JP3696267B2

JP3696267B2 - Method for stabilizing bioactive protein

Info

Publication number: JP3696267B2
Application number: JP05525394A
Authority: JP
Inventors: 則彦倉橋; 茂樹木村; 兼房加藤
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 2005-09-14
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: JPH07236483A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生理活性蛋白質の安定化方法に関する。より詳細にはクリスタリン（Crystallin）を生理活性蛋白質の溶液に含有せしめることによる、該生理活性蛋白質を安定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より各種の生理活性蛋白質及び生理活性ペプチドが報告されている。しかしながらそれらは熱などに対して不安定なものが多く、安定性を十分に確保するための様々な試みがなされている。
【０００３】
例えば酵素は、温和な条件で触媒作用を示す為、従来より、臨床検査、生化学、食品工業等の分野で酵素の利用が盛んに行われている。特に臨床検査分野において用いられる各種生体成分測定用キットでは、従来は凍結乾燥した酵素を含有する試薬を、用時適当な緩衝液などで溶解して酵素溶液とし、用手法或いはオートアナライザーによる生体成分測定に適用していた。
【０００４】
この溶解して得られた酵素含有試薬は測定に使用する場合の温度、化学物質、他の蛋白質等の影響を受けやすく、長期の使用を可能ならしめるために試薬中の酵素の安定性を高める目的で、従来より各種の添加剤が検討されてきた。更に、最近になって、緩衝液中に測定に必要な試薬類を既に溶解してそのままオートアナライザー等に適用できる、いわゆる液状試薬なるキットの要望が高まっている。
【０００５】
これまでは、酵素試薬などは凍結乾燥した形態で供給されることが常であったため、凍結乾燥時に酵素の失活、変性を防止する方法について種々研究がなされてきている。例えばグルタミン酸ソーダ、アルブミン、スキムミルク等のアミノ酸又は蛋白質、シュクロース、マルトース等の糖類、グルタチオン、メルカプトエタノール等の還元剤、グリセロール、ソルビトール等の多価アルコールをそれぞれ添加する方法等が一般的な酵素の安定化方法として知られている。
【０００６】
また、溶液中での安定化効果を発揮する添加物としては、酵素毎に種々の組み合わせが報告されている。例えば、リン酸塩とグルコースオキシダーゼを組み合わせる方法（特開平3-139278）、アデノシン三リン酸とグリセロールキナーゼを組み合わせる方法（特開昭59-21390）、ＦＡＤ、キレート剤とＬ−α−グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭59-14788）、シュウ酸、フタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルタル酸などとグリセロリン酸オキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭60-126084）、グリセリン、ヨウ化カリウム、界面活性剤等の特定割合とコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭57-79885）、マグネシウムイオンとコレステロールエステラーゼを組み合わせる方法（特公昭61-21076）、アルコキシフェノールとペルオキシダーゼの組み合わせ（特開昭64-63380）、アミノピリンとペルオキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭61-224987）などが挙げられる。
【０００７】
一般的な酵素に適用できる方法としては、デキストラン等の水溶性高分子を酸化したのち還元剤でアルデヒド体とし、このものに酵素を共有結合で固定化させる安定化方法（特開昭64-60380）がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記に述べたように、酵素溶液に安定化剤を添加する方法は、酵素の種類により、添加する安定化剤が異なるのが一般的であり、酵素の種類により添加する安定化剤を選択する必要があった。又、安定化剤の安定化作用は、酵素との非特異的な相互作用によることが多く、そのために高濃度に添加する必要があった。
【０００９】
また、各種の酵素を特異的に安定化する効果のある添加物が、酵素を用いた臨床検査用キットに添加された場合、オートアナライザーを用いた多項目検査においては、その測定に支障を与えることがあり、使用が制限される等の問題点を有していた。例えば、コレステロールエステラーゼの安定化剤としてのマグネシウムイオンの添加は、同一セルを用いるオートアナライザーにおいてはマグネシウムの測定にプラスの誤差を与え、グルコースオキシダーゼの安定化にリン酸塩を使用したキットは同様に無機リンの測定に誤差を与えることとなる。
【００１０】
また、汎用性のある安定化剤としての牛血清アルブミンは濁りの発生、腐敗等の問題があった。
【００１１】
このように、溶液中の酵素の変性を防止し、更に活性の低下を防ぎ、長期間安定化する方法で、なおかつ他の測定系に影響を与えない効率的で汎用的な方法は従来は知られていなかった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、溶液中で生理活性蛋白質を安定化する効率的且つ汎用的方法を求め鋭意検討した。そして、生理活性蛋白質溶液中にクリスタリンを添加することにより、効率的且つ汎用的に生理活性蛋白質を安定化できることを知り、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は生理活性蛋白質にクリスタリンを添加し、生理活性蛋白質とクリスタリンとの特異的な相互作用により生理活性蛋白質を安定化する方法に関する。
【００１４】
本発明の対象とする生理活性蛋白質としては、酵素や各種の生理活性ポリペプチド等であり、とりわけ酵素を対象として安定化する効果が認められる。
【００１５】
酵素は動物、植物及び微生物由来のいずれでもよく、その種類としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素等のいずれでもよい。また、酵素の分子量、１次構造、２次構造、立体構造、４次構造（オリゴマー状態）の違いにも左右されない。
