【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は被検体中の塩素イオンの新規な定量方法に関するものであり、例えば、体液中の塩素イオンの定量といった臨床検査などの医療の分野で広く利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
体液中の塩素イオンは、水の平衡、酸塩基平衡、そして、浸透圧の調整などに関与する重要なイオンである。従来、体液中の塩素イオンの測定は、比色法、電量滴定法、電極法などにより行われてきた。
【０００３】
比色法は、塩素イオンとチオシアン第二水銀を反応させ、遊離したチオシアンイオンを第二鉄イオンで発色させて比色定量するものであるが、試薬中に毒性の強い水銀やシアンが含有されているという欠点があった。
【０００４】
電量滴定法は、電解液中で銀電極に一定の電流を流し、遊離した銀イオンと塩素イオンを反応させ塩化銀として沈殿させ、すべての塩素イオンが消費されると銀イオンが急速に増加し、この瞬間を指示電極でとらえて終点とし、これに要した時間から塩素イオンを定量するものであるが、専用の装置が必要で、試料の分析処理効率が悪いなどの欠点があった。
【０００５】
電極法は、イオン選択電極を利用して塩素イオンを定量するものであるが、専用の装置が必要であり、また、塩素イオンだけでなく、他のハロゲンイオンにも応答してしまうというイオン特異性の問題がある。
【０００６】
さらに、これらの様々な問題点を解決する方法として、アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量法がクリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３４巻、５５２頁（１９８８年）に報告された。しかし、この方法は確かに専用装置を必要とせず、広く一般に使用されている分光光度計を利用でき、また、試薬中に有害物質を含有していないという利点を有するが、一方、測定範囲が狭く、試薬の安定性が悪いという欠点を有している。
我々は、モノアミン酸化酵素を利用した酵素法による塩素イオンの定量法と定量試薬を提案した（特願平５−２７０４５７）。この方法は、モノアミン酸化酵素が塩素イオンによって阻害を受け、また、その阻害の程度が塩素イオン濃度に比例するという性質を利用して塩素イオンを決定する方法であり、具体的には、塩素イオンを含有する被検体にモノアミン酸化酵素とアミン化合物とを作用させ、生じた酵素反応生成物を定量することによって実施される。反応生成物として、アンモニア、過酸化水素、アルデヒド化合物が挙げられるが、アンモニアを反応生成物として定量する方法は、アンモニアが被検体中にも存在しているため、好ましくない。過酸化水素を反応生成物として定量する方法は、過酸化水素をペルオキシダーゼを利用して定量するもので、モル吸光係数の高い色素を生成させることができ、その結果、高感度に定量できる方法である。この方法では、血清を定量した場合、正確に塩素イオン濃度を定量することができたが、尿を定量する場合、尿中の何らかの還元性物質によりペルオキシダーゼが阻害を受け、正確に塩素イオン濃度を定量できない尿検体が出現するという問題が生じた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特別な装置の使用及び特別な廃液処理の必要がなく、分析処理効率、定量性及び試薬の安定性に優れた測定範囲の広い、尿検体も正確に定量できる塩素イオンの定量方法の開発を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、モノアミン酸化酵素が塩素イオンによって阻害を受け、また、その阻害の程度が塩素イオン濃度に比例し、モノアミン酸化酵素の触媒する反応の結果生成するアルデヒド化合物を定量することで尿検体においても正確に塩素イオン濃度を定量できるという事実を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、塩素イオンを含有する被検体にモノアミン酸化酵素及びアミン化合物を作用させ、次いで該酵素反応によって生成するアルデヒド化合物に酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させて、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することによって塩素イオン量を決定することを特徴とする塩素イオンの定量方法である。
【００１０】
他の発明は、モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を含んでなり、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化合物とが互いに共存しないように分包された二つの試薬から構成されていることを特徴とする塩素イオン定量試薬である。
【００１１】
。本発明で言う被検体とは、血液、血清、血漿及び尿等に代表される体液、培養物、あるいは細胞内液等の液体あるいは抽出液を言う。
【００１２】
本発明におけるモノアミン酸化酵素とは、塩素イオンにより阻害を受けるという性質を有し、次式に示すアミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化によるアルデヒド化合物、アンモニア、過酸化水素の生成反応を触媒する酵素を指す。
【００１３】
アミン化合物＋酸素＋Ｈ２Ｏ → アルデヒド化合物＋アンモニア＋過酸化水素
モノアミン酸化酵素としては、上記の性質を有する酵素であれば特に限定されず、公知のものが使用でき、具体的には、アグリカルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、２９巻、６４９頁（１９６５年）に記載のアスペルギルス・ニガー由来のアミン酸化酵素、特開昭５８−９６９８号公報に記載のタラロマイセス・フラバス・バリエタス・フラバス・Ｍ４１７５菌（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ Ｍ４１７５）由来のアミン酸化酵素、ペトロミセス・アリアセウス・Ｍ４６４８菌（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｉａｃｅｕｓ Ｍ４６４８）由来のアミン酸化酵素、ネオサルトルヤ・フイツエリー・Ｍ４６９０菌（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ Ｍ４６９０）由来のアミン酸化酵素、ユーロチウム・チエバリエリ・Ｍ４８０５菌（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｈｅｖｅｌｉｅｒｉ Ｍ４８０５）由来のアミン酸化酵素、ユーベニシリウム・パルバム・Ｍ５０５１菌（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ Ｍ５０５１）由来のアミン酸化酵素等が挙げられるが、塩素イオンに対する感受性と安定性という観点から、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミン酸化酵素が好適に使用できる。この様なモノアミン酸化酵素生産菌から公知の方法により目的とする酵素を得る。
【００１４】
本発明におけるアミン化合物は、モノアミン酸化酵素により酸化をうけるものであれば特に限定されるものではない。例えば、ベンジルアミン、ｐ−フルオロベンジルアミン、フェネチルアミン、１−アミノブタン、１−アミノペンタン、１−アミノヘキサン等が挙げられ、特にベンジルアミンが酵素との親和性の点で好ましい。
【００１５】
また、本発明において言うアルデヒド化合物とは、アミン化合物がモノアミン酸化酵素の作用を受けて生成するアルデヒド化合物を言い、上記例示されたアミン化合物に各々対応して生成するアミン化合物由来の、ベンズアルデヒド、ｐ−フルオロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、１−ブタナール、１−ペンタナール、１−ヘキサナールである。
【００１６】
本発明に使用される酸化型ニコチンアミド補酵素は、特に限定されるものではなく使用するアルデヒド脱水素酵素が基質として認識するものであればいかなるものでも良い。例示すれば、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋と略記する）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ＋と略記する）、チオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋と略記する）、及びチオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ＋と略記する）が挙げられる。
【００１７】
本発明に使用するアルデヒド脱水素酵素は、１モルのアルデヒド化合物と１モルの酸化型ニコチンアミド補酵素に対して作用して、１モルのカルボン酸と１モルの還元型ニコチンアミド補酵素を生成するものであれば特に限定されず、かかる特性を有する酵素が制限なく使用される。かかるアルデヒド脱水素酵素の作用は以下の反応式で示すことが出来る。
【００１８】
酸化型ニコチンアミド補酵素 ＋ アルデヒド化合物 →還元型ニコチンアミド補酵素 ＋ カルボン酸化合物
かかる特性を示すアルデヒド脱水素酵素を例示すれば、ジャーナル・バクテリオロジー（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、６６巻、５４８〜５５３頁（１９５３年）に記載のＮＡＤ＋依存性ベンズアルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、２４２巻、５２９４〜５３００頁（１９６７年）に記載のＮＡＤＰ＋依存性ベンズアルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、２４７巻、２６７〜２７２頁（１９７２年）に記載のＮＡＤ＋依存性アルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、２０１巻、６２９〜６３７頁（１９５３年）に記載のＮＡＤＰ＋依存性アルデヒド脱水素酵素、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１７Ａ巻、５９３〜５５９６頁（１９７０年）に記載のＮＡＤ＋依存性フェニルアセトアルデヒド脱水素酵素、ビオヒミカ・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ）、１１８巻、２８５〜２９８頁（１９６６年）に記載のＮＡＤ＋依存性アリールアルデヒド脱水素酵素、及びユアロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、８巻、４１３〜４１９頁（１９６９年）に記載のＮＡＤＰ＋依存性アリールアルデヒド脱水素酵素等が挙げられる。
