塩基及び無機ホスフェートに加水分解又は消化される。ある場合には、放出された核酸を放出段階の他の成分から分離することが望ましい場合があり、そしてこれはこの分野で知られた手段によって達成されることが認められるであろう。例えば生物から放出された核酸を、特定の生物に対し更に選択的濃縮をするために、適当な核酸ハイブリダイブリゼーションプローブを使用して分離することが出来る。加水分解又は消化は種々の加水分解酵素又はヌクレアーゼ類又はホスファターゼ類、例えばエンドヌクレアーゼ類、エクソヌクレアーゼ類及びアルカリホスファターゼ類を使用することにより達成できる。好ましくはそのような組合わせを用いて加水分解又は消化を促進し、早めることが好ましい。
【００１９】
適当なヌクレアーゼの例として、Ｂａｌ 31、エクソヌクレアージIII、エクソヌクレアージIV、マングビーン(Mung bean)ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼP1、膵臓デオキシリボヌクレアーゼ、RNase A、RNase H、RNase T1、及びヌクレアーゼ S1があげられる。適当なホスファターゼの例として、アルカリホスファターゼ（大腸菌A19）、アルカリホスファターゼ（大腸菌C75）、コウシの小腸アルカリホスファターゼ及びエビアルカリホスファターゼをあげることができる。
【００２０】
全核酸を放出するためのセル破裂操作及び生じる全核酸の加水分解又は消化の為の操作は、適当であるならば組合わせて単一段階にすることができ、実質的に同時に実施することが出来ることが理解される。更に細胞の破裂と生じる全核酸の加水分解又は消化は、望まれるならば標的生物がアフィニティマトリックス上で単離されている間、即ちアフィニティマトリックスから生物が解放される前又は解放されると同時に達成されることが出来る。
【００２１】
標的生物の全核酸の加水分解又は消化によって提供される溶液は、標的生物の存在又は非存在を分析するための検定溶液である。
【００２２】
核酸塩基又は無機ホスフェートの存在につき検定溶液を検定することは、多様な方法で達成出来る。例えば、この検定は約１００万の生物の水準を検出できる半定量的なビジュアルな検定か、又は単一の生物まで検出するための定量的な装置検定フォーマットによるものかのいずれでもあり得る。比較的な検定手段の一つは、例えば上記の米国特許５０１９３５１に開示されており、図１に図解されているようなこの分野で知られている適当な凝集反応スライド検定装置上で実施される凝集反応検定である。検定試験エレメントは全体を参照番号１０であらわす。この試験エレメントは、液受け及び混合ウェル１７を含んでおり、そのウェル１７では検定されるべき検定溶液試料と、標的生物に対する抗体と検体類似体又はコンジュゲートで被覆された粒子を含んでいる適当な試薬が混合される。この混合物は次に上流の毛管入口１５を通って螺旋形の毛管反応トラック１８に入ることができる。この混合物はトラック１４に沿って上流の毛管領域１９、中間の毛管領域２１及び下流の毛管領域２０を通り、下流の毛管出口１６から毛管トラックを出ていき、ビューイングウェル１８の形態のビューイング又は観察領域に入る。ビューイング領域１８にはビューイング領域から気体を排気するための穴２２が設けられることができる。壁２３が液受け及び混合ウェル１７、ビューイング領域１８及び毛管トラック領域１４の周りにのびており、これらの領域の周りに流体密封結合を与えている。毛管トラックを検定溶液と試薬試料が横切ってっ通った後に、ビューイング領域での観察によって凝集の存在又は非存在に従い視覚的に結果が決定されることが出来る。即ち、凝集が無いことは標的生物が陽性であり、凝集が存在することは標的生物が陰性であることである。
【００２３】
本発明の方法の最初の段階に於て、試料から標的生物を単離するのに使用するために多種多様のマトリックスを利用できるが、可能な場合には単離段階を適当な多孔質又は透過性の膜を用いて実施することが好ましい。適当な多孔質の膜及びそのような膜を組込んでいる装置は図２〜６に図解されている。
【００２４】
図２、３及び４に示されているのは全体を参照番号２６で示されるそのような生物単離装置に対するエレメントである。このエレメント２６は、単離装置２８中に収容され保持ハウジング３４によって入口キャップ３０と出口キャップ３２の間に保たれる、適当な多孔質又は透過性の膜２８を含んでいる。入口キャップ３０はほぼ中心に位置する入口３６が設けられており、出口キャップ３２にはほぼ中心に位置する出口３８が設けられている。保持ハウジング３４は入口キャップ３０、透過性の膜２８及び出口キャップ３２の周りに流体密封ハウジングを提供する。透過性の膜２８はより詳しく図４に示されている。
