JP3558364B2 - Novel polypeptide - Google Patents

Description

【００１０】

【００１１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡである。
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様のＤＮＡで形質転換させたことを特徴とする形質転換体である。
本発明の第５の態様は、本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子で形質転換させたことを特徴とする形質転換体である。
本発明の第６の態様は、ヒト細胞を培養し、その培養上清から、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする、本発明の第１の態様の新規ポリぺプチドの製造方法である。
【００１２】
本発明の第７の態様は、本発明の第４の態様の形質転換体を培養し、その培養混合物から本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造方法である。
本発明の第８の態様は、本発明の第５の態様の形質転換体を培養し、その培養混合物から本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造方法である。
本発明の第９の態様は、少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行うことを特徴とする、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの精製方法である。
本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを認識する抗体である。
【００１３】
以下に各態様について詳細に説明する。
本発明の第１の態様の新規ポリペプチドは前記配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列の少なくとも一部を有することを特徴とする。ここで「アミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは、そのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方もしくはその両方に任意の１つ以上のアミノ酸が付加しているアミノ酸配列からなるポリペプチドのことである。したがって、本発明の新規ポリペプチドには、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列で規定されるポリペプチドのみではなく、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列の任意の一部分からなるポリペプチド、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列もしくはその一部に任意の１つ以上のアミノ酸が付加した配列からなるポリペプチドが含まれる。しかしながら、本発明の新規ポリペプチドの好ましい例は、配列番号２のアミノ酸配列全体を有することを特徴とするものである。
また、他の好ましい例は、配列番号１ のアミノ酸配列全体を、そのＮ末端配列として有するポリペプチドである。
【００１４】
一般にポリペプチドは、種差や個体差、生体内の酵素や精製過程における修飾等により、そのアミノ酸配列に変異が生じることが多い。ここで言うアミノ酸配列の変異とは、そのアミノ酸配列中の任意の１つ以上のアミノ酸が欠失、もしくは他アミノ酸へ置換していること、および任意の位置に１つ以上のアミノ酸が挿入もしくは付加していることを意味する。これらのアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換は、複数箇所で同時に生じていることもある。
最近の技術によれば、これらのアミノ酸配列の変異を人為的に生じさせることも容易である。従って、本発明のポリペプチドには、それが本発明のポリペプチドの特徴を有している限り、前記配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、もしくはそれらの一部のアミノ酸配列に変異が生じたアミノ酸配列を有するものも含まれる。
【００１５】
本発明の新規ポリペプチドは、その好ましい特徴として、トリプシン阻害活性を有する。当該阻害活性は、少なくともヒトトリプシンに対するものであることが好ましい。
【００１６】
一般に、ポリペプチドを特徴づける要素の一つとして、分子量が挙げられる。ただし、分子量は、糖鎖の有無や糖鎖の種類、測定条件等によって変わるものなので、本発明のポリペプチドの分子量は特には限定されない。
しかしながら、細胞の培養上清や尿等の天然の材料から本発明のポリペプチドを得ようとする場合には、分子量は本発明のポリペプチドを特徴づける重要な情報となる。
本発明のポリペプチドの好ましい分子量は、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０ｋＤ以上３０ｋＤ以下であり、非還元下ではそれよりも小さいことが好ましい。より好ましくは、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２５±３ｋＤ、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０±３ｋＤである。
【００１７】
本発明の新規ポリペプチドには、糖鎖を有するもの、有さないものいずれもが含まれる。
配列番号２のアミノ酸配列には糖鎖認識部位（Ｎ−グリコシレーションサイト）がある（アミノ酸番号６４から６６の Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒの３残基）ので、当該ポリペプチドが動物細胞によって生産されたものであったり、遺伝子工学的に酵母や動物細胞等の真核細胞を宿主として生産させたものであったりした場合には、糖鎖が付加される可能性がある。一方、大腸菌等の原核細胞を宿主として遺伝子工学的に蛋白質を生産させた場合には、当該新規ポリペプチドは糖鎖を持たない。
【００１８】
本発明第１の態様の新規ポリペプチドは、いかなる方法で生産されたものであってもよい。例えば、ペプチド合成機（例えば、モデル４３０Ａ型 アプライドバイオシステムズ社）を使用して化学合成したものでも、ヒトおよびヒト以外のいかなる生物の組織や細胞、尿や血液等の体液から精製されたものであってもよく、また、遺伝工学的に生産されたものであってもよい。
しかしながら、当該ポリペプチドは、好ましくは、ヒト細胞を培養し、その培養上清から精製して得られたものである。特に好ましくは、ヒトのエピダモイドカルシノーマ（上皮性癌細胞）、ヒトのグリオブラストーマ（神経膠芽腫やグリア芽腫細胞）を培養し、その培養上清から得られたものである。これらの材料から当該新規ポリペプチドを得る方法や精製方法の好ましい例は、本発明第６の態様や第９の態様で説明している。
本発明のポリペプチドの他の好ましい例は、遺伝子工学的に生産されたものである。詳しくは、当該新規ポリペプチドをコードするＤＮＡもしくは、それを含む組換えＤＮＡ分子で適当な宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養し、得られた培養混合物から精製されたものである。遺伝子工学的に生産されたものは、本質的にヒト由来の夾雑蛋白質を含まないという利点がある。遺伝子工学的に本発明の新規ポリペプチドを製造する方法については本発明第７および８の態様で説明している。
【００１９】
近年の技術により、ポリペプチドをポリエチレングリコールや、スチレンマレイン酸コポリマー、デキストラン、ピランコポリマー、ポリリジン等の高分子に結合させたり、多糖類や蛋白質などの天然高分子、ホルモンなどの生理活性物質、マグネタイトなどの無機物質に結合させたりすることが可能になった（例えば、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４巻、１４８７〜１４９１頁、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８ 巻、６６１９〜６６２４頁、１９８９年）。
従って、本発明の新規ポリペプチドは、このような修飾を受けたものであってもよい。
ポリペプチドにポリエチレングリコールを結合させる例を説明する。まず、ポリペプチドを、それが活性を失わないような範囲の塩基性ｐＨを有する緩衝液に溶解する。その溶液に、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルサクシネートのような活性化ポリエチレングリコールを混合し、室温で一定時間反応させる。
【００２０】
本発明第１の態様の新規ポリペプチドは、その好ましい特徴としてトリプシン阻害活性を有しているので、トリプシンに起因する各種疾患、たとえばショックや手術時のストレス、多臓器不全、膵炎等の治療薬として使用することができる。本発明の新規ポリペプチドを含有する医薬組成物は、通常の蛋白質を成分とする医薬組成物の製造方法に準じて製造される。例えば、医薬品として使用し得る純度の本発明の新規ポリペプチドを無菌状態で調製し、必要があれば、アルブミン等の安定化剤を加えてアンプルに充填し凍結乾燥する。これを使用時に、注射用蒸留水に溶解し、注射剤として使用する。
また、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドは、抗体の作成に使用することもできる。本発明のポリプペチドを用いて得られた抗体は、血中における当該ポリペプチドの濃度の測定に使用することができる。本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを認識する抗体の作成および使用方法は、本発明第１０の態様で詳細に説明する。
【００２１】
次に、本発明第２の態様のＤＮＡについて説明する。本発明第２の態様のＤＮＡは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする。すなわち、当該新規ＤＮＡは、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列を有するものである。ここで「塩基配列を有するＤＮＡ」とは、その塩基配列からなるＤＮＡ、もしくは、その塩基配列の５’末端、３’末端のいずれが一方、もしくはその両方に任意の１つ以上の塩基が付加している塩基配列からなるＤＮＡのことである。
【００２２】
一般に、１つのアミノ酸をコードするＤＮＡに対応するトリプレットは、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類迄存在することが知られているので、前記配列番号１もしくは２のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、必ずしも１種類には限定されない。したがって、ＤＮＡが、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列を有する限り、いかなる配列からなるＤＮＡであっても、全て本発明の新規ＤＮＡに包含される。
配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の好ましい例は、配列番号３で示した塩基配列である。従って、本発明の新規ＤＮＡの好ましい例は、配列番号３の塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡである。すなわち、本発明の新規ＤＮＡの好ましい例は、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３の塩基配列の一部からなるＤＮＡ、配列番号３の塩基配列のもしくはその一部に加え、その５’末端、３’末端のいずれか一方、もしくはその両方に任意の１つ以上の塩基が付加した塩基配列からなるＤＮＡである。たとえば、配列番号３の塩基配列もしくはその任意の一部分の配列の５’末端、３’末端のいずれか一方、もしくはその両方に、開始コドン、終止コドン、リンカー配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他の蛋白質をコードする塩基配列が付加されたようなものは、すべて本発明のＤＮＡに含まれる。また、当該ＤＮＡは、配列番号３の塩基配列もしくはその任意の一部からなる塩基配列に、ＤＮＡプローブ等を作製する際にその検出感度の増加を目的として付加される配列等、任意の１つ以上の塩基が付加されていてもよい。
【００２３】
本発明の第２の態様のＤＮＡは、いかなる方法で得られたＤＮＡであってもよい。すなわち、配列番号３を参考にして、化学合成されたものであっても、適当なＤＮＡライブラリーからクローニングされたものであってもよい。
本発明のＤＮＡを化学合成するには、たとえば、次のように行えばよい。すなわち、まず、配列番号３を参考にして所望の塩基配列を有するＤＮＡを、約２０塩基からなる断片に分けてＤＮＡ化学合成機（例えば、モデル ３９４型 アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成し、その後、必要に応じて５’末端のリン酸化を行い、各断片をアニーリングし、ライゲーションして目的とするＤＮＡを得る。
【００２４】
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションを基礎としたスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法等がある。本発明のＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とする ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ミカエル Ａ Ｉ（ Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ Ｉ）等編、１９９０年、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））によっても得る事ができる。
ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、適当な細胞から公知の方法（サムブルック Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ）等、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．， コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， １９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、利用することができる。特にヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーや、Ｔ９８Ｇから作成したｃＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを得るのに適している。
【００２５】
イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明第１０の態様の抗体を使用することができる。
ハイブリダイゼーションで使用するプライマーは、配列番号１のアミノ酸配列の任意の一部をコードする塩基配列を化学合成して使用することができる。また、ＰＣＲで使用するプライマーは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列のプラス鎖とマイナス鎖の一部をそれぞれ化学合成し、センスプライマー、アンチセンスプライマーとして組み合わせて使用する。
【００２６】
ＤＮＡの塩基配列が提供されれば、それに相補的なＤＮＡの配列およびＲＮＡの配列が一義的に決定されるので、本発明の開示により、本発明の第２の態様のＤＮＡに対応するＲＮＡや、本発明の第２の態様のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡもまた提供される。
本発明の第２の態様のＤＮＡは、１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。
また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質等で標識されていてもよい。
【００２７】
本発明のＤＮＡは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを大量に生産するために使用することができる。当該ＤＮＡを使用して本発明第１の態様の新規ポリペプチドを生産させる方法の例は、本発明第７、第８の態様で説明する。当該ＤＮＡはまた、上述のように酵素等で標識して、組織における本発明第１の態様のポリペプチドの発現状況を検査するために使用することも可能である。当該ＤＮＡを使用して細胞における本発明の第１の態様の新規ポリペプチドの発現量を確認することにより、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造に適した細胞や細胞の培養条件を決定することができる。
さらには、本発明の新規ＤＮＡを生体内の細胞に導入して遺伝子治療に使用したり、本発明のＤＮＡが有する塩基配列をもとにアンチセンス医薬品を開発することもできる。
【００２８】
次に、本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子について説明する。
本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子は、上述した本発明の第２の態様の新規ＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。本発明の組み換えＤＮＡ分子は、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、本発明の組換えＤＮＡ分子はいかなる用途に使用されるものであってもよい。
例えば、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを産生させる際に用いるものであってもよいし、本発明の第２の態様のＤＮＡを増幅させ大量に得るために用いるものであってもよい。
【００２９】