【００１９】
本発明の定量方法において、被検体にアミン化合物、モノアミン酸化酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる条件としては、生体中の成分を酵素的に定量する公知の条件が特に制限なく使用出来る。
【００２０】
通常、反応液量は、０．１〜５ｍｌの範囲で行われる。モノアミン酸化酵素は、反応液１ｍｌ当たり０．００１〜１０ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０１〜０．５ユニットの範囲で好適に使用される。アミン化合物は、０．０１〜１００ｍＭの範囲の濃度で使用されるが、特に０．５〜１０ｍＭの範囲の濃度で好適に使用される。
【００２１】
本発明の定量方法に用いられる酸化型ニコチンアミド補酵素の濃度は、使用するアルデヒド脱水素酵素の性質に依るが、一般にアルデヒド脱水素酵素の酸化型ニコチンアミド補酵素に対するＫｍ値の２〜２００倍の濃度範囲、すなわち通常は０．５〜２００ｍＭの濃度範囲で添加されが、特に４〜１００倍の濃度範囲、すなわち１〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。
【００２２】
本発明の定量方法に使用するアルデヒド脱水素酵素量は、酵素の活性、反応条件、定量対象となる被検体中の塩素イオン濃度等によって異なり、一概に限定できないが、好ましくは反応液で酵素反応によって生成したアルデヒド化合物が所定の時間内に完全にカルボン酸に変換され、同時にその化学当量の酸化型ニコチンアミド補酵素を還元型ニコチンアミド補酵素に変換せしめるに充分なアルデヒド脱水素酵素量に達していれば良い。かかるアルデヒド脱水素酵素量としては、通常反応液１ｍｌ当り０．０１〜１００ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０５〜５０ユニットの範囲が好適である。
【００２３】
本発明における被検体とモノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を反応させる際の反応系のｐＨは、モノアミン酸化酵素及びアルデヒド脱水素酵素の活性が高く維持されるｐＨであれば特に限定されないが、具体的には、ｐＨ５〜９の範囲、特にｐＨ６〜８の範囲が好適である。ｐＨを維持するための緩衝液は、塩素イオンを含有していなければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用できる。
【００２４】
本発明の定量方法の反応温度条件は、通常１０〜４５℃の範囲で使用出来るが、特に２５℃〜３７℃の範囲が好適である。反応時間は、１〜３０分の範囲、特に３〜１０分の範囲が好適である。
【００２５】
本発明の方法による酵素反応に伴って生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量の定量方法は、既存の一般的な方法を用いることが出来る。例えば、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨである場合は３４０ｎｍの吸光度の増加を、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＴｈｉｏ−ＮＡＤＨあるいはＴｈｉｏ−ＮＡＤＰＨである場合は４００ｎｍの吸光度の増加量を測定することによって定量出来る。また、高感度に定量したい場合は、生成する還元型ニコチンアミド補酵素をテトラゾリウム塩化合物とジアフォラーゼと作用させてホルマザン色素を生成せしめ、このホルマザン色素を比色定量することにより高感度に還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することが出来る。
【００２６】
本発明の塩素イオンの定量方法による代表的な塩素イオン濃度の測定は、モノアミン酸化酵素等を含む溶液に被検体を混合し、次いでアミン化合物等を含む溶液を加えて、最終的に、被検体、モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素、アルデヒド脱水素酵素を共存させ、モノアミン酸化酵素の触媒する反応の結果生じたアルデヒド化合物と酸化型ニコチンアミド補酵素から、アルデヒド脱水素酵素の作用により生成した還元型ニコチンアミド補酵素を、前記の直接またはテトラゾリウム塩を用いた方法により比色定量することにより実施される。
【００２７】
本発明の定量方法において、定量性、酵素の安定性、操作の簡便性の点から、被検体にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミン酸化酵素とベンジルアミンを作用させ、生成したベンズアルデヒドに酸化型ニコチンアミド補酵素とアルデヒド脱水素酵素を作用させ、生成した還元型ニコチンアミド補酵素を、直接またはテトラゾリウム塩を用いた方法で比色定量することにより被検体中の塩素イオン濃度を決定する方法が特に好ましい。
【００２８】
本発明の塩素イオン定量試薬は、モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を含んでなり、これら試薬成分中、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化合物とは互いに分離されて含有され、別包形態の試薬として存在する。該定量試薬は、アルデヒド化合物に対するアルデヒド脱水素酵素の作用により生じた還元型補酵素の生成速度（量）を定量することにより塩素イオン濃度を定量する試薬である。以下更に詳しく説明する。
【００２９】
還元型ニコチンアミド補酵素を還元型補酵素自身の吸光度を測定して直接定量する場合は、モノアミン酸化酵素は、反応液１ｍｌ当たり０．００１〜１０ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０１〜０．５ユニットの範囲で好適に使用される。アミン化合物は、０．０１〜１００ｍＭの範囲の濃度で使用されるが、特に０．５〜１０ｍＭの範囲の濃度で好適に使用される。酸化型ニコチンアミド補酵素は、０．５〜２００ｍＭの濃度範囲で添加されるが、特に１〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。アルデヒド脱水素酵素は、反応液１ｍｌ当り０．０１〜１００ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０５〜５０ユニットの範囲が好適である。
【００３０】
上記組成の試薬に、ジアホラーゼ及びテトラゾリウム塩化合物を配合することにより、還元型ニコチンアミド補酵素とテトラゾリウム塩化合物から下記に示すジアホラーゼの作用によりホルマザン色素を生成させてこのホルマザン色素をその色素の極大吸収波長近辺で比色定量することにより高感度に塩素イオン濃度を定量する試薬とすることができる。
【００３１】
還元型ニコチンアミド型補酵素 ＋ テトラゾリウム塩化合物 →ホルマザン色素 ＋ 酸化型ニコチンアミド補酵素
ジアホラーゼは市販の酵素が特に制限なく使用できる。テトラゾリウム塩は特に限定されるものではなく、種々のものが使用できる。例えば、（株）同人化学研究所総合カタログ（第１９版，平成６年７月３１日発行）１６６〜１７０頁記載のニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルー、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３等が使用できる。この場合、ジアホラーゼは反応液１ｍｌ当たり０．５〜５００ユニットの範囲で使用されるが、特に１〜１００ユニットの範囲で好適に使用される。テトラゾリウム塩化合物は０．０５〜５０ｍＭの範囲で使用されるが、特に０．１〜１０ｍＭの範囲で好適に使用される。
【００３２】
本発明の定量試薬は、モノアミン酸化酵素とアルデヒド脱水素酵素の活性が高く維持されるｐＨ、即ち一般的には、ｐＨ５〜９の範囲、特にｐＨ６〜８で定量に供されるので、少なくとも測定時にｐＨを維持するための緩衝液を使用するのが好ましい。該緩衝液は測定時に反応系に混合してｐＨ調整を行ってもよいが、試薬の活性維持、簡便性の観点から、本試薬中に予め含有させておくことが望ましい。該緩衝液としては、塩素イオンを含有していなければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用できる。
【００３３】
本試薬に含まれる上記必須成分の中で、モノアミン酸化酵素とアミン化合物は酵素反応が進行しないように互いに分離させて別試薬としておく必要があるが、その他の酵素、補酵素、化合物の配合形態には何ら制限はない。例えば、モノアミン酸化酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を緩衝液中に含有させた酵素溶液（高感度に測定したい場合には、さらにジアホラーゼとテトラゾリウム塩化合物も含有する）と、アミン化合物の水溶液からなる基質溶液をそれぞれ調製し、測定時に両者が被検体共々混合され定量に供される。
【００３４】
本発明の塩素イオン定量試薬において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミン酸化酵素、ベンジルアミン、酸化型ニコチンアミド補酵素、アルデヒド酸化酵素からなり、これら試薬成分中、当該アミン酸化酵素とベンジルアミンとは分離して二試薬形態で存在する定量試薬が保存安定性、定量性、操作性の点から特に好ましい。
【００３５】
本発明の定量試薬並びに定量方法を用いた塩素イオンの定量は、一般的には、検体の測定に先だち、塩化ナトリウム溶液、あるいは塩化カリウム溶液等の塩素イオン濃度既知標準溶液を試料として、本発明の定量法に従って検量線を作成し、還元型ニコチンアミド補酵素またはホルマザン色素の生成速度（量）と塩素イオン濃度との検量線を作製し、この検量線から被検体中の塩素イオン濃度を算出する。
【００３６】
【作用】