【００２５】
膜２８は透過性の固相物質で作られたディスク４０であり、それ自体は単離されるべき生物に対し不活性である。膜ディスク４０は上面１２及び下面４４を有しており、それを通る穴又は隙間が存在する。生物に対する抗体又はアフィニティー試薬で被覆されている粒子４６が孔又は隙間中にとらえられ、そしてまた膜ディスク４０の上面１２上にも位置している。
【００２６】
膜ディスク４０の孔又は隙間は被覆された粒子４６の直径よりも少なくともわずかに小さい寸法か又は直径のものである。例えば粒子は一般に少なくとも約０．６ミクロン以上の直径を有し、そして孔又は隙間は一般に約０．４〜約０．７ミクロン、好ましくは約０．４〜０．５ミクロンの範囲である。最も好ましくは、粒子は約１００〜２００ミクロンの直径を有し得る。上記ディスクは、反応体に対し不活性な任意の適当な物質、例えば紙、グラスファイバー、綿、セルロース、酢酸セルロース、及び合成重合体物質、例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオロライド等で構成されることが出来る。好ましい膜ディスクは直径が約２５mmであり、少なくとも１００万個の生物の収容力を有し、最も好ましくは上記寸法のグラスファイバー膜ディスクである。上記粒子は広範囲な適当な材料、例えばシリカ又はガラス、セルロース及び合成重合体類で出来ていることができる。好ましい粒の形態はポリスチレンビーズのラテックスである。
【００２７】
粒子は、まず一般的に知られた方法で、共有結合又は非共有結合のいずれかで、標的生物に対する抗体又はアフィニティー試薬に結合される。粒子に被覆されるべき特定の物質の選択は単離されるべき生物によって変わってくるであろう。生物に対する抗体又はアフィニティー試薬等の生物に対する選択的親和性を有する適当な物質が選ばれるであろう。次に手動で操作される注射器５０（図５）等の吸引／射出装置が用いられて孔又は隙間中の被覆された粒子をとらえそして又被覆された粒子を膜ディスク４０の上面に配置させる。
【００２８】
注射器５０は、一方の末端が中心に位置する導管５４を有する管状のハウジング５２からなっており、その導管５４はハウジングから物質を吸引してそして物質を排出する為のものである。管状のハウジングの反対側の末端はショルダー５６で終っている。ハウジング５２内に、Ｏ−リング等の密封手段６０によって管状のハウジング５２の内壁に対し流体密封関係で保たれた、移動できる管状のピストン５２が位置している。ハウジング５２の外側に於ては、ピストン５８は手動で物質を吸引し排出するための適当なハンドル６２が用いられている。
【００２９】
適当な流体媒体中の、抗体又はアフィニティー試薬が被覆されている粒子４６は、導管５４を通って注射器５０のハウジング５２中に吸引され、次にその導管が濃縮装置２６の入口３６（図６）中に配置され、そして被覆された粒子は注射器から濃縮装置中に押出され、被覆された粒子がディスク４０の孔又は隙間に、そしてまたその上面４２に捕らえられ、一方流体媒体はディスク４０を通って適当な収集容器７０に出口３８から出ていく。この注射器は次に入口３６から取り除かれる。
【００３０】
孔及び隙間中にそしてディスクの上面上に位置する被覆された粒子を有している膜ディスク４０は単離装置を通される試料中の実質的に全ての標的生物に結合することができる。
その後、生物を含有することが疑われる試料は同様の注射器５０に吸引され、その注射器は同様に入口３６に取付けられ、そして試料が単離装置２６に押出される。試料中の標的生物はディスク４０の上面にある抗体又はアフィニティー試薬で被覆された粒子と結合し、そして膜ディスクの孔及び隙間中でとらえられ、一方試料中の流体はディスクを透過しそして出口３８を通って流れ、適当な収集容器又は容器７０に至る。
【００３１】
膜ディスク４０上及び膜ディスク４０中の被覆された粒子に結合された生物は、次に単離装置２８の入口３６中に導入される同様な注射器５０からの又は押し潰し可能な容器からの、少量の溶離溶媒で溶離され、被覆粒子から生物を離れさせ、そして遊離された生物を出口３８から適当な収集容器又は容器７０に溶出させる。この溶離溶媒は後で起こる処理又は検定段階と適合性であり、それを干渉しないものでなければならない。