【００１６】
より具体的に示すと、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、アシラーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、アシルCoAオキシダーゼ、アシルCoAシンセターゼ、ビリルビンオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロフォスフェイトオキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、リポプロテインリパーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ムタロターゼ、ペルオキシダーゼ等を対象とすることができる。
【００１７】
本発明の対象となる生理活性蛋白質溶液の濃度としては特に限定されるものではないが、溶液状態であれば通常例えば数μg/mlから数mg/mlの範囲である。
【００１８】
本発明に使用するクリスタリンとは、動物の水晶体に特異的に存在する蛋白であり、レンズの透明度を維持する役目がある蛋白として知られている。このクリスタリンはα−クリスタリンとβ−クリスタリンの２形がほぼ等量に存在するとされ、魚類、両生類、ほ乳類のレンズにはこのほかにγ−クリスタリンも含まれている。また爬虫類、鳥類の場合にはδ−クリスタリンがあることが知られている。更に、α−クリスタリンはαＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン等に分類されている。
【００１９】
これらのクリスタリンは、ヒート・ショック・プロテイン（heat shock protein）の一種であり、最近は水晶体以外の組織にも存在が確認され、その作用が注目されている。
【００２０】
本発明には、何れの起源からのクリスタリンも使用できるが、供給源の安定性から動物眼球由来のクリスタリンが利用できる。また、より好ましくは、α−クリスタリンが挙げられる。
【００２１】
クリスタリンは、例えば新鮮な牛の眼球よりProc. Natl. Acad. Sci. USA 89巻, 10449-10453頁（1992）記載の方法によって調製することができる。
【００２２】
その精製度合いは、本発明である生理活性蛋白質を安定化させる効果が発揮される程度であればよく、その添加量としては特に限定されない。
【００２３】
溶液状態の酵素に対する添加量について具体的に挙げれば、通常、酵素の0.01倍モル濃度以上で使用する。より好適には、0.05〜１倍モル濃度で使用する。
【００２４】
クリスタリンは、上記記載したように単一の生理活性蛋白質の安定化効果を発揮するばかりでなく、複数の生理活性蛋白質成分を含有する場合においても効果を発揮することができる。例えば、複数の酵素反応を利用して生体成分を測定する臨床検査用キット組成においても各酵素による相互の影響を回避することができる。
【００２５】
即ち、通常臨床検査用に使用される酵素は通常は充分に精製されているが、僅かに夾雑する雑蛋白やキット系に含まれる他の成分（例えば、界面活性剤等）、他の酵素（共役酵素等）が相互に影響を及ぼしあい、キットでは酵素単独よりもその酵素活性が不安定になることが多く、更に液状試薬では濁りを発生することも多い。
【００２６】
本発明の方法はこれらの影響に対して、キット系での配合された各種酵素間での相互作用による活性の低下や濁りの発生等をも押さえることができる。
【００２７】
また、クリスタリンを添加した酵素は溶液状態のみならず、凍結乾燥時の失活を防ぐこともでき、凍結乾燥品の溶解時に発生しやすい濁りの生成を防ぐことも可能である。
【００２８】
更にまた、クリスタリンはそれ自体が生理活性を有するものではないため、クリスタリンを配合した場合でも主たる活性を阻害したり、他に影響を及ぼすこともなく、全ての生理活性蛋白質に適用することが可能である。
【００２９】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
尚、各実施例における各種の酵素活性は以下のようにして測定した。
▲１▼コレステロールデヒドロゲナーゼ活性測定法
コレステロール溶液（１mg／ml）２ml、pH8.5のβ-NAD⁺溶液（３mg／ml）１mlに酵素溶液0.1mlを加え25℃で反応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのNADHを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３１】
▲２▼コレステロールエステラーゼ活性測定法
リノール酸コレステロール溶液（0.4mg／ml）１ml、pH7.0の発色試薬（0 .3mg／ml アミノアンチピリン、１mg/ml フェノール、３u/ml ペルオキシダーゼ、0.5u/ml コレステロールオキシダーゼ）２mlに酵素溶液0. 1mlを加え37℃で反応し、500nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのコレステロールを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３２】
▲３▼Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性測定法
発色試薬（アミノアンチピリン0.6mg／ml、フェノール1.5mg／ml及びペルオキシダーゼ４単位／ml）1.5ml、pH７のDL−α−グリセロリン酸２Na・６ H₂O溶液（0.65mg／ml）1.5mlに酵素溶液0.1mlを加え37℃で反応し、505n mの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのH₂O₂を生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３３】
▲４▼グリセロールキナーゼ活性測定法
ATP-2Na（３mg／ml）１ml、pH9.8のβ-NAD⁺溶液（１mg／ml）１ml、グリセロール溶液（9.2mg／ml）１ml及びG-3PDH（1700単位／ml）0.02mlに酵素溶液0.1mlを加え25℃で反応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのNADHを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３４】
【実施例】
実施例１コレステロールデヒドロゲナーゼのクリスタリンによる安定化効果
以下の試薬組成において37℃でのコレステロールデヒドロゲナーゼの安定性を測定した。