モノアミン酸化酵素は、アミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化によるアルデヒド化合物、アンモニア、及び過酸化水素の生成反応を触媒するが、反応液中に塩素イオンが存在すると、その濃度に比例して活性が変化する。反応生成物であるアルデヒド化合物に酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素と作用させることによって生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量することでモノアミン酸化酵素活性を測定し、被検体中の塩素イオンを定量する。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の塩素イオン定量法により、汎用的な装置を使用し、簡便な操作で、還元性物質が含まれる尿検体においても正確に塩素イオンを定量する方法、並びに広い測定範囲と高い安定性を有する塩素イオン定量試薬が提供される。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、酵素活性値を示す単位として、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を生成させる酵素量を １ユニットと示した。
【００３９】
製造例１〔モノアミン酸化酵素の調製〕
モノアミン酸化酵素は、次の方法にて調製した。３．０％ グルコース、０．３％ 硝酸ナトリウム、０．１％ リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％ 塩化カリウム、０．００１％ 硫酸第一鉄、０．１％ 酵母エキス、０．０２％ 消泡剤から成る前培養培地（ｐＨ５．０）１００ｍｌの入った坂口フラスコを１０本用意し、アスペルギルス・ニガー（ＡＴＣＣ ２８３２５）の胞子懸濁液を接種し、３０℃、攪拌回転数１１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。この坂口フラスコ１０本分の培養液を、２０ｌの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに移し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気２５Ｌ／ｍｉｎで一晩培養した後、集菌した。次いで、１６０ｌの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに植菌し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気１８０ｌ／ｍｉｎで一晩培養した後、集菌し、３．０％グルコース、０．１％ ブチルアミン、０．１％ リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％ 塩化カリウム、０．００１％ 硫酸第一鉄、０．０２％ 消泡剤から成る本培養培地（ｐＨ５．０）を１６０ｌ仕込んだジャーファーメンターに菌体を植菌し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気１８０ｌ／ｍｉｎで一晩本培養を行い集菌した。
【００４０】
得られた菌体の約５ｋｇ（湿菌体重量）を５０ｌの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミル細胞破砕機を用いて菌体破砕を行った。連続遠心分離機により、破砕液から不溶物を除き、上清液を得た。
【００４１】
破砕上清液に、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）を３Ｌ加え、静かに攪拌しながら、４℃で一晩放置した。この溶液を吸引濾過し、タンパク質の吸着した樹脂を得、よく洗浄した後にカラムに充填した。０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液を用いて吸着したタンパク質を溶出し、活性画分を回収し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより脱塩を行った。
【００４２】
次に、脱塩した活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した１ＬのＤＥＡＥ−セルロースカラムに通し、タンパク質を吸着させ、同様の緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度を０Ｍから０．２Ｍまで直線的に増加させてタンパク質を溶出し、活性画分を回収した。
【００４３】
活性画分を限外濾過により濃縮し、０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した ３ＬのセファクリルＳ−４００（ファルマシア社製）カラムに通し、活性画分を回収し、最終精製標品とした。
【００４４】
約５ｋｇ（湿菌体重量）の菌体から、９００ユニット（比活性＝１．５ユニット／ｍｇタンパク質）のモノアミン酸化酵素を得た。
【００４５】
製造例２〔アルデヒド脱水素酵素の調製〕
アルデヒド脱水素酵素は、次の方法にて調製した。０．５％ グルコース、１．３６％ リン酸水素二カリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、０．１％ 硫酸アンモニウム、０．００２％ 硫酸マグネシウム、０．０００１５６％ 硫酸アンモニウム鉄、及び０．０２％ 消泡剤から成る培地（ｐＨ７．０）１Ｌを５Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌した後、２８℃下でシュードモナス・プチダ（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ， ＩＦＯ １４１６４）を植菌した。２８℃で２４時間振盪培養を行った後、この培養液を予め０．１％ マンデル酸を含む上記と同様の組成を有する２０Ｌの培地を仕込み滅菌しておいたジャー・ファーメンターに植菌し、温度：２８℃、攪拌回転数：１５０ｒｐｍ、通気量：２０Ｌ／ｍｉｎにて本培養を行った。１８時間培養の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。
【００４６】
得られた菌体の内、約２００ｇ（湿菌体重量）を１，２００ｍｌの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、冷却下で超音波破砕機を用いて菌体破砕を行った。遠心分離機により、破砕液から不溶物を除き、上清液を得た。
【００４７】
破砕上清液を、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいた１ＬのＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）カラムに通し、タンパク質を吸着させ、同様の緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度を０Ｍから０．２Ｍまで直線的に増加させてタンパク質を溶出して活性画分を回収した。
【００４８】
活性画分を限外濾過により脱塩、濃縮し、０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した ３ＬのセファクリルＳ−４００（ファルマシア社製）カラムに通し、活性画分を回収し、最終精製標品とした。
【００４９】
約２００ｇ（湿菌体重量）の菌体から、３００ユニット（比活性＝１．２ユニット／ｍｇタンパク質）のアルデヒド脱水素酵素を得た。
【００５０】
実施例１
下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。
【００５１】
［酵素溶液］
０．１２８Ｍ リン酸緩衝液 （ｐＨ ７．５）
１．２８１ｍＭ ＮＡＤＰ＋
１３３ｍＵ／ｍｌ モノアミン酸化酵素
１３３ｍＵ／ｍｌ アルデヒド脱水素酵素
［基質溶液］
２５．６ｍＭ ベンジルアミン
基質溶液のｐＨは、リン酸を用いてｐＨ７．０に調整した。
【００５２】
試料として、０ 、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、及び５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を調製し、測定を行った。３２０μｌの酵素溶液に１０μｌの試料を加えてよく混合し、３７℃で５分間保温した。次いで８０μｌの基質溶液を加え、３７℃で、３４０ｎｍの波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ３４０）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸にΔＡ３４０の逆数（１／ΔＡ３４０）をとりプロットした。図１にその結果を示す。図１から明らかなように、塩素イオン濃度０〜５００ｍＭの範囲で良好な直線関係が得られた。
【００５３】
比較例１
アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬として市販測定試薬Ａを使用して、実施例１と同様に、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を測定した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸に１分間当たりの４０４ｎｍの吸光度変化（ΔＡ４０４）をとりプロットした。図２にその結果を示す。
【００５４】
実施例１及び比較例１から、本発明の方法は、アミラーゼを用いた方法より広い塩素イオン濃度にわたって、直線性を有することが確認された。
【００５５】
実施例２
実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を、試薬調製直後、及び４℃で７、１４日間保存した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用した以外は実施例１に記載した方法により測定した。試薬調製直後の１／ΔＡ３４０を１００として、７日後、１４日後の１／ΔＡ３４０から相対値（活性残存率）を算出し、本発明の試薬の保存安定性を測定した。結果を図３に示す。
【００５６】
比較例２
アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａを用いて、実施例２と同様に、試薬調製直後、及び４℃で７、１４日間保存した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用して測定した。試薬調製直後のΔＡ４０４を１００として、７日後、１４日後のΔＡ４０４から相対値（活性残存率）を算出し、市販測定試薬Ａの保存安定性を測定した。結果を図３に示す。
【００５７】
実施例３
実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を、調製直後、及び３７℃で３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分間保温した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用して実施例２に記載した方法により活性残存率を算出し、本発明の試薬の保存安定性を測定した。結果を図４に示す。
【００５８】
比較例３
アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａも実施例３と同様に、調製直後、及び３７℃で３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分間保温した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用して、比較例２に記載した方法により活性残存率を算出し、市販測定試薬Ａの保存安定性を測定した。結果を図４に示す。
【００５９】
実施例２、３と比較例２、３より、本発明の試薬は、アミラーゼを用いた市販試薬Ａより高い保存安定性を有することが確認できた。
【００６０】
実施例４
下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。
【００６１】
［酵素溶液］
０．１２８Ｍ リン酸緩衝液 （ｐＨ ７．５）
０．１％ 界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
１．２８１ｍＭ ＮＡＤＰ＋
２５．６Ｕ／ｍｌ ジアフォラーゼ（ユニチカ社製）
３３．３ｍＵ／ｍｌ モノアミン酸化酵素
３３．３ｍＵ／ｍｌ アルデヒド脱水素酵素
０．２ｍＭ ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ：同仁化学研究所社製）
［基質溶液］
２５．６ｍＭ ベンジルアミン
基質溶液のｐＨは、リン酸を用いてｐＨ７．０に調整した。
【００６２】
試料として、０ 、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、及び５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を調製し、測定を行った。３２０μｌの酵素溶液に１０μｌの試料を加えてよく混合し、３７℃で５分間保温した。次いで８０μｌの基質溶液を加え、３７℃で、５３０ｎｍの波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ５３０）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸にΔＡ５３０の逆数（１／ΔＡ５３０）をとりプロットした。図５にその結果を示す。この様にテトラゾリウム塩を使用する方法によると実施例１より少ない酵素量（約１／４）、すなわち高感度に実施例１と同様の結果が得られた。
【００６３】
実施例５
実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を用いて、０、８０、１２０、１６０、２００、３００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を実施例１と同様の方法により測定し、検量線を作製した。健常者随時尿検体（５検体）を測定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００６４】
実施例６
実施例４で調製した酵素溶液と基質溶液を用いて、０、８０、１２０、１６０、２００、３００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を実施例４と同様の方法により測定し、検量線を作製した。実施例５と同一の健常者尿検体を測定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００６５】
比較例４
モノアミン酸化酵素の反応の結果生じる過酸化水素を定量することにより被検体中の塩素イオンを定量する試薬として、下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。
【００６６】
［酵素溶液］
０．１２８Ｍ リン酸緩衝液 （ｐＨ６．８）
１．２８１ｍＭ ４−アミノアンチピリン
１．２８１ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −ｍ−トルイジン（同仁化学研究所社製）
２３．６Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
３３．３ｍＵ／ｍｌ モノアミン酸化酵素
［基質溶液］
２５．６ｍＭ ベンジルアミン
基質溶液のｐＨは、リン酸を用いてｐＨ７．０に調整した。
【００６７】
０、８０、１２０、１６０、２００、３００ｍＭの塩化ナトリウム溶液調製し、測定を行った。３２０μｌの酵素溶液に１０μｌの試料を加えてよく混合し、３７℃で５分間保温した。次いで８０μｌの基質溶液を加え、３７℃で、５５５ｎｍの波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ５５５）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸にΔＡ５５５の逆数（１／ΔＡ５５５）をとりプロットし、検量線を作製した。実施例５と同一の健常者尿検体を測定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００６８】
比較例５
実施例５と同一の健常者尿検体をＰＶＡ−α（シノテスト社）を用いて、取扱説明書に従って、電量滴定法により測定した。結果を表１に示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
実施例５、６と比較例４、５より、本発明の方法は、尿検体において電量滴定法と良い相関性を示すことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は本発明の塩素イオンの定量法の塩素イオンと１分間当たりの吸光度変化の逆数（１／ΔＡ３４０）との関係を示す図である。
【図２】本図はアミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａの塩素イオンと１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ４０４）との関係を示す図である。
【図３】本図は本発明の塩素イオンの定量試薬と市販測定試薬Ａの４℃における保存安定性（活性残存率）を示す図である。
【図４】本図は本発明の塩素イオンの定量試薬と市販測定試薬Ａの３７℃における保存安定性（活性残存率）を示す図である。
【図５】本図はテトラゾリウム塩を使用した本発明の塩素イオンの定量法の塩素イオンと１分間当たりの吸光度変化の逆数（１／ΔＡ５３０）との関係を示す図である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a novel method for quantifying chloride ions in a subject, and can be widely used in medical fields such as clinical tests, for example, for quantification of chloride ions in body fluids.
[0002]
[Prior art]
Chloride ions in body fluids are important ions involved in water balance, acid-base balance, and adjustment of osmotic pressure. Conventionally, measurement of chloride ions in body fluids has been performed by a colorimetric method, a coulometric titration method, an electrode method, or the like.
[0003]
In the colorimetric method, chloride ions are reacted with mercuric thiocyanate, and the released thiocyanic ions are colored with ferric ions for colorimetric determination.The reagent contains highly toxic mercury or cyanide. There was a disadvantage that.
[0004]
In the coulometric titration method, a constant current is applied to a silver electrode in an electrolytic solution, and the released silver ions react with chloride ions to precipitate as silver chloride.When all the chloride ions are consumed, silver ions increase rapidly. Although this moment is captured by the indicator electrode and determined as the end point, the amount of chloride ion is determined from the time required. However, a dedicated apparatus is required, and there are drawbacks such as a low efficiency of sample analysis.