【００３２】
試料からの生物が適当に単離され前記の方法で溶離された後に、この生物は次に本発明に従って処理され、生物の細胞が破裂させられ、全核酸が放出され、全核酸が加水分解又は消化されて遊離核酸塩基と無機ホスフェートにされる。
【００３３】
生物が単離され、その全核酸が放出されて個々の遊離塩基と無機ホスフェートに加水分解された後に生じる検定溶液は、生物が試料中に存在するかどうかを測定するために検定される。この検定は核酸塩基の検定又は無機ホスフェートの検定又は望まれるならば両方の検定であり得る。加水分解の成分が検定分析に干渉し得るので、この検定溶液は検定段階に先立って浄化段階にかけられる必要があるかもしれないことが述べられるべきである。
【００３４】
個々の核酸塩基はこの分野で良く知られた手順に従って、塩基に対する抗体を用いるイムノアッセイ手順の種々の形態を用いて検定されることが出来る。前に示したように検定の好ましい形態は、図１の反応スライド装置を用いる凝集反応である。
【００３５】
別の方法として、検定は検定溶液中の無機ホスフェートに基づいたであり得る。無機ホスフェート（Ｐｉ）に基づいた検定の例として、Ｐｉををアデノシン酸燐酸（ＡＴＰ）に変換し、そして特に化学発光手順によって、ＡＴＰを検出することに基づく検定が挙げられる。ＰｉをＡＴＰに変換することに基づいた検定の例として、カトー等Appl.Envir.Micro.59,3744-49(1993)によって報告されるように、ＡＤＰ、アセチルＣｏＡ及び酵素アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）の存在下でＰｉをＡＴＰに変換し、そしてタンデム反応を用いてＰｉをＡＴＰに変換し、それによってグリセルアルデヒド燐酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び酵素グリセルアルデヒドフォスフェートデヒドロゲナーゼでの存在下での第１の反応Ｐｉが１，３−ジフォオスフォグリセレート、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び水素に変換され、そして第２の反応において、ブンリンドル(Brindle)，K.M.,Biochemistry，27 6187(1988)に報告されるように、１，３−ジフォスフォグリセレートとＡＤＰが３−フォスフォグリセレート及びＡＴＰに変換されることが挙げられる。ＰｉのＡＴＰへの変換の為の好ましい検定法は、ＡＴＰが消費され、そしてルシフェラーゼ（蛍、細菌、又は他の起原のもの）がＤ−ルシフェリンの酸化を触媒するとき発光する際のＡＴＰの定量的な生物蛍光測定であって、例えばシグマケミカルカンパニーのＡＴＰ生物蛍光検定キット及び蛍光計の使用によるものである。生じる光の量は存在するＡＴＰの量と比例し、従って生物から生じた存在するＰｉの量と比例する。
【００３６】
本発明は溶液中の淋菌（ゴノコッカルバクテリア）の検出例によって例示されるがこれに制限されるものではない。
【００３７】
【実施例】
淋菌のアルファ、ベータ、ガンマー、及びデルタ刺毛と交叉反応するモノクローナル抗体がプロテインＡカラム上で精製され、次に０．８ミクロン(um)のラテックスビーズとコンジュゲートに（複合化）された。この抗体を抗体沈殿の為に氷浴中の抗血清に対し等容量の飽和（１００％）硫酸アンモニウムをゆっくりと加えることによって硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮させた。沈殿抗体をｐＨ約７．０＋−０．１に於て燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そして遠心にかけ、約１７mg/mlの抗体の濃度を与えた。
【００３８】
３０％原溶液中の市販されている白色ポリスチレンラテックスミクロ粒子０．８ミクロン(um)を、貯蔵緩衝液を除去するために、約４℃において、ｐＨ６．０＋−０．１で、５０mMメチルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液で４回洗浄した。
【００３９】
