JP3645522B2 - ヤノウエノアカゴケ（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）のΔ６−アセチレナーゼおよびΔ６−デサチュラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、不飽和脂肪酸の調製方法および不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法に関するものである。本発明はさらに、Δ6三重結合および／またはΔ6二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含量を増加させたトランスジェニック生物（好ましくは、トランスジェニック植物またはトランスジェニック微生物）を作出するための、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼまたはΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列の使用に関するものである。
【０００２】
加えて、本発明は、単離された核酸配列、該核酸配列を含む発現カセット、少なくとも１つの核酸配列または発現カセットを含むベクターおよび生物に関するものである。また、本発明は、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸含量の増加したトリグリセリド、ならびにそれらの使用にも関するものである。
【０００３】
脂肪酸やトリグリセリド類は食品産業、家畜の飼料、化粧品および薬品分野において様々な用途を有している。それらは、遊離の飽和または不飽和脂肪酸であるのか、あるいは飽和または不飽和脂肪酸含量の増加したトリグリセリドであるのかに応じて、用途はさまざまである。こうして、例えば、ポリ不飽和脂肪酸は栄養価を高めるためにベビーフードに添加される。種々の脂肪酸およびトリグリセリド類は、主として、モルティエラ属(mortierella)のような微生物から、またはダイズ、アブラナ、ヒマワリなどの油産生植物から、通常はトリグリセリドの形で、得られる。しかし、魚のような動物種からも得ることができる。遊離脂肪酸の調製には、けん化することが有利である。
【０００４】
使用目的如何により、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸をもつ油が好適である。
例えば、不飽和脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸をもつ脂質はヒトの栄養には好ましいものである。なぜならば、それらは血中コレステロールレベルに有益な効果を及ぼし、ひいては心疾患の発症にも影響を与えるからである。それらは各種のヒト食品および医薬品において汎用されている。
【０００５】
それらの有益な性質のため、これまでは、種々の生物において不飽和脂肪酸含量を改変した油を製造するための、脂肪酸およびトリグリセリドの合成に関与する遺伝子を利用可能にするアプローチは全く存在しなかった。こうして、国際公開WO 91/13972およびそのUS対応物はΔ9-デサチュラーゼを開示している。WO 93/11245はΔ15-デサチュラーゼを、そしてWO 94/11516はΔ12-デサチュラーゼをクレームしている。Δ6-デサチュラーゼはWO 93/06712、US 5,614,393、WO 96/21022およびWO 99/27111に記載されている。別のデサチュラーゼは、例えば、EP-A-0 550 162、WO 94/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0 794 250、Stukeyら, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149、Wadaら, Nature 347, 1990: 200-203、またはHuangら, Lipids 34, 1999: 649-659に記載されている。WO 96/13591はΔ6-パルミトイル-ACP-デサチュラーゼを開示し、クレームしている。しかしながら、各種デサチュラーゼの生化学的特性決定は、これらの酵素が膜に結合されたタンパク質として単離され、特性決定に非常な困難性が伴うため、これまで不十分であった(McKeonら, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147、Wangら, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792)。
【０００６】
WO 97/37033はΔ12-アセチレナーゼを開示している。この酵素は三重結合をもつ不飽和C18-脂肪酸を製造するために用いることができる。ヒト食品中での使用のほかに、このタイプの脂肪酸は、その反応性ゆえに、ポリマーの製造にも使用される。Sperlingらは、同様に脂肪酸に三重結合を導入する酵素を該酵素のクローニングに関するミーティング(South Lake Tahoe, Canada, June 9-13, 1999)で報じているが、この酵素の基質はΔ12-アセチレナーゼのものと相違し、この酵素は脂肪酸の異なる位置に三重結合を導入する。
【０００７】
酵母においては、不飽和脂肪酸に対する脂肪酸スペクトルの変更と、その生産性の増加とを、ともに実証することができた（Huangら, Lipids 34, 1999: 649-659、Napierら, Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614を参照されたい）。しかし、トランスジェニック植物での各種デサチュラーゼの発現は必要とされる成果を収めなかった。不飽和脂肪酸に対する脂肪酸スペクトルの変更を示すことはできたものの、同時にトランスジェニック植物の合成能の著しい低下が見られ、すなわち、もとの植物と比較してほんの少量の油しか得られないことが明らかになった。
【０００８】
したがって、不飽和脂肪酸の生合成に関与する酵素をコードし、かつ工業的規模での不飽和脂肪酸の製造を可能にする、新規遺伝子の大きな必要性が依然として存在する。
【０００９】
本発明の目的は、共役不飽和脂肪酸の合成のための更なる酵素を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、この目的が、Δ6-アセチレナーゼ活性および／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列によって達成されることを見いだした。上記の核酸配列は、次の群：
a) 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列を有する核酸配列、
b) 遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した核酸配列から誘導される核酸配列、
c) 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した核酸配列の誘導体であって、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびアミノ酸レベルで少なくとも75％の相同性を有しかつ該ポリペプチドの酵素活性が無視できる程度にしか低下していないポリペプチド、をコードする該誘導体、
から選択されるものである。
【００１１】
誘導体とは、例えば、配列番号１、配列番号３または配列番号11によりコードされる酵素の機能性相同体またはそれらの酵素活性の機能性相同体、すなわち、配列番号１、配列番号３または配列番号11によりコードされる酵素と同じ酵素反応を触媒する酵素を意味する。これらの遺伝子は同様に６位に三重結合および／または二重結合をもつ不飽和脂肪酸を有利に調製することを可能にする。不飽和脂肪酸とは、以後、三重結合および／または二重結合の不飽和を１以上有する脂肪酸をさす。三重および／または二重結合は共役していても、していなくてもよい。配列番号１、配列番号３または配列番号11において特定された配列は、アセチレナーゼ活性および／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有する新規酵素をコードするものである。
【００１２】
この新規酵素Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼは、グリセロ脂質の脂肪酸残基にC6-C7位置でシス二重結合を導入し、かつ／また、C6-C7位置にすでに存在するシス二重結合を三重結合に変換するのに有利である（配列番号１または配列番号３を参照）。さらに、この酵素はグリセロ脂質の脂肪酸残基にC6-C7位置でシス二重結合を有利にかつ排他的に導入するΔ6-デサチュラーゼ活性を有する。配列番号11において特定された配列を有する酵素はこの活性を示し、一官能性のΔ6-デサチュラーゼである。
【００１３】
新規の核酸配列（本明細書中では単数は複数を含むものであり、同様にその逆も言える）またはその断片は、相同性スクリーニングにより更なるゲノム配列を単離するために有利に用いることができる。
【００１４】
上記の誘導体は、例えば真核生物（例：植物、特にコケ類、渦鞭毛虫、真菌）などの他の生物から単離することができる。
【００１５】
さらに、配列番号１、配列番号３または配列番号11に特定された配列の誘導体または機能性誘導体は、例えば、誘導されたアミノ酸レベルで、少なくとも70％の相同性、有利には少なくとも75％の相同性、好ましくは少なくとも80％の相同性、特に好ましくは少なくとも85％の相同性、最も好ましくは90％の相同性を有する対立遺伝子変異体を意味する。この相同性は全アミノ酸領域にわたって計算されたものである。プログラムとして、PileUp、BESTFIT、GAP、TRANSLATEまたはBACKTRANSLATE（＝UWGCGプログラムパッケージの構成要素、Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Devereuxら, Nucleic Acids Res., 12, 1984: 387-395）を使用した(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987、Higginsら, CABIOS, 5 1989: 151-153)。特定された核酸から誘導されるアミノ酸配列は配列番号２、配列番号４および配列番号12に示される。相同性は同一性と同義であり、すなわち、アミノ酸配列は少なくとも70％の同一性を有する。新規配列は、核酸レベルで、少なくとも65％の相同性、好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは75％、最も好ましくは少なくとも80％の相同性を示す。
【００１６】
対立遺伝子変異体は、特に、ヌクレオチドの欠失、挿入または置換により配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列から得られ、誘導された合成タンパク質が酵素活性を保持している機能性変異体を含む。
【００１７】
そのようなDNA配列は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号11に示したDNA配列、またはこれらの配列の一部から出発して、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはPCR技法を使って、上記したような他の真核生物より単離することができる。こうしたDNA配列は標準条件下で上記の配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのためには、例えば保存領域（当業者に公知の方法で他のアセチレナーゼおよび／またはデサチュラーゼ遺伝子と比較することにより確認できる）の、短いオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。ヒスチジンボックス配列を用いることが好ましい。しかし、ハイブリダイゼーションのために新規核酸のより長い断片または完全な配列を使用することも可能である。これらの標準条件は、用いる核酸、すなわちオリゴヌクレオチドか、より長い断片か、完全な配列かに応じて、また、どのタイプの核酸か、すなわちDNAかRNAかに応じて、変化する。例えば、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は同じ長さのDNA:RNAハイブリッドの融解温度よりも約10℃低くなる。
【００１８】
標準条件は、例えば、核酸に応じて、0.1〜5xSSC（1xSSCは0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2）の濃度の水性バッファー溶液中にて42〜58℃の温度、または、さらに50% ホルムアミドの存在下で、例えば5xSSC、50% ホルムアミド中にて42℃の温度を意味する。DNA:DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、有利には0.1xSSCおよび約20〜45℃の温度であり、約30〜45℃が好ましい。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、有利には0.1xSSCおよび約30〜55℃の温度であり、約45〜55℃が好ましい。ハイブリダイゼーションのための上記温度は、例として、ホルムアミドの非存在下に長さが約100ヌクレオチドで、G+C含量が50%の核酸について計算した融解温度である。DNAハイブリダイゼーションのための実験条件は、適切な遺伝学の教科書、例えば、Sambrookら, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に記載されており、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性質またはG+C含量に応じて、当業者に公知の式により求めることができる。ハイブリダイゼーションに関する更なる情報は、当業者であれば、下記の教科書中に見いだすことができる。すなわち、Ausubelら(編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; HamesおよびHiggins(編), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown(編), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００１９】
誘導体はまた、配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列の相同体、例えば真核生物の相同体、トランケートされた配列、コードおよび非コードDNA配列の一本鎖DNA、またはコードおよび非コードDNA配列のRNAを意味する。
【００２０】
さらに、配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列の相同体は、例えばプロモーター変異体のような誘導体を意味する。これらの変異体は１個以上のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失によって改変することができるが、プロモーターの機能性または効力を損なわないようにする。プロモーターはさらに、その配列を改変することによりその効力を増強したり、効力がより強いプロモーター（異種生物由来でさえも）で完全に置換したりしてもよい。
【００２１】
誘導体はまた、有利には、開始コドンの前の-1から-2000の領域のヌクレオチド配列が改変されていて、遺伝子発現および／またはタンパク質発現が変化している、好ましくは増加している変異体をも意味する。また、誘導体には3'末端で改変された変異体も含まれる。
【００２２】
誘導体はさらに、新規タンパク質の生合成を阻害するために使用できるアンチセンスDNAをも指す。これらのアンチセンスDNAは、酵素活性を全くもたない誘導体のような新規の非機能性誘導体に含まれる。非機能性誘導体を製造するための当業者に公知の他の方法は、いわゆる共抑制、リボザイムおよびイントロンの使用である。リボザイムは、それらに相補的なmRNAなどの一本鎖核酸を切断できるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒RNA分子である。こうしたリボザイムを使用することによって(HaselhoffおよびGerlach, Nature, 334, 1988: 585-591)、mRNA転写産物を触媒的に開裂させ、このmRNAの翻訳を抑制することが可能である。このタイプのリボザイムはその仕事のために特別に注文して作ることができる(US 4,987,071; US 5,116,742; Bartelら, Science 261, 1993: 1411-1418)。こうして、飽和脂肪酸含量の増加した脂肪酸、脂質または油を調製することはアンチセンスDNAの使用によって可能である。
【００２３】
Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードする新規核酸配列は、合成によって調製しても、天然から単離してもよく、または合成DNA成分と天然DNA成分の混合物を含んでいてもよく、様々な生物に由来する多様な異種Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子部分から成る。一般に、合成ヌクレオチド配列は相応の宿主生物（例えば、植物）に好まれるコドンを使って調製される。これにより、通常、異種遺伝子の最適な発現がもたらされる。植物にとって好ましいコドンは、大部分の対象植物種において発現される、最大タンパク質頻度をもつコドンから決定される。Corynebacterium glutamicumについての一例は、Wadaら (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118に示されている。この種の実験は当業者に公知の標準的な方法を用いて行なうことができる。
【００２４】
Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子をコードする機能的に均等な配列は、異なるヌクレオチド配列にもかかわらず、必要とされる機能（すなわち、該タンパク質の酵素活性）をなおも有する新規配列の誘導体である。こうして、機能的均等物は本明細書に開示した配列の天然に存在する変異体、および人工的なヌクレオチド配列（例えば、化学合成により得られ、植物のコドン使用頻度に適合させたもの）を含むものである。
【００２５】
さらに、人工的DNA配列は、上記のように、それらが必要な性質（例えば、作物におけるΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の過剰発現による、植物に含まれる脂肪酸、油または脂質中のΔ6三重結合またはΔ6二重結合の含量の増加）を付与するかぎり、好適である。そのような人工的DNA配列は、例えば、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有する構築されたタンパク質の分子モデリングを用いた逆翻訳により、あるいはin vitro選択により確立することができる。DNA配列を改変または改良するためのDNAの可能なin vitro進化法は、Patten, P.A.ら, Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997)またはMoore, J.C.ら, Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997)に記載されている。宿主植物に固有のコドン使用頻度に従うポリペプチド配列の逆翻訳により得られたコードDNA配列が特に好ましいものである。固有のコドン使用頻度は、植物遺伝学の手法に習熟した当業者であれば、形質転換すべき植物の他の既知遺伝子のコンピュータ解析により容易に確立することができる。
【００２６】
さらに記載すべき好ましい等価の核酸配列は、融合タンパク質（融合タンパク質の一成分がΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼポリペプチド、あるいはその機能性等価部分である）をコードする配列である。融合タンパク質の第２の部分は、例えば、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼの発現を検出するのに役立つ酵素活性をもつ別のポリペプチドまたは抗原ポリペプチド配列（例えば、mycタグ、hisタグ）でありうる。しかしながら、それはΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼタンパク質を必要な作用部位に案内する調節タンパク質配列（例えば、ERのためのシグナル配列）であることが好ましい。
【００２７】
新規方法においてはΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼまたはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子を脂肪酸生合成の他の遺伝子と組み合わせることが有利でありうる。そのような遺伝子の例はアセチルトランスフェラーゼ、他のデサチュラーゼまたはエロンガーゼである。in vivo合成、特にin vitro合成にとっては、例えば、還元当量を受け取るか、または放出することができるNADHシトクロムB5レダクターゼとの組合せが有利である。
【００２８】
新規のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号12に示したアミノ酸配列、またはこれらの配列から１個以上のアミノ酸残基の置換、逆位、挿入または欠失により得られ、かつ配列番号２、配列番号４もしくは配列番号12で表されるタンパク質の酵素活性が保持されているか、または無視できる程度にしか低下していない配列を含むタンパク質を意味する。「無視できる程度にしか低下していない」とは、もとの酵素の酵素活性の少なくとも10％、好ましくは20％、特に好ましくは30％を依然保持している、あらゆる酵素を指す。さらに、例えば、特定のアミノ酸を、同様の物理化学的性質（大きさ、塩基性、疎水性など）を有するアミノ酸と置換することが可能である。例えば、アルギニン残基はリシン残基と、バリン残基はイソロイシン残基と、アスパラギン酸残基はグルタミン酸残基と置換できる。しかしまた、それらの配列において１個以上のアミノ酸を交換、付加、または欠失することも可能であり、こうした手段のいくつかを一緒に組み合わせることもできる。
【００２９】
また、誘導体は、特にΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードする最初に単離された配列の自然のまたは人工的な突然変異を含み、かつ必要な機能をさらに示す（すなわち、酵素活性が無視できる程度にしか低下していない）機能性等価物をも意味する。突然変異は１個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転位または挿入を含む。かくして、本発明は、例えば、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼヌクレオチド配列の改変によって得られるヌクレオチド配列をも含むものである。そのような改変の目的は、例えば、そこに含まれるコード配列を局在化することであったり、また、例えば更なる制限酵素開裂部位を挿入することである。
【００３０】
機能性等価物はまた、その機能が、もとの遺伝子または遺伝子断片と比較して、弱まっている（無視できる程度にしか低下していない）か、または増強している（＝もとの酵素の活性より大きい酵素活性、すなわち、酵素活性が100％を超える、好ましくは110％以上、特に好ましくは130％以上である）変異体である。