[0005]
The electrode method uses an ion-selective electrode to quantify chloride ions, but requires a special device, and responds not only to chloride ions but also to other halogen ions. There is a sex problem.
[0006]
Further, as a method for solving these various problems, a method for quantifying chloride ions by an enzymatic method using amylase was reported in Clinical Chemistry, vol. 34, p. 552 (1988). However, this method does not require a dedicated device, can utilize a widely used spectrophotometer, and has the advantage that it does not contain harmful substances in the reagent. It is disadvantageous in that it is narrow and the stability of the reagent is poor.
We have proposed a method and a reagent for quantifying chloride ions by an enzymatic method using a monoamine oxidase (Japanese Patent Application No. 5-270457). In this method, monoamine oxidase is inhibited by chloride ions, and the degree of the inhibition is proportional to the chloride ion concentration. The reaction is carried out by allowing a monoamine oxidase and an amine compound to act on a test sample containing, and quantifying the generated enzyme reaction product. Examples of the reaction product include ammonia, hydrogen peroxide, and an aldehyde compound. However, a method of quantifying ammonia as a reaction product is not preferable because ammonia is also present in the subject. The method of quantifying hydrogen peroxide as a reaction product is a method of quantifying hydrogen peroxide using peroxidase, which can produce a dye having a high molar extinction coefficient, and as a result, can be quantified with high sensitivity. is there. In this method, when serum was quantified, the chloride ion concentration could be accurately determined.However, when urine was quantified, peroxidase was inhibited by some reducing substances in the urine, and the chloride ion concentration was accurately determined. There was a problem that urine samples that could not be quantified appeared.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Aims to develop a chloride ion quantification method that can accurately quantify urine samples without the need for special equipment and special waste liquid treatment, and has a wide measurement range with excellent analytical processing efficiency, quantification and reagent stability. And
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and found that monoamine oxidase is inhibited by chloride ions, and the degree of the inhibition is proportional to the chloride ion concentration, and the reaction catalyzed by monoamine oxidase is The inventors have found that the chloride ion concentration can be accurately quantified even in a urine sample by quantifying the resulting aldehyde compound, and have completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention, a monoamine oxidase and an amine compound are allowed to act on a test sample containing chloride ions, and then an oxidized nicotinamide coenzyme and an aldehyde dehydrogenase are allowed to act on an aldehyde compound generated by the enzyme reaction. This is a method for quantifying chloride ions, wherein the amount of chloride ions is determined by quantifying the amount of reduced nicotinamide coenzyme produced.
[0010]
Another invention comprises a monoamine oxidase, an amine compound, an oxidized nicotinamide coenzyme, and an aldehyde dehydrogenase, wherein at least the monoamine oxidase and the amine compound are packaged so that they do not coexist with each other. It is a reagent for quantitatively determining chloride ion, which is constituted.
[0011]
. The subject referred to in the present invention refers to a body fluid such as blood, serum, plasma and urine, a culture, or a liquid such as an intracellular fluid or an extract.
[0012]
The monoamine oxidase of the present invention has the property of being inhibited by chloride ions, and catalyzes the reaction of producing an aldehyde compound, ammonia, and hydrogen peroxide by oxidative deamination using an amine compound represented by the following formula as a substrate. Refers to an enzyme that does
[0013]
Amine compound + oxygen + H2O → aldehyde compound + ammonia + hydrogen peroxide
The monoamine oxidase is not particularly limited as long as it is an enzyme having the above-mentioned properties, and known ones can be used. Specifically, Agricultural Biological Chemistry (Agric. Biol. Chem.), 29 Vol., P. 649 (1965), an amine oxidase derived from Aspergillus niger, and a strain derived from Talalomyces flavus varietas flavus M4175 described in JP-A-58-9698. , An amine oxidase derived from Petromyces alliaseus M4648, Neosartoria fitserie M4690 (Neosartoraya fischer) M4690), amine oxidase derived from Eurotium cheeverieri M4805, amine oxidase derived from Eubenicillium parvum M5051 (Eupenicilium parvum M5051), and chlorine. From the viewpoints of ion sensitivity and stability, an amine oxidase derived from Aspergillus niger can be suitably used. The target enzyme is obtained from such a monoamine oxidase-producing bacterium by a known method.
[0014]
The amine compound in the present invention is not particularly limited as long as it is oxidized by a monoamine oxidase. For example, benzylamine, p-fluorobenzylamine, phenethylamine, 1-aminobutane, 1-aminopentane, 1-aminohexane and the like can be mentioned, and benzylamine is particularly preferable in view of affinity with an enzyme.
[0015]
Further, the aldehyde compound referred to in the present invention refers to an aldehyde compound generated by the action of an amine compound under the action of a monoamine oxidase, and is derived from an amine compound corresponding to each of the exemplified amine compounds. -Fluorobenzaldehyde, phenylacetaldehyde, 1-butanal, 1-pentanal, and 1-hexanal.
[0016]
The oxidized nicotinamide coenzyme used in the present invention is not particularly limited, and any oxidized nicotinamide coenzyme may be used as long as the aldehyde dehydrogenase used is recognized as a substrate. For example, nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter referred to as NAD+), Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter NADP)+Thionicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter Thio-NAD).+Thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter Thio-NADP)+Abbreviated).
[0017]
The aldehyde dehydrogenase used in the present invention acts on 1 mol of aldehyde compound and 1 mol of oxidized nicotinamide coenzyme to produce 1 mol of carboxylic acid and 1 mol of reduced nicotinamide coenzyme. There is no particular limitation so long as the enzyme has such properties, and an enzyme having such properties can be used without limitation. The action of such an aldehyde dehydrogenase can be shown by the following reaction formula.
[0018]
Oxidized nicotinamide coenzyme + aldehyde compound → reduced nicotinamide coenzyme + carboxylic acid compound
An example of an aldehyde dehydrogenase exhibiting such properties is the NAD described in Journal Bacteriology (J. Bacteriol.), 66, 548-553 (1953).+-Dependent benzaldehyde dehydrogenase, NADP described in Journal Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 242, 5294-5300 (1967).+Dependent benzaldehyde dehydrogenase, described in Journal Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 247, 267-272 (1972).+-Dependent aldehyde dehydrogenase, NADP described in Journal Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 201, 629-637 (1953).+-Dependent aldehyde dehydrogenase, NAD described in Methods in Enzymology, 17A, 593-5596 (1970).+-Dependent phenylacetaldehyde dehydrogenase, NAD described in Biochimica Biophys. Acta, Vol. 118, pp. 285-298 (1966).+Dependent aryl aldehyde dehydrogenase and NADP described in European Journal Biochemistry (Eur. J. Biochem.), 8, 413-419 (1969).+Dependent aryl aldehyde dehydrogenase.
[0019]
In the quantification method of the present invention, the conditions under which an amine compound, a monoamine oxidase, an oxidized nicotinamide coenzyme, and an aldehyde dehydrogenase act on a subject include known conditions for enzymatically quantifying components in a living body. It can be used without any particular restrictions.
[0020]
Usually, the reaction volume is in the range of 0.1 to 5 ml. The monoamine oxidase is used in the range of 0.001 to 10 units per 1 ml of the reaction solution, and is particularly preferably used in the range of 0.01 to 0.5 units. The amine compound is used at a concentration ranging from 0.01 to 100 mM, and is particularly preferably used at a concentration ranging from 0.5 to 10 mM.