クリスタリンの添加量：コレステロールデヒドロゲナーゼの1/10モル量
測定時間：１〜４時間
その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】

【００３６】
明らかにクリスタリンを添加することによってコレステロールデヒドロゲナーゼの活性が安定化されている。また、クリスタリンが添加されていない試料溶液は濁りを生じたが、クリスタリンを添加した試料溶液については全く濁りの生成は認められなかった。
【００３７】
実施例２Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼのクリスタリンによる安定化効果
以下の試薬組成において37℃でのＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの安定性を測定した。

クリスタリンの添加量：Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの 1/10モル量
測定時間：１〜６日
その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】

【００３９】
明らかにクリスタリンを添加することによってＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの活性が安定化されている。
【００４０】
実施例３コレステロールエステラーゼのクリスタリンによる安定化効果
以下の試薬組成において37℃でのコレステロールエステラーゼの安定性を測定した。

上記の試薬組成に10mMのコール酸ナトリウムを加えた場合と10mMのコール酸ナトリウムとクリスタリンを1/10Ｍ添加した場合を比較した。
測定時間：１〜３日
その結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】

【００４２】
クリスタリンを添加することによってコール酸ナトリウム添加によるコレステロールエステラーゼの活性低下を防止することができることが明らかである。
【００４３】
実施例４グリセロールキナーゼ、ペルオキシダーゼ及びＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを添加したキット系での各酵素のクリスタリンによる37℃での安定化効果
対象として単独の酵素についてクリスタリンの効果を測定した。

その結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】

【００４５】
クリスタリンを添加することによって各酵素は安定化する。グリセロールキナーゼ及びペルオキシダーゼは元来比較的安定なためクリスタリンの効果としては明確にでていない。しかしながら、Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼついては、実施例２と同様に試薬組成が変化してもその安定性を改善する効果は明らかである。
【００４６】
上記の各酵素を配合したキット系の処方におけるクリスタリンの効果を測定した。使用した酵素及び試薬組成は上記と同一にした。尚、クリスタリンの添加量は酵素総量の1/10モル量とした。
その結果を表５に示す。
【００４７】
【表５】