【００３１】
核酸配列は、さらに有利には、例えば、DNAまたはcDNA配列でありうる。新規の発現カセットに挿入するのに適したコード配列は、例えば、６位に三重結合および／または二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質を過剰産生する能力を宿主に付与する、上記配列を有するΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードするものである。これらの配列は同種または異種起源のものであってよい。
【００３２】
新規の発現カセット（＝核酸構築物または断片）は、配列番号１、配列番号３または配列番号11において特定された配列、および遺伝子コードから生じる配列、および／または、有利には遺伝子発現を増強するまたは宿主細胞におけるコード配列の発現を制御する１以上の調節シグナルに機能的に連結された、それらの機能性または非機能性誘導体を意味する。これらの調節配列は特定の遺伝子発現およびタンパク質発現を可能にするためのものである。このことは、例えば、宿主生物に応じて、遺伝子が誘導後にのみ発現および／または過剰発現されること、または遺伝子が直ちに発現および／または過剰発現されることを意味しうる。例えば、こうした調節配列は、インデューサーまたはリプレッサーと結合することにより核酸の発現を調節する配列である。これらの新規の調節配列に加えて、またはこれらの配列の代わりに、こうした配列の天然の調節が、実際の構造遺伝子の前にまだ存在することが可能であり、適宜に、天然の調節が切り替わって遺伝子の発現が増加するように遺伝的に改変されていることも可能である。しかし、遺伝子構築物はもっと単純な構造をしていてもよく、すなわち、核酸配列またはその誘導体の前に追加の調節シグナルがまったく挿入されていなくてもよい。また、天然のプロモーターがその調節と共に欠失されていなくてもよい。その代わりに、天然の調節配列に突然変異を起こさせて、調節がもはや起こらないように、かつ／また、遺伝子発現が増加するようにしてもよい。これらの改変プロモーターはまた、活性を高めるために天然遺伝子の前に部分配列（＝新規核酸配列の部分を有するプロモーター）の形で単独で配置してもよい。さらに、遺伝子構築物は、核酸配列の発現を高めることができる１以上のエンハンサー配列を、プロモーターに機能的に連結させた形で含むことが有利である。また、DNA配列の3'末端に、更なる調節エレメントまたはターミネーターなどの好適な追加の配列を挿入することも可能である。Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子は発現カセット（＝遺伝子構築物）中に１以上のコピー数で存在することができる。
【００３３】
さらに、調節配列または因子は、上記のように、挿入遺伝子の発現に有益な影響を及ぼし、ひいてはその発現を高めることが好ましい。かくして、調節エレメントの強化は、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることで、転写レベルで有利に行なうことができる。しかし、例えばmRNAの安定性を改善することにより、翻訳を増強することも可能である。
【００３４】
発現カセットに適したプロモーターは、主に、生物（有利には、植物または真菌）内で外来遺伝子の発現を制御できるプロモーターである。たいていは、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターを用いることが好ましい。新規方法のために有利な調節配列は、例えば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRなどのプロモーター中、またはλ-PLプロモーター中に存在し、これらはグラム陰性細菌内で使用することが有利である。さらに好適な調節配列は、例えば、グラム陽性細菌のプロモーターであるamyおよびSPO2、酵母や真菌のプロモーターであるADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH、または植物のプロモーターであるCaMV/35S [Franckら, Cell 21(1980) 285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos（＝ノパリンシンターゼプロモーター）、またはユビキチンプロモーター中に存在する。発現カセットはまた、化学的に誘導可能なプロモーターを含むことができ、かかるプロモーターを用いることで、生物（有利には、植物）における外因性Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現を特定の時期で制御することができる。そのような有利な植物プロモーターの例としては、PRP1プロモーター [Wardら, Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366]、ベンゼンスルホンアミド誘導性(EP 388186)、テトラサイクリン誘導性 (Gatzら, (1992) Plant J. 2, 397-404)、サリチル酸誘導性プロモーター (WO 95/19443)、アブシジン酸誘導性 (EP 335528)またはエタノールもしくはシクロヘキサノン誘導性 (WO 93/21334)プロモーターがある。有利に使用できる植物プロモーターの他の例は、ジャガイモ由来の細胞質FBPアーゼのプロモーター、ジャガイモ由来のST-LSIプロモーター (Stockhausら, EMBO J. 8 (1989) 2445-245)、ダイズ(Glycine max)由来のホスホリボシル-ピロリン酸アミドトランスフェラーゼのプロモーター（Genbank登録番号 U87999も参照のこと）またはEP 249676に記載されるような節(node)特異的プロモーターである。特に好ましい植物プロモーターは、脂肪酸またはその前駆体の生合成が起こる組織または植物部分／器官（例えば、胚乳もしくは発生中の胚）における発現を確実にするプロモーターである。種子特異的発現を確実にする有利なプロモーターとして、例えば、USPプロモーターもしくはその誘導体、LEB4プロモーター、ファセオリンプロモーターまたはナピンプロモーターが挙げられる。特に有利なUSPプロモーターまたはその誘導体は、種子発生の非常に早い時期に遺伝子発現を媒介する(Baeumleinら, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67)。単子葉および双子葉植物に使用できる別の有利な種子特異的プロモーターは、例えば、アブラナ由来のナピン遺伝子プロモーター(US 5,608,152)、シロイヌナズナ(arabidopsis)由来のオレオシンプロモーター(WO 98/45461)、白インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)由来のファセオリンプロモーター(US 5,504,200)、アブラナ由来のBce4プロモーター(WO 91/13980)、もしくはマメ科植物のB4プロモーター(LeB4、Baeumleinら, Plant J., 2, 2, 1992: 233-239)のような双子葉植物に適するプロモーター、または、例えば、オオムギ由来のlpt2もしくはlpt1遺伝子のプロモーター(WO 95/15389およびWO 95/23230)、またはオオムギのホーデイン(hordein)遺伝子、イネのグルテリン(glutelin)遺伝子、イネのオリジン(oryzin)遺伝子、イネのプロラミン(prolamin)遺伝子、コムギのグリアジン(gliadin)遺伝子、コムギのグルテリン遺伝子、トウモロコシのゼイン(zein)遺伝子、オートムギのグルテリン遺伝子、モロコシのカシリン(kasirin)遺伝子、もしくはライムギのセカリン(secalin)遺伝子のプロモーターのような単子葉植物に適するプロモーターであり、これらはWO 99/16890に記載されている。
【００３５】
さらに、特に好ましいプロモーターは、例えば脂肪酸、油、脂質またはそれらの前駆体の生合成が起こる、組織または植物部分における発現を確実にするものである。特に、種子特異的発現を確実にするプロモーターを挙げることができる。アブラナ由来のナピン遺伝子のプロモーター(US 5,608,152)、ファバ・ビーン(Vicia faba)由来のUSPプロモーター（USP＝未知の種子タンパク質、Baeumleinら, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67）、シロイヌナズナ由来のオレオシン遺伝子のプロモーター(WO 98/45461)、ファセオリンプロモーター(US 5,504,200)、またはマメ科植物のB4遺伝子のプロモーター(LeB4; Baeumleinら, 1992, Plant JOURNAL, 2(2): 233-239)が挙げられる。さらに、単子葉植物における種子特異的発現を付与するプロモーター、例えば、オオムギ由来のlpt2もしくはlpt1遺伝子のプロモーター(WO 95/15389およびWO 95/23230)も挙げられる。
【００３６】
発現カセット（＝遺伝子構築物、核酸構築物）は、上記のように、生物に導入すべき他の遺伝子を含んでいてもよい。これらの遺伝子はΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼの遺伝子と別個の調節領域下にあっても、同じ調節領域下にあってもよい。こうした遺伝子の例は、増大した合成を可能にする別の生合成遺伝子、有利には脂肪酸生合成の遺伝子である。例として、Δ15-、Δ12-、Δ9-、Δ6-、およびΔ5-デサチュラーゼ、種々のヒドロキシラーゼ、Δ12-アセチレナーゼ、アシルACPチオエステラーゼ、β-ケトアシルACPシンターゼ、またはβ-ケトアシルACPレダクターゼの遺伝子が挙げられる。核酸構築物中ではデサチュラーゼ遺伝子を用いることが有利である。
【００３７】
原則として、後述する新規発現カセットおよび新規方法には、上で挙げたような天然のプロモーターをそれらの調節配列と共に用いることが可能である。また、合成プロモーターを使用できるし、その上有利でもある。
【００３８】
発現カセットを作製するには、便宜上正しい方向で読み取られ、かつ正しい読み枠を備えているヌクレオチド配列を得るために、各種のDNA断片を操作する。DNA断片（＝新規の核酸）を一緒に連結させるために、DNA断片にアダプターまたはリンカーを結合させることができる。
【００３９】
プロモーターおよびターミネーター領域は、リンカーまたはポリリンカー（この配列の挿入のための１以上の制限部位を含む）と共に転写方向で提供することが可能で、好都合でもある。リンカーは通常１〜10、一般には１〜８、好ましくは２〜６の制限部位をもっている。調節領域内のリンカーの大きさは、一般に100bp未満、たいていは60bp未満で、５bp以上である。プロモーターは宿主生物（例えば、宿主植物）に対して天然または同種でも、外来または異種であってもよい。発現カセットは、5'−3'の転写方向で、プロモーター、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列、および転写終結領域を含む。各種の終結領域を希望どおりに相互交換することができる。
【００４０】
さらに、適切な制限開裂部位を挿入したり、過剰のDNAまたは制限開裂部位を欠失させる操作を施すことができる。トランジションやトランスバージョンのような挿入、欠失または置換が問題となる場合は、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーション（連結）を用いることができる。制限、チューイングバック(chewing back)、平滑末端とするための突出部分のフィルインなどの適切な操作を用いて、ライゲーション用の断片の相補端を作製することができる。
【００４１】
特定のER保持シグナルであるSEKDELの結合は、とりわけ、都合のよい高レベル発現にとって重要であり(Schouten, A.ら, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792)、これは平均発現レベルを３倍または４倍に高める。また、発現カセットを構築するために、ERに局在させる植物および動物タンパク質と共に、天然に存在する他の保持シグナルを利用してもよい。
【００４２】
好適なポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナルであり、好ましくは、本質的にAgrobacterium tumefaciens由来のT-DNAポリアデニル化シグナルに対応するもの、特にTiプラスミドpTiACH5 (Gielenら, EMBO J. 3 (1984), 835 ff)のT-DNAの遺伝子３（オクトピンシンターゼ）のもの、または対応する機能性等価物である。
【００４３】
発現カセットは、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) および T.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) および Ausubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)に記載されるような、通常の組換え・クローニング技術を使って、適当なプロモーターを、適当なΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼのDNA配列およびポリアデニル化シグナルに融合することにより作製される。
【００４４】
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列は、脂肪酸、脂質または油の生合成の部位として適切な局在化を達成するために必要とされる全ての配列特徴を含んでいる。したがって、他のターゲッティング配列をまったく必要としない。しかし、そのような局在化は望ましく、有利でもあるので、局在化を人工的に改変または増強することができ、そのような融合構築物もまた本発明の好ましい有利な実施形態である。
【００４５】
特に好ましい配列は、色素体へのターゲッティングを確実にするものである。いくつかの状況においては、他の構成要素へのターゲッティング（報告：Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423)、例えば、液胞、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、脂質体へのターゲッティング、あるいは、適切な機能性配列の不在により、産生コンパートメントである細胞質ゾルに残存させることが望ましいこともある。
【００４６】
新規の核酸配列は、少なくとも１つのレポーター遺伝子と共に発現カセット（ベクターを介して生物に導入されるか、ゲノムに直接導入される）にクローニングすることが有利である。このレポーター遺伝子は、増殖、蛍光、化学もしくは生物発光、または耐性の各アッセイにより、あるいは光学測定により、簡便な検出を可能にすべきである。レポーター遺伝子の例として、抗生物質もしくは除草剤耐性遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、化学発光遺伝子、糖もしくはヌクレオチド代謝遺伝子、または生合成遺伝子、例えば、Ura3遺伝子、Ilv2遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、gfp遺伝子、2-デオキシグルコース-6-リン酸ホスファターゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子もしくはBASTA（＝グルホシネート耐性）遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は転写活性（ひいては遺伝子発現）の測定および定量を容易に行なえるようにする。したがって、生産性の差異を示すゲノムの部位を同定することが可能である。
【００４７】
好ましい実施形態において、発現カセットは、コード配列の上流すなわち5'末端にプロモーター、およびコード配列の下流すなわち3'末端にポリアデニル化シグナルを含み、適宜に、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼのDNA配列のための、該コード配列に機能的に連結された別の調節エレメントを含有する。機能的に連結されたとは、各調節エレメントがコード配列の発現において意図された機能を果たせるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター、適宜に、追加の調節エレメントの逐次的配置を意味する。機能的に連結させるのに好適な配列は、色素体への細胞下局在を確実にするターゲッティング配列である。しかし、ミトコンドリア、小胞体(ER)、細胞核、エライオプラスト（脂肪体）または他のコンパートメントへの細胞下局在を確実にするターゲッティング配列も必要に応じて使用することができる。同様に、タバコモザイクウイルス由来の5'リーダー配列のような翻訳エンハンサーも利用できる(Gallieら, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711)。
【００４８】
発現カセットは、例えば、構成プロモーター（好ましくは、USPまたはナピンプロモーター）、発現すべき遺伝子、およびER保持シグナルを含みうる。用いるのに適したER保持シグナルはアミノ酸配列：KDEL（リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン）である。
【００４９】
発現のために、発現カセットは原核または真核宿主生物（例えば、真菌のような微生物または植物）に挿入され、有利には、該遺伝子の宿主生物における最適な発現を可能にするベクター（例えば、プラスミド、ファージ、または他のDNA）に挿入される。適当なプラスミドの例は、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322のようなpBR系列、pUC18 またはpUC19 のようなpUC系列、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、またはpBdCI、ストレプトミセス属のpIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361、バシラス属のpUB110、pC194またはpBD214、コリネバクテリウム属のpSA77またはpAJ667、真菌のpALS1、pIL2またはpBB116である。さらに有利な真菌ベクターは、Romanos, M.A.ら[(1992)「酵母における外来遺伝子発現：レビュー」Yeast 8: 423-488]およびvan den Hondel, C.A.M.J.J.ら[(1991)「糸状真菌における異種遺伝子発現」]およびMore Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure編, p.396-428: Academic Press: San Diego]および「糸状真菌のための遺伝子導入系およびベクターの開発」[van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.ら編, p.1-28, Cambridge University Press: Cambridge]に記載されている。有利な酵母プロモーターの例は、2μM、pAG-1、YEp6、YEp13およびpEMBLYe23である。藻類または植物プロモーターの例は、pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKHおよびpDH51である（Schmidt, R.およびWillmitzer, L., 1988を参照のこと）。上記ベクターまたは上記ベクターの誘導体は、使用可能なプラスミドのわずかな選択にすぎない。別のプラスミドが当業者にはよく知られており、例えば、Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら編, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) という書物に載っている。適当な植物ベクターは、特に、「植物の分子生物学およびバイオテクノロジーの方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)」(CRC Press)、第6/7章、第71-119頁に記載されている。好ましいベクターは大腸菌およびアグロバクテリウム中で複製するシャトルベクターまたはバイナリーベクターである。
【００５０】
プラスミドは別として、ベクターは当業者に知られたあらゆる他のベクターをも意味し、例えば、ファージ、ウイルス（SV40、CMV、バキュロウイルス、アデノウイルスなど）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状または環状DNAが含まれる。これらのベクターは宿主生物中での自律複製または染色体複製が可能であり、染色体複製が好適である。
【００５１】
ベクターの更なる実施形態において、新規の発現カセットは、線状DNAの形で生物に都合よく導入して、宿主生物のゲノムに異種または相同組換えによって組み込むこともできる。この線状DNAは、線状化したプラスミドであっても、ベクターとしての発現カセットまたは新規核酸配列のみであってもよい。
【００５２】
さらに有利な実施形態においては、新規核酸配列を生物に単独で導入することもできる。
【００５３】
この新規核酸配列の他に、別の遺伝子をその生物内に導入しようとする場合は、全部一緒に単一のベクター中にレポーター遺伝子とともに入れるか、あるいは個別の遺伝子をそれぞれ１個のベクター中にレポーター遺伝子とともに入れて、生物内に導入することが可能である。この場合、多種のベクターを同時にまたは順次導入することができる。
【００５４】
ベクターは少なくとも１コピーの新規核酸配列および／または新規発現カセットを含むものが好都合である。
【００５５】
例えば、植物発現カセットをタバコ形質転換ベクターpBinAR中に組み込むことが可能である。図１はタバコ形質転換ベクター、35SプロモーターをもつpBinAR（C）およびUSPプロモーターをもつpBin-USP（D）を示す。もとのベクターを図１A）およびB）に示す。
【００５６】
これとは別に、例えば、T7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼを使用することによる、組換えベクター（＝発現ベクター）のin vitro転写および翻訳もまた可能である。
【００５７】
原核生物中で使用する発現ベクターは、融合タンパク質若しくは融合オリゴペプチドを含むまたは含まない誘導系を利用することが多いが、これらの融合は、N末端およびC末端の両方で、たは１タンパク質中で使用できるその他のドメイン上で生起させることが可能である。このタイプの融合ベクターは通常次の目的で使用される。すなわち、i) RNA発現率を増大させる、ii) 達成しうるタンパク質合成率を増大させる、iii) タンパク質の溶解性を増大させる、またはiv) アフィニティークロマトグラフィーに使用できる結合配列によって精製を単純化する。しばしば、融合タンパク質を介してタンパク質分解性開裂部位を導入して、精製するために融合タンパク質の一部の除去を可能にする。こうしたプロテアーゼのための認識配列は、例えば因子Xa、トロンビンおよびエンテロキナーゼを認識する。
【００５８】