[0021]
The concentration of the oxidized nicotinamide coenzyme used in the quantification method of the present invention depends on the properties of the aldehyde dehydrogenase to be used, but is generally 2 to 200 times the Km value of the aldehyde dehydrogenase with respect to the oxidized nicotinamide coenzyme. Is added in a concentration range of 0.5 to 200 mM, but a concentration range of 4 to 100 times, that is, a concentration range of 1 to 100 mM is particularly preferable.
[0022]
The amount of the aldehyde dehydrogenase used in the quantification method of the present invention depends on the activity of the enzyme, the reaction conditions, the chloride ion concentration in the analyte to be quantified, and the like, and cannot be unconditionally limited. The aldehyde compound produced by the reaction is completely converted into carboxylic acid within a predetermined time, and at the same time, the amount of aldehyde dehydrogenase sufficient to convert the oxidized nicotinamide coenzyme of the chemical equivalent to reduced nicotinamide coenzyme is reached. It would be fine. The amount of the aldehyde dehydrogenase is usually used in the range of 0.01 to 100 units per 1 ml of the reaction solution, and particularly preferably in the range of 0.05 to 50 units.
[0023]
In the present invention, the pH of the reaction system when reacting the analyte with the monoamine oxidase, the amine compound, the oxidized nicotinamide coenzyme, and the aldehyde dehydrogenase, the activity of the monoamine oxidase and the aldehyde dehydrogenase is kept high. The pH is not particularly limited as long as it is a specific pH, but specifically, a range of pH 5 to 9, particularly a range of pH 6 to 8 is preferable. The buffer for maintaining the pH is not particularly limited as long as it does not contain chloride ions. For example, a phosphate buffer, a good buffer and the like can be suitably used.
[0024]
The reaction temperature condition of the quantification method of the present invention can be generally used in the range of 10 to 45 ° C, but is particularly preferably in the range of 25 ° C to 37 ° C. The reaction time is preferably in the range of 1 to 30 minutes, particularly preferably in the range of 3 to 10 minutes.
[0025]
As a method for quantifying the amount of reduced nicotinamide coenzyme produced by the enzymatic reaction according to the method of the present invention, an existing general method can be used. For example, when the reduced nicotinamide coenzyme to be produced is NADH or NADPH, the absorbance at 340 nm increases, and when the reduced nicotinamide coenzyme to be produced is Thio-NADH or Thio-NADPH, the absorbance at 400 nm increases. It can be quantified by measuring the amount. When highly sensitive quantification is desired, the resulting reduced nicotinamide coenzyme is reacted with a tetrazolium salt compound and diaphorase to form a formazan dye, and the formazan dye is colorimetrically quantified to provide a highly sensitive reduced nicotine. The amount of amide coenzyme produced can be determined.
[0026]
A typical measurement of chloride ion concentration by the method for quantifying chloride ions of the present invention is to mix a test sample with a solution containing a monoamine oxidase and the like, and then add a solution containing an amine compound and the like. , A monoamine oxidase, an amine compound, an oxidized nicotinamide coenzyme, and an aldehyde dehydrogenase are allowed to coexist, and the aldehyde compound and oxidized nicotinamide coenzyme produced as a result of the reaction catalyzed by the monoamine oxidase are converted to aldehyde dehydrogenase. The reduction is performed by colorimetric determination of the reduced nicotinamide coenzyme produced by the action by the above-mentioned method using a direct or tetrazolium salt.
[0027]
In the quantification method of the present invention, an amine oxidase derived from Aspergillus niger and benzylamine are allowed to act on the sample to oxidize the generated benzaldehyde from the viewpoints of quantification, enzyme stability, and easy operation. Nicotinamide coenzyme and aldehyde dehydrogenase are acted on, and the reduced nicotinamide coenzyme produced is determined colorimetrically, directly or using a tetrazolium salt, to determine the chloride ion concentration in the subject Is particularly preferred.
[0028]
The reagent for quantifying chloride ions of the present invention comprises a monoamine oxidase, an amine compound, an oxidized nicotinamide coenzyme and an aldehyde dehydrogenase. Among these reagent components, at least the monoamine oxidase and the amine compound are separated from each other. Contained and present as separate packaged reagents. The quantification reagent is a reagent for quantifying the chloride ion concentration by quantifying the production rate (amount) of reduced coenzyme generated by the action of the aldehyde dehydrogenase on the aldehyde compound. The details will be described below.
[0029]
When the reduced nicotinamide coenzyme is directly quantified by measuring the absorbance of the reduced coenzyme itself, the monoamine oxidase is used in the range of 0.001 to 10 units per 1 ml of the reaction solution. It is suitably used in the range of from 01 to 0.5 unit. The amine compound is used at a concentration ranging from 0.01 to 100 mM, and is particularly preferably used at a concentration ranging from 0.5 to 10 mM. The oxidized nicotinamide coenzyme is added in a concentration range of 0.5 to 200 mM, and a concentration range of 1 to 100 mM is particularly preferable. The aldehyde dehydrogenase is used in the range of 0.01 to 100 units per 1 ml of the reaction solution, and preferably in the range of 0.05 to 50 units.
[0030]
By mixing a diaphorase and a tetrazolium salt compound with the reagent having the above composition, a formazan dye is generated from the reduced nicotinamide coenzyme and the tetrazolium salt compound by the action of a diaphorase shown below, and the formazan dye is subjected to the maximum absorption of the dye. By performing colorimetric quantification near the wavelength, it can be used as a reagent for quantifying chloride ion concentration with high sensitivity.
[0031]
Reduced nicotinamide coenzyme + tetrazolium salt compound → Formazan dye + oxidized nicotinamide coenzyme
As diaphorase, a commercially available enzyme can be used without any particular limitation. The tetrazolium salt is not particularly limited, and various ones can be used. For example, nitrotetrazolium blue, tetrazolium blue, WST-1, WST-3, and the like described in Dojindo Chemical Laboratory General Catalog (19th edition, published on July 31, 1994), pages 166 to 170 can be used. In this case, diaphorase is used in a range of 0.5 to 500 units per 1 ml of the reaction solution, and particularly preferably in a range of 1 to 100 units. The tetrazolium salt compound is used in the range of 0.05 to 50 mM, and is particularly preferably used in the range of 0.1 to 10 mM.
[0032]
Since the quantification reagent of the present invention is used for quantification at a pH at which the activity of monoamine oxidase and aldehyde dehydrogenase is maintained at a high level, that is, generally in the range of pH 5 to 9, especially pH 6 to 8, Sometimes it is preferable to use a buffer to maintain the pH. The buffer may be mixed with the reaction system at the time of measurement to adjust the pH. However, from the viewpoint of maintaining the activity of the reagent and simplicity, it is desirable that the buffer is previously contained in the present reagent. The buffer is not particularly limited as long as it does not contain chloride ions. For example, a phosphate buffer, a good buffer and the like can be suitably used.
[0033]
Among the above essential components contained in this reagent, the monoamine oxidase and the amine compound need to be separated from each other as separate reagents so that the enzyme reaction does not proceed, but the mixing forms of other enzymes, coenzymes, and compounds Has no restrictions. For example, an enzyme solution in which a monoamine oxidase, an oxidized nicotinamide coenzyme, and an aldehyde dehydrogenase are contained in a buffer solution (if highly sensitive measurement is desired, diaphorase and a tetrazolium salt compound are further included) Substrate solutions each comprising an aqueous solution of an amine compound are prepared, and both are mixed with each other for measurement at the time of measurement.