【００４８】
クリスタリンを添加しないキット系においては配合した酵素が相互に作用し、クリスタリンを添加しない場合の酵素単独の場合よりも酵素の安定性が低下している。それと比較して、クリスタリンを添加したキット系では酵素単独にクリスタリンを添加する効果と同様な安定性が得られる。更に、ＡＴＰなどの安定性も改善されている。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により生理活性蛋白質の安定性が改善され、更に各々の酵素が相互に及ぼす影響も回避することができ、臨床検査分野に用いる臨床検査用の酵素試薬の液状での安定性を改善することができる。また、クリスタリンは測定系に影響を及ぼさないため、いずれの系にも安定剤として広く使用することができる。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for stabilizing a physiologically active protein. More specifically, the present invention relates to a method for stabilizing a physiologically active protein by incorporating crystallin into the solution of the physiologically active protein.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, various physiologically active proteins and physiologically active peptides have been reported. However, many of them are unstable with respect to heat and the like, and various attempts have been made to ensure sufficient stability.
[0003]
For example, since an enzyme exhibits a catalytic action under mild conditions, the enzyme has been actively used in fields such as clinical examination, biochemistry, and food industry. Particularly, in various biological component measurement kits used in the clinical laboratory field, conventionally, a reagent containing a freeze-dried enzyme is dissolved in an appropriate buffer solution at the time of use to obtain an enzyme solution, and the biological component obtained by the method or autoanalyzer is used. It was applied to the measurement.
[0004]
The enzyme-containing reagent obtained by dissolution is easily affected by temperature, chemical substances, and other proteins used for measurement, and increases the stability of the enzyme in the reagent to enable long-term use. For the purpose, various additives have been studied conventionally. Furthermore, recently, there has been a growing demand for kits that are so-called liquid reagents that can be used in autoanalyzers and the like by dissolving reagents necessary for measurement in a buffer solution.
[0005]
Until now, since enzyme reagents and the like have been usually supplied in a lyophilized form, various studies have been made on methods for preventing inactivation and denaturation of enzymes during lyophilization. For example, amino acids or proteins such as sodium glutamate, albumin and skim milk, sugars such as sucrose and maltose, reducing agents such as glutathione and mercaptoethanol, and methods of adding polyhydric alcohols such as glycerol and sorbitol, etc. It is known as a stabilization method.
[0006]
Moreover, various combinations have been reported for each enzyme as an additive that exhibits a stabilizing effect in a solution. For example, a method of combining phosphate and glucose oxidase (JP-A-3-139278), a method of combining adenosine triphosphate and glycerol kinase (JP 59-21390), FAD, chelating agent and L-α-glycerol-3 -Method of combining phosphate oxidase (Japanese Patent Laid-Open No. 59-14788), Method of combining oxalic acid, phthalic acid, malic acid, α-ketoglutaric acid and glycerophosphate oxidase (Japanese Patent Laid-Open No. 60-126084), glycerin, iodide Method of combining cholesterol esterase and cholesterol oxidase with a specific ratio of potassium, surfactant, etc. (Japanese Patent Publication No. 57-79885), Method of combining magnesium ion and cholesterol esterase (Japanese Patent Publication No. 61-21076), Combination of alkoxyphenol and peroxidase ( JP-A-64-63380), aminopyrine And a method of combining peroxidase (Japanese Patent Laid-Open No. 61-224987).
[0007]
As a method applicable to general enzymes, there is a stabilization method in which a water-soluble polymer such as dextran is oxidized and then converted into an aldehyde form with a reducing agent, and the enzyme is covalently immobilized on this (Japanese Patent Laid-Open No. 64-60380). )
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in the method of adding a stabilizer to an enzyme solution, the stabilizer to be added is generally different depending on the type of enzyme, and the stabilizer to be added is selected depending on the type of enzyme. There was a need. In addition, the stabilizing action of the stabilizer is often due to non-specific interaction with the enzyme, and for this purpose, it has been necessary to add it at a high concentration.
[0009]
In addition, when additives that have the effect of specifically stabilizing various enzymes are added to clinical test kits that use enzymes, this may hinder measurement in multi-item tests using an autoanalyzer. In some cases, the use is limited. For example, the addition of magnesium ion as a stabilizer for cholesterol esterase gives a positive error in the measurement of magnesium in an autoanalyzer that uses the same cell, and a kit that uses phosphate to stabilize glucose oxidase is similar. An error will be given to the measurement of inorganic phosphorus.
[0010]
Further, bovine serum albumin as a general-purpose stabilizer has problems such as turbidity and decay.
[0011]
Thus, an efficient and versatile method that prevents denaturation of the enzyme in the solution, further prevents a decrease in activity, and stabilizes for a long period of time and does not affect other measurement systems has been conventionally known. It was not done.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have eagerly studied for an efficient and versatile method for stabilizing a physiologically active protein in a solution. Then, by adding crystallin to the physiologically active protein solution, it was found that the physiologically active protein can be efficiently and universally stabilized, and the present invention was completed.
[0013]
That is, the present invention relates to a method for stabilizing a physiologically active protein by adding crystallin to the physiologically active protein and performing a specific interaction between the physiologically active protein and crystallin.
[0014]
