JP3615798B2 - ガングリオシドの製造法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アルカリで加水分解することによってガングリオシドＧ_Ｄ３からガングリオシドＧ_Ｍ３を製造する方法に関する。本発明の製造法により得られるガングリオシドＧ_Ｍ３は、医学、薬学及び生化学などの分野で試薬として有用であり、また、医薬品、化粧品、飲食品及び飼料などの素材としても有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ガングリオシドは、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称であり、種々の分子種が存在することが知られている。その中で、ガングリオシドＧ_Ｍ３は、セラミドに乳糖の還元末端が結合し、かつ乳糖の非還元末端にシアル酸がα２−３結合した構造を有している。また、ガングリオシドＧ_Ｄ３は、ガングリオシドＧ_Ｍ３の非還元末端にさらにシアル酸がα２−８結合した構造を有しており、分子全体としてはシアル酸を２分子含んでいる。
【０００３】
ガングリオシドＧ_Ｍ３については、多様な生理機能が知られており、例えば、ケラチノサイトの増殖阻害作用や血管形成抑制作用、白血球の分化作用などが報告されている。また、ガングリオシドＧ_Ｍ３は、インフルエンザやニューカッスル病ウイルスのレセプターであることも知られている。
【０００４】
ガングリオシドＧ_Ｄ３からガングリオシドＧ_Ｍ３を製造する方法としては、シアリダーゼで加水分解する方法や酸で加水分解する方法が知られている〔特開平５−２７９３７９号公報〕。しかしながら、シアリダーゼで加水分解する方法は、共存するタンパク質などによって阻害を受けたり、共存する遊離のシアル酸や結合性のシアル酸などによって基質阻害が起こり易い状態となっており、用いるシアリダーゼも高価であることなどから、必ずしも工業的に有利な方法であるとはいい難い。また、酸で加水分解する方法は、変換に要するコストは小さいが、タンパク質の沈澱が生成し易いので、例えば、牛乳や乳製品などタンパク質を含有する割合が大きい原材料に、この方法を適用することは困難性が大きいといえる。さらに、酸で加水分解した場合、溶液の粘度が上昇し易いという問題もある。
【０００５】
なお、一般にアルカリではタンパク質の沈澱は生成せず、粘度の上昇もないことが知られているが、糖の結合はアルカリで切断されることなく安定で、アルカリにより脱シアル酸反応を行うことは困難であった。
【０００６】
【発明の解決しようとする課題】
本発明者らは、ガングリオシドＧ_Ｄ３からガングリオシドＧ_Ｍ３を製造する方法について、種々、研究を進めていたところ、アルカリでの特定条件下でガングリオシドＧ_Ｄ３を処理することで、ガングリオシドＧ_Ｄ３のシアル酸部分の非還元末端に結合するシアル酸１分子のみを脱シアル化してガングリオシドＧ_Ｄ３をガングリオシドＧ_Ｍ３に変換できることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、タンパク質などの沈澱が生成しないアルカリ条件下で、ガングリオシドＧ_Ｄ３をガングリオシドＧ_Ｍ３に変換させてガングリオシドＧ_Ｍ３を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の製造法の特徴は、アルカリの特定条件下でガングリオシドＧ_Ｄ３をガングリオシドＧ_Ｍ３に変換させることにある。つまり、本発明の製造法では、反応ｐＨ及び反応温度の設定が非常に重要となる。反応ｐＨが高ければ高い程、また、反応温度が高ければ高い程、ガングリオシドＧ_Ｍ３の生成速度は大きくなるが、ガングリオシドＧ_Ｍ３の分解速度も大きくなる。したがって、ガングリオシドＧ_Ｍ３を高収率で製造するためには、反応ｐＨを８〜１１の範囲に調整し、また、反応温度を３０℃〜 １４０℃の範囲に調整することが好ましい。そして、この反応条件に応じた反応時間を適宜、設定すればよい。
【０００８】
本発明の製造法では、原料としてガングリオシドＧ_Ｄ３を用いる。この原料としては、高度に精製されたガングリオシドＧ_Ｄ３を用いることもできるし、ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ） やバターミルクなどガングリオシドＧ_Ｄ３を比較的多量に含む素材、または全乳や脱脂乳などのタンパク質を多量に含有するがガングリオシドＧ_Ｄ３を余り多量には含まない素材を用いることもできる。また、ガングリオシドＧ_Ｄ３を含む素材をエタノールなどの有機溶媒で抽出する方法〔特開平２−２０７０９０号公報〕で調製したものを用いることもできる。そして、生成したガングリオシドＧ_Ｍ３は、常法に従って分離、精製し、試薬などとして用いることもできるし、ガングリオシドＧ_Ｍ３を含有する組成物の状態で、医薬品、化粧品、飲食品及び飼料などの素材として用いることもできる。
【０００９】
このように、本発明の製造法によると、ガングリオシドＧ_Ｄ３から比較的安価にかつ簡便にガングリオシドＧ_Ｍ３を製造することができるので、本発明の方法は、工業的なガングリオシドＧ_Ｍ３の製造法として有用である。