[0034]
The reagent for quantifying chloride ions according to the present invention comprises an amine oxidase derived from Aspergillus niger, benzylamine, an oxidized nicotinamide coenzyme, and an aldehyde oxidase. In particular, a quantitative reagent which is present in a two-reagent form separately from the above is particularly preferable in terms of storage stability, quantitative property, and operability.
[0035]
In the determination of chloride ions using the quantitative reagent and the quantitative method of the present invention, generally, prior to the measurement of a sample, a standard solution having a known chloride ion concentration such as a sodium chloride solution or a potassium chloride solution is used as a sample. A calibration curve is created according to the method of quantification, and a calibration curve is created between the production rate (amount) of reduced nicotinamide coenzyme or formazan dye and the chloride ion concentration, and the chloride ion concentration in the subject is calculated from the calibration curve. I do.
[0036]
[Action]
Monoamine oxidase catalyzes the production reaction of aldehyde compounds, ammonia, and hydrogen peroxide by oxidative deamination using an amine compound as a substrate, but if chloride ions are present in the reaction solution, it is proportional to its concentration. Activity changes. The monoamine oxidase activity is measured by quantifying the reduced nicotinamide coenzyme produced by reacting the aldehyde compound, which is the reaction product, with the oxidized nicotinamide coenzyme and the aldehyde dehydrogenase. Quantify the ions.
[0037]
【The invention's effect】
By the chloride ion determination method of the present invention, using a general-purpose device, by a simple operation, a method for accurately determining chloride ions even in urine samples containing reducing substances, and a wide measurement range and high stability The present invention provides a chloride ion determination reagent having
[0038]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples. In addition, as a unit showing the enzyme activity value, the amount of the enzyme that produces 1 μmole of product per minute is shown as 1 unit.
[0039]
Production Example 1 [Preparation of monoamine oxidase]
Monoamine oxidase was prepared by the following method. 3.0% glucose, 0.3% sodium nitrate, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.05% potassium chloride, 0.001% ferrous sulfate, 0.1% Ten Sakaguchi flasks containing 100 ml of a preculture medium (pH 5.0) composed of a yeast extract and a 0.02% antifoaming agent were prepared, inoculated with a spore suspension of Aspergillus niger (ATCC 28325), and heated at 30 ° C. The cells were cultured overnight at 110 rpm with shaking. The culture solution of 10 Sakaguchi flasks was transferred to a jar fermenter charged with 20 l of the pre-culture solution, and cultured overnight at 30 ° C., a stirring rotation speed of 200 rpm and aeration of 25 L / min, and then collected. Next, the cells were inoculated into a jar fermenter charged with 160 l of the preculture, and cultured overnight at 30 ° C., a stirring rotation speed of 200 rpm, and aeration at 180 l / min. % Butylamine, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.05% potassium chloride, 0.001% ferrous sulfate, 0.02% defoamer (pH 5 .0) was inoculated into a jar fermenter charged with 160 l, and subjected to main culture overnight at 30 ° C., a stirring rotation speed of 200 rpm, and aeration at 180 l / min to collect the cells.
[0040]
About 5 kg (wet cell weight) of the obtained cells was suspended in 50 l of a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5), and the cells were disrupted using a Dynomill cell disrupter. Insoluble matter was removed from the crushed liquid by a continuous centrifuge to obtain a supernatant.
[0041]
To the crushed supernatant, 3 L of DEAE-cellulose (manufactured by Whatman) preliminarily equilibrated with a 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C overnight with gentle stirring. This solution was subjected to suction filtration to obtain a resin on which the protein was adsorbed, washed well, and then packed in a column. The adsorbed protein was eluted using a 20 mM phosphate buffer containing 0.2 M ammonium sulfate, the active fraction was collected, and desalted by gel filtration column chromatography.
[0042]
Next, the desalted active fraction was passed through a 1 L DEAE-cellulose column equilibrated with a 20 mM phosphate buffer to adsorb proteins, and the column was washed with the same buffer. The protein was eluted with a linear increase to .2M and the active fraction was collected.
[0043]
The active fraction was concentrated by ultrafiltration, passed through a 3 L Sephacryl S-400 (Pharmacia) column equilibrated with 10 mM phosphate buffer containing 0.1 M ammonium sulfate, and the active fraction was recovered. It was a standard.
[0044]
From about 5 kg (wet cell weight) of cells, 900 units (specific activity = 1.5 units / mg protein) of monoamine oxidase were obtained.
[0045]
Production Example 2 [Preparation of aldehyde dehydrogenase]
Aldehyde dehydrogenase was prepared by the following method. 0.5% glucose, 1.36% dipotassium hydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.1% ammonium sulfate, 0.002% magnesium sulfate, 0.0000156% ammonium iron sulfate, and 0.02% antifoam One liter of a medium (pH 7.0) containing the agent was placed in a 5 L Erlenmeyer flask, sterilized in an autoclave at 120 ° C. for 20 minutes, and inoculated with Pseudomonas putida (IFO 14164) at 28 ° C. After shaking culture at 28 ° C. for 24 hours, this culture solution was inoculated into a jar fermenter previously sterilized with 20 L of a medium having the same composition as described above containing 0.1% mandelic acid. Main culture was carried out at a temperature of 28 ° C., a stirring rotation speed of 150 rpm, and an aeration rate of 20 L / min. After culturing for 18 hours, the culture was centrifuged to collect the cells.
[0046]
About 200 g (wet cell weight) of the obtained cells was suspended in 1,200 ml of a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5), and the cells were crushed using an ultrasonic crusher under cooling. Was. The supernatant was obtained by removing insolubles from the crushed liquid by a centrifuge.
[0047]
The disrupted supernatant is passed through a 1 L DEAE-cellulose (Whatman) column which has been equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to adsorb proteins, and the column is washed with the same buffer. After that, the protein was eluted by linearly increasing the concentration of ammonium sulfate from 0 M to 0.2 M, and the active fraction was collected.
[0048]
The active fraction was desalted and concentrated by ultrafiltration, and passed through a 3 L Sephacryl S-400 (Pharmacia) column equilibrated with 10 mM phosphate buffer containing 0.1 M ammonium sulfate to collect the active fraction. And a final purified sample.
[0049]
From about 200 g (wet cell weight) of cells, 300 units (specific activity = 1.2 units / mg protein) of aldehyde dehydrogenase were obtained.
[0050]
Example 1
An enzyme solution and a substrate solution having the following compositions were prepared.
[0051]
[Enzyme solution]
0.128M phosphate buffer (pH 7.5)
1.281 mM NADP+
133 mU / ml monoamine oxidase
133 mU / ml aldehyde dehydrogenase
[Substrate solution]
25.6 mM benzylamine
The pH of the substrate solution was adjusted to pH 7.0 using phosphoric acid.
[0052]
As samples, sodium chloride solutions of 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300, 400, and 500 mM were prepared and measured. 10 μl of the sample was added to 320 μl of the enzyme solution, mixed well, and kept at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 80 μl of the substrate solution was added, the absorbance at a wavelength of 340 nm was measured at 37 ° C. for 5 minutes, and the change in absorbance per minute (ΔA340) was calculated. The abscissa plots the chlorine ion concentration, and the ordinate plots the reciprocal (1 / ΔA340) of ΔA340. FIG. 1 shows the results. As is clear from FIG. 1, a good linear relationship was obtained in the range of chloride ion concentration of 0 to 500 mM.