本発明の第３の態様の組み換えＤＮＡ分子は、本発明の第２の態様のＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー、プロモーター、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点配列、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。これらの塩基配列の必要性は、組換えＤＮＡ分子の使用目的によって決定されるが、複製開始点およびマーカー遺伝子はいずれの場合も必要である。マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等があげられる。
【００３０】
当該組換えＤＮＡ分子は、好ましくは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを発現するように大腸菌を形質転換させうるものがよい。すなわち、当該組換えＤＮＡ分子の好適な例は、少なくとも大腸菌の複製開始点、マーカー配列に加えて大腸菌内で機能するプロモーター配列を有していることが好ましい。また、これらに加え、少なくともシグナルペプチドをコードする配列を有していることが好ましい。大腸菌で機能するプロモーター配列の好適な例は ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターであり、大腸菌で機能しうるシグナルペプチドの好適な例は、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドである。
当該組換えＤＮＡ分子の他の好ましい例は、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを発現するように動物細胞を形質転換しうるものである。すなわち、当該組換えＤＮＡ分子は、少なくとも、マーカー配列に加えて、ポリＡ付加配列を有していることが好ましい。これらに加えて、少なくともＳＶ４０のプロモーターやヒトエロンゲーションフアクター１α（ＥＦ１α） のプロモーター、大腸菌の複製開始点を有するものも動物細胞を形質転換しうる組換えＤＮＡ分子の好適な例として挙げられる。
【００３１】
本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子は、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡを任意の塩基配列を有する他のＤＮＡ断片とライゲーションしたり、任意のベクターに導入して得ることができる。ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（サムブルック Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ）等、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．， コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるものでもよい。たとえば、 ｐＵＣ１１８ 、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 、λＺａｐＩＩ 、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＹＲＰ１７ 、ｐＥＦＢＯＳ、 ｐＥＦＮ−ＩＩ等から適宜選択して使用することができる。
【００３２】
次に、本発明の第４の態様の形質転換体について説明する。
本発明の第４の態様の形質転換体は、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡで形質転換されたことを特徴とする。すなわち、本発明第４の態様の形質転換体は、宿主となる適当な細胞や微生物に、本発明第２の態様の新規ＤＮＡを直接導入する事によって形質転換されたことを特徴とする。本発明の第４の態様の新規ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポーレイション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年 ３月２０日発行、羊土社）があるがいずれの方法を用いても構わない。
【００３３】
本発明の形質転換体は、本発明の第４の態様のＤＮＡ分子を大量に製造する目的や、本発明の第１の態様の新規ポリプペチドを製造する目的等に使用できる。
【００３４】
次に、本発明の第５の態様の形質転換体について説明する。
本発明第５の態様の形質転換体は、本発明の第３の態様の組み換えＤＮＡ分子を宿主となる細胞や微生物に導入する事によって形質転換されたことを特徴とする。ただし、該組換えＤＮＡ分子の作成に使用したベクターは、宿主細胞に適した種類のものである必要がある。同様に、組換えＤＮＡ分子内に含まれるプロモター、シグナルペプチドをコードする塩基配列、マーカー遺伝子等は、宿主細胞に適したものである必要がある。
組み換えＤＮＡ分子に使用したベクターと宿主の好ましい組み合わせの例としては、ｐＵＣ１１８と大腸菌、ｐＥＦＢＯＳと ＣＯＳ細胞あるいは ＣＨＯ細胞、 Ｙａｃベクターと酵母、 ＡｃＮＰＶとＳｆ細胞等（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年 ３月２０日発行、羊土社参照）があげられる。ここで用いる組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞にあったものを使用する必要がある。
【００３５】
本発明の第３の態様の組み換えＤＮＡ分子を宿主細胞に導入する方法としては、上記第４の態様の形質転換体の作成方法と同様に、エレクトロポーレイション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いてインフェクションさせる方法、その他の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年 ３月２０日発行、羊土社）が挙げられる。
本発明の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のいずれであってもよい。原核細胞の代表的な例としては大腸菌と枯草菌があげられる。真核細胞の代表的な例としては ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、 ＣＯＳ細胞、 Ｎａｍａｌｗａ細胞等の動物細胞の他、Ｓｆ細胞等の昆虫細胞や酵母があげられる。しかしながら、本発明の形質転換体は好ましくは、大腸菌もしくは ＣＨＯ細胞もしくは酵母を形質転換させたものである。
【００３６】
本発明の形質転換体は、いかなる目的で使用されるものであってもよい。例えば、本発明第２の態様の新規ＤＮＡを大量に得る目的で使用されるものであっても、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを生産するために使用されるものであってもよい。しかしながら、好ましくは、当該形質転換体は本発明の新規ポリペプチドを産生するものがよく、より好ましくは、本発明の新規ポリペプチドを培地中に分泌するものがよい。
本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを産生する形質転換体を得るためには、宿主細胞に導入する本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子中に、少なくとも、その宿主細胞で機能しうるプロモーター配列が含まれていること、および本発明第２の態様のＤＮＡの５’末端に開始コドンが存在することが必要である。
宿主細胞が大腸菌等の原核細胞である場合には、ここで導入する組換えＤＮＡ分子には上記配列に加え、複製開始点が含まれている必要がある。また、宿主細胞が動物細胞等の真核細胞である場合には、組換えＤＮＡ分子中には、上記配列に加え、ポリＡ付加サイトが含まれていることが必要である。なお、いずれの場合にも、使用する組換えＤＮＡ分子にはマーカー配列が含まれていることが好ましい。
【００３７】
また、当該形質転換体が本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを発現し分泌するためには、形質転換に使用する組換えＤＮＡ分子中には、上記の産生に必要な配列に加えて、本発明の第２の態様のＤＮＡの５’末端に、シグナルペプチドをコードする塩基配列を有している必要がある。
【００３８】
本発明の形質転換体のより好ましい例の一つは、複製開始点、 ｔｒｐプロモーター、マーカー配列、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列および本発明第２の態様のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌である。
他の好ましい例は、ヒト ＥＦ１αのプロモーターもしくはＳＶ４０のプロモーター、マーカー配列、ポリＡ付加配列、本発明第２の態様のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子で形質転換された ＣＨＯ細胞である。また、アルコールオキシターゼ（ＡＯＸ） のプロモーターおよび本発明第２の態様のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子で、形質転換されたＰｉｃｈｉａ属の酵母も、当該形質転換体の好ましい例である。
【００３９】
次に本発明の第６の態様を説明する。
本発明の第６の態様の製造方法は、ヒト細胞を培養し、その培養上清から本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする。詳しくは、ヒト細胞を培養し、その培養上清を得、得られた培養上清を材料とし、必要に応じて濃縮、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行い、本発明第１の新規ポリペプチドを得る方法である。
【００４０】
ここで用いる細胞は、本発明のポリペプチドを産生するヒト細胞であればいかなる細胞であってもよいが、培養の容易さ等の点から株化された細胞が好ましい。株化細胞の中でも、グリオブラストーマ（神経膠芽腫細胞やグリア腫細胞）等の神経系の株化細胞やエピダモイドカルシノーマ（上皮性癌細胞）等の上皮系の株化細胞は、本発明の製造方法に使用する細胞として適している。
本発明の製造方法のより好ましい例は、神経膠芽腫細胞であるＴ９８Ｇ細胞、もしくは上皮性癌細胞であるＡ４３１細胞を培養し、その培養上清から、本発明の新規ポリペプチドを回収、精製する方法であり、特に好ましくは、Ｔ９８Ｇ細胞を用いた方法である。なお、Ｔ９８Ｇ細胞およびＡ４３１細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されている。
【００４１】
これらの細胞の培養は一般的な条件で行うことが可能であり、細胞の培養については各種の成書（たとえば「組織培養の技術」、日本培養学会編、１９８２年、朝倉書店）があるので、それらを参考にして行うことができる。
簡単に説明すると、培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）やＲＰＭＩ１６４０、 Ｆ−１２等の合成培地から適宜選択し、必要であれば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） やウシ胎児血清（ＦＢＳ） 、グルコース等を適宜加えてもよい。これらＢＳＡや ＦＢＳ等が添加された培地は、細胞の維持や継代時の培地としては適しているが、培養上清からポリペプチドを精製する場合には、ポリペプチドの単離を困難にし、精製効率を下げるという欠点がある。従って、本発明の製造方法においては、まず、これらの添加物を含む培地で細胞を維持した後、添加物を含まない培地に交換して細胞を培養し、培養上清を回収して精製を行うことが好ましい。培養温度は３７℃付近、炭酸ガス濃度は５％、細胞の植え込み濃度は４×１０^４ 〜１×１０^５ 細胞／ｍｌ 、培地交換の頻度は３日に１度ぐらいを目安として行えばよい。
【００４２】
培養上清から、本発明の新規ポリペプチドを精製するには、塩析法、等電点沈殿法等の分別沈殿、限外濾過法等の濃縮、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび逆相クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーといった公知の精製方法（たとえば、「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」、日本生化学会編、１９７６年、東京化学同人）から、本発明のポリペプチドの活性が失われないような方法を適宜選択し、組み合わせて行うことができる。しかしがら、好ましくは、少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを精製の工程で行うことがよい。好ましい精製方法の具体例は第９の態様で説明する。
【００４３】
次に、本発明の第７および第８の態様を説明する。本発明第７および第８の製造方法は、いずれも、形質転換体を培養し、その培養混合物から本発明第１の態様のポリペプチドを回収、精製することを特徴とする。ただし、本発明第７の態様で用いる形質転換体は本発明第４態様の形質転換体であり、本発明第８の態様で用いる形質転換体は本発明第５の態様の形質転換体である。
当該製造方法では、まず、本発明第４もしくは第５の態様の形質転換体を培養し、必要に応じて、遺伝子の増幅や発現誘導をおこなう。次に、培養混合物を回収し、それらを材料として、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行い、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを精製する。当該製造方法で使用する形質転換体は、いかなる細胞を形質転換したものであってもよい。しかしながら、好ましくは、 ＣＨＯ細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。
【００４４】
形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（たとえば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。また、遺伝子の増幅や発現誘導の方法および必要性は、宿主となる細胞の種類や、使用するプロモーターによって異なる。例えば、プロモーターがｔｒｐプロモーターである時には３β−インドールアクリル酸で、ＭＭＴＶプロモーターである場合にはデキサメサゾンで発現誘導することができる。
以下に、形質転換体として大腸菌および ＣＨＯを使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。
ｔｒｐプロモーターを有する発現プラスミドが導入された大腸菌の形質転換体では、Ｌ−ブロース（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ） で菌体を前培養し、それを Ｍ９−ＣＡ培地に対して１／５０量となるように植え込み、３７℃で培養を行う。培養開始数時間後に培地のＯＤ_５５０ 値が１〜３（すなわち対数増殖期）に達した時点で、３β−インドールアクリル酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、発現誘導を行う。さらに約２０時間の培養を行うことにより、目的ポリペプチドを含む培養混合物を得ることができる。
【００４５】
一方、エロンゲーションファクターのプロモーターを有する発現プラスミドが導入された ＣＨＯ細胞等の動物細胞の形質転換体では、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養する。細胞は、約５×１０^４ 細胞／ｍｌ の濃度で植え込み、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気の条件で培養を行う。通常、２〜３日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で、培地を血清不含のＤＭＥＭに交換する。さらに引き続き、２〜３日間の培養を行うことにより目的ポリペプチドを含む培養混合物を得ることができる。なお、目的ポリペプチドの産生量が少ない場合にはｄｈｆｒ遺伝子欠損 ＣＨＯ細胞を使用し、メソトレキセートにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることも可能である。
【００４６】
上述の培養混合物とは、培養上清もしくは細胞のライセートのことである。すなわち、形質転換体が、当該ポリペプチドを細胞外に分泌する場合にはその培養上清を材料として、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを回収、精製する。一方、当該新規ポリペプチドが宿主細胞内に蓄積される場合には、リゾチーム、界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破砕した後、遠心分離して上清を回収し、濾過等により不要な細胞断片等を取り除いた後に、それを材料として本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製する。
使用する形質転換体が大腸菌である場合に、産生された当該新規ポリペプチドが、ペリプラズムに蓄積される場合は、ウィルスキー（Ｗｉｌｓｋｙ）等の方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １ 巻， ５９５ 頁、１９７６年）等が使用できる。
精製方法としては、第６の態様と同様、ポリペプチドの精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。精製方法の例は第６の態様で説明したとおりであるが、好ましくは、少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを精製の工程で行うのがよい。精製方法の好ましい例については本発明第９の態様で説明する。
【００４７】
当該製造方法において、本発明第１の態様の新規ポリペプチドは他のポリペプチドとの融合蛋白として、形質転換体に生産させてもよい。たとえば、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡの下流に目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを接続し、目的のポリペプチドをベータガラクトシダーゼとの融合蛋白として発現させる方法は、高い生産量が期待できることから、一般に行われている方法である。