Examples of the physiologically active protein targeted by the present invention include enzymes and various physiologically active polypeptides, and in particular, the effect of stabilizing the enzyme as a target is recognized.
[0015]
The enzyme may be derived from animals, plants, or microorganisms, and may be any of oxidoreductase, transferase, hydrolase, and the like. Moreover, it is not influenced by the difference in the molecular weight, primary structure, secondary structure, three-dimensional structure, and quaternary structure (oligomer state) of the enzyme.
[0016]
More specifically, lipase, amylase, protease, cellulase, catalase, acylase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, acyl CoA oxidase, acyl CoA synthetase, bilirubin oxidase, cholesterol dehydrogenase, glucose dehydrogenase, glycerol kinase, L- α-glycerophosphate oxidase, lactate dehydrogenase, lipoprotein lipase, malate dehydrogenase, mutarotase, peroxidase and the like can be targeted.
[0017]
The concentration of the physiologically active protein solution that is the subject of the present invention is not particularly limited, but is usually in the range of, for example, several μg / ml to several mg / ml in the solution state.
[0018]
The crystallin used in the present invention is a protein specifically present in the lens of an animal, and is known as a protein having a role of maintaining the transparency of the lens. This crystallin is said to be present in approximately equal amounts of α-crystallin and β-crystallin, and fish, amphibians and mammal lenses also contain γ-crystallin. In the case of reptiles and birds, it is known that there is δ-crystallin. Furthermore, α-crystallin is classified into αA-crystallin, αB-crystallin and the like.
[0019]
These crystallins are a type of heat shock protein, and recently their presence has been confirmed in tissues other than the lens, and their action has attracted attention.
[0020]
In the present invention, crystallins from any source can be used, but crystallins derived from animal eyeballs can be used because of the stability of the source. More preferably, α-crystallin is used.
[0021]
Crystallin can be prepared, for example, from a fresh bovine eyeball by the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-10453 (1992).
[0022]
The degree of purification is not particularly limited as long as the effect of stabilizing the physiologically active protein of the present invention is exhibited.
[0023]
If it adds concretely about the addition amount with respect to the enzyme of a solution state, it will normally be used by 0.01 times or more molar concentration of an enzyme. More preferably, it is used in a molar concentration of 0.05 to 1 times.
[0024]
As described above, crystallin not only exhibits the effect of stabilizing a single physiologically active protein, but also when it contains a plurality of physiologically active protein components. For example, the mutual influence by each enzyme can be avoided also in the kit composition for clinical examination which measures a biological component using a some enzyme reaction.
[0025]
That is, the enzyme usually used for clinical tests is usually sufficiently purified, but it is slightly contaminated protein, other components (for example, surfactants) contained in the kit system, other enzymes ( Conjugated enzymes and the like) affect each other, and in the kit, the enzyme activity is often more unstable than in the enzyme alone, and the liquid reagent is often turbid.
[0026]
With respect to these effects, the method of the present invention can also suppress the decrease in activity and the occurrence of turbidity due to the interaction between various enzymes blended in the kit system.
[0027]
Moreover, the enzyme to which crystallin is added can prevent inactivation at the time of freeze-drying as well as in a solution state, and it is also possible to prevent generation of turbidity that tends to occur when a freeze-dried product is dissolved.
[0028]
Furthermore, since crystallin itself does not have physiological activity, even when crystallin is added, it can be applied to all physiologically active proteins without inhibiting the main activity or affecting other factors. It is.
[0029]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to these.
[0030]
In addition, the various enzyme activities in each Example were measured as follows.
(1) Cholesterol dehydrogenase activity measurement method 2 ml of cholesterol solution (1 mg / ml), 0.1 ml of enzyme solution to 1 ml of β-NAD ⁺ solution of pH 8.5 (3 mg / ml), react at 25 ° C, and measure absorbance at 340 nm To do. The amount of enzyme required to produce 1 μmole of NADH per minute is defined as 1 unit.
[0031]
(2) Cholesterol esterase activity measurement method 1 ml of linoleic acid cholesterol solution (0.4 mg / ml), pH 7.0 coloring reagent (0.3 mg / ml aminoantipyrine, 1 mg / ml phenol, 3 u / ml peroxidase, 0.5 u / ml cholesterol Add 0.1 ml of enzyme solution to 2 ml of oxidase), react at 37 ° C, and measure the absorbance at 500 nm. The amount of enzyme required to produce 1 μmole of cholesterol per minute is defined as 1 unit.
[0032]
(3) Method for measuring L-α-glycerophosphate oxidase activity Color reagent (aminoantipyrine 0.6 mg / ml, phenol 1.5 mg / ml and peroxidase 4 units / ml) 1.5 ml, pH 7 DL-α-glycerophosphate 2Na · 6 Add 0.1 ml of enzyme solution to 1.5 ml of H ₂ O solution (0.65 mg / ml), react at 37 ° C., and measure the absorbance at 505 nm. The amount of enzyme required to produce 1 μmole of H ₂ O ₂ per minute is defined as 1 unit.
[0033]
(4) Glycerol kinase activity measurement method
Enzyme solution in 1 ml of ATP-2Na (3 mg / ml), 1 ml of β-NAD ⁺ solution of pH9.8 (1 mg / ml), 1 ml of glycerol solution (9.2 mg / ml) and 0.02 ml of G-3PDH (1700 units / ml) Add 0.1 ml, react at 25 ° C, and measure absorbance at 340 nm. The amount of enzyme required to produce 1 μmole of NADH per minute is defined as 1 unit.
[0034]
【Example】
Example 1 Stabilizing effect of cholesterol dehydrogenase by crystallin The stability of cholesterol dehydrogenase at 37 ° C. was measured in the following reagent composition.

