JP3624960B2

JP3624960B2 - Thermostable ribonuclease H and uses thereof

Info

Publication number: JP3624960B2
Application number: JP25819094A
Authority: JP
Inventors: 浩明井上; 裕宝田; 秀司柴田; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1994-10-24
Filing date: 1994-10-24
Publication date: 2005-03-02
Anticipated expiration: 2020-03-02
Also published as: JPH08116969A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は耐熱性に優れた新規なリボヌクレアーゼＨ、該リボヌクレアーゼＨを製造する方法および該リボヌクレアーゼＨを使用するＤＮＡ一本鎖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から大腸菌のような中温性細菌およびステアロサーモフィラスのような中度高温菌由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、既に多くの研究がなされている。しかし、その熱安定性、精製工程、収率等は、必ずしも十分満足し得るものではなかった（特開平３−１４７７８５号公報、金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム・要旨集（１９９０）、６９頁など）。またサーマス・サーモフィルスからも耐熱性リボヌクレアーゼＨが見い出されている（特開平４−８２９４号公報、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１６，ｐ．４４４３−４４４９）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
通常、リボヌクレアーゼＨは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断するという基質特異性を有し、ｃＤＮＡのクローニングの際の鋳型であるｍＲＮＡの除去、ｍＲＮＡのポリＡ領域の除去、ＲＮＡの断片化等の遺伝子工学の分野において、極めて利用価値の高い酵素である。従来のリボヌクレアーゼＨでは、耐熱性を要求される場合には、十分満足する結果が得られず、従来品に比べより耐熱性を向上させる酵素が得られれば、従来のリボヌクレアーゼＨでは利用できなかった条件下での利用が可能となるのみならず、その操作性の著しい向上が期待されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記観点より、従来のリボヌクレアーゼＨに比して耐熱性の向上されたリボヌクレアーゼＨの検索を鋭意検討し、本発明に至った。
【０００５】
すなわち本発明は、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨである。
（１）次の反応を触媒する。
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：約７．５〜９．３
【０００６】
また本発明は、好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラスを培養し、該培養物から、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨを採取することを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨの製造法である。
（１）次の反応を触媒する。
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：約７．５〜９．３
【０００７】
さらに本発明は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させて、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることを特徴とするＤＮＡ一本鎖の製造法である。
（１）次の反応を触媒する。
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：約７．５〜９．３
【０００８】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、好熱性細菌が産生する耐熱性リボヌクレアーゼＨである。
【０００９】
また本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラスが産生するものであることが好ましい。サーマス・サーモフィルが産生する本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。従来から公知であるサーマス・サーモフィルス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、分子量が約２０Ｋであり、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しない。
【００１０】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを生産する菌株としては、サーマス・サーモフィラス、サーマス・アクアチカス、バチルス・ステアロサーモフィラスなどの超高熱性細菌に属する細菌が挙げられる。好ましくはサーマス・サーモフィラスが挙げられ、さらに好ましくはサーマス・サーモフィラスＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４）などが挙げられる。
【００１１】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを製造するに当たっては、例えばサーマス属に属する菌株を通常の方法で培養する。使用する培地組成は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用可能である。例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、デキストリン等が使用できる。窒素源としては、例えばポリペプトン、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、グルタミン酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。
【００１２】
培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培養で行うことができる。培養温度は５０℃〜８０℃の範囲、好ましくは７５℃付近にて、培養ｐＨはｐＨ５〜１０の範囲、好ましくはｐＨ７〜９に制御することが好ましい。これらの条件以外の条件でも使用する菌株が生育可能であれば実施可能である。培養期間は、通常１〜３日間で生育菌体内に耐熱性リボヌクレアーゼＨが生成蓄積される。
【００１３】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを精製する方法は、一般に使用される酵素の精製法を用いれば良い。例えば菌体からの酵素の抽出には、超音波破砕、ガラスビーズ等を用いる機械的な破砕法や、界面活性剤、酵素等を用いる破砕法など、何れも使用することができる。この様にして抽出された抽出液については、公知の硫酸アンモニウム等による塩析法、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等による金属凝集法、更に、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）セファロースなどのイオン交換クロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００１４】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを使用してＤＮＡ一本鎖を製造するには、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、好ましくは塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの存在下に耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせる。