当該ポリペプチドを他のポリペプチドとの融合蛋白として発現させた場合には、精製工程のいずれかのステップにおいて、融合蛋白質をブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該ポリペプチドを切り出す操作が必要になる。
【００４８】
また、使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、当該ポリペプチドを不溶化蛋白であるインクルージョンボディーとして産生させた場合には、精製の際に、インクルージョンボディーを可溶化し、デネイチャーし、リフォールディングするという操作を精製の適当なステップで行えばよい（トマス Ｅ（Ｔｈｏｍａｓ Ｅ）及びクライトン Ｊ．（ Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｊ． ） ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．８７， ｐｐ５６３−５７７，１９７４年）。たとえば、まず、菌体を破砕し、遠心分離してペレットを回収する。次に、尿素もしくはグアニジン塩酸、界面活性剤、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを適量含む可溶化バッファー（たとえば、５Ｍグアニジン塩酸、 ０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０ 、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０） 、５ｍＭ ＥＤＴＡ 、２ｍＭ 還元型グルタチオン、０．０２ｍＭ 酸化型グルタチオンを含む緩衝液）をペレットに加え、２ーメルカプトエタノールを加えてデネイチャーし、上記可溶化バッファーからグアニジン塩酸を取り除いた溶液に対して透析してリフォールディングする。融合蛋白質として発現させている場合には、これらの操作の後で、ブロムシアン等の化学物質もしくはフロテアーゼ等の酵素で不要なポリペプチド部分を切断し、その後、適当なクロマトグラフィーを行う。
【００４９】
次に、本発明の第１１の態様の精製方法について説明する。
本発明の第１１の態様の精製方法は、トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行うことを特徴とする。
トリプシンアフィニティークロマトグラフィーに使用する樹脂は、ウシトリプシン、ブタトリプシン、もしくはヒトトリプシンを吸着させたものが好ましい。吸着させる樹脂は特に限定されないが、アガロースが好ましい。また、溶出はトリフルオロ酢酸溶液を使用しすることが好ましい。
得られた各画分のトリプシン阻害活性を測定することにより、本発明の新規ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、トリプシン阻害活性の確認には、参考例で示したリバースザイモグラフィーの手法が便利である。
【００５０】
本発明の精製方法は、上記トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを複数回繰り返すことを含むものであってもよい。その場合、試料中に混在する他のトリプシン吸着性の物質と分離するために、１回目のトリプシンアフィニティークロマトグラフィーでは、非吸着画分を回収し、回収した非吸着画分に対して再度トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行い、本発明の新規ポリペプチドを含む吸着画分を回収するのが好ましい。
【００５１】
本発明の精製方法は、上記トリプシンアフィニティークロマトグラフィーの前後に、他の工程を含むものであってもよい。すなわち、本発明の精製方法には、上記トリプシンアフィニティークロマトグラフィーの前後に、濃縮や各種クロマトグラフィーなどの操作の中から当該ポリペプチドを失活させない方法を選択し組み合わせて行う方法も含まれる。
【００５２】
本発明の精製方法のより好ましい例は、少なくとも、下記ａ）〜ｃ）の工程を含む精製方法である。
ａ）硫酸アンモニウムを加えて塩析し、沈殿物を回収する。
ｂ）ゲル濾過を行う。
ｃ）トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行う。
工程ａ）の塩析は、約８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを試料に加えて行うのが好ましい。硫酸アンモニウムを加えた後、約一晩静置したものを遠心分離することにより沈殿が得られる。沈殿を、ｐＨが中性付近の緩衝液に溶解し、必要があれば、適当な透析外液に対して透析する。
工程ｂ）のゲル濾過は、排除体積 ３００万ダルトンの樹脂を使用し、中性付近のｐＨで行うのが好ましい。特に、 ｐＨ７．５付近で行うのが好ましい。樹脂の種類は特に限定されないが、好ましくはセロースがよい。ゲル濾過で得られた各画分のトリプシン阻害活性を測定することにより、本発明の新規ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、トリプシン阻害活性の確認には、参考例で示したリバースザイモグラフィーの手法が便利である。
工程ｃ）のトリプシンアフィニティークロマトグラフィーについては既に説明した通りである。
【００５３】
上記好ましい例では、工程ａ）からｃ）は連続して行ってもよいし、これらの操作の間に他の操作を行ってもよい。また、工程ａ）からｃ）はそれぞれ１回に限らず複数回繰り返して行ってもよい。
【００５４】
本発明の精製方法は、それが培養上清を材料とする場合でも、尿を材料とする場合でも、細胞や組織の破砕物を材料とする場合でも適用することができる。しかしながら、細胞や組織の破砕物を材料とする場合には、遠心分離等を行ってこれらの組織や細胞の断片を取り除いたものに対して本発明の精製方法を行うことが望ましい。
【００５５】
次に、本発明の第１０の態様の抗体について説明する。
本発明の第１０の態様の新規抗体は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドに結合することを特徴とする。
本発明の第１０の態様の新規抗体は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドと結合する限り、モノクローナル抗体であっても、ポリクリーナル抗体であってもよい。
【００５６】
抗体、すなわち、免疫グロブリンの構造は、Ｈ鎖とＬ鎖とからなり、物理化学的性質や免疫学的性質は、５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ） に分けられる。このうち、ＩｇＧ 、ＩｇＡ はさらにＨ鎖のタイプによって、サブクラスに分けられる。本発明の新規抗体は、これらのいずれのクラス、サブクラスに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンは例えばペプシンで分解すると、Ｆ（ａｂ’）_２ と Ｆｃ’に別れ、パパインで分解すると ＦａｂとＦｃに分かれる。本発明の抗体は、抗原と結合するものであれば完全な抗体分子でもその一部のフラグメントでもよい。
また、本発明の抗体はキメラ抗体であってもよい。
【００５７】
本発明の抗体は、それがポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても、公知方法を参考にして得ることができる（例えば免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の第１の態様の新規ポリペプチドもしくはその断片を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ） や不完全アジュバント（ＦＩＡ） 等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の新規ポリペプチドは、それが抗体の精製用に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。また、免疫抗原として、ポリペプチド断片を使用する場合には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ） 等のキャリアを結合させることが好ましい。
当該新規ポリペプチドを用いて免疫する動物もいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる様な動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００５８】
また、モノクローナル抗体を得るには、以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。本発明の第１ないし第３の態様の新規ポリペプチドに結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の上述のような公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００５９】
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られ得る。すなわち、本発明第１ないし第３の態様の新規ポリペプチドもしくはポリペプチド断片で免疫した動物の脾細胞、リンパ球、あるいは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を、公知方法を組み合わせて精製することができる。
【００６０】
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
なお、以下に示す実施例中の諸操作は、主に下記の雑誌、成書を参考として実施した。
【００６１】
（参考文献）
１．生化学実験講座１ タンパク質の化学Ｉ 、日本生化学会編、１９７６年、東京化学同人
２．新生化学実験講座１ タンパク質ＩＩ 一次構造、日本生化学会編、１９９０年東京化学同人
３．新生化学実験講座１８ 細胞培養技術、日本生化学会編、１９９０年、東京化学同人
４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９ 年
５．組換え遺伝子の細胞への導入と発現、今本文男等編、蛋白質核酸酵素臨時増刊 ２８（１４） 、１９８３年
６．細胞工学的技術総集編、岡田善雄監修、実験医学臨時増刊７（１３）、１９８９年
【００６２】
【実施例】
〔実施例１〕Ｔ９８Ｇ細胞の培養および培養上清の調製
Ｔ９８Ｇ細胞を１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地（１：１ ）中に懸濁し、１０^５ 細胞／ｍｌ に調製した。この細胞懸濁液２００ｍｌ を８００ｍｌ のローラーボトルに植え込み、５％炭酸ガス／９５％空気下、３７℃で培養した。２ 日間培養した後、培養液を除去し、Ｃａ、Ｍｇ不含 １５０ｍＭりん酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（以下 ＰＢＳ⁻ と略す） さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地（１：１ ）を用いて細胞を洗浄した。次いで、改めて、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地（１：１）をローラーボトル当り２００ｍｌ 加え、さらに培養を２ 日間継続した。その後、培養上清をローラーボトルから回収した。
【００６３】
〔実施例２〕Ｔ９８Ｇ細胞の培養上清からの本発明の新規蛋白質の精製および分析
実施例１ で得られた各培養上清より、以下の方法にて本発明の新規蛋白質を分析した。
【００６４】
▲１▼硫安塩析
実施例１で得られた培養上清３．２Ｌに、８０％ 飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４ ℃にて一晩静置した。静置後、４ ℃、９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈殿を回収し、２５ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５ に溶解した。これを、同緩衝液に対して一晩透析し、４ ℃、１８，０００ ｒｐｍで、３０分間遠心分離して沈殿を除去したのち、以下のゲル濾過に供した。
【００６５】
▲２▼ゲル濾過
あらかじめ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１％Ｂｒｉｊ３５ で平衡化したセルロファインＧＣＬ−２０００（チッソ社製）カラム（φ２６ｍｍ×９４ｃｍ）に、上述の試料２５ｍｌをアプライし、同緩衝液にて流速２０ｍｌ／時間で展開した（図１ ）。各画分を５ｍｌ ずつ分取し、その一部を用いて後述の方法でリバースザイモグラフィーを行い、トリプシン阻害活性を示すバンドを検出した（図２ ）。フラクション６５〜７４の画分をプールし以下のトリプシン固定化カラムに供した。
【００６６】
▲３▼トリプシンアフィニティークロマトグラフィー
後述の方法で作製したトリプシンセファロース４Ｂのうち３．５ｍｌ をカラム（φ１０ｍｍ×４．５ｃｍ ）に充填し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１％Ｂｒｉｊ３５ で平衡化した。このカラムに▲２▼でプールしたサンプル５０ｍｌを流速５ｍｌ／時間でアプライした後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／１．０Ｍ ＮａＣｌ／０．０１％Ｂｒｉｊ３５ 、続いて２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．０１％Ｂｒｉｊ３５ にて洗浄した。さらに０．０５％ トリフルオロ酢酸にて流速１０ｍｌ／ 時間で溶出し、溶出画分を２ｍｌ ずつ分取した（図３ ）。分取した画分の一部を用いて後述の方法でリバースザイモグラフィーを行った。その結果、フラクション３９にトリプシン阻害活性のあるバンドが認められた（図４ ）。
【００６７】
▲４▼アミノ酸配列分析
▲３▼で得られた部分精製標品を、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）の方法（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ， ２２７巻， ６８０−６８５ 頁， １９７０年）を参考にして還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に供した後、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ） の方法（ Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ， Ｐ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６２ 巻， １００３５−１００３８， １９８７ 年） に従ってＰＶＤＦ（ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ）膜にブロッティングした。続いて、分子量約２５ｋＤ付近のバンドを切断した後、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０ＡＰＴＨアナライザー（アプライドバイオシステム社製）を使用してアミノ酸配列の分析を行った。その結果、配列番号３のアミノ酸配列が確認された。
【００６８】

【００６９】
［実施例３］Ｔ９８Ｇ培養上清からの本発明の新規蛋白質の精製
実施例１ で得られた培養上清より以下の方法にて本発明の新規蛋白質を回収、精製した。
【００７０】
▲１▼硫安塩析
実施例１ で得られた培養上清に、８０％ 飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４ ℃にて一晩静置した。静置後、４ ℃、９，０００ｒ．ｐ．ｍ． で３０分間遠心分離して沈殿を回収し、６０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５ に溶解した。これを、同緩衝液に対して一晩透析し、４ ℃、１８，０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離して沈殿を除去したのち、以下のゲル濾過に供した。
【００７１】
▲２▼ゲル濾過
あらかじめ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ ＮａＣｌ で平衡化したセルロファインＧＣＬ−２０００（既出）カラム（φ５０ｍｍ×１００ｃｍ ）に、上述のサンプル６０ｍｌをアプライし、同緩衝液にて流速８０ｍｌ／ 時間で展開した。各画分を１２ｍｌずつ分取し、その一部を用いて後述の方法でリバースザイモグラフィーを行い、トリプシン阻害活性を示すバンドを検出した。ここで活性を示したフラクションをプールし以下のトリプシン固定化カラムに供した。
【００７２】
▲３▼トリプシンアフィニティークロマトグラフィー
後述の方法で作製したトリプシンセファロース４Ｂのうち３．５ｍｌ をカラム（φ８ｍｍ ×７ｃｍ ）に充填し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ ＮａＣｌ で平衡化した。このカラムに▲２▼でプールしたサンプル８０ｍｌを流速１０ｍｌ／ 時間でアプライした後、非吸着画分をトリプシンセファロース４Ｂカラムでリクロマトグラフィーを行った。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／１．０Ｍ ＮａＣｌ 、続いて２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５ にてこのカラムを洗浄した。
さらに０．０５％ トリフルオロ酢酸にて流速１０ｍｌ／ 時間で溶出し、溶出画分を３．５ｍｌ ずつ分取した。分取した画分の一部を用いて、後述の方法でリバースザイモグラフィーを行った。その結果、０．０５％ トリフルオロ酢酸の溶出画分にトリプシン阻害活性のあるバンドが検出された。この溶出画分を減圧乾固し、本発明の新規蛋白質の精製標品を得た。