典型的な好都合な融合および発現ベクターは、pGEX [Pharmacia Biotech Inc； Smith,D.B. and Johnson,K.S.(1988) Gene 67:31-40]、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合性タンパク質、またはプロテインAを含むpRIT5（Pharmacia, Piscataway, NJ）である。
【００５９】
大腸菌発現ベクターの別の例は、pTrc [Amannら、(1988) Gene 69:301-315]およびpETベクター[Studierら、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89； Stratagene, Amsterdam, The Netherlands]である。
【００６０】
酵母中で使用するための別の好都合なベクターは、pYepSec1（Baldariら、(1987) Embo J.6:229-234）、pMFa（Kurjan and Herskowitz,(1982) Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら、(1987) Gene 54:113-123）、およびpYES誘導体（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）である。糸状菌中で使用するためのベクターは以下の文献に記載されている：van den Hondel,C.A.M.J.J. & Punt,P.J.(1991)「糸状菌のための遺伝子導入系およびベクターの開発」(Gene transfer system and vector development for filamentous fungi), Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F.Peberdyら編, p.1-28, Cambridge University Press: Cambridge。
【００６１】
例えばSf 9細胞中での発現のために、昆虫細胞発現ベクターを使用することも、別法として有利な可能性がある。これらの例はpAc系列（Smithら、(1983) Mol.Cell Biol. 3: 2156-2165）およびpVL系列（Lucklow and Summers(1989) Virology 170: 31-39）のベクターである。
【００６２】
さらに、遺伝子発現のために植物細胞または藻類細胞を使用することが可能で、有利である。植物発現ベクターの例は、Becker,D.ら、(1992) 「左ボーダー近傍に選択マーカーをもつ新規の植物バイナリーベクター」(New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border), Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197、またはBevan,M.W. (1984)「植物形質転換のためのバイナリーAgrobacteriumベクター」(Binary Agrobacterium vectors for plant transformation), Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721、に見出だされる。
【００６３】
この新規核酸配列を哺乳動物細胞中で発現させることもできる。適切な発現ベクターの例は、Seed,B.(1987) Nature 329:840またはKaufmanら(1987) EMBO J.6:187-195中に言及されているpCDM8およびpMT2PCである。これらの場合、使用する好ましいプロモーターは、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス若しくはシミアンウイルス40のプロモーターなどのウイルス起源のものである。その他の原核生物および真核生物発現系が、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd,ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の16および17章に記載されている。
【００６４】
この新規核酸、発現カセットまたはベクターの生物、例えば植物中への導入は、原則として当業者に知られたすべての方法によって実行することができる。
【００６５】
当業者は以下の教科書から微生物のための適切な方法を見出だすことができる：Sambrook,J.ら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F.M. Ausubelら、(1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons、D.M. Gloverら、DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press(ISBN 019-963476-9)、Kaiserら(1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press、またはGuthrieら、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press 。
【００６６】
植物のゲノム中への外来遺伝子の導入を形質転換と称する。この場合、一過性のまたは安定な形質転換のための、植物組織若しくは植物細胞の形質転換およびそれからの植物の再生に関して記載された方法が利用される。好適な方法は、ポリエチレングリコールで誘発されるDNA取込みによるプロトプラストの形質転換、遺伝子ガンによるバイオリスティック法、いわゆる粒子ボンバードメント法、エレクトロポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション、およびアグロバクテリウムが仲介する遺伝子導入である。提示した方法は、例えば Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, S.D. Kung and R. Wu編、Academic Press(1993) 128-143中のB. Jenesら、Techniques for Gene Transfer、およびPotrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225に記載されている。発現させる構築物を、好ましくはAgrobacterium tumefaciensを形質転換させるのに好適なベクター、例えばpBin19 （Bevanら、Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711）中にクローン化させる。次に、こうしたベクターで形質転換したアグロバクテリウムを公知の手法で使用して、例えば傷をつけた葉若しくは葉の小片をアグロバクテリウムの溶液中に浸漬し、その後好適な培地中で培養することによって、植物、特に例えばタバコ植物などの栽培植物を形質転換することができる。Agrobacterium tumefaciensによる植物の形質転換は、例えばHofgenおよびWillmitzerによってNucl. Acids Res.(1988) 16, 9877に記載されており、あるいは特に、Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, S.D.Kung and R.Wu編、Academic Press, 1993, pp.15-38中のF.F. White, 「高等植物遺伝子導入用ベクター」(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)中に開示されている。
【００６７】
新規発現ベクターで形質転換したアグロバクテリウムを同様に公知の手法で使用し、例えば傷をつけた葉または葉の小片をアグロバクテリウムの溶液中に浸漬し、その後好適な培地中で培養することによって、以下の植物：シロイヌナズナ(arabidopsis)などの試験植物、または穀草類、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ニンジン、パプリカ、アブラナ、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、センジュギク、アルファルファ、レタスならびに各種の樹木、堅果およびつる植物などの栽培植物など、特にダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ、アマ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）若しくはカカオ豆などの油産生栽培植物を形質転換することができる。
【００６８】
遺伝子改変した植物細胞を当業者に知られたすべての方法によって再生させることができる。適切な方法は上記のS.D. Kung and R. Wu、PotrykusまたはHofgen and Willmitzerによる出版物に見出だすことができる。
【００６９】
新規な核酸、発現カセット若しくはベクターにとって原則として好適で好都合な生物若しくは宿主生物は、脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を合成することができるか、または組換え遺伝子を発現するのに好適なすべての生物である。例を挙げると、シロイヌナズナなどの植物、キンセンカなどのキク科植物、またはダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ、アマ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）若しくはカカオ豆などの栽培植物、微生物、例えばMortierella、Saprolegnia若しくはPythium属などの真菌類、Escherichia属などの細菌、Saccharomyces属などの酵母、シアノバクテリウム、繊毛虫、藻類、あるいは原生動物、crypthecodiniumなどの渦鞭毛虫など、である。天然に油を比較的大量に合成することができる生物、Mortierella alpina、Pythium insidiosumなどの真菌類、またはダイズ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ、ヒマ、キンセンカ、ピーナッツ、カカオ豆若しくはヒマワリなどの植物、あるいはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母が好ましく、またダイズ、アブラナ、ヒマワリ、キンセンカまたはSaccharomyces cerevisiaeが特に好ましい。宿主生物として、トランスジェニック動物、例えばC.elegansも原則として好適である。
【００７０】
使用することができる宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)、に挙げられている。
【００７１】
使用することができる、例えば比較的低いプロテアーゼ活性をもつ発現菌株は、Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128、に記載されている。
【００７２】
本発明はさらに、植物細胞若しくは組織または植物の部分の形質転換のための、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子をコードするDNA配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に関する。その使用は、6位の三重結合および二重結合の含量が増加した脂肪酸、油または脂質の含量を増加させることが目的である。
【００７３】
さらに、プロモーターの選択如何によって、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現を、植物の葉、種子、塊茎またはその他の部分で特異的に生じさせることが可能である。こうしたΔ6三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質を過剰産生するトランスジェニック植物、それらの繁殖材料、ならびにそれらの植物細胞、組織若しくは部分は、本発明のさらに別の態様である。本発明は好ましくは、新規な機能性もしくは非機能性（＝アンチセンスDNAもしくは酵素的に不活性な酵素）核酸配列または機能性もしくは非機能性発現カセットを含むトランスジェニック植物に関する。
【００７４】
Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子配列を含む発現カセットまたは新規核酸配列はさらに、Δ6三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質の含量を増加させることを目的として、例として上に挙げた、細菌、シアノバクテリウム、酵母、糸状菌、繊毛虫および藻類などの生物を形質転換するために使用することができる。
【００７５】
本発明にとって、Δ6三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質の含量を増加させるとは、例えば、新規生物体、有利には新規トランスジェニック植物において、遺伝子改変をしていない当初の植物に比較して、少なくとも１植物世代の間、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の機能性過剰発現によって、生合成活性を増加させる、人工的に獲得された能力、を意味する。
【００７６】
脂肪酸、油または脂質の生合成の部位は、例えば一般的には種子若しくは種子の細胞層であり、したがって、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の種子特異的発現が合理的である。しかし、脂肪酸、油または脂質の生合成は種子組織に限定されるものとは限らず、植物のすべての他の部分、例えば上皮細胞中、または塊茎中でも組織特異的に生じさせ得ることは明らかである。
【００７７】
その上、外因性Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の構成性発現が好都合である。しかし、その一方で、誘導性発現も望ましいだろう。
【００７８】
トランスジェニックΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現の有効性は、例えば、in vitroでの生長点分裂組織の増殖によって、判定することができる。その上、試験植物に対する温室実験において、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現の特性およびレベルの変化、ならびに脂肪酸、油または脂質の生合成活性に及ぼすその影響を試験することができる。
【００７９】
本発明はさらに、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子をコードするDNA配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転換したトランスジェニック植物、ならびにこうした植物のトランスジェニック細胞、組織、部分および繁殖材料に関する。これに関係して特に好ましいのは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、アブラナおよびカノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、アルファルファ、レタスならびに各種の樹木、堅果およびつる植物などのトランスジェニック栽培植物である。
【００８０】
本発明の目的のための植物は、単子葉および双子葉植物または藻類である。
【００８１】
別の新規な実施形態は、機能性もしくは非機能性の新規核酸配列または機能性もしくは非機能性の新規発現カセットを含む、上に記載したトランスジェニック植物を含んでいる。非機能性とは、酵素的に活性なタンパク質の合成がなくなっていることを意味する。その上、非機能性核酸若しくは核酸構築物はまた、酵素活性の減少を示すかまたは酵素活性を何らもたないトランスジェニック植物をもたらす、いわゆるアンチセンスDNAを意味する。特に新規核酸配列をそのアンチセンスDNA中で別の脂肪酸合成遺伝子と結合させ、飽和脂肪酸の含量が増加したトリグリセリドを合成するか、あるいは飽和脂肪酸を合成するアンチセンス技法を使用することができる。トランスジェニック植物とは、個々の植物細胞および固体培地上もしくは液体培養液中のそれらの培養物、植物の部分ならびに植物全体を意味する。
【００８２】
本発明はさらに以下の件に関する：
- Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、植物全体または植物のプロトプラスト中に導入することを含む、植物を形質転換するための方法。
- 植物中でこのΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼDNAを発現させることによって、三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質の含量が増加した植物を作出するための、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
- 配列番号８に示したアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 配列番号１０に示したアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 不飽和脂肪酸を製造するための、配列番号８および配列番号１０の配列を有するタンパク質の使用。
【００８３】
本発明はさらに、少なくとも１つの上記の新規核酸配列または少なくとも１つの新規核酸構築物を好ましくは油産生生物に導入し、この生物を培養し、この生物に含まれる油を単離し、そしてその油に含まれる脂肪酸を遊離させることを含む、不飽和脂肪酸を製造するための方法に関する。これらの不飽和脂肪酸は有利にはΔ6三重結合および／またはΔ6二重結合を含む。脂肪酸は、例えば塩基性加水分解（例えば、NaOHもしくはKOH）によって、油または脂質から遊離させることもできる。
【００８４】
本発明はさらに、不飽和脂肪酸の含量が増加したトリグリセリドを調製するための方法に関する。この方法は、少なくとも１つの上記の新規核酸配列または少なくとも１つの新規発現カセットを好ましくは油産生生物に導入し、この生物を培養し、そしてこの生物に含まれる油を単離することを含む。
【００８５】
本発明はさらに、飽和脂肪酸をもつか、不飽和脂肪酸をもつか、または飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸をもつトリグリセリドを、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１０もしくは配列番号１１の配列の１つによってコードされるタンパク質の少なくとも１種と共にインキュベートすることによる、不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法に関する。この方法は、還元当量を受け取るか、または放出することができる化合物の存在下で実施するのが好都合である。その後、このトリグリセリドから脂肪酸を遊離させることができる。
【００８６】
請求項１６または１７に記載された方法において、脂肪酸をトリグリセリドから遊離させる。
【００８７】
上記の方法は、Δ6三重結合および／またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸含量が増加した脂肪酸またはトリグリセリドを好都合に合成することを可能にする。
【００８８】
１方法において、いわゆるアンチセンス技法を使用して、飽和脂肪酸含量が増加した脂肪酸またはトリグリセリドを調製することもできる。
【００８９】
これらの方法のための生物の例を挙げるならば、シロイヌナズナ、オオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、アブラナおよびカノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）若しくはカカオ豆などの植物、微生物、Mortierella、Saprolegnia若しくはPythium属などの真菌類、Escherichia属などの細菌、シアノバクテリウム、Saccharomyces属などの酵母、藻類、あるいは原生動物、crypthecodiniumなどの渦鞭毛虫である。Mortierella alpina、Pythium insidiosumなどの真菌、またはダイズ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ、ヒマ、キンセンカ、ピーナッツ、カカオ豆もしくはヒマワリなどの植物、またはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母などの、自然界で油を比較的大量に合成できる生物が好ましく、特に好ましいのはダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ベニバナ(carthamus)またはSaccharomyces cerevisiaeである。
【００９０】
本方法で使用する生物は、宿主生物に応じて、当業者に知られた方法で、生育または培養する。微生物は普通、糖の形態の炭素源、酵母エキスなどの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態の窒素源、鉄、マンガン、マグネシウム塩などの微量元素、および適宜にビタミン類を含む液体培地中で、0℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃の温度で、酸素を通しながら、培養する。栄養液のpHはこの間一定の値に保つ、すなわち培養中に制御することができ、制御しなくてもよい。培養は、バッチ式、半バッチ式または連続式で実施することができる。栄養源は培養の開始時に導入するか、またはその後半連続的もしくは連続的に投入することができる。
【００９１】
形質転換後、植物を最初に上記のように再生させ、その後通常の方法で培養または栽培する。
【００９２】
育成後、通常の方法で生物から脂質を単離する。この目的のため、収穫後に生物をまず破砕するか、または直接使用することができる。脂質は、好適な溶媒、ヘキサンなどの無極性溶媒、またはエタノール、イソプロパノール、またはヘキサン／イソプロパノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールなどの混合物などで、0℃〜80℃、好ましくは20℃〜50℃の温度で好都合に抽出される。バイオマスは普通、過剰の溶媒、例えばバイオマスに対して１：４の過剰の溶媒で抽出される。その後、例えば蒸留によって溶媒を除去する。抽出は超臨界CO2によっても実施することができる。抽出後に残留するバイオマスを例えば 濾過によって除去することができる。
【００９３】
次にこの方法で取得した粗油を、例えばアセトンもしくはクロロホルムなどの極性溶媒の添加およびその後の濾過もしくは遠心分離によって濁り分を除去することにより、さらに精製することができる。カラムによるさらなる精製も可能である。
【００９４】
トリグリセリドから遊離の脂肪酸を単離するためには、これを通常の方法で加水分解する。
【００９５】
本発明はさらに、上記の方法によって調製した、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の含量が増加したトリグリセリド、ならびにヒト食品、動物飼料、化粧品または医薬品を製造するためのこれらの使用に関する。こうした目的のため、これらを常套的な量でヒト食品、動物飼料、化粧品または医薬品に添加する。