酵素濃度は、０．０１〜２単位（Ｕ）／μｌであり、作用ｐＨは、７〜１０である。カリウムイオンとしては酢酸、硝酸などの有機酸または無機酸のカリウム塩が挙げられる。その濃度は、５〜５００ｍＭである。マグネシウムイオンとしては酢酸、硝酸などの有機酸または無機酸のマグネシウム塩が挙げられる。その濃度は、０．５〜１０ｍＭである。マンガンイオンとしては酢酸、硝酸などの有機酸または無機酸のマンガン塩が挙げられる。その濃度は、０．５〜１００ｍＭである。緩衝液としては、トリス緩衝液、トリシン緩衝液、ビシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳなどが挙げられる。
【００１５】
またＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの存在下に、高温度にて耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることが好ましい。特に耐熱性リボヌクレアーゼＨを５０〜８０℃にて作用させる。
【００１６】
本発明に使用するＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料とは、ＲＮＡとこのＲＮＡを鋳型に逆転写酵素により合成されたｃＤＮＡとの二本鎖、ＲＮＡにＤＮＡをハイブリダイズさせた二本鎖、ＤＮＡにＲＮＡをハイブリダイズさせた二本鎖など、どのような方法によって形成されたＲＮＡ／ＤＮＡの二本鎖でもよい。また使用されるＲＮＡ、ＤＮＡは生体細胞、組織から調製されたもの、酵素的に合成されたもの、化学的に合成されたもののいずれの組み合わせでもよい。
【００１７】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨのうち、サーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、リボヌクレアーゼＨ活性の他に、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。したがって、これらの三つの酵素作用を利用して、下記標的核酸配列の増幅法を実施することができる。
【００１８】
標的核酸配列の増幅法は、反応媒体中で実質的に一定の温度で標的核酸配列のコピー数を増加させる方法であって、下記工程を含む。
工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第一鋳型に、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズせしめ、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る；
工程２：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一鋳型ＲＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る；
工程３：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の標的核酸（ＤＮＡ）に対して相補的な核酸配列を有する第二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして上流に機能可能なプロモーター配列に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；
（ここで第一プライマー又は第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的又は相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる）
工程４：前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーを増加せしめ；
そして、
工程５：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程１から工程４を必要な回数繰り返す。
【００１９】
また別なる標的核酸配列の増幅法は、反応媒体中で実質的に一定の温度で標的核酸配列のコピー数を増加させる方法であって、下記工程を含む。
工程１’：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第一鋳型に、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズせしめ、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る；
工程２’：第一鋳型ＤＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る；
工程３’：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列（ＤＮＡ）を有する第二プライマーをハイブリダイズせしめ耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして標的核酸配列に上流にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成せしめた後、
工程４’：前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーを増加せしめ；
そして、
工程５’：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて、下記工程１〜工程４を必要な回数繰り返す。
工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第一鋳型に、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズせしめ、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る；
工程２：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一鋳型ＲＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る；
工程３：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の標的核酸（ＤＮＡ）に対して相補的な核酸配列を有する第二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして上流に機能可能なプロモーター配列に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；
（ここで第一プライマー又は第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的又は相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる）
工程４：前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーを増加せしめる；
【００２０】
【発明の効果】
本発明の耐熱性リボヌクレア−ゼＨは、従来から知られている大腸菌のような中温性細菌およびステアロサ−モフィラスのような中度高温菌由来の耐熱性リボヌクレア−ゼＨが変性、失活する高い温度条件下でも変性、失活することがなく、ＲＮＡ／ＤＮＡバイブリッドに作用させることことが可能である。さらに耐熱性であることから、保存安定性も優れ、取扱いが容易になることが期待される。また、本発明のサーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、一種のタンパク質でありながら、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ−ゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）をも有するから、反応条件により容易に多種の酵素反応を同時に進め得ることが可能である。このような作用を利用して、新たな標的核酸の増幅が可能となる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例中、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性は、以下の方法により測定した。