Addition amount of crystallin: 1/10 molar amount of cholesterol dehydrogenase Measurement time: 1 to 4 hours The results are shown in Table 1.
[0035]
[Table 1]

[0036]
Apparently, the activity of cholesterol dehydrogenase is stabilized by adding crystallin. The sample solution to which no crystallin was added was turbid, but no turbidity was observed in the sample solution to which crystallin was added.
[0037]
Example 2 Stabilizing effect of L-α-glycerophosphate oxidase by crystallin The stability of L-α-glycerophosphate oxidase at 37 ° C. was measured in the following reagent composition.

Addition amount of crystallin: 1/10 molar amount of L-α-glycerophosphate oxidase Measurement time: 1 to 6 days The results are shown in Table 2.
[0038]
[Table 2]

[0039]
Apparently, the activity of L-α-glycerophosphate oxidase is stabilized by adding crystallin.
[0040]
Example 3 Stabilization effect of cholesterol esterase by crystallin The stability of cholesterol esterase at 37 ° C. was measured in the following reagent composition.

The case where 10 mM sodium cholate was added to the above reagent composition was compared with the case where 10 mM sodium cholate and crystallin were added 1/10 M.
Measurement time: 1 to 3 days.
[0041]
[Table 3]

[0042]
It is clear that the addition of crystallin can prevent a decrease in cholesterol esterase activity due to the addition of sodium cholate.
[0043]
Example 4 The effect of crystallin on a single enzyme was measured as an object of stabilization at 37 ° C. with crystallin of each enzyme in a kit system to which glycerol kinase, peroxidase and L-α-glycerophosphate oxidase were added.

The results are shown in Table 4.
[0044]
[Table 4]

[0045]
Each enzyme is stabilized by adding crystallin. Since glycerol kinase and peroxidase are relatively stable by nature, the effect of crystallin is not clear. However, the effect of improving the stability of L-α-glycerophosphate oxidase even when the reagent composition is changed is clear as in Example 2.
[0046]
The effect of crystallin in a kit-based formulation containing the above enzymes was measured. The enzyme and reagent composition used was the same as described above. The amount of crystallin added was 1/10 mol of the total enzyme.
The results are shown in Table 5.
[0047]
[Table 5]

[0048]
In the kit system in which no crystallin is added, the blended enzymes interact with each other, and the stability of the enzyme is lower than in the case of the enzyme alone when no crystallin is added. In comparison, the kit system with added crystallin provides the same stability as the effect of adding crystallin to the enzyme alone. Furthermore, the stability of ATP and the like is also improved.
[0049]
【The invention's effect】
According to the present invention, the stability of bioactive proteins is improved, the influence of each enzyme can be avoided, and the stability of enzyme reagents for clinical tests used in clinical laboratory fields is improved. Can do. In addition, since crystallin does not affect the measurement system, it can be widely used as a stabilizer in any system.

Claims

Method for stabilizing enzymatic activity, characterized in that it allowed to contain crystalline cholesterol dehydrogenase Rogge toner peptidase.

Method for stabilizing the enzymatic activity in the solution, characterized in that it allowed to contain click Risutarin cholesterol dehydrogenase solution.

The method according to claim 1 or 2, wherein the crystallin is α-crystallin.

A stable cholesterol dehydrogenase composition containing crystallin .

The stable cholesterol dehydrogenase composition according to claim 4, wherein the crystallin is α-crystallin .