【００９６】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。
【００９７】
実施例
実施例１
一般的なクローニング方法
例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロース膜およびナイロン膜への転移、DNA断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌の培養ならびに組換えDNA配列解析などのクローニング方法を、Sambrookら(1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press : ISBN 0-87969-309-6）によって記載されたようにして、実施した。
【００９８】
実施例２
組換え DNA 配列解析
Sangerの方法（Sangerら(1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463-5467）によって、ABIレーザー蛍光DNA配列解析機を使用して、組換えDNA分子を配列決定した。ポリメラーゼ連鎖反応から得られた断片を配列決定し、発現させる構築物内のポリメラーゼエラーを回避するために、検査した。
【００９９】
実施例３
トランスジェニックアブラナ植物の作出（ Moloney ら , 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242, の改変方法）
Agrobacterium tumefaciens C58C1：pGV2260または大腸菌中のバイナリーベクターを使用して、トランスジェニックアブラナ植物を作出した（Deblaereら, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788）。陽性形質転換したアグロバクテリアコロニーの3％ショ糖を含むMurashige-Skoog培地（Murashige and Skoog 1962 Physiol.Plant.15,473）（3MS培地）中での一晩培養物の1：50希釈物を使用することによって、アブラナ植物（Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Germany）を形質転換した。新たに発芽させた滅菌アブラナ植物からの葉柄または胚軸（それぞれ約 1 cm2）を、アグロバクテリアの1：50希釈物とともにペトリ皿中で5〜10分間にわたりインキュベートした。その後、これを25℃、暗所で３日間、0.8％ Bactoアガーを含む3MS培地上でインキュベートした。３日後、明所で16時間／暗所で8時間、培養を継続し、そして週間周期で、500 mg/l Claforan（セフォタキシムナトリウム）、50 mg/l カナマイシン、20マイクロM ベンジルアミノプリン（BAP）および1.6 g/lグルコースを含むMS培地で、培養を継続した。生長している新芽を、2％ショ糖、250 mg/l Claforanおよび0.8％Bactoアガーを含むMS培地に移した。3週間後、根が形成されない場合は、発根のために、培地に生長ホルモンである2-インドール酪酸を添加した。
【０１００】
実施例４
トランスジェニック・シロイヌナズナ植物の作出
Bechtold, N., Ellis, J.およびPelletier, G. Planta,「成体シロイヌナズナ植物の浸潤によるアグロバクテリウム仲介遺伝子導入(Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants)」, C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316 (1993), 1194-119に記載された花浸潤法、または根形質転換法によって、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) Columbia Col 0 変種（Lehle Seeds, Round Rock, Texas, USA）を形質転換した。
【０１０１】
実施例５
Pareddy, D., Petolino, J., Skokut, T., Hopkins,N., Miller,M., Welter,M., Smith,K., Clayton,D., Pescitelli,S., Gould,A.によって、Maize Transformation via Helium Blasting. Maydica. 42(2):143-154, 1997、に記載されたようにして、トウモロコシ植物を形質転換した。
【０１０２】
実施例６
ヤノウエノアカゴケ (Ceratodon purpureus) 由来のΔ 6- アセチレナーゼ／Δ 6- デサチュラーゼおよびΔ 6- デサチュラーゼの単離およびクローニング
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)からΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよびΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列を単離するため、Δ5-（EMBL 登録番号Z81122）およびΔ6-脂肪酸デサチュラーゼ（U79010、AJ222980、AF031477）をコードするDNA配列から以下の各種の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを誘導した。
【０１０３】
一本鎖ヤノウエノアカゴケcDNAを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、プライマーAおよびプライマーBを用いて長さが557 bp（Cer3）および575 bp（Cer16）の2つのDNA断片を増幅し、またプライマーBおよびプライマーCを用いて長さが560 bp（Cer1）の1つのDNA断片を増幅した。増幅のために以下のプログラムを使用した：94 ℃で10分間、加熱開始まで72℃で待機、その後94℃で20秒間、45℃（アニーリング温度、Tm）で1分間および72℃で1分間を32サイクル、72℃で10分間を1サイクル、ならびに4℃で停止。この増幅のために、Taq-DNAポリメラーゼ（Gibco BRL）を使用した。
【０１０４】
上記の2つのPCR増幅からの二本鎖DNA断片をpGEM-Tベクター（Promega）中に連結し、大腸菌 XL1blue MRF' Kan（Stratagene）中に形質転換し、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer,Weiterstadt）を使用して、配列解析した。Cer1およびCer3 DNAサブ配列は70％の同一性を示した。上記のDNAサブ配列はプライマーを除いて、以下のオープンリーディングフレームをコードしていた：Cer1の場合、173アミノ酸（配列番号５＝プライマーを除いたCer1の部分ヌクレオチド配列、および配列番号６＝Cer1の部分推定アミノ酸配列）、Cer3の場合、172アミノ酸（配列番号７＝プライマーを除いたCer3の部分ヌクレオチド配列、および配列番号８＝Cer3の部分推定アミノ酸配列）、ならびにCer16の場合、178アミノ酸（配列番号９＝プライマーを除いたCer16の部分ヌクレオチド配列、および配列番号１０＝Cer16の部分推定アミノ酸配列）。誘導されたCer1のタンパク質配列はCer3と64％、およびCer16と28％のアミノ酸同一性を示し、Cer3およびCer16では、27％のアミノ酸同一性だった。
【０１０５】
Cer1およびCer3タンパク質はPhyscomitrella patens Δ6-アシル-脂質デサチュラーゼ（Girkeら, Plant J., 15, 1998: 39-48）と最大の類似性を示し、一方Cer16はより高等な植物からのΔ6-アシル-脂質デサチュラーゼおよびΔ8-スフィンゴ脂質デサチュラーゼと最大の類似性を示す。
【０１０６】
Fritz Thummler, Department of Botany, University of Munichによって、ある方向性をもつヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)λZAP cDNAライブラリーが提供された（Pasentsisら, Plant J., 13, 1, 1998: 51-61）。このヤノウエノアカゴケライブラリーをPCR試験に供し、ここで上記のDNAサブ配列 Cer1、Cer3およびCer16から特異的プライマーを誘導した：
特異的前進および逆進プライマー：
PCRによってcDNAライブラリーから増幅した生成物の制限分析（HindIIIおよびEcoRV）から、3つの場合すべてにおいて、ss-cDNAからのPCR増幅物と同一の制限パターンが示された。すなわち、ヤノウエノアカゴケcDNAライブラリーは3つのクローンCer1、Cer3およびCer16を含んでいる。
【０１０７】
実施例７
完全長クローンの cDNA ライブラリースクリーニングおよび配列解析
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)λZAP cDNAライブラリーからの完全長クローンをさらにスクリーニングするために、ss-cDNA（実施例6参照）から増幅した3種の〜570 bp PCR断片、Cer1、Cer3およびCer16のpGEM-T中のDNAミニプレップがM.LeeおよびS.Stymneに 手渡された。現在のところ、このcDNAライブラリースクリーニングでおよそ2.2kbのインサートを有するCer1およびCer3の2つの完全長クローンが得られており、これをλZAPベクターからEcoRI/KpnI断片としてpuc19ベクター（New England Biolabs）のEcoRI/KpnI切断部位にサブクローン化し、そして大腸菌 JM105中に形質転換した。
【０１０８】
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションプローブとしてCer1およびCer3によるcDNAライブラリーのさらなるスクリーニングから、Cer1と相同性を有する少なくとも１つの別のクローンが存在することが明らかになり、これはおそらくΔ5-デサチュラーゼをコードすると考えられる。
【０１０９】
2つの大腸菌クローン、Cer1-50およびCer3-50を完全に配列決定した。Cer1-50は長さが2003 bp（配列番号１＝5'および3'非翻訳領域ならびにpolyAを含むヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼのヌクレオチド配列）で、483アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号２＝ヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼの推定アミノ酸配列）をコードする。Cer3-50は長さが2142 bp（配列番号１１＝5'および3'非翻訳領域を含むヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-デサチュラーゼのヌクレオチド配列[2142 bp]）で、520アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号１２＝ヤノウエノアカゴケからのΔ6-デサチュラーゼの推定アミノ酸配列）を有する。両タンパク質配列はN末端に高度に保存されたチトクロームb5由来のHPGGモチーフ（Lederer F., Biochimie 76, 1994: 674-692）と、C末端にデサチュラーゼに特徴的な３つのヒスチジンボックス（Shanklinら, Biochemistry, 33 , 1994: 12787-12794）を示す。このように、これらは増えてきているチトクロームb5融合タンパク質のファミリー（Napierら, Trends in Plant Science, 4, 1, 1999: 2-4）のさらなるメンバーを構成する。３番目のボックスの最初のヒスチジンはグルタミンに交換されており、このことは、Δ5-およびΔ6-アシル-脂質デサチュラーゼならびにΔ8-スフィンゴ脂質デサチュラーゼのもう１つの特徴である。
【０１１０】
実施例８
PCR による完全に機能活性なΔ 6- アセチレナーゼ／Δ 6- デサチュラーゼおよびΔ 6- デサチュラーゼのクローニング、およびベクターへのクローニングのための該配列の供給、ならびに酵母中での機能発現
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするcDNAを調製した。本明細書中に記載する実施例と同様にして、Δ6-デサチュラーゼをクローニングした（配列番号２、配列番号４および配列番号１２参照）。
【０１１１】
このクローニングは、最初にヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼに対するCer1 cDNAに基づくポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのオリゴヌクレオチドを誘導することにより実施する。
【０１１２】
Cer1から誘導した以下のプライマーを酵母中での発現のために適応させた：
PCR中の鋳型として、ヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼ cDNAを使用する。Δ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼcDNAの開始コドンの前に、プライマーによってBamHI制限切断部位を導入する。目的とするクローニングのために、終止コドンの後にSalI制限切断部位を導入する。反応混合物は、約1ng/マイクロlの鋳型DNA、0.5マイクロM オリゴヌクレオチドおよび200 マイクロM デオキシヌクレオチド（Pharmacia）、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl （25℃でpH 8.3、1.5 mM MgCl2）ならびに0.02 U/マイクロl Pwoポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を含有し、以下の温度プログラムでPerkin Elmer PCR装置中でインキュベートする：
アニーリング温度： 50℃、52秒
変性温度： 95℃、52秒
伸長温度： 72℃、90秒
サイクル数： 30
EcoRVで切断しておいたベクター pBluescript SK-（Stratagene）中に、生成した1467塩基対の断片を連結する。pBS-Cer1の制御した切断によって１クローンが同定されるが、そのインサートはBamHI/SalIによって全長が切除されている（1452塩基対プラス制限切断部位の15ヌクレオチド）。クローン Cer50のcDNA配列を使用することも、同様に可能である。これは、単官能性Δ6-デサチュラーゼである（配列番号３参照）。誘導されるアミノ酸配列は配列番号４中に見出だされる。
【０１１３】
微生物内でコードされた酵素の機能性を調べるため、BamHI/XhoIで切断しておいた発現ベクター pYES2（Invitrogen, Groningen, The Netherlands）中に、pBS-Cer1由来の1467 bp BamHI/SalI断片を連結し、標準的プロトコルによって、この新たに作製したプラスミド pYES2-Cer1を用いて酵母を形質転換する（Invitrogen形質転換プロトコル、Groningen,The Netherlands、参照）。生成するコロニーをラフィノース含有培地上で培養し、ガラクトースを用いてΔ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼ遺伝子発現を誘導する（下記参照）。
【０１１４】
実施例９
形質転換した酵母の脂質分析
酵母は内在性脂肪酸（16:0、16:1、18:0および18:1）ばかりでなく、外因性脂肪酸をもその膜脂質内に取り込むことができる。発現された特定のデサチュラーゼの基質特異性を試験するため、接種の前に、CM-2％ラフィノース培地に、外因性脂肪酸を可溶化するための1％ Tergitol NP-40（w/v、Sigma）および0.003％の当該脂肪酸（ストック溶液：5％ Tergitol NP-40中の0.3％もしくは3％脂肪酸、w/v）を補充する。トランスジェニック酵母コロニーと一緒にCM-2％ラフィノース培地／1％ Tergitol NP-40 3 mlを接種し、その後600 nmでの光学密度（OD600）が4.0〜4.3になるまで、30℃の回転装置で2日間、インキュベートすることによって、前培養を実施した。主培養のため、CM-2％ラフィノース／1％ Tergitol NP-40培地±0.003％脂肪酸 10 mlに前培養物（200倍希釈物）のアリコートをOD600が0.02になるまで接種し、振盪機で30℃、250 rpmで24時間インキュベートする。試験培養物は対数増殖期（OD600が0.5〜0.6）にガラクトースを1.8％まで添加することによって、誘導した。誘導した細胞を30℃でさらに24時間、通気して増殖させた後、OD600が4.0〜4.3で細胞を回収した。
【０１１５】
誘発した酵母細胞を2000 gで10分間の遠心分離によって回収し、蒸留水3 ml中に再懸濁し、100℃で10分間沸騰させ、氷上で冷却した後、再沈降させる。1 N メタノール性硫酸および2％ジメトキシプロパンを使用し、90℃で１時間、細胞沈降物を加水分解し、脂質をメチル基転移させた。生成した脂肪酸メチルエステル（FAME）を石油エーテルで抽出する。毛細管カラム（Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm）ならびに170℃〜240℃で20分間および240℃で5分間の温度勾配、を使用するガス液体クロマトグラフィーによって、抽出したFAMEを分析する。好適なFAME標準（Sigma）との比較によって、モノエン-、ジエン-、トリエン-およびテトラエン酸メチルエステルの実体を確認する。トリイン酸およびテトライン酸については、参照物質が入手できない。FAME混合物を好適な化学的誘導体、例えば4,4-ジメトキシオキサゾリン誘導体にすることによる、GC-MSに よって、その実体および三重結合の位置を分析する（Christie,1998）。ブランクベクター pYES2、pYES2-Cer1（Δ6-アセチレナーゼ）を用いて形質転換したトランスジェニック酵母由来の脂肪酸メチルエステルのGC分析を表１に示す。トランスジェニック酵母細胞を、外因性脂肪酸なしで、またはリノール酸（18:2）、γリノレン酸（γ-18:3）、α-リノレン酸（α-18:3）もしくは ω3-オクタデカテトラエン酸（18:4）の添加後に、分析する。
【０１１６】
表１は、ブランクベクター pYES2、ベクター pYES-Cer1（Cer1/pYES2）およびベクター pYES-Cer3（Cer3/pYES2）を用いて形質転換したトランスジェニック酵母由来の脂肪酸メチルエステルのGC分析を示すものである。トランスジェニック酵母細胞を、外因性脂肪酸なし（−）、またはリノール酸（18:2）、γリノレン酸（γ-18:3）、α-リノレン酸（α-18:3）もしくはω3-オクタデカテトラエン酸（18:4）の添加後に、分析した。各供給実験の総脂肪酸中の脂肪酸組成[mol％]、供給脂肪酸の取り込み、不飽和化生成物および総不飽和化生成物（最終行）を示している。
【０１１７】
実施例１０
Δ 6- アセチレナーゼ／デサチュラーゼ活性を有する酵素を過剰発現するトランス
ジェニック植物の作出
植物を形質転換するために、BamHI/SalIで切断しておいたベクターpBin-USPまたはpBinAR中にpBS-Cer1由来のBamHI/SalI断片を連結した形質転換ベクターを作出する。pBin-USPおよびpBinARはプラスミドpBin19の誘導体である。pBinARは、pBin19中に35S CaMVプロモーターをEcoRI-KpnI断片（カリフラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909-7437に相当する）（Franckら(1980) Cell 21,285）とし て挿入することによって、pBin19から作製した（Bevanら(1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711）。Tiプラスミド pTiACH5（Gielenら、(1984) EMBO J. 3, 835）のT-DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド11749-11939をPvuII-HindIII断片として単離し、そのPvuII切断部位にSphIリンカーを添加した後、ベクターのSphI-HindIII切断部位間でクローン化する。この結果、プラスミド pBinARが生成した（Hofgen and Willmitzer(1990) Plant Science 66,221-230）。これにはpBluescriptからの再クローニングによって、プロモーターとターミネーターの間に、利用可能ないくつかの制限切断部位がある。USPプロモーターはヌクレオチド1-684（Genbank 登録番号X56240）に相当し、そのプロモーター内にはUSP遺伝子の非コード領域の一部が存在している。サイズが684塩基対のプロモーター断片を、市販のT7標準プライマー（Stratagene）および合成プライマーを使用し、標準的方法によるPCRによって増幅した（プライマー配列：5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3'）。このPCR断片を次にEcoRI/SalIで切断し、ベクター pBinAR中に挿入した。その結果がpBinUSPと称されるプラスミドである。
【０１１８】
この構築物を使用して、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)およびアブラナ植物を形質転換する。
【０１１９】
カナマイシンおよびセフォタキシム(Claforan)を含む2MS培地上で再生した新芽を取得し、発根後、土中に移し、空調付チャンバまたは温室内で2週間育成後、開花を誘導し、成熟種子を収穫し、脂質分析によって、Δ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼ発現について調査する。アセチレン性脂肪酸もしくはデルタ6位の二重結合の含量が増加した系を同定する。機能的にトランス遺伝子を発現する、安定形質転換されたトランスジェニック系において、非形質転換対照植物と比較してアセチレン性脂肪酸もしくはデルタ6位の二重結合の含量の増加が見られる。
【０１２０】
実施例１１
種子からの脂質の抽出
酵母脂質の分析と同様にして、植物種子由来の脂質の分析を実行する。しかしながら、抽出のために利用し得るように、乳鉢を使用して、最初に植物材料を機械的にホモジナイズする。
【０１２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、タバコ形質転換ベクター、35SプロモーターをもつpBinAR（C）およびUSPプロモーターをもつpBin-USP（D）を示す。もとのベクターを図１A）およびB）に示す。
【配列表】