まず、下記組成を有する試薬Ａ，Ｂ，ＣおよびＤを調製した。

【００２２】
^＊［^３Ｈ］にてラベルされた基質ポリＡ／ポリｄＴの調製方法
ポリＡ（ファルマシア製：コード２７−４１１０−０１）１００ｍｇを１０ｍｌの滅菌水にて溶解した。ポリｄＴ（ファルマシア製：コード２７−７８３４−０１）５ユニットを２００μｌのＴＥバッファーにて溶解した。［^３Ｈ］ポリＡ（アマーシャム製：コードＴＲＫ．４８０１０μＣｉ）を先に調製したポリＡ溶液５０μｌにて溶解した。５０サンプル分の基質調製のために、ここで調製した［^３Ｈ］ポリＡ＋ポリＡを５０万ｃｐｍ相当量を取り出し、先に調製したポリｄＴ溶液２０μｌ（１９ｐｍｏｌ／μｌ）と混合した。５倍濃度のアニーリングバッファー（５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ［ｐＨ８．０］，５００ｍＭＫＣｌ）２０μｌ、および滅菌水を加え１００μｌとした。この溶液を６５℃にて１０分間加熱後、室温にて冷却し基質溶液とした。
【００２３】
次いで試薬Ａ２．５μｌ、試薬Ｂ２μｌおよび滅菌水１９．５μｌをマイクロチューブに加え、撹拌後、酵素１μｌを加え、６０℃にて２０分間反応した。その後氷冷し、試薬Ｄ２５μｌおよび試薬Ｃ５０μｌを加えて撹拌した。更に１０分間氷冷した後、遠心分離（１２０００回転，１０分間）にて、酸不溶性画分を分離した。この上清の酸可溶性画分を５０μｌ採取し、液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、遊離［^３Ｈ］を測定した。酵素活性の１単位は、この条件下で１分間当り１μｍｏｌの酸可溶性物質を遊離する酵素量とした。
【００２４】
実施例１
（好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来のリボヌクレアーゼＨの調製）
ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．２％を含む培地（ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行った後、室温にて冷却した。そこへ好熱性細菌サーマス・サーモフィラスＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４）を１白金耳接種し、７０℃にて２４時間振盪培養した。次に同組成の培地６Ｌを１０Ｌジャファ−メンタ−に移し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行い、放冷後これに上記記載したフラスコにて培養した培養液１００ｍｌを接種した。通気量２Ｌ／分、撹拌数４００回転／分、温度７０℃の条件にて１０時間培養した。
【００２５】
培養液６Ｌを遠心分離（８０００回転／分、１０分間）にて集菌し、１０ｍＭ２−メルカプロエタノール、５％グリセロールを含むＫ−リン酸バッファーｐＨ７．５（以下バッファーＡとする）に懸濁した。超音波破砕機（海上電気製、１９ＫＨｚ）にて２０分間処理し、再度遠心分離し細胞残さを取り除いた上清を回収した。
【００２６】
上清液を硫酸アンモニウムによる塩析後、バッファーＡに対し透析した。この液をバッファーＡにて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０ＭＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜０．５ＭＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。活性画分をバッファーＡに対し透析した。この液をバッファーＡにて平衡化したフォスフォセルロースＰ−１１（Ｗｈａｔｍａｎ社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０ＭＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜０．５ＭＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。
活性画分をバッファーＡに対し透析した。更に、この液をバッファーＡにて平衡化したｎａｔｉｖｅＤＮＡセルロース（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０ＭＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜０．５ＭＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。
活性画分を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロールに対し透析した。更に、この液を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭＥＤＴＡ、５０％グリセロールに対し透析し酵素標品とした。
【００２７】
（１）分子量
上記酵素標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて既知の分子量マーカーと同時に泳動した。既知の分子量マーカーとの比較から、分子量は約８５，０００〜９５，０００と推定された（図１）。
【００２８】
（２）熱安定性
上記酵素標品をｐＨ８．０で６０℃〜９０℃で２時間処理後、その残存活性を測定した。熱処理後の残存活性は、７５℃にて２時間反応後においても、５０％以上認められた（図２）。
【００２９】
（３）至適ｐＨ
上記酵素標品ををｐＨ７．５〜ｐＨ９．５にて作用させ、その至適ｐＨを求めた。ｐＨの調製は試薬ＡのｐＨを変動させて行った。その結果、至適ｐＨはｐＨ７．５〜９．３付近であった（図３）。
【００３０】
（４）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性
本酵素はリボヌクレアーゼＨ活性以外に、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性も有しており、その活性１に対し、約５倍以上であった。ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の定義は、７０℃での活性測定条件下でｓｓＤＮＡ／プライマーを基質として、３０分間に１０ｎモルのｄＴＮＰを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を１単位とした。
【００３１】
（５）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）活性
本酵素はリボヌクレアーゼＨ活性以外に、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）活性も有しており、その活性はリボヌクレアーゼＨ１に対し、約０．１以下であった。ＲＮＡ依存ＤＮＡポリラーゼ（逆転写酵素）活性の定義は、７０℃での活性測定条件下でポリ（Ａ）オリゴ（ｄＴ）を基質として、３０分間に１０ｎモルのｄＴＴＰを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を１単位とした。
【００３２】
以上の結果から、本発明にて見いだされた好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来のリボヌクレアーゼＨは、著しく熱安定性が向上していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来の新規リボヌクレアーゼＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真を示す。
【図２】好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来の新規リボヌクレアーゼＨの熱安定性を示す。