得られた精製標品を使用して、実施例８ に示す活性測定および以下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸配列の分析を行った。
【００７３】
▲４▼ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
▲３▼で得られた精製標品を、ラエムリの方法を参考にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、非還元下で約２０ｋＤ付近に、還元下で約２５ｋＤ付近に単一のバンドが認められた（図５ ）。
【００７４】
▲５▼アミノ酸配列の分析
▲３▼で得られた精製標品のアミノ酸配列を以下の方法で決定した。すなわち、精製標品を５０％ 酢酸に溶解した後、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０ＡＰＴＨアナライザー（既出）を使用して、アミノ酸配列の分析を行った。その結果、下記のアミノ酸配列が確認された。
【００７５】

【００７６】
［実施例４］Ａ４３１細胞の培養
Ａ４３１細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地（１：１）を用いて、９０ｍｍφディッシュでコンフレントになるまで培養した。細胞がコンフレントになった時点でＭｇ、Ｃａ不含ＰＢＳ さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地（１：１）を用いて細胞を洗浄した。次いで改めてＤＭＥＭ／Ｆ−１２ 培地（１：１）を１０ｍｌ加え２ 日間培養後、上清を回収した。
【００７７】
［実施例５］Ａ４３１細胞培養上清のリバースザイモグラフィー
実施例４ で得られた培養上清１０ｍｌを実施例１ ▲１▼に従って硫安塩析し、さらに後述の方法でリバースザイモグラフィーを行った。その結果、本発明の新規蛋白質のバンドと同じ２０ｋＤ付近にバンドが確認された（図６）。
【００７８】
［実施例６］トリプシン阻害活性
実施例３ で得られた精製標品を１００ μｌ の蒸留水に溶解後、実施例３ ▲４▼のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さより推定した蛋白濃度をもとに、約５６ｎＭとなるように０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液ｐＨ７．８ で希釈し、ウシトリプシン阻害活性測定用サンプルとした。このサンプルのウシトリプシン阻害活性を、合成基質Ｓ−２４４４（第一化学薬品株式会社製）を基質として、カッセル（Ｋａｓｓｅｌｌ）の方法（Ｋａｓｓｅｌｌ Ｂ 等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９ 巻，８４４−８５２ 頁，１９７０年）に準じて以下のように測定した。
まず、ウシトリプシン（Ｔｙｐｅ ＸＩＩＩ 、シグマ社製）を０．００１Ｍ塩酸に溶解し、１３６００（α−Ｎ− ベンゾイル−Ｌ− アルギニン、ＢＡＥＥ）Ｕ／ｍｌ に調製し、それを０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８ ）にて希釈し、１．２ＢＡＥＥＵ／ｍｌ のトリプシン溶液を調製した。
一方、合成基質Ｓ−２４４４を蒸留水に溶解し、２ｍＭ のＳ−２４４４溶液を調製した。次にサンプル５０μｌ もしくは、対照として５０μｌ の０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液ｐＨ７．８ を各々トリプシン溶液５０μｌ と混合した。３７℃にて１０分間静置後、あらかじめ３７℃に保温しておいた２５μｌ の２ｍＭ Ｓ−２４４４溶液を添加し、反応を開始した。反応開始後１５分間の４０５ｎｍ の吸光度を、分光光度計にて経時的に測定した。その結果、本発明の新規蛋白質は、反応時濃度約２２ｎＭで、８４％ ウシトリプシンを阻害することが確認された（図７）。
【００７９】
（参考例）
▲１▼リバースザイモグラフィー
リバースザイモグラフィーは、プロテアーゼに対する阻害活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル中で見ることのできるアッセイ法である。通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、クマシーブリリアントブルーで染色を行うと、濃く染色されるバンドに近接しているバンドや、きわめて薄く染色されるバンドは、検出が難しい。
しかし、このアッセイ法を用いることにより、微量の蛋白であっても検出が可能となる。このアッセイ法の検出感度は１ μｇ 以下であり、強いインヒビター活性を有する蛋白では数十ｎｇでも検出することができる。
【００８０】
原理を簡単に説明する。まず、予めゼラチンを含むＳＤＳ−ゲルを調製し、試料を通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様に泳動させる。ついで、トリプシンでゲル全体を処理する。このとき、トリプシン阻害活性のない蛋白は、ゼラチンとともに消化され、トリプシン阻害活性のある蛋白だけがゲル内に残される。このゲルをクマシーブリリアントブルーで染色すると、トリプシンインヒビターだけを同定することが可能となる。
リバースザイモグラフィーは以下のように行った。
まず、１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有した１４％ のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを作製した。次に被験物質を６２．５ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５／２％ＳＤＳ／７％グリセロール／０．００２５％ブロモフェノールブルー中で２５℃、１時間静置した後、ゲルにアプライし泳動した。
【００８１】
泳動終了後ゲルを２．５％トライトンＸ１００／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５ に浸し、１．５ 時間振とうした。続いて１０ｎｇ／ｍｌ のウシトリプシンを含有した５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５ 中に入れ、３７℃で一晩酵素反応を行った。反応終了後、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０ で３０分間ゲルを染色した。染色後、２５％ エタノール／８％ 酢酸中で２０分間浸し、続いて５％エタノール／７．５％ 酢酸中で本発明のトリプシンインヒビターが検出できるようになるまで脱色した。
【００８２】
▲２▼トリプシンセファロース４Ｂの作製
ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）２ｇを約２００ｍｌ の１ｍＭ 塩酸に懸濁し、膨潤させた。これをグラスフィルター上で濾過し、さらに約１００ｍｌ の１ｍＭ 塩酸での懸濁、濾過を２ 回くり返した。次に１０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ 緩衝液ｐＨ８．３ に懸濁した。この懸濁液に、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン溶液１０ｍｌを添加し、４ ℃で一晩振とうした。次に０．２Ｍグリシン溶液ｐＨ８．３ で、室温で２ 時間反応させて過剰活性基をブロッキングしたのち、０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ４．０ で、続いて０．０５％ トリフルオロ酢酸でゲルを洗浄した。
【００８３】
〔実施例７〕本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定−１
（１）Ｔ９８Ｇ細胞の培養
Ｔ９８Ｇ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６９０） を１０％ＦＢＳ含有 ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１） 中に懸濁し、 ６×１０^４ 細胞／ｍｌ に調製した。この細胞懸濁液５０ｍｌを培養面積１５０ｃｍ^２のルーフラスコに植え込み、３７℃，５％炭酸ガス／９５％空気の条件で培養した。２日間培養した後、培養液を除去し、 ＰＢＳ⁻ で洗浄し、さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地で細胞を洗浄した。次いで、改めて、５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地を加え、約２４時間の培養を行った。その後、培養液を除去し、 ＰＢＳ⁻ を用いて洗浄した。洗浄後の細胞を材料としてポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ の抽出を行った。
【００８４】
（２）Ｔ９８Ｇ細胞からのポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ の抽出
（１）で調製した細胞より、トータルＲＮＡセパレーターキットおよびｍＲＮＡセパレーターキット（ともにクローンテック社）を用いて、そのプロトコールに従いポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ の抽出を行った。以下のバッファーは、特に記載がない限り、上記キット付属のバッファーである。
まず、（１）で準備した細胞に変性用溶液を加え、細胞を回収し、激しく撹拌した。さらに２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５） 、水飽和フェノール、クロロホルムを加えて、再度、激しく撹拌した。このサンプルを遠心分離後、上清にイソプロパノールを加え、イソプロパノール沈殿を行った。さらに沈殿物を前述の変性用溶液に溶解し、再度、イソプロパノール沈殿を行い、 ８０％エタノールでリンスすることによりトータル ＲＮＡを得た。
【００８５】
次に、得られたトータルＲＮＡ をＴＥバッファーに溶解し、サンプルバッファーを加え６８℃、３分間の熱処理を行った。これを、キット付属の高塩濃度バッファーで平衡化したオリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムにアプライした。さらに高塩濃度バッファーおよび低塩濃度バッファーでカラムを洗浄した後、６５℃に暖めておいた溶出用バッファーを用いて溶出を行った。溶出液をエタノール沈殿させることによりポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ を得た。
【００８６】
（３）一本鎖ｃＤＮＡの合成
（２）で得られたポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ をテンプレートとして、スーパースクリプトプレアンプリフィケーションシステム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ： ＢＲＬ社）を用いて、そのプロトコールに従い一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
すなわち、（２）で得られた ２μｇのポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ を９７．５μｌのジエチルピロカーボネイト（ＤＥＰＣ）処理済みの蒸留水に溶解し、 ７．５μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマーを加え、７０℃、１０分間の熱処理を行った後、氷中にて急冷した。
次に、１５μｌの１０×反応バッファー、 ７．５μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） 溶液、１５μｌの ０．１ＭＤＴＴ、および ７．５μｌのスーパースクリプト逆転写酵素（２００Ｕ／ ｍｌ）を加え、 １５０μｌの反応液とした。室温で１０分間、４２℃で５０分間、９０℃で１０分間、氷中で１０分間反応させた後、 ７．５μｌの ＲＮａｓｅ Ｈを加えてさらに３７℃で２０分間反応させた。こうして得られた反応液（一本鎖ｃＤＮＡ）を、以後の実験の ＰＣＲ用テンプレートとした。
【００８７】
（４）新規ｃＤＮＡのクローニング
実施例２▲４▼で確認した本発明の新規ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）を基に、次に示す３種類のセンスプライマーをＤＮＡ合成機にて（３９４型、アプライドバイオシステムズ社）合成した。さらにポリ （Ａ）^＋ ＲＮＡ を認識する１種類のアンチセンスプライマーも同様に合成した。
【００８８】

（配列中、ＹはＴまたはＣ、ＨはＴまたはＣまたはＡ、ＲはＡまたはＧの塩基を示す）
【００８９】
次に、センスプライマー１とアンチセンスプライマー１、センスプライマー２とアンチセンスプライマー１、センスプライマー３とアンチセンスプライマー１の組合わせおよび順番で３回の ＰＣＲを行った。すなわち、１回目の ＰＣＲは（３）で調製した一本鎖ｃＤＮＡを、２回目の ＰＣＲは１回目の ＰＣＲで得られたＤＮＡの増幅産物を各々テンプレートとして用いた。３回目の ＰＣＲは２回目の ＰＣＲで得られたＤＮＡの増幅産物をテンプレートとして用いて行った。
なお ＰＣＲはテンプレート１μｌに ０．１μｇ／μｌの濃度のセンスおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ１μｌ、ｄＮＴＰ（各１．２５ｍＭ）溶液を ３．２μｌ、アンプリタック（ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ、 ５Ｕ／μｌ：宝酒造株式会社）を ０．２μｌ、キット付属の１０×反応バッファーを２μｌ、蒸留水１１．６μｌを添加して、２０μｌとした反応液を９４℃にて３０秒間、６０℃にて １２０秒間、７２℃にて６０秒間反応させることを１サイクルとし、サーマルサイクラー（ジーンアンプ ＰＣＲシステム９６００ （Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００）：パーキン−エルマー社）を用いて４０サイクルの反応を行った。
３回目の ＰＣＲ終了後の反応液を １．５％アガロースゲル電気泳動にて解析したところ、鎖長約 ７００ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅されており、そのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルより回収し、Ｍ１３ ｍｐ１８を用いてクローニングした。
【００９０】
（５）塩基配列の確認
（４）でクローニングされた約７００ｂｐ のＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を行った。すなわち、 Ｔａｑダイデオキシターミネイターサイクルシーケンシングキット（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ ＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ：アプライドバイオシステムズ社）を用いてそのプロトコールに従いシーケンシング反応を行った後、ＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ型 アプライドバイオシステムズ社）にて解析した。その結果、Ｍ１３ ｍｐ１８にクローニングされた約７００ｂｐ のＤＮＡフラグメントは配列番号１に示されたアミノ酸配列の一部、および同じ読み取り枠で新規な蛋白質をコードする塩基配列を有していることが判明した。
【００９１】
〔実施例８〕本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定−２
（１）ｃＤＮＡ のクローニング
本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を確定するため、実施例７（５）で得られた塩基配列の一部をプライマーとする ＰＣＲを行い、再度、ＤＮＡのクローニングを行った。すなわち、実施例７（５）で確認された塩基配列の終止コドンの下流の塩基配列をもとに、次に示す２種類のアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機（既出）にて合成した。また、配列番号１のアミノ酸配列を参考に次に示すセンスプライマーをＤＮＡ合成機（既出）にて合成した。
【００９２】

（配列中、ＹはＴまたはＣ、ＨはＴまたはＣまたはＡ、ＲはＡまたはＧの塩基を示す）
【００９３】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）およびＴ９８Ｇ細胞一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、実施例７（４）で行った方法に準じて、センスプライマー１とアンチセンスプライマー２、センスプライマー４とアンチセンスプライマー３の組合わせおよび順番で２回の ＰＣＲを行った。それぞれのテンプレートより増幅された約６００ｂｐ のＤＮＡフラグメントをそれぞれプラスミドｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトに組み込んだ。これらを用い、ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．著、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ， Ｉｎ： ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌ．１， グローバー， Ｄ．Ｍ．（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．） 編）， １０９−１３６頁、ＩＲＬ出版 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）， １９８５ 年）で大腸菌ＪＭ１０９ 株を形質転換させ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ） およびイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢプレートに播種した。白いコロニーを選択し、目的の形質転換体を得た。これらのコロニーよりＳＤＳ−アルカリ法にてプラスミドＤＮＡを回収した。