本発明は、不飽和脂肪酸の調製方法および不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法に関するものである。本発明はさらに、Δ6三重結合および／またはΔ6二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含量を増加させたトランスジェニック生物（好ましくは、トランスジェニック植物またはトランスジェニック微生物）を作出するための、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼまたはΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列の使用に関するものである。
【０００２】
加えて、本発明は、単離された核酸配列、該核酸配列を含む発現カセット、少なくとも１つの核酸配列または発現カセットを含むベクターおよび生物に関するものである。また、本発明は、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸含量の増加したトリグリセリド、ならびにそれらの使用にも関するものである。
【０００３】
脂肪酸やトリグリセリド類は食品産業、家畜の飼料、化粧品および薬品分野において様々な用途を有している。それらは、遊離の飽和または不飽和脂肪酸であるのか、あるいは飽和または不飽和脂肪酸含量の増加したトリグリセリドであるのかに応じて、用途はさまざまである。こうして、例えば、ポリ不飽和脂肪酸は栄養価を高めるためにベビーフードに添加される。種々の脂肪酸およびトリグリセリド類は、主として、モルティエラ属(mortierella)のような微生物から、またはダイズ、アブラナ、ヒマワリなどの油産生植物から、通常はトリグリセリドの形で、得られる。しかし、魚のような動物種からも得ることができる。遊離脂肪酸の調製には、けん化することが有利である。
【０００４】
使用目的如何により、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸をもつ油が好適である。
例えば、不飽和脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸をもつ脂質はヒトの栄養には好ましいものである。なぜならば、それらは血中コレステロールレベルに有益な効果を及ぼし、ひいては心疾患の発症にも影響を与えるからである。それらは各種のヒト食品および医薬品において汎用されている。
【０００５】
それらの有益な性質のため、これまでは、種々の生物において不飽和脂肪酸含量を改変した油を製造するための、脂肪酸およびトリグリセリドの合成に関与する遺伝子を利用可能にするアプローチは全く存在しなかった。こうして、国際公開WO 91/13972およびそのUS対応物はΔ9-デサチュラーゼを開示している。WO 93/11245はΔ15-デサチュラーゼを、そしてWO 94/11516はΔ12-デサチュラーゼをクレームしている。Δ6-デサチュラーゼはWO 93/06712、US 5,614,393、WO 96/21022およびWO 99/27111に記載されている。別のデサチュラーゼは、例えば、EP-A-0 550 162、WO 94/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0 794 250、Stukeyら, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149、Wadaら, Nature 347, 1990: 200-203、またはHuangら, Lipids 34, 1999: 649-659に記載されている。WO 96/13591はΔ6-パルミトイル-ACP-デサチュラーゼを開示し、クレームしている。しかしながら、各種デサチュラーゼの生化学的特性決定は、これらの酵素が膜に結合されたタンパク質として単離され、特性決定に非常な困難性が伴うため、これまで不十分であった(McKeonら, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147、Wangら, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792)。
【０００６】
WO 97/37033はΔ12-アセチレナーゼを開示している。この酵素は三重結合をもつ不飽和C18-脂肪酸を製造するために用いることができる。ヒト食品中での使用のほかに、このタイプの脂肪酸は、その反応性ゆえに、ポリマーの製造にも使用される。Sperlingらは、同様に脂肪酸に三重結合を導入する酵素を該酵素のクローニングに関するミーティング(South Lake Tahoe, Canada, June 9-13, 1999)で報じているが、この酵素の基質はΔ12-アセチレナーゼのものと相違し、この酵素は脂肪酸の異なる位置に三重結合を導入する。
【０００７】
酵母においては、不飽和脂肪酸に対する脂肪酸スペクトルの変更と、その生産性の増加とを、ともに実証することができた（Huangら, Lipids 34, 1999: 649-659、Napierら, Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614を参照されたい）。しかし、トランスジェニック植物での各種デサチュラーゼの発現は必要とされる成果を収めなかった。不飽和脂肪酸に対する脂肪酸スペクトルの変更を示すことはできたものの、同時にトランスジェニック植物の合成能の著しい低下が見られ、すなわち、もとの植物と比較してほんの少量の油しか得られないことが明らかになった。
【０００８】
したがって、不飽和脂肪酸の生合成に関与する酵素をコードし、かつ工業的規模での不飽和脂肪酸の製造を可能にする、新規遺伝子の大きな必要性が依然として存在する。
【０００９】
本発明の目的は、共役不飽和脂肪酸の合成のための更なる酵素を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、この目的が、Δ6-アセチレナーゼ活性および／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列によって達成されることを見いだした。上記の核酸配列は、次の群：
a) 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列を有する核酸配列、
b) 遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した核酸配列から誘導される核酸配列、
c) 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した核酸配列の誘導体であって、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびアミノ酸レベルで少なくとも75％の相同性を有しかつ該ポリペプチドの酵素活性が無視できる程度にしか低下していないポリペプチド、をコードする該誘導体、
から選択されるものである。
【００１１】
誘導体とは、例えば、配列番号１、配列番号３または配列番号11によりコードされる酵素の機能性相同体またはそれらの酵素活性の機能性相同体、すなわち、配列番号１、配列番号３または配列番号11によりコードされる酵素と同じ酵素反応を触媒する酵素を意味する。これらの遺伝子は同様に６位に三重結合および／または二重結合をもつ不飽和脂肪酸を有利に調製することを可能にする。不飽和脂肪酸とは、以後、三重結合および／または二重結合の不飽和を１以上有する脂肪酸をさす。三重および／または二重結合は共役していても、していなくてもよい。配列番号１、配列番号３または配列番号11において特定された配列は、アセチレナーゼ活性および／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有する新規酵素をコードするものである。
【００１２】
この新規酵素Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼは、グリセロ脂質の脂肪酸残基にC6-C7位置でシス二重結合を導入し、かつ／また、C6-C7位置にすでに存在するシス二重結合を三重結合に変換するのに有利である（配列番号１または配列番号３を参照）。さらに、この酵素はグリセロ脂質の脂肪酸残基にC6-C7位置でシス二重結合を有利にかつ排他的に導入するΔ6-デサチュラーゼ活性を有する。配列番号11において特定された配列を有する酵素はこの活性を示し、一官能性のΔ6-デサチュラーゼである。
【００１３】
新規の核酸配列（本明細書中では単数は複数を含むものであり、同様にその逆も言える）またはその断片は、相同性スクリーニングにより更なるゲノム配列を単離するために有利に用いることができる。
【００１４】
上記の誘導体は、例えば真核生物（例：植物、特にコケ類、渦鞭毛虫、真菌）などの他の生物から単離することができる。
【００１５】
さらに、配列番号１、配列番号３または配列番号11に特定された配列の誘導体または機能性誘導体は、例えば、誘導されたアミノ酸レベルで、少なくとも70％の相同性、有利には少なくとも75％の相同性、好ましくは少なくとも80％の相同性、特に好ましくは少なくとも85％の相同性、最も好ましくは90％の相同性を有する対立遺伝子変異体を意味する。この相同性は全アミノ酸領域にわたって計算されたものである。プログラムとして、PileUp、BESTFIT、GAP、TRANSLATEまたはBACKTRANSLATE（＝UWGCGプログラムパッケージの構成要素、Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Devereuxら, Nucleic Acids Res., 12, 1984: 387-395）を使用した(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987、Higginsら, CABIOS, 5 1989: 151-153)。特定された核酸から誘導されるアミノ酸配列は配列番号２、配列番号４および配列番号12に示される。相同性は同一性と同義であり、すなわち、アミノ酸配列は少なくとも70％の同一性を有する。新規配列は、核酸レベルで、少なくとも65％の相同性、好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは75％、最も好ましくは少なくとも80％の相同性を示す。
【００１６】
対立遺伝子変異体は、特に、ヌクレオチドの欠失、挿入または置換により配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列から得られ、誘導された合成タンパク質が酵素活性を保持している機能性変異体を含む。
【００１７】
そのようなDNA配列は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号11に示したDNA配列、またはこれらの配列の一部から出発して、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはPCR技法を使って、上記したような他の真核生物より単離することができる。こうしたDNA配列は標準条件下で上記の配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのためには、例えば保存領域（当業者に公知の方法で他のアセチレナーゼおよび／またはデサチュラーゼ遺伝子と比較することにより確認できる）の、短いオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。ヒスチジンボックス配列を用いることが好ましい。しかし、ハイブリダイゼーションのために新規核酸のより長い断片または完全な配列を使用することも可能である。これらの標準条件は、用いる核酸、すなわちオリゴヌクレオチドか、より長い断片か、完全な配列かに応じて、また、どのタイプの核酸か、すなわちDNAかRNAかに応じて、変化する。例えば、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は同じ長さのDNA:RNAハイブリッドの融解温度よりも約10℃低くなる。
【００１８】
標準条件は、例えば、核酸に応じて、0.1〜5xSSC（1xSSCは0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2）の濃度の水性バッファー溶液中にて42〜58℃の温度、または、さらに50% ホルムアミドの存在下で、例えば5xSSC、50% ホルムアミド中にて42℃の温度を意味する。DNA:DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、有利には0.1xSSCおよび約20〜45℃の温度であり、約30〜45℃が好ましい。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、有利には0.1xSSCおよび約30〜55℃の温度であり、約45〜55℃が好ましい。ハイブリダイゼーションのための上記温度は、例として、ホルムアミドの非存在下に長さが約100ヌクレオチドで、G+C含量が50%の核酸について計算した融解温度である。DNAハイブリダイゼーションのための実験条件は、適切な遺伝学の教科書、例えば、Sambrookら, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に記載されており、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性質またはG+C含量に応じて、当業者に公知の式により求めることができる。ハイブリダイゼーションに関する更なる情報は、当業者であれば、下記の教科書中に見いだすことができる。すなわち、Ausubelら(編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; HamesおよびHiggins(編), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown(編), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００１９】
誘導体はまた、配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列の相同体、例えば真核生物の相同体、トランケートされた配列、コードおよび非コードDNA配列の一本鎖DNA、またはコードおよび非コードDNA配列のRNAを意味する。
【００２０】
さらに、配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列の相同体は、例えばプロモーター変異体のような誘導体を意味する。これらの変異体は１個以上のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失によって改変することができるが、プロモーターの機能性または効力を損なわないようにする。プロモーターはさらに、その配列を改変することによりその効力を増強したり、効力がより強いプロモーター（異種生物由来でさえも）で完全に置換したりしてもよい。
【００２１】
誘導体はまた、有利には、開始コドンの前の-1から-2000の領域のヌクレオチド配列が改変されていて、遺伝子発現および／またはタンパク質発現が変化している、好ましくは増加している変異体をも意味する。また、誘導体には3'末端で改変された変異体も含まれる。
【００２２】
誘導体はさらに、新規タンパク質の生合成を阻害するために使用できるアンチセンスDNAをも指す。これらのアンチセンスDNAは、酵素活性を全くもたない誘導体のような新規の非機能性誘導体に含まれる。非機能性誘導体を製造するための当業者に公知の他の方法は、いわゆる共抑制、リボザイムおよびイントロンの使用である。リボザイムは、それらに相補的なmRNAなどの一本鎖核酸を切断できるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒RNA分子である。こうしたリボザイムを使用することによって(HaselhoffおよびGerlach, Nature, 334, 1988: 585-591)、mRNA転写産物を触媒的に開裂させ、このmRNAの翻訳を抑制することが可能である。このタイプのリボザイムはその仕事のために特別に注文して作ることができる(US 4,987,071; US 5,116,742; Bartelら, Science 261, 1993: 1411-1418)。こうして、飽和脂肪酸含量の増加した脂肪酸、脂質または油を調製することはアンチセンスDNAの使用によって可能である。
【００２３】
Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードする新規核酸配列は、合成によって調製しても、天然から単離してもよく、または合成DNA成分と天然DNA成分の混合物を含んでいてもよく、様々な生物に由来する多様な異種Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子部分から成る。一般に、合成ヌクレオチド配列は相応の宿主生物（例えば、植物）に好まれるコドンを使って調製される。これにより、通常、異種遺伝子の最適な発現がもたらされる。植物にとって好ましいコドンは、大部分の対象植物種において発現される、最大タンパク質頻度をもつコドンから決定される。Corynebacterium glutamicumについての一例は、Wadaら (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118に示されている。この種の実験は当業者に公知の標準的な方法を用いて行なうことができる。
【００２４】
Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子をコードする機能的に均等な配列は、異なるヌクレオチド配列にもかかわらず、必要とされる機能（すなわち、該タンパク質の酵素活性）をなおも有する新規配列の誘導体である。こうして、機能的均等物は本明細書に開示した配列の天然に存在する変異体、および人工的なヌクレオチド配列（例えば、化学合成により得られ、植物のコドン使用頻度に適合させたもの）を含むものである。
【００２５】
さらに、人工的DNA配列は、上記のように、それらが必要な性質（例えば、作物におけるΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の過剰発現による、植物に含まれる脂肪酸、油または脂質中のΔ6三重結合またはΔ6二重結合の含量の増加）を付与するかぎり、好適である。そのような人工的DNA配列は、例えば、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有する構築されたタンパク質の分子モデリングを用いた逆翻訳により、あるいはin vitro選択により確立することができる。DNA配列を改変または改良するためのDNAの可能なin vitro進化法は、Patten, P.A.ら, Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997)またはMoore, J.C.ら, Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997)に記載されている。宿主植物に固有のコドン使用頻度に従うポリペプチド配列の逆翻訳により得られたコードDNA配列が特に好ましいものである。固有のコドン使用頻度は、植物遺伝学の手法に習熟した当業者であれば、形質転換すべき植物の他の既知遺伝子のコンピュータ解析により容易に確立することができる。
【００２６】
さらに記載すべき好ましい等価の核酸配列は、融合タンパク質（融合タンパク質の一成分がΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼポリペプチド、あるいはその機能性等価部分である）をコードする配列である。融合タンパク質の第２の部分は、例えば、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼの発現を検出するのに役立つ酵素活性をもつ別のポリペプチドまたは抗原ポリペプチド配列（例えば、mycタグ、hisタグ）でありうる。しかしながら、それはΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼタンパク質を必要な作用部位に案内する調節タンパク質配列（例えば、ERのためのシグナル配列）であることが好ましい。
【００２７】
新規方法においてはΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼまたはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子を脂肪酸生合成の他の遺伝子と組み合わせることが有利でありうる。そのような遺伝子の例はアセチルトランスフェラーゼ、他のデサチュラーゼまたはエロンガーゼである。in vivo合成、特にin vitro合成にとっては、例えば、還元当量を受け取るか、または放出することができるNADHシトクロムB5レダクターゼとの組合せが有利である。
【００２８】
新規のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号12に示したアミノ酸配列、またはこれらの配列から１個以上のアミノ酸残基の置換、逆位、挿入または欠失により得られ、かつ配列番号２、配列番号４もしくは配列番号12で表されるタンパク質の酵素活性が保持されているか、または無視できる程度にしか低下していない配列を含むタンパク質を意味する。「無視できる程度にしか低下していない」とは、もとの酵素の酵素活性の少なくとも10％、好ましくは20％、特に好ましくは30％を依然保持している、あらゆる酵素を指す。さらに、例えば、特定のアミノ酸を、同様の物理化学的性質（大きさ、塩基性、疎水性など）を有するアミノ酸と置換することが可能である。例えば、アルギニン残基はリシン残基と、バリン残基はイソロイシン残基と、アスパラギン酸残基はグルタミン酸残基と置換できる。しかしまた、それらの配列において１個以上のアミノ酸を交換、付加、または欠失することも可能であり、こうした手段のいくつかを一緒に組み合わせることもできる。
【００２９】
また、誘導体は、特にΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードする最初に単離された配列の自然のまたは人工的な突然変異を含み、かつ必要な機能をさらに示す（すなわち、酵素活性が無視できる程度にしか低下していない）機能性等価物をも意味する。突然変異は１個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転位または挿入を含む。かくして、本発明は、例えば、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼヌクレオチド配列の改変によって得られるヌクレオチド配列をも含むものである。そのような改変の目的は、例えば、そこに含まれるコード配列を局在化することであったり、また、例えば更なる制限酵素開裂部位を挿入することである。
【００３０】
機能性等価物はまた、その機能が、もとの遺伝子または遺伝子断片と比較して、弱まっている（無視できる程度にしか低下していない）か、または増強している（＝もとの酵素の活性より大きい酵素活性、すなわち、酵素活性が100％を超える、好ましくは110％以上、特に好ましくは130％以上である）変異体である。
【００３１】
核酸配列は、さらに有利には、例えば、DNAまたはcDNA配列でありうる。新規の発現カセットに挿入するのに適したコード配列は、例えば、６位に三重結合および／または二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質を過剰産生する能力を宿主に付与する、上記配列を有するΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードするものである。これらの配列は同種または異種起源のものであってよい。
【００３２】