【図３】好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来の新規リボヌクレアーゼＨの至適ｐＨを示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a novel ribonuclease H excellent in heat resistance, a method for producing the ribonuclease H, and a method for producing a DNA single strand using the ribonuclease H.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, many studies have already been made on thermostable ribonuclease H derived from mesophilic bacteria such as Escherichia coli and moderately thermophilic bacteria such as stearothermophilus. However, the thermal stability, purification process, yield, etc. are not always satisfactory (Japanese Patent Laid-Open No. 3-147785, Kanaya et al., 2nd Annual Meeting of the Protein Engineering Society of Japan, Abstracts ( 1990), page 69). Thermos thermophilus has also found thermostable ribonuclease H (Japanese Patent Laid-Open No. 4-8294, Nucleic Acid Research, vol. 19, No. 16, p. 4443-4449).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In general, ribonuclease H has substrate specificity of specifically cleaving only double-stranded RNA strands, which are DNA / RNA hybrids, by an end action, and removal of mRNA as a template for cDNA cloning, mRNA In the field of genetic engineering such as removal of the poly A region of RNA and fragmentation of RNA, the enzyme is extremely useful. In the case of the conventional ribonuclease H, when heat resistance is required, a sufficiently satisfactory result cannot be obtained, and if an enzyme that improves the heat resistance compared to the conventional product is obtained, the conventional ribonuclease H cannot be used. Not only can it be used under conditions, but a significant improvement in operability is expected.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
From the above viewpoint, the present inventors diligently searched for a ribonuclease H having improved heat resistance as compared with the conventional ribonuclease H, and reached the present invention.
[0005]
That is, the present invention is a thermostable ribonuclease H having the following physicochemical properties.
(1) Catalyze the next reaction.
It acts specifically and exclusively on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Maintains an activity of 50% or more after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimum pH: about 7.5 to 9.3
[0006]
The present invention is also a method for producing thermostable ribonuclease H, characterized by culturing a thermophilic bacterium, Thermos thermophilus, and collecting thermostable ribonuclease H having the following physicochemical properties from the culture.
(1) Catalyze the next reaction.
It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Maintains an activity of 50% or more after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimum pH: about 7.5 to 9.3
[0007]
Furthermore, the present invention provides a method for producing a DNA single strand, characterized in that a DNA single strand is produced by allowing a thermostable ribonuclease H having the following physicochemical properties to act on a sample containing RNA / DNA double strand It is.
(1) Catalyze the next reaction.
It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Maintains an activity of 50% or more after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimum pH: about 7.5 to 9.3
[0008]
The thermostable ribonuclease H of the present invention is a thermostable ribonuclease H produced by a thermophilic bacterium.
[0009]
The heat-resistant ribonuclease H of the present invention is preferably produced by Thermos thermophilus, which is a thermophilic bacterium. The thermostable ribonuclease H of the present invention produced by Thermus thermophil further has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity. The thermostable ribonuclease H derived from Thermus thermophilus, which has been conventionally known, has a molecular weight of about 20K and does not have RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity.