【００９４】
（２）塩基配列の確認
（１）で得られたＤＮＡフラグメント、すなわち、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）およびＴ９８Ｇ細胞一本鎖ｃＤＮＡそれぞれのテンプレートより増幅されたＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を実施例７（５）の方法に準じて行った。確認された塩基配列および対応するアミノ酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号４、５及び６に示した。ここでクローニングされたＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸配列番号の１１番め以降をコードする塩基配列を有していた。この配列は、上記二種類のテンプレートから増幅されたＤＮＡでともに確認された。
配列番号４及び５に示される塩基配列を有するプラスミドｐＵＣ１１８（プラスミドｐＭ１２００と称する）により大腸菌ＪＭ１０９ 株をハナハン等の方法（既出）で形質転換させ、得られた形質転換体 大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭ１２００） を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに２月２日付けで寄託した（寄託番号Ｐ−１４１０５）。
【００９５】
〔実施例９〕本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定−３
（１）ｃＤＮＡのクローニング
実施例８で確認された塩基配列のさらに上流の配列を確認する目的で、５’−ＲＡＣＥ−レディーｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ、ヒト胎盤ｃＤＮＡ：クローンテック社）を用いてそのプロトコールに従い ＰＣＲを行った。まず、配列番号４及び５に示した新規蛋白質ｃＤＮＡの塩基配列を基に、次に示す２種類のアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機（既出）を用いて合成した。
【００９６】

【００９７】
キットに添付されている５’−ＲＡＣＥ−レディーｃＤＮＡをテンプレートとして用い、実施キット付属のアンカープライマーと上述のアンチセンスプライマー４、アンチセンスプライマー５とを組合わせ、この順番で実施例７（４）の方法に準じて２回の ＰＣＲを行った。増幅された約２８０ｂｐ のＤＮＡフラグメントを、実施例８（１）の方法に準じてプラスミドｐＵＣ１１８に組み込み、大腸菌ＪＭ１０９ 株の形質転換体を得、プラスミドＤＮＡを回収した。
【００９８】
（２）塩基配列の確認
（１）で得られたＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を、実施例７（５）の方法に準じて行った。その結果、（１）で得られたクローンは配列表の配列番号７に示した塩基配列を含むことが確認された。この塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列に加え、そのＣ末端にさらに３７アミノ酸が付加されたアミノ酸配列をコードしていた（配列番号８）。ここで確認された塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列は、実施例８で得られた結果と一致していた。
配列番号７に示される塩基配列を有するプラスミドｐＵＣ１１８（プラスミドｐＭ１２０１と称す）で大腸菌ＪＭ１０９ 株を形質転換させて得られた形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭ１２０１）を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに２月２日付けで寄託した（寄託番号Ｐ−１４１０６）。
【００９９】
〔実施例１０〕
（１）ｃＤＮＡのクローニング
新規蛋白質をコードするｃＤＮＡの全長をクローニングする目的で、実施例９において確認された塩基配列を基に、新規蛋白質のＮ末端の上流に位置する２種類のセンスプライマーを合成した。一方、実施例７で確認された塩基配列を基に、終止コドンの下流に位置するアンチセンスプライマーの合成も行った。プライマーの合成はＤＮＡ合成機（既出）を用いて行い、それらの配列は次に示した。
【０１００】

【０１０１】
次に、Ｔ９８Ｇ組胞一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとしてセンスプライマー５とアンチセンスプライマー２、センスプライマー６とアンチセンスプライマー６の組合わせおよび順番で２回の ＰＣＲを行った。増幅された約６６０ｂｐ のＤＮＡフラグメントを実施例８（１）の方法に準じてプラスミドｐＵＣ１１８に組込み、大腸菌ＪＭ１０９ 株の形質転換体を得、プラスミドＤＮＡを回収した。
【０１０２】
（２）塩基配列の確認
（１）で得られたＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を実施例７（５）の方法に準じて行った。その結果、（１）で得られたクローンは配列表の配列番号３に示した塩基配列を含むことが確認された（配列番号９）。この配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードしており、（１）で得られたクロ一ンは新規ポリペプチドの全長をコードしていることが確認された。
配列番号９に示される塩基配列を有するプラスミドｐＵＣ１１８（プラスミドｐＭ１２０２と称す）で大腸菌ＪＭ１０９ 株を形質転換させて得られた形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭ１２０２）を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号Ｐ−１４２０２）。
【０１０３】
〔実施例１１〕ポリクロ一ナル抗体の作製
実施例３と同様な方法で作製した新規蛋白質２０μｇを ２００μｌの生理食塩水に溶解し、これを ＦＣＡと等量混合してエマルジョンを作製し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、４週齢、日本チャールズリバー株式会社）の皮下に、１週間の間隔で４回投与した。最終投与後、全採血、血清分離を行い抗血清を得た。
２ｍＬのプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂをカラムに充填し、３ＭのＮａＣｌを含む１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ 緩衝液ｐＨ８．９（以下、平衡化バッファーと略す）で平衡化した。
得られた抗血清を平衡化バッファーで２倍に希釈し、カラムにアプライし、平衡化バッファーで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸−ＮａＯＨ 緩衝液 ｐＨ４．０で溶出し、ポリクローナル抗体を得た。
【０１０４】
〔実施例１２〕
（１）抗原不溶化プレートの作製
実施例３で得た新規蛋白質を０．０７６Ｍりん酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．４（以下、 ＰＢＳと略）で希釈し１μｇ／ｍｌ に調整する。希釈した新規蛋白質溶液 １００μｌを９６ウェルマイクロプレートに分注し、４℃で一晩静置した。 ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水（以下、洗浄液と略）で各ウェルを５回洗浄後、 ０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ１５０μｌを分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗原不溶化プレートを作製した。
【０１０５】
（２）モノクローナル抗体の作製
実施例３と同様な方法で精製した新規蛋白質２０μｇを ２００μｌの生理食塩水に溶解し、これを ＦＣＡと等量混合してエマルジョンを作製し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、４週齢、日本チャールズリバー株式会社）の皮下に１週間の間隔で３回投与した。さらに１週間後に ２０μｇの抗原溶液のみを静脈内投与し、最終免疫を行った。
最終免疫の４日後に同マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。これを細断した後、ステンレス・メッシュを通し、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、脾細胞浮遊液を得た。この脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）を１０：１の割合で混合して遠心分離 （１，４００ｒｐｍで８分間）した。得られた沈殿に ０．５ｍｌの ４２．５％のポリエチレングリコール１５４０と１５％のジメチルスルフォキサイドを含むＲＰＭＩ１６４０をすばやく加え、さらに１分間激しく細胞を振とうした後、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０をゆっくり加えた後、遠心分離 （８００ｒｐｍで５分間）を行った。
この沈殿を ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン１×１０^−４Ｍ 、アミノプテリン４×１０^−７Ｍ 、チミジン １．６×１０^−５Ｍ 、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に２×１０^５ 細胞／ｍｌ になるように懸濁し、９６穴マイクロプレートのウェル当り ０．２ｍｌを分注した。２〜３日毎に半量の培地を交換し、その後ＨＴ培地（ヒポキサンチン１×１０^−４Ｍ 、チミジン １．６×１０^−５Ｍ 、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に交換した。
【０１０６】
ハイブリドーマ細胞の生育が認められたところで、 ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行った。すなわち、実施例１０（１）で作製した新規蛋白質を不溶化させた９６ウェルプレートを洗浄液で２回洗浄後、１０％ウサギ血清および ０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍に希釈した培養上清 １００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。反応終了後、洗浄液で５回洗浄し、第２抗体として１０％ウサギ血清および ０．１％ＢＳＡを含む ＰＢＳで ２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇｓ抗体（ダコ パッツ デンマーク（ＤＡＫＯ ＰＡＴＳ Ｄｅｍｍａｒｋ）社）１００ μｌを添加し、室温で２時間反応させた。
反応終了後、洗浄液で５回洗浄後、３ｍｇ／ｍｌ オルトフェニレンジアミンおよび０．０２７％過酸化水素を含む０．１Ｍマッキルベイン緩衝液 ｐＨ５．０を １００μｌ添加し、室温で１０分間酵素反応を行い、 １００μｌの２Ｎ硫酸で反応を停止し、 ４９０ｎｍの吸光度を測定した。
ＥＬＩＳＡ法で陽性であったウェルのハイブリドーマを、９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり２個、１個、あるいは０．５個となるよう１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈した。ウィスターラットの胸腺細胞をフィーダー細胞として加えて、プレートの各ウェルに植え込み、クローニングを行った。顕微鏡下で観察して、確実にシングルセルコロニーであるウェルを選択し、それらの培養上清を前述の ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ５株を得た。
【０１０７】
次に、大量にモノクローナル抗体を産生させるために、抗体を産生しているハイブリドーマ細胞約１０^７ 細胞を、各々プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。９日目に採取した腹水液を １０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清をとり、モノクローナル抗体 １Ｂ６、３Ｄ４ 、３Ｇ１ 、４Ａ７ および ４Ｃ３を得た。
得られたモノクローナル抗体のクラスを、クラス特異的抗マウス血清を使用してオクタロニーゲル拡散試験で決定した。その結果、モノクローナル抗体 １Ｂ６のクラスは ＩｇＭで、その他の４抗体は ＩｇＧであった。
【０１０８】
（３）ウエスタンブロッティング
実施例１２（２） で得たモノクローナル抗体 ３Ｄ４を用いてウエスタンブロッティングを行った。実施例３で精製した新規蛋白質をラムエリの方法を参考にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲルをニトロセルロースメンブレンにのせ、転写用バッファー（２５ｍＭ トリス塩酸／１９２ｍＭグリシン，ｐＨ８．３）中、１５０ｍＡ の定電流で１． ５時間トランスファーを行った。各細胞の蛋白質をトランスファーしたメンブレンを、１．５％のブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ．） 社）を含む ＰＢＳに浸し、３時間ブロッキングを行った。
上述のようにして得たモノクローナル抗体を１％の ＢＳＡを含む ＰＢＳで ５，０００倍希釈し、その中にブロッキングを行ったメンブレンを入れ１時間室温にて反応させた。その後、蒸留水で１度軽くリンスし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む ＰＢＳで１０分間軽く振とうしながら洗浄した。この洗浄操作を５回繰り返した後、１％の ＢＳＡを含む ＰＢＳで ５，０００倍希釈した ＥＩＡ級アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＥＩＡ Ｇｒａｄｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ ＋Ｌ）Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ 、バイオラッド（ＢＩＯ ＲＡＤ ）社、ＵＳＡ）中にメンブレンを１時間軽く振とうさせて反応させた。
その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む ＰＢＳで１０分間軽く振とうしながら５回洗浄し、同様に ＰＢＳで最後に１回洗浄した。続いて、 ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社、ＵＫ） の発光試薬液を使用直前に調製し、上述のように処理したメンブレンを浸し、室温で１分間反応させた。発光試薬液中からメンブレンを取り出し、ハイパーフィルム−ＥＣＬ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社、ＵＫ） を感光させ、現像した。
その結果、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０ＫＤ付近に単一のバンドが認められた。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明により新規なポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドはトリプシン阻害活性を有するため、膵炎や、ショック、多臓器不全、播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、ＤＩＣ）等トリプシンが関与する疾患の治療剤の開発に利用できる。
【０１１０】
【配列表】

【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ゲル濾過の溶出プロファイルを示すグラフである。
【図２】図２は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ｔ９８Ｇ細胞の培養上清のゲル濾過後のリバースザイモグラフィーの結果を示す写真である。
【図３】図３は、トリプシンアフィニティークロマトグラフィーの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図４】図４は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ｔ９８Ｇ細胞の培養上清のトリプシンアフィニティークロマトグラフィー後のリバースザイモグラフィーの結果を示す写真である。
【図５】図５は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ｔ９８Ｇ細胞より精製した本発明の新規蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図６】図６は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ａ４３１細胞の培養上清のリバースザイモグラフィーの結果を示す写真である。
【図７】図７は、本発明の新規蛋白質のトリプシン阻害活性を示すグラフである。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a novel polypeptide, a novel DNA encoding the polypeptide, a recombinant DNA molecule having the DNA, and a transformant transformed with the DNA or the recombinant DNA molecule. The present invention also relates to a method for producing the novel polypeptide and a novel antibody recognizing the polypeptide.