新規の発現カセット（＝核酸構築物または断片）は、配列番号１、配列番号３または配列番号11において特定された配列、および遺伝子コードから生じる配列、および／または、有利には遺伝子発現を増強するまたは宿主細胞におけるコード配列の発現を制御する１以上の調節シグナルに機能的に連結された、それらの機能性または非機能性誘導体を意味する。これらの調節配列は特定の遺伝子発現およびタンパク質発現を可能にするためのものである。このことは、例えば、宿主生物に応じて、遺伝子が誘導後にのみ発現および／または過剰発現されること、または遺伝子が直ちに発現および／または過剰発現されることを意味しうる。例えば、こうした調節配列は、インデューサーまたはリプレッサーと結合することにより核酸の発現を調節する配列である。これらの新規の調節配列に加えて、またはこれらの配列の代わりに、こうした配列の天然の調節が、実際の構造遺伝子の前にまだ存在することが可能であり、適宜に、天然の調節が切り替わって遺伝子の発現が増加するように遺伝的に改変されていることも可能である。しかし、遺伝子構築物はもっと単純な構造をしていてもよく、すなわち、核酸配列またはその誘導体の前に追加の調節シグナルがまったく挿入されていなくてもよい。また、天然のプロモーターがその調節と共に欠失されていなくてもよい。その代わりに、天然の調節配列に突然変異を起こさせて、調節がもはや起こらないように、かつ／また、遺伝子発現が増加するようにしてもよい。これらの改変プロモーターはまた、活性を高めるために天然遺伝子の前に部分配列（＝新規核酸配列の部分を有するプロモーター）の形で単独で配置してもよい。さらに、遺伝子構築物は、核酸配列の発現を高めることができる１以上のエンハンサー配列を、プロモーターに機能的に連結させた形で含むことが有利である。また、DNA配列の3'末端に、更なる調節エレメントまたはターミネーターなどの好適な追加の配列を挿入することも可能である。Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子は発現カセット（＝遺伝子構築物）中に１以上のコピー数で存在することができる。
【００３３】
さらに、調節配列または因子は、上記のように、挿入遺伝子の発現に有益な影響を及ぼし、ひいてはその発現を高めることが好ましい。かくして、調節エレメントの強化は、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることで、転写レベルで有利に行なうことができる。しかし、例えばmRNAの安定性を改善することにより、翻訳を増強することも可能である。
【００３４】
発現カセットに適したプロモーターは、主に、生物（有利には、植物または真菌）内で外来遺伝子の発現を制御できるプロモーターである。たいていは、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターを用いることが好ましい。新規方法のために有利な調節配列は、例えば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRなどのプロモーター中、またはλ-PLプロモーター中に存在し、これらはグラム陰性細菌内で使用することが有利である。さらに好適な調節配列は、例えば、グラム陽性細菌のプロモーターであるamyおよびSPO2、酵母や真菌のプロモーターであるADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH、または植物のプロモーターであるCaMV/35S [Franckら, Cell 21(1980) 285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos（＝ノパリンシンターゼプロモーター）、またはユビキチンプロモーター中に存在する。発現カセットはまた、化学的に誘導可能なプロモーターを含むことができ、かかるプロモーターを用いることで、生物（有利には、植物）における外因性Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現を特定の時期で制御することができる。そのような有利な植物プロモーターの例としては、PRP1プロモーター [Wardら, Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366]、ベンゼンスルホンアミド誘導性(EP 388186)、テトラサイクリン誘導性 (Gatzら, (1992) Plant J. 2, 397-404)、サリチル酸誘導性プロモーター (WO 95/19443)、アブシジン酸誘導性 (EP 335528)またはエタノールもしくはシクロヘキサノン誘導性 (WO 93/21334)プロモーターがある。有利に使用できる植物プロモーターの他の例は、ジャガイモ由来の細胞質FBPアーゼのプロモーター、ジャガイモ由来のST-LSIプロモーター (Stockhausら, EMBO J. 8 (1989) 2445-245)、ダイズ(Glycine max)由来のホスホリボシル-ピロリン酸アミドトランスフェラーゼのプロモーター（Genbank登録番号 U87999も参照のこと）またはEP 249676に記載されるような節(node)特異的プロモーターである。特に好ましい植物プロモーターは、脂肪酸またはその前駆体の生合成が起こる組織または植物部分／器官（例えば、胚乳もしくは発生中の胚）における発現を確実にするプロモーターである。種子特異的発現を確実にする有利なプロモーターとして、例えば、USPプロモーターもしくはその誘導体、LEB4プロモーター、ファセオリンプロモーターまたはナピンプロモーターが挙げられる。特に有利なUSPプロモーターまたはその誘導体は、種子発生の非常に早い時期に遺伝子発現を媒介する(Baeumleinら, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67)。単子葉および双子葉植物に使用できる別の有利な種子特異的プロモーターは、例えば、アブラナ由来のナピン遺伝子プロモーター(US 5,608,152)、シロイヌナズナ(arabidopsis)由来のオレオシンプロモーター(WO 98/45461)、白インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)由来のファセオリンプロモーター(US 5,504,200)、アブラナ由来のBce4プロモーター(WO 91/13980)、もしくはマメ科植物のB4プロモーター(LeB4、Baeumleinら, Plant J., 2, 2, 1992: 233-239)のような双子葉植物に適するプロモーター、または、例えば、オオムギ由来のlpt2もしくはlpt1遺伝子のプロモーター(WO 95/15389およびWO 95/23230)、またはオオムギのホーデイン(hordein)遺伝子、イネのグルテリン(glutelin)遺伝子、イネのオリジン(oryzin)遺伝子、イネのプロラミン(prolamin)遺伝子、コムギのグリアジン(gliadin)遺伝子、コムギのグルテリン遺伝子、トウモロコシのゼイン(zein)遺伝子、オートムギのグルテリン遺伝子、モロコシのカシリン(kasirin)遺伝子、もしくはライムギのセカリン(secalin)遺伝子のプロモーターのような単子葉植物に適するプロモーターであり、これらはWO 99/16890に記載されている。
【００３５】
さらに、特に好ましいプロモーターは、例えば脂肪酸、油、脂質またはそれらの前駆体の生合成が起こる、組織または植物部分における発現を確実にするものである。特に、種子特異的発現を確実にするプロモーターを挙げることができる。アブラナ由来のナピン遺伝子のプロモーター(US 5,608,152)、ファバ・ビーン(Vicia faba)由来のUSPプロモーター（USP＝未知の種子タンパク質、Baeumleinら, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67）、シロイヌナズナ由来のオレオシン遺伝子のプロモーター(WO 98/45461)、ファセオリンプロモーター(US 5,504,200)、またはマメ科植物のB4遺伝子のプロモーター(LeB4; Baeumleinら, 1992, Plant JOURNAL, 2(2): 233-239)が挙げられる。さらに、単子葉植物における種子特異的発現を付与するプロモーター、例えば、オオムギ由来のlpt2もしくはlpt1遺伝子のプロモーター(WO 95/15389およびWO 95/23230)も挙げられる。
【００３６】
発現カセット（＝遺伝子構築物、核酸構築物）は、上記のように、生物に導入すべき他の遺伝子を含んでいてもよい。これらの遺伝子はΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼの遺伝子と別個の調節領域下にあっても、同じ調節領域下にあってもよい。こうした遺伝子の例は、増大した合成を可能にする別の生合成遺伝子、有利には脂肪酸生合成の遺伝子である。例として、Δ15-、Δ12-、Δ9-、Δ6-、およびΔ5-デサチュラーゼ、種々のヒドロキシラーゼ、Δ12-アセチレナーゼ、アシルACPチオエステラーゼ、β-ケトアシルACPシンターゼ、またはβ-ケトアシルACPレダクターゼの遺伝子が挙げられる。核酸構築物中ではデサチュラーゼ遺伝子を用いることが有利である。
【００３７】
原則として、後述する新規発現カセットおよび新規方法には、上で挙げたような天然のプロモーターをそれらの調節配列と共に用いることが可能である。また、合成プロモーターを使用できるし、その上有利でもある。
【００３８】
発現カセットを作製するには、便宜上正しい方向で読み取られ、かつ正しい読み枠を備えているヌクレオチド配列を得るために、各種のDNA断片を操作する。DNA断片（＝新規の核酸）を一緒に連結させるために、DNA断片にアダプターまたはリンカーを結合させることができる。
【００３９】
プロモーターおよびターミネーター領域は、リンカーまたはポリリンカー（この配列の挿入のための１以上の制限部位を含む）と共に転写方向で提供することが可能で、好都合でもある。リンカーは通常１〜10、一般には１〜８、好ましくは２〜６の制限部位をもっている。調節領域内のリンカーの大きさは、一般に100bp未満、たいていは60bp未満で、５bp以上である。プロモーターは宿主生物（例えば、宿主植物）に対して天然または同種でも、外来または異種であってもよい。発現カセットは、5'−3'の転写方向で、プロモーター、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列、および転写終結領域を含む。各種の終結領域を希望どおりに相互交換することができる。
【００４０】
さらに、適切な制限開裂部位を挿入したり、過剰のDNAまたは制限開裂部位を欠失させる操作を施すことができる。トランジションやトランスバージョンのような挿入、欠失または置換が問題となる場合は、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーション（連結）を用いることができる。制限、チューイングバック(chewing back)、平滑末端とするための突出部分のフィルインなどの適切な操作を用いて、ライゲーション用の断片の相補端を作製することができる。
【００４１】
特定のER保持シグナルであるSEKDELの結合は、とりわけ、都合のよい高レベル発現にとって重要であり(Schouten, A.ら, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792)、これは平均発現レベルを３倍または４倍に高める。また、発現カセットを構築するために、ERに局在させる植物および動物タンパク質と共に、天然に存在する他の保持シグナルを利用してもよい。
【００４２】
好適なポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナルであり、好ましくは、本質的にAgrobacterium tumefaciens由来のT-DNAポリアデニル化シグナルに対応するもの、特にTiプラスミドpTiACH5 (Gielenら, EMBO J. 3 (1984), 835 ff)のT-DNAの遺伝子３（オクトピンシンターゼ）のもの、または対応する機能性等価物である。
【００４３】
発現カセットは、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) および T.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) および Ausubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)に記載されるような、通常の組換え・クローニング技術を使って、適当なプロモーターを、適当なΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼのDNA配列およびポリアデニル化シグナルに融合することにより作製される。
【００４４】
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列は、脂肪酸、脂質または油の生合成の部位として適切な局在化を達成するために必要とされる全ての配列特徴を含んでいる。したがって、他のターゲッティング配列をまったく必要としない。しかし、そのような局在化は望ましく、有利でもあるので、局在化を人工的に改変または増強することができ、そのような融合構築物もまた本発明の好ましい有利な実施形態である。
【００４５】
特に好ましい配列は、色素体へのターゲッティングを確実にするものである。いくつかの状況においては、他の構成要素へのターゲッティング（報告：Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423)、例えば、液胞、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、脂質体へのターゲッティング、あるいは、適切な機能性配列の不在により、産生コンパートメントである細胞質ゾルに残存させることが望ましいこともある。
【００４６】
新規の核酸配列は、少なくとも１つのレポーター遺伝子と共に発現カセット（ベクターを介して生物に導入されるか、ゲノムに直接導入される）にクローニングすることが有利である。このレポーター遺伝子は、増殖、蛍光、化学もしくは生物発光、または耐性の各アッセイにより、あるいは光学測定により、簡便な検出を可能にすべきである。レポーター遺伝子の例として、抗生物質もしくは除草剤耐性遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、化学発光遺伝子、糖もしくはヌクレオチド代謝遺伝子、または生合成遺伝子、例えば、Ura3遺伝子、Ilv2遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、gfp遺伝子、2-デオキシグルコース-6-リン酸ホスファターゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子もしくはBASTA（＝グルホシネート耐性）遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は転写活性（ひいては遺伝子発現）の測定および定量を容易に行なえるようにする。したがって、生産性の差異を示すゲノムの部位を同定することが可能である。
【００４７】
好ましい実施形態において、発現カセットは、コード配列の上流すなわち5'末端にプロモーター、およびコード配列の下流すなわち3'末端にポリアデニル化シグナルを含み、適宜に、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼのDNA配列のための、該コード配列に機能的に連結された別の調節エレメントを含有する。機能的に連結されたとは、各調節エレメントがコード配列の発現において意図された機能を果たせるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター、適宜に、追加の調節エレメントの逐次的配置を意味する。機能的に連結させるのに好適な配列は、色素体への細胞下局在を確実にするターゲッティング配列である。しかし、ミトコンドリア、小胞体(ER)、細胞核、エライオプラスト（脂肪体）または他のコンパートメントへの細胞下局在を確実にするターゲッティング配列も必要に応じて使用することができる。同様に、タバコモザイクウイルス由来の5'リーダー配列のような翻訳エンハンサーも利用できる(Gallieら, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711)。
【００４８】
発現カセットは、例えば、構成プロモーター（好ましくは、USPまたはナピンプロモーター）、発現すべき遺伝子、およびER保持シグナルを含みうる。用いるのに適したER保持シグナルはアミノ酸配列：KDEL（リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン）である。
【００４９】
発現のために、発現カセットは原核または真核宿主生物（例えば、真菌のような微生物または植物）に挿入され、有利には、該遺伝子の宿主生物における最適な発現を可能にするベクター（例えば、プラスミド、ファージ、または他のDNA）に挿入される。適当なプラスミドの例は、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322のようなpBR系列、pUC18 またはpUC19 のようなpUC系列、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、またはpBdCI、ストレプトミセス属のpIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361、バシラス属のpUB110、pC194またはpBD214、コリネバクテリウム属のpSA77またはpAJ667、真菌のpALS1、pIL2またはpBB116である。さらに有利な真菌ベクターは、Romanos, M.A.ら[(1992)「酵母における外来遺伝子発現：レビュー」Yeast 8: 423-488]およびvan den Hondel, C.A.M.J.J.ら[(1991)「糸状真菌における異種遺伝子発現」]およびMore Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure編, p.396-428: Academic Press: San Diego]および「糸状真菌のための遺伝子導入系およびベクターの開発」[van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.ら編, p.1-28, Cambridge University Press: Cambridge]に記載されている。有利な酵母プロモーターの例は、2μM、pAG-1、YEp6、YEp13およびpEMBLYe23である。藻類または植物プロモーターの例は、pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKHおよびpDH51である（Schmidt, R.およびWillmitzer, L., 1988を参照のこと）。上記ベクターまたは上記ベクターの誘導体は、使用可能なプラスミドのわずかな選択にすぎない。別のプラスミドが当業者にはよく知られており、例えば、Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら編, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) という書物に載っている。適当な植物ベクターは、特に、「植物の分子生物学およびバイオテクノロジーの方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)」(CRC Press)、第6/7章、第71-119頁に記載されている。好ましいベクターは大腸菌およびアグロバクテリウム中で複製するシャトルベクターまたはバイナリーベクターである。
【００５０】
プラスミドは別として、ベクターは当業者に知られたあらゆる他のベクターをも意味し、例えば、ファージ、ウイルス（SV40、CMV、バキュロウイルス、アデノウイルスなど）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状または環状DNAが含まれる。これらのベクターは宿主生物中での自律複製または染色体複製が可能であり、染色体複製が好適である。
【００５１】
ベクターの更なる実施形態において、新規の発現カセットは、線状DNAの形で生物に都合よく導入して、宿主生物のゲノムに異種または相同組換えによって組み込むこともできる。この線状DNAは、線状化したプラスミドであっても、ベクターとしての発現カセットまたは新規核酸配列のみであってもよい。
【００５２】
さらに有利な実施形態においては、新規核酸配列を生物に単独で導入することもできる。
【００５３】
この新規核酸配列の他に、別の遺伝子をその生物内に導入しようとする場合は、全部一緒に単一のベクター中にレポーター遺伝子とともに入れるか、あるいは個別の遺伝子をそれぞれ１個のベクター中にレポーター遺伝子とともに入れて、生物内に導入することが可能である。この場合、多種のベクターを同時にまたは順次導入することができる。
【００５４】
ベクターは少なくとも１コピーの新規核酸配列および／または新規発現カセットを含むものが好都合である。
【００５５】
例えば、植物発現カセットをタバコ形質転換ベクターpBinAR中に組み込むことが可能である。図１はタバコ形質転換ベクター、35SプロモーターをもつpBinAR（C）およびUSPプロモーターをもつpBin-USP（D）を示す。もとのベクターを図１A）およびB）に示す。
【００５６】
これとは別に、例えば、T7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼを使用することによる、組換えベクター（＝発現ベクター）のin vitro転写および翻訳もまた可能である。
【００５７】
原核生物中で使用する発現ベクターは、融合タンパク質若しくは融合オリゴペプチドを含むまたは含まない誘導系を利用することが多いが、これらの融合は、N末端およびC末端の両方で、たは１タンパク質中で使用できるその他のドメイン上で生起させることが可能である。このタイプの融合ベクターは通常次の目的で使用される。すなわち、i) RNA発現率を増大させる、ii) 達成しうるタンパク質合成率を増大させる、iii) タンパク質の溶解性を増大させる、またはiv) アフィニティークロマトグラフィーに使用できる結合配列によって精製を単純化する。しばしば、融合タンパク質を介してタンパク質分解性開裂部位を導入して、精製するために融合タンパク質の一部の除去を可能にする。こうしたプロテアーゼのための認識配列は、例えば因子Xa、トロンビンおよびエンテロキナーゼを認識する。
【００５８】
典型的な好都合な融合および発現ベクターは、pGEX [Pharmacia Biotech Inc； Smith,D.B. and Johnson,K.S.(1988) Gene 67:31-40]、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合性タンパク質、またはプロテインAを含むpRIT5（Pharmacia, Piscataway, NJ）である。
【００５９】
大腸菌発現ベクターの別の例は、pTrc [Amannら、(1988) Gene 69:301-315]およびpETベクター[Studierら、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89； Stratagene, Amsterdam, The Netherlands]である。