[0010]
Examples of the strain that produces the thermostable ribonuclease H of the present invention include bacteria belonging to super thermophilic bacteria such as Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus. Thermus thermophilus is preferable, and thermus thermophilus HB8 (ATCC 27634) is more preferable.
[0011]
In producing the thermostable ribonuclease H of the present invention, for example, a strain belonging to the genus Thermus is cultured by a usual method. As the medium composition to be used, any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, and other nutrients that can be assimilated by the strain used. For example, glucose, sucrose, dextrin and the like can be used as the carbon source. As the nitrogen source, for example, nitrogen-containing natural products such as polypeptone, meat extract, and yeast extract, and inorganic or organic nitrogen compounds such as amino acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and glutamic acid can be used.
[0012]
Culturing can usually be performed by shaking culture or aeration-agitation culture. The culture temperature is in the range of 50 ° C. to 80 ° C., preferably in the vicinity of 75 ° C., and the culture pH is preferably controlled in the range of pH 5 to 10, preferably pH 7 to 9. It can be carried out under conditions other than these as long as the strain used can grow. The culture period is usually 1 to 3 days, and heat-stable ribonuclease H is produced and accumulated in the growing cells.
[0013]
As a method for purifying the thermostable ribonuclease H of the present invention, a commonly used enzyme purification method may be used. For example, for the extraction of enzymes from bacterial cells, any of ultrasonic crushing, mechanical crushing methods using glass beads and the like, crushing methods using surfactants, enzymes and the like can be used. With respect to the extract thus extracted, a known salting-out method using ammonium sulfate or the like, metal agglutination method using magnesium chloride, calcium chloride or the like, and ions such as DEAE (diethylaminoethyl) sepharose, CM (carboxymethyl) sepharose, etc. It can be purified by exchange chromatography or the like.
[0014]
In order to produce a DNA single strand using the thermostable ribonuclease H of the present invention, a thermostable ribonuclease H is preferably added to a sample containing an RNA / DNA duplex, preferably in the presence of potassium chloride, magnesium chloride and manganese chloride. And only the RNA strand of the RNA / DNA double strand is specifically and specifically acted to generate a DNA single strand.
The enzyme concentration is 0.01-2 units (U) / μl and the working pH is 7-10. Examples of potassium ions include potassium salts of organic acids or inorganic acids such as acetic acid and nitric acid. The concentration is 5 to 500 mM. Examples of magnesium ions include magnesium salts of organic acids or inorganic acids such as acetic acid and nitric acid. The concentration is 0.5-10 mM. Manganese ions include manganese salts of organic acids or inorganic acids such as acetic acid and nitric acid. The concentration is 0.5-100 mM. Examples of the buffer include Tris buffer, Tricine buffer, Bicine buffer, HEPES, and TAPS.
[0015]
In addition, heat-resistant ribonuclease H is allowed to act on a sample containing RNA / DNA duplexes at high temperatures in the presence of potassium chloride, magnesium chloride and manganese chloride, and only RNA strands of RNA / DNA duplexes are specific. It is preferable to act on the endothelium to produce a DNA single strand. In particular, thermostable ribonuclease H is allowed to act at 50 to 80 ° C.
[0016]
The sample containing RNA / DNA duplex used in the present invention is a double strand of RNA and cDNA synthesized by reverse transcriptase using this RNA as a template, a double strand obtained by hybridizing RNA to DNA, RNA / DNA double strands formed by any method, such as double strands obtained by hybridizing RNA to DNA, may be used. The RNA and DNA used may be any combination of those prepared from living cells and tissues, those synthesized enzymatically, and those synthesized chemically.
[0017]
Among the thermostable ribonucleases H of the present invention, thermostable ribonuclease H derived from Thermus thermophilus has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity in addition to ribonuclease H activity. Therefore, the following target nucleic acid sequence amplification method can be carried out using these three enzyme actions.
[0018]
The method for amplifying a target nucleic acid sequence is a method for increasing the copy number of a target nucleic acid sequence at a substantially constant temperature in a reaction medium, and includes the following steps.