[0002]
[Prior art]
Trypsin is a typical protease existing in a living body. Trypsin normally plays an important role in vivo as a digestive enzyme and as a substance that cleaves and activates a precursor protein. However, trypsin, on the other hand, is also known to trigger various inflammatory diseases.
Typical diseases in which trypsin is involved include pancreatitis and shock. In the case of pancreatitis, trypsin, which normally exists as an inactive proenzyme in the pancreas, is activated due to infection, inflammation of the biliary tract, and the like, and autolysis of the pancreas occurs. Once trypsin becomes active, it activates various other proenzymes such as chymotrypsin and elastase, causing circulatory failure and tissue damage. Even in shock, trypsin activated for various reasons promotes activation of various proenzymes involved in blood coagulation and release of chemical mediators, and blood coagulates in blood vessels, causing ischemia in each organ Dysfunction occurs, causing damage to the kidneys, lungs, liver, etc. These influence each other to form a vicious circle, and at the end stage, cause severe systemic symptoms such as multiple organ failure.
[0003]
In these symptoms, the inhibition of trypsin activation is important, and currently, various trypsin inhibitors are used in the treatment of diseases such as pancreatitis, which is thought to involve trypsin, shock, and multiple organ failure. Controls treatment outcome.
Currently used trypsin inhibitors are roughly divided into two. That is, one is a non-proteinaceous compound such as gabexate mesylate or nafamostat mesylate, and the other is a proteinaceous trypsin inhibitor such as aprotinin or ulinastatin. The former is characterized by a broad enzyme inhibition spectrum, and the latter is characterized by having an effect of restoring the homeostasis of the living body, such as stabilization of cell membranes, in addition to its action as a trypsin inhibitor. It is used properly in clinical settings.
Proteinic trypsin inhibitors are widely distributed in the animal and plant kingdoms, but when used as pharmaceuticals, human-derived substances are ideal in terms of reducing antigenicity. As protein-derived trypsin inhibitors of human origin, α1 antitrypsin, pancreatic secretory trypsin inhibitor, nexin and the like have been known and isolated, including the above-mentioned urinastatin.
[0004]
These in vivo trypsin inhibitors, in addition to trypsin, also inhibit elastase, kinin, and kallikrein, and it is thought that each plays a characteristic role in vivo according to its inhibition spectrum and physiological activity. Can be In addition, it is thought that trypsin inhibitors that have not yet been isolated are present in the living body, and isolating them and elucidating their physiological activities requires the identification of more effective drugs for diseases involving trypsin. It is important for development. For more effective treatment, it is important to appropriately select and combine these in vivo trypsin inhibitors according to the disease or condition.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
At present, protein-based trypsin inhibitors used as pharmaceuticals are mainly purified from tissues and urine, but the supply is not constant or the purified product is kept homogeneous by various proteins mixed in tissues and urine. It is difficult to secure the safety of those engaged in purification due to the virus present in the tissue.
[0006]
An object of the present invention is to solve the above problems, to provide a novel polypeptide having a trypsin inhibitory activity, and a part thereof, and to enable the development of a new therapeutic agent.
It is another object of the present invention to provide a DNA encoding the above novel protein, to produce the novel polypeptide by genetic engineering, and to produce a DNA probe for diagnosis. .
Another object of the present invention is to provide a method for producing the novel polypeptide of the present invention.
Another object of the present invention is to provide an antibody that recognizes the novel polypeptide, and to enable the use of the antibody to detect the novel polypeptide of the present invention.
[0007]
[Means to solve the problem]
The present inventors have intensively studied to obtain a novel trypsin inhibitor that has not been isolated before. That is, research was conducted to identify the main components of the trypsin inhibitory activity found in the supernatants of various cultured cells, and the novel polypeptide was successfully isolated and identified. Furthermore, the present inventors searched a cDNA library using primers prepared based on the amino acid sequence of the isolated novel polypeptide to obtain a DNA encoding the novel polypeptide, The DNA was successfully cloned. The present inventors have also succeeded in obtaining an antibody that recognizes the obtained novel polypeptide.
The present invention has been completed based on the above findings. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0008]
A first aspect of the present invention is a novel polypeptide having at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 below.
[0009]

[0010]

[0011]
A second aspect of the present invention is a DNA having a base sequence encoding the novel polypeptide of the first aspect of the present invention.
A third aspect of the present invention is a recombinant DNA molecule comprising the DNA of the second aspect of the present invention.
A fourth aspect of the present invention is a transformant characterized by being transformed with the DNA of the second aspect of the present invention.
A fifth aspect of the present invention is a transformant characterized by being transformed with the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention.
A sixth aspect of the present invention is directed to a novel aspect of the first aspect of the present invention, which comprises culturing human cells and purifying the novel polypeptide of the first aspect of the present invention from the culture supernatant. This is a method for producing a polypeptide.
[0012]
The seventh aspect of the present invention is characterized in that the transformant of the fourth aspect of the present invention is cultured, and the novel polypeptide of the first aspect of the present invention is purified from a culture mixture thereof. 1 is a method for producing a novel polypeptide according to one embodiment.
An eighth aspect of the present invention is characterized in that the transformant of the fifth aspect of the present invention is cultured, and the novel polypeptide of the first aspect of the present invention is purified from a culture mixture thereof. 1 is a method for producing a novel polypeptide according to one embodiment.
A ninth aspect of the present invention is the method for purifying a novel polypeptide according to the first aspect of the present invention, which comprises performing at least trypsin affinity chromatography.
A tenth aspect of the present invention is an antibody that recognizes the novel polypeptide of the first aspect of the present invention.
[0013]
Hereinafter, each embodiment will be described in detail.
The novel polypeptide of the first aspect of the present invention is characterized by having at least a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. As used herein, the term "polypeptide having an amino acid sequence" refers to a polypeptide comprising the amino acid sequence or one or more amino acids added to one or both of the N-terminal and the C-terminal of the amino acid sequence. Is a polypeptide consisting of an amino acid sequence. Accordingly, the novel polypeptide of the present invention includes not only the polypeptide defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, but also a polypeptide consisting of any part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, And a polypeptide comprising a sequence obtained by adding any one or more amino acids to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a part thereof. However, a preferred example of the novel polypeptide of the present invention is characterized by having the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Another preferred example is a polypeptide having the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as its N-terminal sequence.
[0014]
In general, the amino acid sequence of a polypeptide often changes due to species differences, individual differences, enzymes in the living body, modifications in the purification process, and the like. As used herein, the term "mutation of an amino acid sequence" means that one or more amino acids in the amino acid sequence are deleted or substituted with another amino acid, and one or more amino acids are inserted or added at an arbitrary position. Means you are. These amino acid deletions, insertions, additions, and substitutions may occur simultaneously at a plurality of positions.
According to the recent technology, it is easy to artificially generate these amino acid sequence mutations. Therefore, the polypeptide of the present invention includes an amino acid having a mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or a partial amino acid sequence thereof, as long as it has the characteristics of the polypeptide of the present invention. Those having a sequence are also included.
[0015]
The novel polypeptide of the present invention has, as a preferable feature, trypsin inhibitory activity. Preferably, the inhibitory activity is at least on human trypsin.
[0016]
In general, one of the elements that characterize a polypeptide is its molecular weight. However, the molecular weight varies depending on the presence or absence of sugar chains, the type of sugar chains, measurement conditions, and the like, and thus the molecular weight of the polypeptide of the present invention is not particularly limited.
However, when trying to obtain the polypeptide of the present invention from a natural material such as a cell culture supernatant or urine, the molecular weight is important information characterizing the polypeptide of the present invention.
The preferred molecular weight of the polypeptide of the present invention is 20 kD or more and 30 kD or less by SDS-PAGE under reduction, and preferably smaller than that under non-reduction. More preferably, it is 25 ± 3 kD for SDS-PAGE under reduction and 20 ± 3 kD for SDS-PAGE under non-reduction.
[0017]
The novel polypeptide of the present invention includes both those having a sugar chain and those having no sugar chain.
Since the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has a sugar chain recognition site (N-glycosylation site) (3 residues of Asn Leu Ser of amino acids 64 to 66), the polypeptide produced by animal cells In addition, when the eukaryotic cells such as yeasts and animal cells are produced by genetic engineering as a host, a sugar chain may be added. On the other hand, when a protein is produced by genetic engineering using a prokaryotic cell such as Escherichia coli as a host, the novel polypeptide does not have a sugar chain.
[0018]
The novel polypeptide of the first aspect of the present invention may be produced by any method. For example, those synthesized chemically using a peptide synthesizer (for example, Model 430A, Applied Biosystems), or those purified from tissues or cells of any human or non-human organism, and body fluids such as urine and blood. And it may be produced by genetic engineering.
However, the polypeptide is preferably obtained by culturing human cells and purifying from the culture supernatant. Particularly preferably, it is obtained by culturing human epidamoid carcinoma (epithelial cancer cells) or human glioblastoma (glioblastoma or glioblastoma cells) and obtaining the culture supernatant. Preferred examples of the method for obtaining the novel polypeptide and the purification method from these materials are described in the sixth and ninth aspects of the present invention.
Another preferred example of the polypeptide of the present invention is produced by genetic engineering. Specifically, the DNA encoding the novel polypeptide or a recombinant DNA molecule containing the same is transformed into a suitable host cell, the transformant is cultured, and the transformant is purified from the resulting culture mixture. . Those produced by genetic engineering have the advantage that they are essentially free of human-derived contaminating proteins. The method for producing the novel polypeptide of the present invention by genetic engineering is described in the seventh and eighth embodiments of the present invention.
[0019]
With recent technology, polypeptides can be bonded to polymers such as polyethylene glycol, styrene maleic acid copolymer, dextran, pyran copolymer, polylysine, etc., natural polymers such as polysaccharides and proteins, physiologically active substances such as hormones, magnetite (For example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 1487-1491, 1987, Biochemistry 28, 6619-6624, 1989). ).
Therefore, the novel polypeptide of the present invention may have been subjected to such modifications.
An example in which polyethylene glycol is bound to a polypeptide will be described. First, the polypeptide is dissolved in a buffer having a basic pH in a range such that it does not lose activity. Activated polyethylene glycol such as methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate is mixed with the solution and reacted at room temperature for a certain period of time.
[0020]
Since the novel polypeptide of the first aspect of the present invention has a trypsin inhibitory activity as a preferable feature thereof, it can be used as a therapeutic agent for various diseases caused by trypsin, for example, shock, stress during surgery, multiple organ failure, pancreatitis and the like. Can be used as The pharmaceutical composition containing the novel polypeptide of the present invention is produced according to a method for producing a pharmaceutical composition containing a usual protein as a component. For example, a novel polypeptide of the present invention having a purity that can be used as a pharmaceutical is prepared under aseptic conditions, and if necessary, a stabilizing agent such as albumin is added, filled into an ampoule, and freeze-dried. At the time of use, this is dissolved in distilled water for injection and used as an injection.
The novel polypeptide of the first aspect of the present invention can also be used for producing antibodies. The antibody obtained using the polypeptide of the present invention can be used for measuring the concentration of the polypeptide in blood. Methods for making and using antibodies that recognize the novel polypeptide of the first aspect of the invention are described in detail in the tenth aspect of the invention.
[0021]
Next, the DNA of the second embodiment of the present invention will be described. The DNA according to the second aspect of the present invention has a nucleotide sequence encoding the novel polypeptide according to the first aspect of the present invention. That is, the novel DNA has a base sequence encoding at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. As used herein, the term "DNA having a base sequence" refers to a DNA comprising the base sequence or one or more of the 5 'end and the 3' end of the base sequence to which one or more bases are added. It is a DNA consisting of a base sequence.
[0022]
In general, it is known that there are 1 to 6 types of triplets corresponding to DNAs encoding one amino acid for each type of amino acid. Therefore, the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is However, it is not necessarily limited to one type. Therefore, as long as the DNA has a nucleotide sequence encoding at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, any DNA having any sequence is included in the novel DNA of the present invention.