【００６０】
酵母中で使用するための別の好都合なベクターは、pYepSec1（Baldariら、(1987) Embo J.6:229-234）、pMFa（Kurjan and Herskowitz,(1982) Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら、(1987) Gene 54:113-123）、およびpYES誘導体（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）である。糸状菌中で使用するためのベクターは以下の文献に記載されている：van den Hondel,C.A.M.J.J. & Punt,P.J.(1991)「糸状菌のための遺伝子導入系およびベクターの開発」(Gene transfer system and vector development for filamentous fungi), Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F.Peberdyら編, p.1-28, Cambridge University Press: Cambridge。
【００６１】
例えばSf 9細胞中での発現のために、昆虫細胞発現ベクターを使用することも、別法として有利な可能性がある。これらの例はpAc系列（Smithら、(1983) Mol.Cell Biol. 3: 2156-2165）およびpVL系列（Lucklow and Summers(1989) Virology 170: 31-39）のベクターである。
【００６２】
さらに、遺伝子発現のために植物細胞または藻類細胞を使用することが可能で、有利である。植物発現ベクターの例は、Becker,D.ら、(1992) 「左ボーダー近傍に選択マーカーをもつ新規の植物バイナリーベクター」(New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border), Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197、またはBevan,M.W. (1984)「植物形質転換のためのバイナリーAgrobacteriumベクター」(Binary Agrobacterium vectors for plant transformation), Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721、に見出だされる。
【００６３】
この新規核酸配列を哺乳動物細胞中で発現させることもできる。適切な発現ベクターの例は、Seed,B.(1987) Nature 329:840またはKaufmanら(1987) EMBO J.6:187-195中に言及されているpCDM8およびpMT2PCである。これらの場合、使用する好ましいプロモーターは、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス若しくはシミアンウイルス40のプロモーターなどのウイルス起源のものである。その他の原核生物および真核生物発現系が、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd,ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の16および17章に記載されている。
【００６４】
この新規核酸、発現カセットまたはベクターの生物、例えば植物中への導入は、原則として当業者に知られたすべての方法によって実行することができる。
【００６５】
当業者は以下の教科書から微生物のための適切な方法を見出だすことができる：Sambrook,J.ら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F.M. Ausubelら、(1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons、D.M. Gloverら、DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press(ISBN 019-963476-9)、Kaiserら(1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press、またはGuthrieら、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press 。
【００６６】
植物のゲノム中への外来遺伝子の導入を形質転換と称する。この場合、一過性のまたは安定な形質転換のための、植物組織若しくは植物細胞の形質転換およびそれからの植物の再生に関して記載された方法が利用される。好適な方法は、ポリエチレングリコールで誘発されるDNA取込みによるプロトプラストの形質転換、遺伝子ガンによるバイオリスティック法、いわゆる粒子ボンバードメント法、エレクトロポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション、およびアグロバクテリウムが仲介する遺伝子導入である。提示した方法は、例えば Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, S.D. Kung and R. Wu編、Academic Press(1993) 128-143中のB. Jenesら、Techniques for Gene Transfer、およびPotrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225に記載されている。発現させる構築物を、好ましくはAgrobacterium tumefaciensを形質転換させるのに好適なベクター、例えばpBin19 （Bevanら、Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711）中にクローン化させる。次に、こうしたベクターで形質転換したアグロバクテリウムを公知の手法で使用して、例えば傷をつけた葉若しくは葉の小片をアグロバクテリウムの溶液中に浸漬し、その後好適な培地中で培養することによって、植物、特に例えばタバコ植物などの栽培植物を形質転換することができる。Agrobacterium tumefaciensによる植物の形質転換は、例えばHofgenおよびWillmitzerによってNucl. Acids Res.(1988) 16, 9877に記載されており、あるいは特に、Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, S.D.Kung and R.Wu編、Academic Press, 1993, pp.15-38中のF.F. White, 「高等植物遺伝子導入用ベクター」(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)中に開示されている。
【００６７】
新規発現ベクターで形質転換したアグロバクテリウムを同様に公知の手法で使用し、例えば傷をつけた葉または葉の小片をアグロバクテリウムの溶液中に浸漬し、その後好適な培地中で培養することによって、以下の植物：シロイヌナズナ(arabidopsis)などの試験植物、または穀草類、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ニンジン、パプリカ、アブラナ、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、センジュギク、アルファルファ、レタスならびに各種の樹木、堅果およびつる植物などの栽培植物など、特にダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ、アマ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）若しくはカカオ豆などの油産生栽培植物を形質転換することができる。
【００６８】
遺伝子改変した植物細胞を当業者に知られたすべての方法によって再生させることができる。適切な方法は上記のS.D. Kung and R. Wu、PotrykusまたはHofgen and Willmitzerによる出版物に見出だすことができる。
【００６９】
新規な核酸、発現カセット若しくはベクターにとって原則として好適で好都合な生物若しくは宿主生物は、脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を合成することができるか、または組換え遺伝子を発現するのに好適なすべての生物である。例を挙げると、シロイヌナズナなどの植物、キンセンカなどのキク科植物、またはダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ、アマ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）若しくはカカオ豆などの栽培植物、微生物、例えばMortierella、Saprolegnia若しくはPythium属などの真菌類、Escherichia属などの細菌、Saccharomyces属などの酵母、シアノバクテリウム、繊毛虫、藻類、あるいは原生動物、crypthecodiniumなどの渦鞭毛虫など、である。天然に油を比較的大量に合成することができる生物、Mortierella alpina、Pythium insidiosumなどの真菌類、またはダイズ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ、ヒマ、キンセンカ、ピーナッツ、カカオ豆若しくはヒマワリなどの植物、あるいはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母が好ましく、またダイズ、アブラナ、ヒマワリ、キンセンカまたはSaccharomyces cerevisiaeが特に好ましい。宿主生物として、トランスジェニック動物、例えばC.elegansも原則として好適である。
【００７０】
使用することができる宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)、に挙げられている。
【００７１】
使用することができる、例えば比較的低いプロテアーゼ活性をもつ発現菌株は、Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128、に記載されている。
【００７２】
本発明はさらに、植物細胞若しくは組織または植物の部分の形質転換のための、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子をコードするDNA配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に関する。その使用は、6位の三重結合および二重結合の含量が増加した脂肪酸、油または脂質の含量を増加させることが目的である。
【００７３】
さらに、プロモーターの選択如何によって、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現を、植物の葉、種子、塊茎またはその他の部分で特異的に生じさせることが可能である。こうしたΔ6三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質を過剰産生するトランスジェニック植物、それらの繁殖材料、ならびにそれらの植物細胞、組織若しくは部分は、本発明のさらに別の態様である。本発明は好ましくは、新規な機能性もしくは非機能性（＝アンチセンスDNAもしくは酵素的に不活性な酵素）核酸配列または機能性もしくは非機能性発現カセットを含むトランスジェニック植物に関する。
【００７４】
Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子配列を含む発現カセットまたは新規核酸配列はさらに、Δ6三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質の含量を増加させることを目的として、例として上に挙げた、細菌、シアノバクテリウム、酵母、糸状菌、繊毛虫および藻類などの生物を形質転換するために使用することができる。
【００７５】
本発明にとって、Δ6三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質の含量を増加させるとは、例えば、新規生物体、有利には新規トランスジェニック植物において、遺伝子改変をしていない当初の植物に比較して、少なくとも１植物世代の間、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の機能性過剰発現によって、生合成活性を増加させる、人工的に獲得された能力、を意味する。
【００７６】
脂肪酸、油または脂質の生合成の部位は、例えば一般的には種子若しくは種子の細胞層であり、したがって、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の種子特異的発現が合理的である。しかし、脂肪酸、油または脂質の生合成は種子組織に限定されるものとは限らず、植物のすべての他の部分、例えば上皮細胞中、または塊茎中でも組織特異的に生じさせ得ることは明らかである。
【００７７】
その上、外因性Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の構成性発現が好都合である。しかし、その一方で、誘導性発現も望ましいだろう。
【００７８】
トランスジェニックΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現の有効性は、例えば、in vitroでの生長点分裂組織の増殖によって、判定することができる。その上、試験植物に対する温室実験において、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子の発現の特性およびレベルの変化、ならびに脂肪酸、油または脂質の生合成活性に及ぼすその影響を試験することができる。
【００７９】
本発明はさらに、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子をコードするDNA配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転換したトランスジェニック植物、ならびにこうした植物のトランスジェニック細胞、組織、部分および繁殖材料に関する。これに関係して特に好ましいのは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、アブラナおよびカノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、アルファルファ、レタスならびに各種の樹木、堅果およびつる植物などのトランスジェニック栽培植物である。
【００８０】
本発明の目的のための植物は、単子葉および双子葉植物または藻類である。
【００８１】
別の新規な実施形態は、機能性もしくは非機能性の新規核酸配列または機能性もしくは非機能性の新規発現カセットを含む、上に記載したトランスジェニック植物を含んでいる。非機能性とは、酵素的に活性なタンパク質の合成がなくなっていることを意味する。その上、非機能性核酸若しくは核酸構築物はまた、酵素活性の減少を示すかまたは酵素活性を何らもたないトランスジェニック植物をもたらす、いわゆるアンチセンスDNAを意味する。特に新規核酸配列をそのアンチセンスDNA中で別の脂肪酸合成遺伝子と結合させ、飽和脂肪酸の含量が増加したトリグリセリドを合成するか、あるいは飽和脂肪酸を合成するアンチセンス技法を使用することができる。トランスジェニック植物とは、個々の植物細胞および固体培地上もしくは液体培養液中のそれらの培養物、植物の部分ならびに植物全体を意味する。
【００８２】
本発明はさらに以下の件に関する：
- Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、植物全体または植物のプロトプラスト中に導入することを含む、植物を形質転換するための方法。
- 植物中でこのΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼDNAを発現させることによって、三重結合またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸、油または脂質の含量が増加した植物を作出するための、Δ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子配列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
- 配列番号８に示したアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 配列番号１０に示したアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 不飽和脂肪酸を製造するための、配列番号８および配列番号１０の配列を有するタンパク質の使用。
【００８３】
本発明はさらに、少なくとも１つの上記の新規核酸配列または少なくとも１つの新規核酸構築物を好ましくは油産生生物に導入し、この生物を培養し、この生物に含まれる油を単離し、そしてその油に含まれる脂肪酸を遊離させることを含む、不飽和脂肪酸を製造するための方法に関する。これらの不飽和脂肪酸は有利にはΔ6三重結合および／またはΔ6二重結合を含む。脂肪酸は、例えば塩基性加水分解（例えば、NaOHもしくはKOH）によって、油または脂質から遊離させることもできる。
【００８４】
本発明はさらに、不飽和脂肪酸の含量が増加したトリグリセリドを調製するための方法に関する。この方法は、少なくとも１つの上記の新規核酸配列または少なくとも１つの新規発現カセットを好ましくは油産生生物に導入し、この生物を培養し、そしてこの生物に含まれる油を単離することを含む。
【００８５】
本発明はさらに、飽和脂肪酸をもつか、不飽和脂肪酸をもつか、または飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸をもつトリグリセリドを、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１０もしくは配列番号１１の配列の１つによってコードされるタンパク質の少なくとも１種と共にインキュベートすることによる、不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法に関する。この方法は、還元当量を受け取るか、または放出することができる化合物の存在下で実施するのが好都合である。その後、このトリグリセリドから脂肪酸を遊離させることができる。
【００８６】
請求項１６または１７に記載された方法において、脂肪酸をトリグリセリドから遊離させる。
【００８７】
上記の方法は、Δ6三重結合および／またはΔ6二重結合をもつ脂肪酸含量が増加した脂肪酸またはトリグリセリドを好都合に合成することを可能にする。
【００８８】
１方法において、いわゆるアンチセンス技法を使用して、飽和脂肪酸含量が増加した脂肪酸またはトリグリセリドを調製することもできる。
【００８９】
これらの方法のための生物の例を挙げるならば、シロイヌナズナ、オオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、アブラナおよびカノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）若しくはカカオ豆などの植物、微生物、Mortierella、Saprolegnia若しくはPythium属などの真菌類、Escherichia属などの細菌、シアノバクテリウム、Saccharomyces属などの酵母、藻類、あるいは原生動物、crypthecodiniumなどの渦鞭毛虫である。Mortierella alpina、Pythium insidiosumなどの真菌、またはダイズ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ、ヒマ、キンセンカ、ピーナッツ、カカオ豆もしくはヒマワリなどの植物、またはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母などの、自然界で油を比較的大量に合成できる生物が好ましく、特に好ましいのはダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ベニバナ(carthamus)またはSaccharomyces cerevisiaeである。
【００９０】
本方法で使用する生物は、宿主生物に応じて、当業者に知られた方法で、生育または培養する。微生物は普通、糖の形態の炭素源、酵母エキスなどの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態の窒素源、鉄、マンガン、マグネシウム塩などの微量元素、および適宜にビタミン類を含む液体培地中で、0℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃の温度で、酸素を通しながら、培養する。栄養液のpHはこの間一定の値に保つ、すなわち培養中に制御することができ、制御しなくてもよい。培養は、バッチ式、半バッチ式または連続式で実施することができる。栄養源は培養の開始時に導入するか、またはその後半連続的もしくは連続的に投入することができる。
【００９１】
形質転換後、植物を最初に上記のように再生させ、その後通常の方法で培養または栽培する。
【００９２】
育成後、通常の方法で生物から脂質を単離する。この目的のため、収穫後に生物をまず破砕するか、または直接使用することができる。脂質は、好適な溶媒、ヘキサンなどの無極性溶媒、またはエタノール、イソプロパノール、またはヘキサン／イソプロパノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールなどの混合物などで、0℃〜80℃、好ましくは20℃〜50℃の温度で好都合に抽出される。バイオマスは普通、過剰の溶媒、例えばバイオマスに対して１：４の過剰の溶媒で抽出される。その後、例えば蒸留によって溶媒を除去する。抽出は超臨界CO2によっても実施することができる。抽出後に残留するバイオマスを例えば 濾過によって除去することができる。
【００９３】
次にこの方法で取得した粗油を、例えばアセトンもしくはクロロホルムなどの極性溶媒の添加およびその後の濾過もしくは遠心分離によって濁り分を除去することにより、さらに精製することができる。カラムによるさらなる精製も可能である。
【００９４】
トリグリセリドから遊離の脂肪酸を単離するためには、これを通常の方法で加水分解する。
【００９５】
本発明はさらに、上記の方法によって調製した、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の含量が増加したトリグリセリド、ならびにヒト食品、動物飼料、化粧品または医薬品を製造するためのこれらの使用に関する。こうした目的のため、これらを常套的な量でヒト食品、動物飼料、化粧品または医薬品に添加する。
【００９６】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。
【００９７】
実施例
実施例１
一般的なクローニング方法
例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロース膜およびナイロン膜への転移、DNA断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌の培養ならびに組換えDNA配列解析などのクローニング方法を、Sambrookら(1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press : ISBN 0-87969-309-6）によって記載されたようにして、実施した。