Step 1: A single-stranded first template in which a target nucleic acid is denatured if necessary, a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence (RNA) of the first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof. Hybridizing one primer and extending with a thermostable RNA-dependent DNA polymerase to obtain a first primer extension (DNA) which is a second template complementary to the first template RNA;
Step 2: Separating the second template DNA from the first template RNA with a thermostable ribonuclease H that specifically degrades only the RNA of the RNA / DNA hybrid to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA);
Step 3: A second primer having a nucleic acid sequence complementary to a target nucleic acid (DNA) of a second template is hybridized to a single-stranded second template DNA and extended by a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. Obtaining a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus generating a double stranded DNA intermediate having a target nucleic acid sequence linked to an upstream functional promoter sequence;
(Wherein the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand) Directed to)
Step 4: Increase multiple RNA copies of the target nucleic acid sequence from the double-stranded DNA intermediate using a thermostable DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence;
And
Step 5: Repeat Step 1 to Step 4 as many times as necessary using the RNA copy.
[0019]
Another target nucleic acid sequence amplification method is a method of increasing the copy number of a target nucleic acid sequence at a substantially constant temperature in a reaction medium, and includes the following steps.
Step 1 ′: A single-stranded first template in which a target nucleic acid is denatured as necessary has a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence (RNA) of the first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof. Hybridizing the first primer and extending with a thermostable RNA-dependent DNA polymerase to obtain a first primer extension (DNA) which is a second template complementary to the first template RNA;
Step 2 ′: separating the second template DNA from the first template DNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA);
Step 3 ′: A second primer having a nucleic acid sequence (DNA) complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized to the single-stranded second template DNA, and extended by a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. After obtaining a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus generating a double stranded DNA intermediate having a promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence,
Step 4 ′: increasing the number of RNA copies of the target nucleic acid sequence from the double stranded DNA intermediate using a thermostable DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence;
And
Step 5 ′: Steps 1 to 4 below are repeated as many times as necessary using the RNA copy as necessary.
Step 1: A single-stranded first template in which a target nucleic acid is denatured if necessary, a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence (RNA) of the first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof. Hybridizing one primer and extending with a thermostable RNA-dependent DNA polymerase to obtain a first primer extension (DNA) which is a second template complementary to the first template RNA;
Step 2: Separating the second template DNA from the first template RNA with a thermostable ribonuclease H that specifically degrades only the RNA of the RNA / DNA hybrid to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA);
Step 3: A second primer having a nucleic acid sequence complementary to a target nucleic acid (DNA) of a second template is hybridized to a single-stranded second template DNA and extended by a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. Obtaining a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus generating a double stranded DNA intermediate having a target nucleic acid sequence linked to an upstream functional promoter sequence;
(Wherein the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand) Directed to)
Step 4: Increase multiple RNA copies of the target nucleic acid sequence from the double-stranded DNA intermediate using a thermostable DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence;
[0020]
【The invention's effect】
The thermostable ribonuclease H of the present invention is a highly thermostable ribonuclease H derived from a conventionally known mesophilic bacterium such as Escherichia coli and a moderately thermophilic bacterium such as stearosa mophilus. It is possible to act on RNA / DNA hybrids without denaturation and inactivation even under temperature conditions. Furthermore, since it is heat resistant, it is expected to have excellent storage stability and easy handling. In addition, the thermostable ribonuclease H derived from Thermus thermophilus of the present invention is a kind of protein but also has DNA-dependent DNA polymerase activity and RNA-dependent DNA polymerase activity (reverse transcription activity). It is possible to proceed with various enzyme reactions simultaneously. Using such an action, a new target nucleic acid can be amplified.
[0021]
【Example】
EXAMPLES Next, an Example is given and this invention is demonstrated further in detail.
In the examples, thermostable ribonuclease H activity was measured by the following method.
First, reagents A, B, C and D having the following composition were prepared.