A preferred example of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. Therefore, a preferred example of the novel DNA of the present invention is a DNA having at least a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. That is, preferred examples of the novel DNA of the present invention include a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, a DNA comprising a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a part thereof, It is a DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are added to one or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end. For example, at one or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or any part thereof, a start codon, a stop codon, a linker sequence, a base sequence encoding a signal peptide, Any DNAs to which a nucleotide sequence encoding another protein is added are all included in the DNA of the present invention. In addition, the DNA may be an arbitrary one such as a sequence added to the base sequence of SEQ ID NO: 3 or a base sequence consisting of any part thereof for the purpose of increasing the detection sensitivity when a DNA probe or the like is prepared. The above bases may be added.
[0023]
The DNA according to the second aspect of the present invention may be a DNA obtained by any method. That is, it may be chemically synthesized with reference to SEQ ID NO: 3 or cloned from an appropriate DNA library.
The chemical synthesis of the DNA of the present invention may be performed, for example, as follows. That is, first, a DNA having a desired base sequence is divided into fragments of about 20 bases with reference to SEQ ID NO: 3, and synthesized using a DNA chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems). Then, if necessary, phosphorylation of the 5 'end is performed, and each fragment is annealed and ligated to obtain a desired DNA.
[0024]
Examples of obtaining the DNA of the present invention from a DNA library include screening an appropriate genomic DNA library or cDNA library by a screening method based on hybridization or an immunoscreening method using an antibody to obtain the DNA of interest. , And a method of cutting out the clone using a restriction enzyme or the like. The DNA of the present invention can also be obtained by PCR using a genomic DNA library or a cDNA library as a template (PCR: Polymerase Chain Reaction, PCR Protocols, a guide to methods and applications, Michael AI, 19th edition, Acad. Publishing (Academic Press)).
Any DNA library can be used as long as it has the DNA of the present invention. A commercially available DNA library can be used, or a suitable method can be used from a suitable cell (Sambrook J). A cDNA library can be prepared and used in accordance with Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, et al., Et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989. In particular, a human placenta cDNA library and a cDNA library prepared from T98G are suitable for obtaining the DNA of the present invention.
[0025]
As the antibody used in the immunoscreening method, the antibody according to the tenth aspect of the present invention described later can be used.
Primers used for hybridization can be used by chemically synthesizing a base sequence encoding any part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The primer used in the PCR is obtained by chemically synthesizing a part of a plus strand and a part of a minus strand of the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and combining them as a sense primer and an antisense primer.
[0026]
When the DNA base sequence is provided, the complementary DNA sequence and RNA sequence are uniquely determined. Therefore, according to the disclosure of the present invention, RNA or DNA corresponding to the DNA of the second aspect of the present invention can be obtained. A DNA having a sequence complementary to the DNA of the second aspect of the present invention is also provided.
The DNA according to the second aspect of the present invention may be single-stranded or may form a double-stranded or triple-stranded form by binding to DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
In addition, the DNA may be labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRPO), a radioisotope, a fluorescent substance, or the like.
[0027]
The DNA of the present invention can be used for mass-producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. Examples of the method for producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention using the DNA will be described in the seventh and eighth aspects of the present invention. The DNA can also be labeled with an enzyme or the like as described above and used to examine the expression status of the polypeptide of the first aspect of the present invention in a tissue. By confirming the expression level of the novel polypeptide of the first aspect of the present invention in the cells using the DNA, cells and culture conditions of the cells suitable for producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention can be determined. Can be determined.
Furthermore, the novel DNA of the present invention can be introduced into cells in a living body and used for gene therapy, or an antisense drug can be developed based on the nucleotide sequence of the DNA of the present invention.
[0028]
Next, the recombinant DNA molecule according to the third aspect of the present invention will be described.
The recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention is a recombinant DNA molecule comprising the novel DNA of the second aspect of the present invention described above. The recombinant DNA molecule of the present invention may be in any form such as circular or linear. In addition, the recombinant DNA molecule of the present invention may be used for any purpose.
For example, it may be used for producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention, or may be used for amplifying and obtaining a large amount of the DNA of the second aspect of the present invention. Good.
[0029]
The recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention may have another base sequence, if necessary, in addition to the DNA of the second aspect of the present invention. Other base sequences include enhancer, promoter, ribosome binding sequence, base sequence used for the purpose of copy number amplification, base sequence encoding a signal peptide, base sequence encoding another polypeptide, additional sequence of poly A , A splicing sequence, a replication origin sequence, a base sequence of a gene to be a selection marker, and the like. The necessity of these nucleotide sequences is determined depending on the purpose of use of the recombinant DNA molecule, but the origin of replication and the marker gene are required in each case. Examples of the marker gene include an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a neomycin resistance gene, a thymidine kinase gene and the like.
[0030]
Preferably, the recombinant DNA molecule is capable of transforming Escherichia coli so as to express the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. That is, a preferable example of the recombinant DNA molecule preferably has at least a promoter sequence that functions in Escherichia coli in addition to a replication origin and a marker sequence of Escherichia coli. In addition, it is preferable to have at least a sequence encoding a signal peptide. Preferred examples of promoter sequences that function in Escherichia coli are trp promoter and lac promoter, and preferred examples of signal peptides that can function in Escherichia coli are signal peptides of Escherichia coli alkaline phosphatase.
Another preferred example of the recombinant DNA molecule is one that can transform an animal cell to express the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. That is, the recombinant DNA molecule preferably has at least a polyA-added sequence in addition to the marker sequence. In addition, those having at least the promoter of SV40, the promoter of human elongation factor 1α (EF1α), and the replication origin of Escherichia coli are also preferable examples of the recombinant DNA molecule capable of transforming animal cells.
[0031]
The recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention can be obtained by ligating the novel DNA of the second aspect of the present invention with another DNA fragment having an arbitrary nucleotide sequence, or by introducing it into an arbitrary vector. it can. Methods for introducing DNA into vectors are known (Sambrook J, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York, New York, 89, New York, New York, 1992. ). That is, the DNA and the vector may be digested with appropriate restriction enzymes, and the obtained fragments may be ligated using DNA ligase. The vector may be any vector such as a plasmid vector, a phage vector, and a virus vector. For example, pUC118, pBR322, pSV2-dhfr, λZapII, λgt10, pAc700, YRP17, pEFBOS, pEFN-II and the like can be appropriately selected and used.
[0032]
Next, the transformant according to the fourth aspect of the present invention will be described.
The transformant according to the fourth aspect of the present invention is characterized by being transformed with the novel DNA of the second aspect of the present invention. That is, the transformant of the fourth aspect of the present invention is characterized by being transformed by directly introducing the novel DNA of the second aspect of the present invention into an appropriate host cell or microorganism. Examples of the method for introducing the novel DNA of the fourth aspect of the present invention into host cells include electroporation, protoplast, alkali metal, calcium phosphate, DEAE dextran, microinjection, and methods using virus particles. There are known methods (experimental medicine extra edition, Genetic Engineering Handbook, published on March 20, 1991, Yodosha), but any method may be used.
[0033]
The transformant of the present invention can be used for the purpose of producing a large amount of the DNA molecule of the fourth aspect of the present invention, or for the purpose of producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention.
[0034]
Next, the transformant according to the fifth aspect of the present invention will be described.
The transformant according to the fifth aspect of the present invention is characterized by being transformed by introducing the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention into a host cell or microorganism. However, the vector used to create the recombinant DNA molecule must be of a type suitable for the host cell. Similarly, a promoter, a base sequence encoding a signal peptide, a marker gene, and the like contained in the recombinant DNA molecule must be suitable for the host cell.
Examples of preferable combinations of the vector and the host used for the recombinant DNA molecule include pUC118 and Escherichia coli, pEFBOS and COS cells or CHO cells, Yac vector and yeast, AcNPV and Sf cells (Experimental Medicine Special Edition, Gene Engineering Handbook, 1991) Issued on March 20, refer to Yodosha). It is necessary to use a recombinant DNA molecule suitable for the host cell.
[0035]
As a method for introducing the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention into a host cell, the electroporation method, protoplast method, alkali metal method, calcium phosphate method and the like can be used in the same manner as in the method of preparing the transformant of the fourth aspect. Method, a DEAE dextran method, a microinjection method, a method of infecting using a virus particle, and other known methods (Experimental Medicine extra edition, Genetic Engineering Handbook, published on March 20, 1991, Yodosha).
The transformant of the present invention may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. Representative examples of prokaryotic cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. Representative examples of eukaryotic cells include animal cells such as CHO cells, HeLa cells, COS cells, and Namalwa cells, as well as insect cells such as Sf cells and yeast. However, the transformants of the present invention are preferably those obtained by transforming Escherichia coli, CHO cells or yeast.
[0036]
The transformant of the present invention may be used for any purpose. For example, it may be used for the purpose of obtaining a large amount of the novel DNA of the second aspect of the present invention, or may be used for producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. . However, preferably, the transformant produces the novel polypeptide of the present invention, and more preferably, the transformant secretes the novel polypeptide of the present invention into the medium.
In order to obtain a transformant producing the novel polypeptide of the first aspect of the present invention, at least the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention to be introduced into a host cell has at least a function in the host cell. And the presence of an initiation codon at the 5 'end of the DNA of the second aspect of the present invention.
When the host cell is a prokaryotic cell such as Escherichia coli, the recombinant DNA molecule introduced here must contain an origin of replication in addition to the above sequence. When the host cell is a eukaryotic cell such as an animal cell, it is necessary that the recombinant DNA molecule contains a polyA addition site in addition to the above sequence. In any case, it is preferable that the recombinant DNA molecule used contains a marker sequence.
[0037]
In order for the transformant to express and secrete the novel polypeptide of the first aspect of the present invention, the recombinant DNA molecule used for the transformation contains, in addition to the sequences necessary for the above-mentioned production, It is necessary that the DNA of the second embodiment of the present invention has a nucleotide sequence encoding a signal peptide at the 5 ′ end.
[0038]
One of the more preferable examples of the transformant of the present invention is a recombinant DNA having a replication origin, a trp promoter, a marker sequence, a base sequence encoding a signal peptide of Escherichia coli alkaline phosphatase, and the DNA of the second embodiment of the present invention. E. coli transformed with the molecule.
Another preferred example is a CHO cell transformed with a recombinant DNA molecule having a human EF1α promoter or SV40 promoter, a marker sequence, a polyA addition sequence, and the DNA of the second aspect of the present invention. Pichia yeast transformed with a recombinant DNA molecule having an alcohol oxidase (AOX) promoter and the DNA of the second aspect of the present invention is also a preferred example of the transformant.
[0039]
Next, a sixth embodiment of the present invention will be described.
The production method of the sixth aspect of the present invention is characterized in that human cells are cultured, and the novel polypeptide of the first aspect of the present invention is purified from the culture supernatant. More specifically, human cells are cultured, the culture supernatant is obtained, and the obtained culture supernatant is used as a material, and if necessary, operations such as concentration, dialysis, and various types of chromatography are performed. This is a method for obtaining a peptide.
[0040]
The cell used here may be any cell as long as it is a human cell that produces the polypeptide of the present invention, but a cell established from the viewpoint of easiness of culture and the like is preferable. Among the cell lines, cell lines of the nervous system such as glioblastoma (glioblastoma cells and glioma cells) and cell lines of the epithelial system such as epidamoid carcinoma (epithelial cancer cells) are: It is suitable as a cell used in the production method of the present invention.
A more preferred example of the production method of the present invention is to culture a T98G cell as a glioblastoma cell or an A431 cell as an epithelial cancer cell, and recover and purify the novel polypeptide of the present invention from the culture supernatant. And particularly preferably a method using T98G cells. In addition, T98G cells and A431 cells are registered with the ATCC (American Type Culture Collection).
[0041]
Culture of these cells can be carried out under general conditions, and there are various books on cell culture (eg, “Tissue Culture Technology”, edited by The Japan Culture Society, 1982, Asakura Shoten). Can be performed with reference to them.
Briefly, the medium is appropriately selected from synthetic media such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and RPMI1640 and F-12, and if necessary, bovine serum albumin (BSA) or fetal bovine serum (FBS). ), Glucose and the like may be added as appropriate. A medium to which these BSA, FBS, etc. are added is suitable as a medium for cell maintenance or passage, but when purifying a polypeptide from a culture supernatant, isolation of the polypeptide becomes difficult. There is a disadvantage that purification efficiency is reduced. Therefore, in the production method of the present invention, first, after maintaining the cells in a medium containing these additives, the cells are cultured by replacing the cells with a medium containing no additives, and the culture supernatant is collected to purify the cells. It is preferred to do so. The culture temperature was around 37 ° C., the carbon dioxide concentration was 5%, and the cell implantation concentration was 4 × 10 ⁴ ~ 1 × 10 ⁵ The frequency of cells / ml and medium exchange may be about once every three days.