【００９８】
実施例２
組換え DNA 配列解析
Sangerの方法（Sangerら(1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463-5467）によって、ABIレーザー蛍光DNA配列解析機を使用して、組換えDNA分子を配列決定した。ポリメラーゼ連鎖反応から得られた断片を配列決定し、発現させる構築物内のポリメラーゼエラーを回避するために、検査した。
【００９９】
実施例３
トランスジェニックアブラナ植物の作出（ Moloney ら , 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242, の改変方法）
Agrobacterium tumefaciens C58C1：pGV2260または大腸菌中のバイナリーベクターを使用して、トランスジェニックアブラナ植物を作出した（Deblaereら, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788）。陽性形質転換したアグロバクテリアコロニーの3％ショ糖を含むMurashige-Skoog培地（Murashige and Skoog 1962 Physiol.Plant.15,473）（3MS培地）中での一晩培養物の1：50希釈物を使用することによって、アブラナ植物（Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Germany）を形質転換した。新たに発芽させた滅菌アブラナ植物からの葉柄または胚軸（それぞれ約 1 cm2）を、アグロバクテリアの1：50希釈物とともにペトリ皿中で5〜10分間にわたりインキュベートした。その後、これを25℃、暗所で３日間、0.8％ Bactoアガーを含む3MS培地上でインキュベートした。３日後、明所で16時間／暗所で8時間、培養を継続し、そして週間周期で、500 mg/l Claforan（セフォタキシムナトリウム）、50 mg/l カナマイシン、20マイクロM ベンジルアミノプリン（BAP）および1.6 g/lグルコースを含むMS培地で、培養を継続した。生長している新芽を、2％ショ糖、250 mg/l Claforanおよび0.8％Bactoアガーを含むMS培地に移した。3週間後、根が形成されない場合は、発根のために、培地に生長ホルモンである2-インドール酪酸を添加した。
【０１００】
実施例４
トランスジェニック・シロイヌナズナ植物の作出
Bechtold, N., Ellis, J.およびPelletier, G. Planta,「成体シロイヌナズナ植物の浸潤によるアグロバクテリウム仲介遺伝子導入(Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants)」, C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316 (1993), 1194-119に記載された花浸潤法、または根形質転換法によって、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) Columbia Col 0 変種（Lehle Seeds, Round Rock, Texas, USA）を形質転換した。
【０１０１】
実施例５
Pareddy, D., Petolino, J., Skokut, T., Hopkins,N., Miller,M., Welter,M., Smith,K., Clayton,D., Pescitelli,S., Gould,A.によって、Maize Transformation via Helium Blasting. Maydica. 42(2):143-154, 1997、に記載されたようにして、トウモロコシ植物を形質転換した。
【０１０２】
実施例６
ヤノウエノアカゴケ (Ceratodon purpureus) 由来のΔ 6- アセチレナーゼ／Δ 6- デサチュラーゼおよびΔ 6- デサチュラーゼの単離およびクローニング
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)からΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよびΔ6-デサチュラーゼをコードするDNA配列を単離するため、Δ5-（EMBL 登録番号Z81122）およびΔ6-脂肪酸デサチュラーゼ（U79010、AJ222980、AF031477）をコードするDNA配列から以下の各種の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを誘導した。
【０１０３】
【０１０４】
上記の2つのPCR増幅からの二本鎖DNA断片をpGEM-Tベクター（Promega）中に連結し、大腸菌 XL1blue MRF' Kan（Stratagene）中に形質転換し、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer,Weiterstadt）を使用して、配列解析した。Cer1およびCer3 DNAサブ配列は70％の同一性を示した。上記のDNAサブ配列はプライマーを除いて、以下のオープンリーディングフレームをコードしていた：Cer1の場合、173アミノ酸（配列番号５＝プライマーを除いたCer1の部分ヌクレオチド配列、および配列番号６＝Cer1の部分推定アミノ酸配列）、Cer3の場合、172アミノ酸（配列番号７＝プライマーを除いたCer3の部分ヌクレオチド配列、および配列番号８＝Cer3の部分推定アミノ酸配列）、ならびにCer16の場合、178アミノ酸（配列番号９＝プライマーを除いたCer16の部分ヌクレオチド配列、および配列番号１０＝Cer16の部分推定アミノ酸配列）。誘導されたCer1のタンパク質配列はCer3と64％、およびCer16と28％のアミノ酸同一性を示し、Cer3およびCer16では、27％のアミノ酸同一性だった。
【０１０５】
Cer1およびCer3タンパク質はPhyscomitrella patens Δ6-アシル-脂質デサチュラーゼ（Girkeら, Plant J., 15, 1998: 39-48）と最大の類似性を示し、一方Cer16はより高等な植物からのΔ6-アシル-脂質デサチュラーゼおよびΔ8-スフィンゴ脂質デサチュラーゼと最大の類似性を示す。
【０１０６】
Fritz Thummler, Department of Botany, University of Munichによって、ある方向性をもつヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)λZAP cDNAライブラリーが提供された（Pasentsisら, Plant J., 13, 1, 1998: 51-61）。このヤノウエノアカゴケライブラリーをPCR試験に供し、ここで上記のDNAサブ配列 Cer1、Cer3およびCer16から特異的プライマーを誘導した：
特異的前進および逆進プライマー：
【０１０７】
実施例７
完全長クローンの cDNA ライブラリースクリーニングおよび配列解析
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)λZAP cDNAライブラリーからの完全長クローンをさらにスクリーニングするために、ss-cDNA（実施例6参照）から増幅した3種の〜570 bp PCR断片、Cer1、Cer3およびCer16のpGEM-T中のDNAミニプレップがM.LeeおよびS.Stymneに 手渡された。現在のところ、このcDNAライブラリースクリーニングでおよそ2.2kbのインサートを有するCer1およびCer3の2つの完全長クローンが得られており、これをλZAPベクターからEcoRI/KpnI断片としてpuc19ベクター（New England Biolabs）のEcoRI/KpnI切断部位にサブクローン化し、そして大腸菌 JM105中に形質転換した。
【０１０８】
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションプローブとしてCer1およびCer3によるcDNAライブラリーのさらなるスクリーニングから、Cer1と相同性を有する少なくとも１つの別のクローンが存在することが明らかになり、これはおそらくΔ5-デサチュラーゼをコードすると考えられる。
【０１０９】
2つの大腸菌クローン、Cer1-50およびCer3-50を完全に配列決定した。Cer1-50は長さが2003 bp（配列番号１＝5'および3'非翻訳領域ならびにpolyAを含むヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼのヌクレオチド配列）で、483アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号２＝ヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼの推定アミノ酸配列）をコードする。Cer3-50は長さが2142 bp（配列番号１１＝5'および3'非翻訳領域を含むヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-デサチュラーゼのヌクレオチド配列[2142 bp]）で、520アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号１２＝ヤノウエノアカゴケからのΔ6-デサチュラーゼの推定アミノ酸配列）を有する。両タンパク質配列はN末端に高度に保存されたチトクロームb5由来のHPGGモチーフ（Lederer F., Biochimie 76, 1994: 674-692）と、C末端にデサチュラーゼに特徴的な３つのヒスチジンボックス（Shanklinら, Biochemistry, 33 , 1994: 12787-12794）を示す。このように、これらは増えてきているチトクロームb5融合タンパク質のファミリー（Napierら, Trends in Plant Science, 4, 1, 1999: 2-4）のさらなるメンバーを構成する。３番目のボックスの最初のヒスチジンはグルタミンに交換されており、このことは、Δ5-およびΔ6-アシル-脂質デサチュラーゼならびにΔ8-スフィンゴ脂質デサチュラーゼのもう１つの特徴である。
【０１１０】
実施例８
PCR による完全に機能活性なΔ 6- アセチレナーゼ／Δ 6- デサチュラーゼおよびΔ 6- デサチュラーゼのクローニング、およびベクターへのクローニングのための該配列の供給、ならびに酵母中での機能発現
ヤノウエノアカゴケ(Ceratodon purpureus)由来のΔ6-アセチレナーゼ／Δ6-デサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするcDNAを調製した。本明細書中に記載する実施例と同様にして、Δ6-デサチュラーゼをクローニングした（配列番号２、配列番号４および配列番号１２参照）。
【０１１１】
このクローニングは、最初にヤノウエノアカゴケ由来のΔ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼに対するCer1 cDNAに基づくポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのオリゴヌクレオチドを誘導することにより実施する。
【０１１２】
アニーリング温度： 50℃、52秒
変性温度： 95℃、52秒
伸長温度： 72℃、90秒
サイクル数： 30
EcoRVで切断しておいたベクター pBluescript SK-（Stratagene）中に、生成した1467塩基対の断片を連結する。pBS-Cer1の制御した切断によって１クローンが同定されるが、そのインサートはBamHI/SalIによって全長が切除されている（1452塩基対プラス制限切断部位の15ヌクレオチド）。クローン Cer50のcDNA配列を使用することも、同様に可能である。これは、単官能性Δ6-デサチュラーゼである（配列番号３参照）。誘導されるアミノ酸配列は配列番号４中に見出だされる。
【０１１３】
微生物内でコードされた酵素の機能性を調べるため、BamHI/XhoIで切断しておいた発現ベクター pYES2（Invitrogen, Groningen, The Netherlands）中に、pBS-Cer1由来の1467 bp BamHI/SalI断片を連結し、標準的プロトコルによって、この新たに作製したプラスミド pYES2-Cer1を用いて酵母を形質転換する（Invitrogen形質転換プロトコル、Groningen,The Netherlands、参照）。生成するコロニーをラフィノース含有培地上で培養し、ガラクトースを用いてΔ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼ遺伝子発現を誘導する（下記参照）。
【０１１４】
実施例９
形質転換した酵母の脂質分析
酵母は内在性脂肪酸（16:0、16:1、18:0および18:1）ばかりでなく、外因性脂肪酸をもその膜脂質内に取り込むことができる。発現された特定のデサチュラーゼの基質特異性を試験するため、接種の前に、CM-2％ラフィノース培地に、外因性脂肪酸を可溶化するための1％ Tergitol NP-40（w/v、Sigma）および0.003％の当該脂肪酸（ストック溶液：5％ Tergitol NP-40中の0.3％もしくは3％脂肪酸、w/v）を補充する。トランスジェニック酵母コロニーと一緒にCM-2％ラフィノース培地／1％ Tergitol NP-40 3 mlを接種し、その後600 nmでの光学密度（OD600）が4.0〜4.3になるまで、30℃の回転装置で2日間、インキュベートすることによって、前培養を実施した。主培養のため、CM-2％ラフィノース／1％ Tergitol NP-40培地±0.003％脂肪酸 10 mlに前培養物（200倍希釈物）のアリコートをOD600が0.02になるまで接種し、振盪機で30℃、250 rpmで24時間インキュベートする。試験培養物は対数増殖期（OD600が0.5〜0.6）にガラクトースを1.8％まで添加することによって、誘導した。誘導した細胞を30℃でさらに24時間、通気して増殖させた後、OD600が4.0〜4.3で細胞を回収した。
【０１１５】
誘発した酵母細胞を2000 gで10分間の遠心分離によって回収し、蒸留水3 ml中に再懸濁し、100℃で10分間沸騰させ、氷上で冷却した後、再沈降させる。1 N メタノール性硫酸および2％ジメトキシプロパンを使用し、90℃で１時間、細胞沈降物を加水分解し、脂質をメチル基転移させた。生成した脂肪酸メチルエステル（FAME）を石油エーテルで抽出する。毛細管カラム（Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm）ならびに170℃〜240℃で20分間および240℃で5分間の温度勾配、を使用するガス液体クロマトグラフィーによって、抽出したFAMEを分析する。好適なFAME標準（Sigma）との比較によって、モノエン-、ジエン-、トリエン-およびテトラエン酸メチルエステルの実体を確認する。トリイン酸およびテトライン酸については、参照物質が入手できない。FAME混合物を好適な化学的誘導体、例えば4,4-ジメトキシオキサゾリン誘導体にすることによる、GC-MSに よって、その実体および三重結合の位置を分析する（Christie,1998）。ブランクベクター pYES2、pYES2-Cer1（Δ6-アセチレナーゼ）を用いて形質転換したトランスジェニック酵母由来の脂肪酸メチルエステルのGC分析を表１に示す。トランスジェニック酵母細胞を、外因性脂肪酸なしで、またはリノール酸（18:2）、γリノレン酸（γ-18:3）、α-リノレン酸（α-18:3）もしくは ω3-オクタデカテトラエン酸（18:4）の添加後に、分析する。
【０１１６】
表１は、ブランクベクター pYES2、ベクター pYES-Cer1（Cer1/pYES2）およびベクター pYES-Cer3（Cer3/pYES2）を用いて形質転換したトランスジェニック酵母由来の脂肪酸メチルエステルのGC分析を示すものである。トランスジェニック酵母細胞を、外因性脂肪酸なし（−）、またはリノール酸（18:2）、γリノレン酸（γ-18:3）、α-リノレン酸（α-18:3）もしくはω3-オクタデカテトラエン酸（18:4）の添加後に、分析した。各供給実験の総脂肪酸中の脂肪酸組成[mol％]、供給脂肪酸の取り込み、不飽和化生成物および総不飽和化生成物（最終行）を示している。
【０１１７】
実施例１０
Δ 6- アセチレナーゼ／デサチュラーゼ活性を有する酵素を過剰発現するトランス
ジェニック植物の作出
植物を形質転換するために、BamHI/SalIで切断しておいたベクターpBin-USPまたはpBinAR中にpBS-Cer1由来のBamHI/SalI断片を連結した形質転換ベクターを作出する。pBin-USPおよびpBinARはプラスミドpBin19の誘導体である。pBinARは、pBin19中に35S CaMVプロモーターをEcoRI-KpnI断片（カリフラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909-7437に相当する）（Franckら(1980) Cell 21,285）とし て挿入することによって、pBin19から作製した（Bevanら(1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711）。Tiプラスミド pTiACH5（Gielenら、(1984) EMBO J. 3, 835）のT-DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド11749-11939をPvuII-HindIII断片として単離し、そのPvuII切断部位にSphIリンカーを添加した後、ベクターのSphI-HindIII切断部位間でクローン化する。この結果、プラスミド pBinARが生成した（Hofgen and Willmitzer(1990) Plant Science 66,221-230）。これにはpBluescriptからの再クローニングによって、プロモーターとターミネーターの間に、利用可能ないくつかの制限切断部位がある。USPプロモーターはヌクレオチド1-684（Genbank 登録番号X56240）に相当し、そのプロモーター内にはUSP遺伝子の非コード領域の一部が存在している。サイズが684塩基対のプロモーター断片を、市販のT7標準プライマー（Stratagene）および合成プライマーを使用し、標準的方法によるPCRによって増幅した（プライマー配列：5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3'）。このPCR断片を次にEcoRI/SalIで切断し、ベクター pBinAR中に挿入した。その結果がpBinUSPと称されるプラスミドである。
【０１１８】
この構築物を使用して、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)およびアブラナ植物を形質転換する。
【０１１９】
カナマイシンおよびセフォタキシム(Claforan)を含む2MS培地上で再生した新芽を取得し、発根後、土中に移し、空調付チャンバまたは温室内で2週間育成後、開花を誘導し、成熟種子を収穫し、脂質分析によって、Δ6-アセチレナーゼ／デサチュラーゼ発現について調査する。アセチレン性脂肪酸もしくはデルタ6位の二重結合の含量が増加した系を同定する。機能的にトランス遺伝子を発現する、安定形質転換されたトランスジェニック系において、非形質転換対照植物と比較してアセチレン性脂肪酸もしくはデルタ6位の二重結合の含量の増加が見られる。
【０１２０】
実施例１１
種子からの脂質の抽出
酵母脂質の分析と同様にして、植物種子由来の脂質の分析を実行する。しかしながら、抽出のために利用し得るように、乳鉢を使用して、最初に植物材料を機械的にホモジナイズする。
【０１２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、タバコ形質転換ベクター、35SプロモーターをもつpBinAR（C）およびUSPプロモーターをもつpBin-USP（D）を示す。もとのベクターを図１A）およびB）に示す。
【配列表】
Claims (13)
- Δ6-アセチレナーゼ活性および／またはΔ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、下記の核酸の群：
a) 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列からなる核酸
b) 配列番号2、配列番号4または配列番号12に示したアミノ酸配列を、遺伝子コードの縮重を考慮して逆翻訳することによって誘導された核酸配列からなる核酸
c) 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した核酸であって、配列番号２、配列番号４または配列番号12に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびアミノ酸レベルで少なくとも90％の相同性を有しかつ該ポリペプチドの酵素活性が無視できる程度にしか低下していないポリペプチドをコードする核酸
から選択される、上記核酸。 - 請求項１に記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 配列番号１、配列番号３または配列番号11に示した配列によりコードされる、請求項２に記載のアミノ酸からなるポリペプチド。
- １つ以上の調節シグナルに連結された請求項１に記載の核酸を含有する発現カセット。
- 請求項１に記載の核酸または請求項４に記載の発現カセットを含有するベクター。
- 少なくとも１つの請求項１に記載の核酸または少なくとも１つの請求項４に記載の発現カセットを、ヒトを除く油産生生物に導入し、該生物を培養し、該生物に含まれる油を分離し、該油に含まれる脂肪酸を遊離させることを含んでなる、不飽和脂肪酸の調製方法。
- 少なくとも１つの請求項１に記載の核酸または少なくとも１つの請求項４に記載の発現カセットを、ヒトを除く油産生生物に導入し、該生物を培養し、該生物に含まれる油を分離することを含んでなる、不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法。
- 不飽和脂肪酸は、６位に三重結合もしくは二重結合をもつか、または６位に三重結合と二重結合をもつ不飽和脂肪酸の含量が増加している、請求項６または７に記載の方法。
- 飽和脂肪酸をもつか、または不飽和脂肪酸をもつか、または飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸をもつトリグリセリドを、請求項２に記載のタンパク質の少なくとも１種と共にインキュベートすることによる、不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法。
- 還元当量を受け取るか、または放出することができる化合物の存在下でトリグリセリドを調製する、請求項９に記載の方法。
- 脂肪酸をトリグリセリドから遊離させる、請求項９または１０に記載の方法。
- 相同性スクリーニングによりゲノム配列を単離するための、請求項１に記載の核酸の使用。
- ヒト食品、動物飼料、化粧品または医薬品を製造するための、請求項９に記載の不飽和脂肪酸含量が増加したトリグリセリドの調製方法によって得られたトリグリセリドの使用。
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