[0053]
Comparative Example 1
In the same manner as in Example 1, a 0 to 500 mM sodium chloride solution was measured using a commercially available measurement reagent A as a reagent for quantifying chloride ions by an enzymatic method using amylase. The abscissa plots the chloride ion concentration, and the ordinate plots the change in absorbance at 404 nm per minute (ΔA404). FIG. 2 shows the result.
[0054]
From Example 1 and Comparative Example 1, it was confirmed that the method of the present invention had linearity over a wider chloride ion concentration than the method using amylase.
[0055]
Example 2
The enzyme solution and the substrate solution prepared in Example 1 were measured by the method described in Example 1 immediately after preparation of the reagent and after storage at 4 ° C. for 7 to 14 days, except that a 100 mM sodium chloride solution was used as a sample. . The relative value (remaining activity) was calculated from 1 / ΔA340 7 days and 14 days after 1 / ΔA340 immediately after preparation of the reagent as 100, and the storage stability of the reagent of the present invention was measured. The results are shown in FIG.
[0056]
Comparative Example 2
Immediately after preparation of the reagent and after storage for 7 to 14 days at 4 ° C. using a commercially available measuring reagent A, which is a reagent for quantifying chloride ions by an enzymatic method utilizing amylase, as in Example 2, 100 mM sodium chloride Measured using the solution. With ΔA404 immediately after preparation of the reagent taken as 100, a relative value (remaining activity) was calculated from ΔA404 after 7 days and 14 days, and the storage stability of the commercially available measurement reagent A was measured. The results are shown in FIG.
[0057]
Example 3
Immediately after preparation, the enzyme solution and the substrate solution prepared in Example 1 were incubated at 37 ° C. for 30, 60, 90, 120, 150, and 180 minutes, and then a 100 mM sodium chloride solution was used as a sample. The residual activity ratio was calculated by the method described, and the storage stability of the reagent of the present invention was measured. FIG. 4 shows the results.
[0058]
Comparative Example 3
As in Example 3, a commercially available measuring reagent A, which is a reagent for quantifying chloride ions by an enzymatic method using amylase, was used immediately after preparation and after keeping at 37 ° C. for 30, 60, 90, 120, 150, and 180 minutes. The residual activity was calculated by the method described in Comparative Example 2 using a 100 mM sodium chloride solution, and the storage stability of the commercially available reagent A was measured. FIG. 4 shows the results.
[0059]
From Examples 2 and 3 and Comparative Examples 2 and 3, it was confirmed that the reagent of the present invention had higher storage stability than the commercially available reagent A using amylase.
[0060]
Example 4
An enzyme solution and a substrate solution having the following compositions were prepared.
[0061]
[Enzyme solution]
0.128M phosphate buffer (pH 7.5)
0.1% surfactant (Triton X-100)
1.281 mM NADP+
25.6 U / ml Diaphorase (unitika)
33.3 mU / ml monoamine oxidase
33.3 mU / ml aldehyde dehydrogenase
0.2 mM nitrotetrazolium blue (NBT: Dojindo Laboratories)
[Substrate solution]
25.6 mM benzylamine
The pH of the substrate solution was adjusted to pH 7.0 using phosphoric acid.
[0062]
As samples, sodium chloride solutions of 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300, 400, and 500 mM were prepared and measured. 10 μl of the sample was added to 320 μl of the enzyme solution, mixed well, and kept at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 80 μl of the substrate solution was added, the absorbance at a wavelength of 530 nm was measured at 37 ° C. for 5 minutes, and the change in absorbance per minute (ΔA530) was calculated. The abscissa plots the chlorine ion concentration, and the ordinate plots the reciprocal (1 / ΔA530) of ΔA530. FIG. 5 shows the result. As described above, according to the method using the tetrazolium salt, the amount of the enzyme was smaller than that of Example 1 (about ４), that is, the same result as Example 1 was obtained with high sensitivity.
[0063]
Example 5
Using the enzyme solution and the substrate solution prepared in Example 1, 0, 80, 120, 160, 200, and 300 mM sodium chloride solutions were measured in the same manner as in Example 1 to prepare a calibration curve. Urine samples (5 samples) were measured at any time in healthy subjects, and the chloride ion concentration in the urine samples was quantified using the calibration curve prepared above. Table 1 shows the results.
[0064]
Example 6
Using the enzyme solution and the substrate solution prepared in Example 4, 0, 80, 120, 160, 200, and 300 mM sodium chloride solutions were measured in the same manner as in Example 4 to prepare a calibration curve. The same healthy person urine sample as in Example 5 was measured, and the chloride ion concentration in the urine sample was quantified using the calibration curve prepared earlier. Table 1 shows the results.
[0065]
Comparative Example 4
An enzyme solution and a substrate solution having the following compositions were prepared as reagents for quantifying chloride ions in a subject by quantifying hydrogen peroxide generated as a result of the reaction of monoamine oxidase.
[0066]
[Enzyme solution]
0.128M phosphate buffer (pH 6.8)
1.281 mM 4-aminoantipyrine
1.281 mM N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (manufactured by Dojindo Laboratories)
23.6 U / ml peroxidase
33.3 mU / ml monoamine oxidase
[Substrate solution]
25.6 mM benzylamine
The pH of the substrate solution was adjusted to pH 7.0 using phosphoric acid.
[0067]
0, 80, 120, 160, 200, and 300 mM sodium chloride solutions were prepared and measured. 10 μl of the sample was added to 320 μl of the enzyme solution, mixed well, and kept at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 80 μl of the substrate solution was added, the absorbance at a wavelength of 555 nm was measured at 37 ° C. for 5 minutes, and the change in absorbance per minute (ΔA555) was calculated. The abscissa plots the chlorine ion concentration and the ordinate plots the reciprocal (1 / ΔA555) of ΔA555 to prepare a calibration curve. The same healthy person urine sample as in Example 5 was measured, and the chloride ion concentration in the urine sample was quantified using the calibration curve prepared earlier. Table 1 shows the results.
[0068]
Comparative Example 5
The same urine sample as in Example 5 was measured by coulometric titration using PVA-α (Sinotest) according to the instruction manual. Table 1 shows the results.
[0069]
[Table 1]
[0070]
From Examples 5 and 6, and Comparative Examples 4 and 5, it was confirmed that the method of the present invention showed a good correlation with the coulometric titration method in urine samples.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the relationship between chloride ions and the reciprocal of change in absorbance per minute (1 / ΔA340) in the method for quantifying chloride ions of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the relationship between chloride ion of commercially available measurement reagent A, which is a reagent for quantifying chloride ion by an enzymatic method using amylase, and change in absorbance per minute (ΔA404).
FIG. 3 is a graph showing the storage stability (remaining activity ratio) at 4 ° C. of the reagent for quantitatively determining chloride ion and the commercially available reagent A for measurement of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the storage stability (remaining activity ratio) at 37 ° C. of the reagent for quantitatively determining chloride ion of the present invention and a commercially available reagent A for measurement.
FIG. 5 is a graph showing the relationship between chloride ion and the reciprocal of change in absorbance per minute (1 / ΔA530) in the method for quantifying chloride ion of the present invention using a tetrazolium salt.