精製した抗体を５０mM ＭＥＳ緩衝液で希釈し、そして等容量の一連の希釈された抗体溶液を洗浄されたラテックスミクロ粒子と混合し、そしてラテックス粒子を感受性にするために一夜撹拌した。ラテックス粒子上の非結合場所を、ＭＥＳ緩衝液中の等容量の１００mg/mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を抗体−ラテックスミクロ粒子混合物に加えることによって封じた。封鎖から１時間後、ラテックス−抗体−ＢＳＡ混合物を洗浄し、そして５０mM ＭＥＳ緩衝液中に再懸濁し、そして最終ラテックス溶液を１０％固形分に調節した。
【００４０】
注射器をもちいて０．６mlの１００％固形ラテックス粒子−抗体−ＢＳＡ混合物を注射器中に吸引し、そしてそこから１分あたり０．５mlの流速でガラス繊維膜ディスクを通して排出した。そのガラス繊維膜ディスクは図６に図解されるように濃縮装置中に於て、０．４５ミクロンの孔又は隙間を有するものであり、膜ディスクの孔及び隙間中にそして上面上に結合したラテックス粒子を捕足するものである。その後１mlあたり１０を越える淋菌を含有することが知られている細菌試料溶液５０mlを注射器を用いて１分あたり３〜１０mlの速度でディスクを通して、試料中の細菌を結合させた。
【００４１】
細菌が膜に結合した後、膜を５０mlのＰＢＳ緩衝液で洗浄し、非特異的に結合した微生物の全てを除去した。
【００４２】
５０mMグルコース、０．２M NaOH及び０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含有している溶菌緩衝液をもちいて膜から淋菌を除去した。１mlの溶菌緩衝液を注射器を用いて膜に通し集めた。この膜を氷上で５分間培養し、そして溶菌緩衝液の別の１mlアリコートを膜に通しそして集めた。６０mlの５．０M酢酸カリウム、１１．５mlの氷酢酸及び２８．５mlの水を含有している溶液１．５mlを、集めた溶出液２mlに加え、氷上で更に５分間さらに培養した。等容量（３．５ml）のフェノール／クロロホルムを加え、そしてかきまぜによって混合し、そして上澄みを新たな試験管に移しながら添加混合した。このＤＮＡを室温で２容量のエタノールで沈殿させた。ＤＮＡ試料を１０分間１２，０００RPMで遠心し、上澄みを吸引した。このＤＮＡペレットを乾燥させ、次に７０％エタノール中で濯いだ。核酸を５０マイクロリットルのＴＥ緩衝液（１０mM トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１mM ＥＤＴＡ）中に溶解した。
【００４３】
全てのＤＮＡをそれぞれ１０単位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｉ制限酵素及びＢａｌ３１ヌクレアーゼで消化し、モノヌクレオチド塩基と無機ホスフェートを発生させた。この消化は３７℃で１時間実施された。これが検定溶液である。
【００４４】
試料中のＤＮＡ及びＲＮＡの加水分解からの検定溶液中の個々のヌクレオチドの検定は数多くの方法で実施できる。以下は２つの例示方法、即ちスライド凝集反応とＥＬＩＳＡ検定法によるものを記載したものである。
【００４５】
単離された核酸の検定は１１マイクロリットルの試料検定溶液、約５０マイクロリットルのヌクレオチド−ＢＳＡ被覆ラテックスミクロ粒子、約５０マイクロリットルのヌクレオチドに対する抗体及び反応緩衝液５０マイクロリットルを図１に図解されるような凝集スライド装置の液受け混合ウェル中に入れた。成分をスパチュラで混合し、そしてスライドのビューイング領域に向かって毛管を流下させた。ビューイング領域中の凝集ラテックス粒子の非存在は、ヌクレオチドの存在を確認し、そして間接的に、特異的な淋菌の存在を確認するものである。これとは対象的に、もし試料が核酸を含有しなかったならば、ビューイング領域は凝集が見える筈である。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ検定手順については、５つの個々のヌクレオチドは、リンカーを経て、キャリア蛋白質であるウシチログロブリン（ＢＴＧ）に対し１：７５の比率（ＢＴＧ：ヌクレオチド）で、共有結合的にコンジュゲートにされる（複合体化される）。複合体化は独立した反応として実施される。複合体化キャリア蛋白質は複合体化されていないヌクレオチドを取り除くため、そして望まれる免疫原（イムノゲン）を作り出すために、ＰＢＳに対し徹底的に透析される。複合体を等モル比で一緒に混合し、各免疫化された動物が全ての５つのヌクレオチド塩基に対し抗体を生じるようにする。６ヵ月〜１歳の年齢のヤギ、ヒツジ及びウサギが、完全フロイントアジュバント（流動パラフィンと表面活性剤とを混ぜたものにさらに結核死菌体を加えたもので細胞性免疫を増強する目的で用いられるものが多い）中で乳化されたこれらのイムノゲン３ミリグラムで免疫化される。その後の免疫化は不完全フロイントアジュバント（結核死菌体を加えないもので、抗体産生を増強する目的で用いられるものが多い。）を使用して実施される。このようにして生じさせられた抗ヌクレオチド抗体は、ＢＳＡヌクレオチド被覆プレートに対する結合及び可溶性のヌクレオチド類によって阻害されるべき結合の能力について、ＥＬＩＳＡによって評価される。