[0022]
^* Preparation method of substrate poly A / poly dT labeled with [ ³ H] 100 mg of poly A (Pharmacia: Code 27-4110-01) was dissolved in 10 ml of sterilized water. 5 units of poly dT (Pharmacia: Code 27-7834-01) was dissolved in 200 μl of TE buffer. [ ³ H] Poly A (manufactured by Amersham: Code TRK.480 10 μCi) was dissolved in 50 μl of the previously prepared poly A solution. In order to prepare the substrate for 50 samples, [ ³ H] polyA + polyA prepared here was taken out in an amount equivalent to 500,000 cpm and mixed with 20 μl (19 pmol / μl) of the previously prepared poly dT solution. A 5-fold annealing buffer (50 mM Hepes-KOH [pH 8.0], 500 mM KCl) 20 μl and sterile water were added to make 100 μl. This solution was heated at 65 ° C. for 10 minutes and then cooled to room temperature to obtain a substrate solution.
[0023]
Next, 2.5 μl of reagent A, 2 μl of reagent B and 19.5 μl of sterilized water were added to the microtube, and after stirring, 1 μl of enzyme was added and reacted at 60 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the mixture was ice-cooled, and 25 μl of reagent D and 50 μl of reagent C were added and stirred. After further cooling with ice for 10 minutes, the acid-insoluble fraction was separated by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes). 50 μl of the acid-soluble fraction of the supernatant was collected and measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and free [ ³ H] was measured. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that liberates 1 μmol of acid-soluble substance per minute under these conditions.
[0024]
Example 1
(Preparation of ribonuclease H from thermophilic bacterium Thermus thermophilus)
100 ml of a medium (pH 7.5) containing 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, and 0.2% NaCl was transferred to a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, and then at room temperature. Cooled down. One platinum loop of thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB8 (ATCC 27634) was inoculated there and cultured with shaking at 70 ° C. for 24 hours. Next, 6 L of the medium having the same composition was transferred to a 10 L Jaffer mentor and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. The cells were cultured for 10 hours under the conditions of an aeration rate of 2 L / min, a stirring speed of 400 rpm, and a temperature of 70 ° C.
[0025]
6 L of the culture solution was collected by centrifugation (8000 rpm / min, 10 minutes) and suspended in K-phosphate buffer pH 7.5 (hereinafter referred to as buffer A) containing 10 mM 2-mercaproethanol and 5% glycerol. did. It processed for 20 minutes with the ultrasonic crusher (Kaijo Electric, 19KHz), and centrifuged again, and the supernatant liquid which removed the cell residue was collect | recovered.
[0026]
The supernatant was salted out with ammonium sulfate and dialyzed against buffer A. This solution is subjected to DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) column chromatography equilibrated with buffer A and adsorbed. After washing the column with buffer A and elution with buffer A containing 0 to 1.0 M NaCl, ribonuclease H activity was obtained in the 0 to 0.5 M NaCl elution fraction. The active fraction was dialyzed against buffer A. This solution is subjected to phosphocellulose P-11 (manufactured by Whatman) column chromatography equilibrated with buffer A to be adsorbed. After washing the column with buffer A and elution with buffer A containing 0 to 1.0 M NaCl, ribonuclease H activity was obtained in the 0 to 0.5 M NaCl elution fraction.
The active fraction was dialyzed against buffer A. Further, this solution is subjected to native DNA cellulose (Pharmacia) column chromatography equilibrated with buffer A and adsorbed. After washing the column with buffer A and elution with buffer A containing 0 to 1.0 M NaCl, ribonuclease H activity was obtained in the 0 to 0.5 M NaCl elution fraction.
The active fraction was dialyzed against 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol. Further, this solution was dialyzed against 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% glycerol to prepare an enzyme preparation.
[0027]
(1) Molecular weight The enzyme preparation was electrophoresed simultaneously with a known molecular weight marker by SDS-PAGE. From a comparison with known molecular weight markers, the molecular weight was estimated to be about 85,000-95,000 (FIG. 1).
[0028]
(2) Thermal stability The enzyme preparation was treated at 60 ° C. to 90 ° C. for 2 hours at pH 8.0, and then its residual activity was measured. The residual activity after the heat treatment was found to be 50% or more even after the reaction at 75 ° C. for 2 hours (FIG. 2).
[0029]
(3) Optimum pH
The enzyme preparation was allowed to act at pH 7.5 to pH 9.5, and the optimum pH was determined. The pH was adjusted by changing the pH of reagent A. As a result, the optimum pH was around pH 7.5 to 9.3 (FIG. 3).