【００１０】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
１リットル当たり １３０ｍｇのガングリオシドＧ_Ｄ３を含有する１０％ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ） 水溶液に５Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを ９．７に調整し、８５℃にて６０分間反応を行った。この際、反応液中に沈澱は生成せず、粘度の上昇もなかった。反応終了後、反応液に２Ｎ塩酸を加えて中和し、脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出した後、薄層クロマトグラフィーを行った。なお、薄層クロマトグラフィーは、Ｎｏ．１３７４９（メルク社製）を用い、溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝６０：３５：８）で展開し、レゾルシノール発色を行った。その結果は、図１に示した通りであり、標準品である牛脳由来ガングリオシドＧ_Ｍ３と同様のＲｆ値を示すガングリオシドＧ_Ｍ３が生成していることが判った。また、デンシトメトリーによると、この反応液中には、１リットル当たり４２ｍｇのガングリオシドＧ_Ｍ３が含まれていることを確認した。
【００１１】
【実施例２】
バターミルク粉１００ｇに８０％エタノール２リットルを加え、室温で８時間撹拌した後、濾過によって沈澱物を除去し、さらに水を加えて低温で減圧蒸留を繰り返してエタノールを除去し、最終的に２リットルの水溶液としたものを原料として用いた。なお、この水溶液中には、１リットル当たり２．６ｇのガングリオシドＧ_Ｄ３と ０．１６ｇのガングリオシドＧ_Ｍ３が含まれていた。
【００１２】
この水溶液に２Ｎ水酸化カリウムを加えてｐＨを８に調整し、９５℃にて６０分間反応を行った。反応終了後、反応液に２Ｎ塩酸を加えて中和し、脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出した後、実施例１と同様の薄層クロマトグラフィーを行った。その結果、この反応液中には、１リットル当たり ０．７２ｇのガングリオシドＧ_Ｍ３が含まれていることを確認した。
【００１３】
このガングリオシドＧ_Ｍ３に相当する画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出し、減圧乾固して得られた白色粉末を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５ （ファルマシア社製）によるイオン交換クロマトグラフィーに供し、さらに、イアトロビーズ ６ＲＳ ８０６０（ヤトロン社製）によるシリカゲルクロマトグラフィーに供して反応生成物を回収した。凍結乾燥後、得られた白色粉末 ０．６８ｇをＮＭＲで分析したところ、図２に示した通りの結果を得た。この結果は標準品と一致した。
【００１４】
【実施例３】
１リットル当たり ３．８ｍｇのガングリオシドＧ_Ｄ３と ０．１ｍｇのガングリオシドＧ_Ｍ３を含有する脱脂乳５リットルに１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを ８．７に調整し、９０℃にて６０分間反応を行った。反応終了後、反応液に０．５Ｎ塩酸を加えて中和し、脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出した後、実施例１と同様の薄層クロマトグラフィーを行った。その結果、この反応液中には、１リットル当たり １．１ｍｇのガングリオシドＧ_Ｍ３が含まれていることを確認した。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の製造法によると、ガングリオシドＧ_Ｄ３から比較的安価にかつ簡便にガングリオシドＧ_Ｍ３を製造することができる。特に、タンパク質を比較的多量に含む乳や乳製品を原料としてガングリオシドＧ_Ｍ３を製造することができるので、本発明の方法は工業的なガングリオシドＧ_Ｍ３の製造法として有用である。そして、本発明の製造法によって製造されたガングリオシドＧ_Ｍ３は、感染防御能などの生理機能を有するので、医薬品、化粧品、飲食品及び飼料などの素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、実施例１における反応生成物の薄層クロマトグラフィーの結果である。
【図２】は、実施例２における反応生成物のＮＭＲスペクトルである。

Claims (2)

1. アルカリ条件下で加熱処理を行ってガングリオシドＧ_Ｄ３をガングリオシドＧ_Ｍ３に変換することを特徴とするガングリオシドＧ_Ｍ３の製造法。
2. 反応ｐＨ８〜１１及び反応温度３０℃〜 １４０℃の範囲で加熱処理を行う請求項１記載の製造法。

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