【００４７】
９６個のウェルのミクロリットルプレートが、ＢＳＡ中で希釈された５マイクログラム(ug)／mLヌクレオチド−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）複合体（コンジュゲート）５０マイクロリットル(ul)で被覆され、そして室温で２時間培養される。プレートを流しに向かって振ることによってこの液体をプレートから除去し、そしてプレートを吸収紙上で吸取らせることによって除去した。ＰＢＳ／アジド中の１％ＢＳＡの１００mLを各ウェル中に分配し、そしてプレートを１時間室温で培養した。培養に続いてプレートを３回ＰＢＳ／０．０１％ ツイーン２０で洗浄した。２５マイクロリットルの抗ヌクレオチド抗体を、阻害剤としての遊離ヌクレオチドの存在下又は非存在下で、各ウェルに加えた。これらのプレートを被いそして３７℃で１時間培養した。プレートをプレートウォッシャー上で３回洗浄し、そして５０マイクロリットルのアルカリフォスファターゼにコンジュゲートさせられた抗マウス抗体を各ウェルに加えた。これらのプレートを３７℃で１時間培養し、そして次に上記のように洗浄した。この検定をｐＨ９．８でジエタノールアミン緩衝液中に溶解した１mg／mlのパラニトロフェノールフォスフェートの添加によって展開した。プレートを含有している基質を、室温で３０分間培養した。５０マイクロリットルの３M NaOHをウェルに加え、酵素反応を停止させた。プレートを即座に４０５nmで読み取った。
【００４８】
置き換えに対する標準曲線を５つのヌクレオチド、即ちグアニン、アデニン、チミン、シトシン及びウラシルの等モル混合物の添加によって発生させた。次に検定溶液のヌクレオチド含有量を次に標準曲線値の比較に基づいて評価した。
【００４９】
検定溶液中の単離された無機ホスフェートの検定はシグマケミカルカンパニーの検定キット、ストック番号ＦＬ-ＡＡ等のアデノシン-５’-三燐酸（ＡＴＰ）生物蛍光検定キットの使用によって実施する。検定溶液中の単離された無機ホスフェート（Ｐｉ）をまずＡＴＰに変換する。無機フォスフェートは酵素アセテートキナーゼ、コエンザイムＡ及びアデノシン二燐酸の存在下で、当業者に手順に従ってＡＴＰに変換できる。ＰｉのＡＴＰへの変換後、この検定はアッセイキットからの０．１mlのＡＴＰ検定混合物を反応バイヤルに添加し、これを渦巻き撹拌し、約３分間室温で放置して任意のアンドロゲンＡＴＰを加水分解してバックグラウンドを減少させることによって開始される。次に０．１mlの検定溶液を迅速に反応バイヤル中に加え、手短に撹拌し、そして生じる光の量を即座に０．１mlのサンプル希釈液によってつくりだされるバックグラウンドの光と比較して蛍光計で測定し、検定溶液中で無機ホスフェート又はＡＴＰの量に比例した光の量を測定する。検定溶液中の無機ホスフェートによって作られた光の量は試料中に淋菌が存在することのしるしである。
【００５０】
本発明の前記の記載と共に当業者は本発明の精神からそれることなしに発明に対し修正がなされ得ることを認めるであろう。従って本発明の範囲は例示され、記載された特定の具体例に限られるものではないことが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法に有用な凝集反応検定の為の凝集反応検定スライド検定装置の平面図である。
【図２】 標的生物を単離する為の流体密封ハウジング中の透過性膜の透視図である。
【図３】 図２の線３−３に沿った断面図である。
【図４】 図４は図３の膜エレメントの拡大断面図である。
【図５】 図５は本発明の生物単離段階で使用するための圧力差提供装置の部分断面図である。
【図６】 図６は本発明の方法の試料溶液からの生物を単離するための装置の部分断面図である。

Claims (13)

1. 試料中の標的生物の存在を検出する方法であって、
   （１）標的生物を含有し得る試料を準備し、