[0030]
(4) DNA-dependent DNA polymerase activity This enzyme has a DNA-dependent DNA polymerase activity in addition to the ribonuclease H activity. The definition of the DNA-dependent DNA polymerase activity is defined as 1 unit of enzyme that takes 10 nmole of dTNP into an acid-insoluble precipitate in 30 minutes using ssDNA / primer as a substrate under the activity measurement condition at 70 ° C.
[0031]
(5) RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) activity In addition to ribonuclease H activity, this enzyme also has RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) activity, which is about 0.1 times that of ribonuclease H1. It was the following. The definition of RNA-dependent DNA polylase (reverse transcriptase) activity is an enzyme that incorporates poly (A) oligo (dT) as a substrate under an activity measurement condition at 70 ° C. and incorporates 10 nmole of dTTP into an acid-insoluble precipitate for 30 minutes. The amount was 1 unit.
[0032]
From the above results, it was confirmed that the thermostability of the ribonuclease H derived from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus found in the present invention was remarkably improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an SDS-PAGE photograph of a novel ribonuclease H derived from a thermophilic bacterium, Thermus thermophilus.
FIG. 2 shows the thermal stability of a novel ribonuclease H from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus.
FIG. 3 shows the optimum pH of a novel ribonuclease H derived from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus.

Claims

A thermostable ribonuclease H derived from Thermus thermophilus having the following physicochemical properties:
(1) Catalyze the next reaction. It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Retains 50% or more activity after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimal pH : 7 . 5 to 9.3
(5) Furthermore, it has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity.

A method for producing thermostable ribonuclease H, comprising culturing a thermophilic bacterium, Thermos thermophilus, and collecting thermostable ribonuclease H having the following physicochemical properties from the culture.
(1) Catalyze the next reaction. It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Retains 50% or more activity after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimal pH : 7 . 5 to 9.3
(5) Furthermore, it has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity.

A method for producing a DNA single strand, characterized by causing a thermostable ribonuclease H derived from Thermus thermophilus having the following physicochemical properties to act on a sample containing an RNA / DNA double strand to generate a DNA single strand: .
(1) Catalyze the next reaction. It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Maintains an activity of 50% or more after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimal pH : 7 . 5 to 9.3
(5) Furthermore, it has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity.

4. A DNA single strand according to claim 3, wherein a heat-resistant ribonuclease H is allowed to act on a sample containing RNA / DNA double strands in the presence of potassium ions, magnesium ions and manganese ions to produce a single DNA strand. Manufacturing method of this chain.

A sample containing RNA / DNA duplex is allowed to act on thermostable ribonuclease H derived from Thermus thermophilus having the following physicochemical properties in the presence of potassium chloride, magnesium chloride and manganese chloride, and RNA / DNA duplex 4. The method for producing a DNA single strand according to claim 3, wherein only the RNA strand is specifically end-acted to produce a DNA single strand.
(1) Catalyze the next reaction. It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Retains 50% or more activity after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimal pH : 7 . 5 to 9.3
(5) Furthermore, it has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity.

The method for producing a DNA single strand according to claim 3, wherein the thermostable ribonuclease H is allowed to act at a high temperature.

The method for producing a DNA single strand according to claim 6, wherein the thermostable ribonuclease H is allowed to act at 50 to 80 ° C.

In a sample containing RNA / DNA double strand, in the presence of potassium ion, magnesium ion and manganese ion, thermus thermophilus-derived heat-resistant ribonuclease H having the following physicochemical properties is heated to pH 7.5 to 9.3 at a high temperature A method for producing a DNA single strand, which comprises producing a DNA single strand.
(1) Catalyze the next reaction. It acts specifically and end-to-end only on the RNA strand of the RNA / DNA duplex to produce a DNA single strand.
(2) Molecular weight: 85,000-95,000
(3) Thermal stability: Retains 50% or more activity after treatment at 75 ° C. for 2 hours.
(4) Optimal pH : 7 . 5 to 9.3
(5) Furthermore, it has RNA-dependent DNA polymerase activity and DNA-dependent DNA polymerase activity.