   （２）該標的生物に対するアフィニティー試薬を取付けたマトリックスにより、該試料から該標的生物を単離し、
   （３）該標的生物のセルを破裂させて全核酸を放出させるよう該単離された標的生物を処理し、
   （４）該標的生物の全核酸を加水分解又は消化して個々の遊離核酸塩基及び無機ホスフェートとし、検定溶液を形成し、そして
   （５）該標的生物が該試料中に存在するかどうかを決定するために（ａ）遊離核酸塩基又は（ｂ）無機ホスフェートの少なくとも１つの存在について該検定溶液を検定することからなる方法。
2. 該標的生物のセルを破裂させ全核酸を放出させるように該単離された標的生物を処理する前に、該アフィニティーマトリックスから単離された該標的生物を解放させることを含んでいる請求項１に記載の方法。
3. 検定段階（５）が、遊離核酸塩基の存在を、その塩基に対する抗体を用いて検定することからなる請求項２に記載の方法。
4. 検定段階（５）が、検定溶液の無機ホスフェートをアデノシン三燐酸に転換し、アデノシン三燐酸の存在を検出することによって検定することからなる請求項２に記載の方法。
5. アデノシン三燐酸が消費されルシフェラーゼ酵素がD-ルシフェリンの酸化を触媒するときに光を発する、ルシフェラーゼ検定でアデノシン三燐酸の存在が検出される請求項４に記載の方法。
6. アデノシン三燐酸の量がルシフェラーゼ検定で生じる光の量によって決定される請求項５に記載の方法。
7. 検定段階（５）が化学発光段階を含む請求項２に記載の方法。
8. 生物が細菌、菌類（fungus)、又はウィルスである請求項２に記載の方法。
9. 生物がエセリキヤ(Escherichia)、ナイセリヤ(Neisseria)、サルモネラ(Salmonella)、スタフェロコッカス(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、トレポネマ(Treponema)、クラミジア(Chlamydia)、ヘモフィラス(Haemophilus)、ビブリオ(Vibrio)、ボルデテラ(Bordetella)、ラクトバシルス(Lactobacillus)、シジェラ(Shigella)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、及びパスツーレラ(Pasteurella)細菌からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
10. 生物がレトロウィルス(retrovirus)、パラインフルエンザウィルス(parainfluenza virus)、ロイコウェルス(leukovirus)、細菌ウィルス(bacterial virus)、脳心筋炎ウィルス(encephalomyocarditis virus)、リノウィルス(rhinovirus)、コクサッキーウィルス(coxsackievirus)、エボラウィルス(Ebola virus)、東部型馬脳脊髄炎ウィルス(eastern equine encephalomyelitis virus)、エプスタインバールウィルス(Epstein-Barr virus)、肝炎ウィルス(hepatitis virus)、ヘルペスウィルス(herpes virus)、感染性イボウィルス(infectious wart virus)、ラッサ熱ウィルス(Lassa fever virus)、呼吸器シンシチアウィルス(respiratory syncytial virus)、アデノウィルス(adenovirus)、カブ黄斑モザイクウィルス(turnip yellow mosaic virus)、ポテトＸウィルス(potato X virus)、及びタバコモザイクウィルス(tabacco mosaic virus)からなる群から選択されるウィルスである請求項８に記載の方法。
11. 検定段階（５）が反応スライド上で実施される凝集反応検定からなる請求項２に記載の方法。
12. 単離段階（２）が、該試料を膜と接触させることからなっており、該膜は、孔又は隙間を中に有しており、そして該膜がラテックス粒を有し、該ラテックス粒が、該膜の表面上及び該孔及び該隙間中に位置し、且つ該生物に対するアフィニティ試薬で被覆されている、請求項２に記載の方法。
13. アフィニティ試薬が生物に対する抗体である請求項１２に記載の方法。

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