[0042]
To purify the novel polypeptide of the present invention from the culture supernatant, fractionation precipitation such as salting out method, isoelectric point precipitation method, etc., concentration such as ultrafiltration method, gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography Known purification methods such as chromatography, affinity chromatography, adsorption chromatography, chromatofocusing, and chromatography such as reverse phase chromatography (for example, “Biochemical Experiment Course 1, Protein Chemistry I”, edited by The Japanese Biochemical Society, 1976, (Tokyo Kagaku Dojin), methods that do not lose the activity of the polypeptide of the present invention can be appropriately selected and combined. However, it is preferred that at least trypsin affinity chromatography be performed in the purification step. A specific example of a preferable purification method will be described in a ninth embodiment.
[0043]
Next, seventh and eighth aspects of the present invention will be described. Each of the seventh and eighth production methods of the present invention is characterized by culturing a transformant, and recovering and purifying the polypeptide of the first aspect of the present invention from the culture mixture. However, the transformant used in the seventh aspect of the present invention is the transformant of the fourth aspect of the present invention, and the transformant used in the eighth aspect of the present invention is the transformant of the fifth aspect of the present invention. .
In the production method, first, the transformant of the fourth or fifth aspect of the present invention is cultured, and if necessary, gene amplification or expression induction is performed. Next, the culture mixture is recovered, and using them as materials, if necessary, operations such as concentration, solubilization, dialysis, and various types of chromatography are performed to purify the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. The transformant used in the production method may be any cell transformed. However, preferably, the transformant is preferably a CHO cell or a cell selected from yeast or Escherichia coli as a host.
[0044]
The transformant can be cultured by a general method. The culture of the transformant can be performed by referring to various books (for example, see “Microbial Experiment Method”, edited by The Japanese Biochemical Society, edited by Tokyo Chemical Dojin Co., Ltd., 1992). . In addition, the method and necessity of gene amplification and expression induction vary depending on the type of host cell and the promoter used. For example, when the promoter is a trp promoter, expression can be induced with 3β-indoleacrylic acid, and when the promoter is a MMTV promoter, expression can be induced with dexamethasone.
Hereinafter, examples of culture and expression induction when Escherichia coli and CHO are used as transformants will be described.
In a transformant of Escherichia coli into which an expression plasmid having a trp promoter has been introduced, the cells are pre-cultured with L-Broth, and the cells are diluted to 1/50 with respect to M9-CA medium. Inoculate and culture at 37 ° C. OD of culture medium several hours after the start of culture ₅₅₀ When the value reaches 1 to 3 (that is, logarithmic growth phase), 3β-indoleacrylic acid is added to a final concentration of 10 μg / ml to induce expression. By further culturing for about 20 hours, a culture mixture containing the target polypeptide can be obtained.
[0045]
On the other hand, a transformant of an animal cell such as a CHO cell into which an expression plasmid having an elongation factor promoter has been introduced is cultured in a DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Cells are about 5 × 10 ⁴ The cells are inoculated at a concentration of cells / ml and cultured at 37 ° C. under the conditions of 5% carbon dioxide / 95% air. Usually, the cells become confluent after a few days, at which point the medium is replaced with serum-free DMEM. Subsequently, by culturing for 2 to 3 days, a culture mixture containing the target polypeptide can be obtained. When the production amount of the target polypeptide is small, it is possible to increase the production amount by using dhfr gene-deficient CHO cells and amplifying the gene with methotrexate.
[0046]
The above-mentioned culture mixture is a culture supernatant or a lysate of cells. That is, when the transformant secretes the polypeptide extracellularly, the culture supernatant is used as a material to recover and purify the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. On the other hand, when the novel polypeptide accumulates in the host cells, the cells are disrupted using lysozyme, a detergent, freeze-thawing, means such as pressurization, and then centrifuged to collect the supernatant. After removing unnecessary cell fragments and the like by filtration or the like, the novel polypeptide of the first aspect of the present invention is purified using the same as a material.
When the transformant to be used is Escherichia coli and the produced novel polypeptide accumulates in the periplasm, a method such as Wilsky et al. (J. Bacteriol. 1, 595, 1976) ) Can be used.
As in the case of the sixth embodiment, an appropriate method can be selected as a purification method from those commonly used for polypeptide purification. Examples of the purification method are as described in the sixth embodiment. Preferably, at least trypsin affinity chromatography is performed in the purification step. A preferred example of the purification method will be described in the ninth embodiment of the present invention.
[0047]
In the production method, the novel polypeptide of the first aspect of the present invention may be produced in a transformant as a fusion protein with another polypeptide. For example, a method of connecting a DNA encoding a polypeptide of interest to the downstream of a DNA encoding β-galactosidase of Escherichia coli and expressing the polypeptide of interest as a fusion protein with beta-galactosidase can be expected to have a high yield. This is a commonly used method.
When the polypeptide is expressed as a fusion protein with another polypeptide, in any step of the purification step, the fusion protein is treated with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as a protease to convert the polypeptide. An operation to cut out is required.
[0048]
When the transformant used is Escherichia coli and the polypeptide is produced as an inclusion body that is an insolubilized protein, the inclusion body is solubilized during purification, denatured, and purified. The operation of folding may be performed in an appropriate step of purification (Thomas E and Creighton J., Molecular Biology, vol. 87, pp 563-577, 1974). For example, first, the cells are disrupted and centrifuged to collect the pellet. Next, a solubilization buffer containing an appropriate amount of urea or guanidine hydrochloride, a surfactant, reduced glutathione, and oxidized glutathione (for example, 5 M guanidine hydrochloride, 0.005% Tween 80, 50 mM Tris hydrochloride (pH 8.0), 5 mM EDTA, A buffer solution containing 2 mM reduced glutathione and 0.02 mM oxidized glutathione) was added to the pellet, 2-mercaptoethanol was added, the mixture was denatured, and the solution obtained by removing guanidine hydrochloride from the above solubilization buffer was dialyzed to obtain a solution. Fold. When expressed as a fusion protein, after these operations, unnecessary polypeptide portions are cleaved with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as flotease, and then appropriate chromatography is performed.
[0049]
Next, the purification method of the eleventh aspect of the present invention will be described.
The purification method according to the eleventh aspect of the present invention is characterized by performing trypsin affinity chromatography.
The resin used for trypsin affinity chromatography is preferably a resin to which bovine trypsin, porcine trypsin, or human trypsin has been adsorbed. The resin to be adsorbed is not particularly limited, but agarose is preferred. It is preferable to use a trifluoroacetic acid solution for elution.
The fraction containing the novel polypeptide of the present invention can be obtained by measuring the trypsin inhibitory activity of each of the obtained fractions. For confirming the trypsin inhibitory activity, the reverse zymography technique shown in Reference Example is convenient.
[0050]
The purification method of the present invention may include repeating the trypsin affinity chromatography a plurality of times. In that case, in order to separate from the other trypsin-adsorbing substances mixed in the sample, in the first trypsin affinity chromatography, the non-adsorbed fraction is collected, and the collected non-adsorbed fraction is again subjected to trypsin affinity. Preferably, chromatography is performed to recover the adsorbed fraction containing the novel polypeptide of the present invention.
[0051]
The purification method of the present invention may include other steps before and after the trypsin affinity chromatography. That is, the purification method of the present invention also includes a method in which a method that does not inactivate the polypeptide is selected from among operations such as concentration and various types of chromatography before and after the trypsin affinity chromatography and performed in combination.
[0052]
A more preferred example of the purification method of the present invention is a purification method including at least the following steps a) to c).
a) Salting out by adding ammonium sulfate, and collecting a precipitate.
b) Perform gel filtration.
c) Perform trypsin affinity chromatography.
The salting out of step a) is preferably carried out by adding ammonium sulphate to the sample so as to be about 80% saturated. After the addition of ammonium sulfate, a precipitate is obtained by centrifuging the mixture that has been allowed to stand for about overnight. The precipitate is dissolved in a buffer having a pH around neutrality, and if necessary, dialyzed against an appropriate external dialysis solution.
The gel filtration of step b) is preferably carried out using a resin with an excluded volume of 3 million daltons and at a pH near neutrality. In particular, it is preferable to carry out the reaction at around pH 7.5. Although the type of the resin is not particularly limited, cellulose is preferably used. By measuring the trypsin inhibitory activity of each fraction obtained by gel filtration, a fraction containing the novel polypeptide of the present invention can be obtained. For confirming the trypsin inhibitory activity, the reverse zymography technique shown in Reference Example is convenient.
The trypsin affinity chromatography of step c) is as described above.
[0053]
In the above preferred example, steps a) to c) may be performed continuously, or other operations may be performed between these operations. Further, each of the steps a) to c) is not limited to one time, and may be performed a plurality of times.
[0054]
The purification method of the present invention can be applied regardless of whether the material is a culture supernatant, urine, or a crushed cell or tissue. However, in the case where a crushed cell or tissue is used as a material, it is desirable to perform the purification method of the present invention on a material obtained by removing such tissue or cell fragments by centrifugation or the like.
[0055]
Next, the antibody according to the tenth aspect of the present invention will be described.
The novel antibody according to the tenth aspect of the present invention binds to the novel polypeptide according to the first aspect of the present invention.
The novel antibody of the tenth aspect of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as long as it binds to the novel polypeptide of the first aspect of the present invention.
[0056]
The structure of an antibody, that is, an immunoglobulin, is composed of an H chain and an L chain, and its physicochemical and immunological properties are divided into five classes (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE). Of these, IgG and IgA are further divided into subclasses depending on the type of H chain. The novel antibody of the present invention may belong to any of these classes and subclasses. Furthermore, immunoglobulins can be decomposed with, for example, pepsin to give F (ab ') ₂ And Fc ', and when decomposed with papain, it is divided into Fab and Fc. The antibody of the present invention may be a complete antibody molecule or a fragment thereof as long as it binds to an antigen.
Further, the antibody of the present invention may be a chimeric antibody.
[0057]
The antibody of the present invention, whether it is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, can be obtained by referring to a known method (for example, an immunological experiment operation method, edited by the Japan Society of Immunology, published by the Japan Society of Immunology). This will be briefly described below.
In order to obtain the novel antibody, an animal is first treated with the novel polypeptide of the first aspect of the present invention or a fragment thereof as an immunizing antigen, if necessary, such as Freund's complete adjuvant (FCA) or incomplete adjuvant (FIA). Inoculate with an appropriate adjuvant and boost if necessary at 2-4 week intervals. After the booster, blood is collected to obtain antiserum. The novel polypeptide of the present invention used as an antigen may be obtained by any method as long as it has a degree of purification that can be used for antibody purification. When a polypeptide fragment is used as the immunizing antigen, it is preferable to bind a carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH).
The animal immunized with the novel polypeptide may be any animal, but is preferably a rat, a mouse, a rabbit, a sheep, a horse, a chicken, a goat, a pig usually used for immunological experiments by those skilled in the art. It is preferable to select and use an animal species that can produce the target antibody from cattle and cattle.
A polyclonal antibody can be obtained by purifying the obtained antiserum. Purification may be performed by appropriately combining known methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
[0058]
In order to obtain a monoclonal antibody, the following procedure is performed. That is, antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal, and fused with a myeloma cell line or the like by a known method using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse, etc., to produce a hybridoma. It may be obtained by selecting and culturing a clone producing an antibody that binds to the novel polypeptide of the first to third aspects of the present invention, and purifying the culture supernatant of the selected clone. For purification, known methods such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like described above may be appropriately combined and used.
[0059]
Also, the novel antibody can be obtained by using a genetic engineering method. That is, from spleen cells and lymphocytes of an animal immunized with the novel polypeptide or polypeptide fragment of the first to third aspects of the present invention, or from a hybridoma producing a monoclonal antibody against the novel polypeptide of the first aspect of the present invention. mRNA is collected and a cDNA library is prepared based on the mRNA. A clone producing an antibody that reacts with the antigen is screened, the obtained clone is cultured, and the desired antibody can be purified from the culture mixture by a combination of known methods.
[0060]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, these are merely examples, and the present invention is not limited thereto.
Abbreviations used in the following description are based on commonly used abbreviations in the art.
Various operations in the following examples were mainly performed with reference to the following magazines and books.
[0061]
(References)
1. Biochemistry Experiment Lecture 1 Protein Chemistry I, edited by The Biochemical Society of Japan, 1976, Tokyo Dojin
2. New Chemistry Experiment Course 1 Protein II Primary Structure, edited by The Biochemical Society of Japan, 1990
3. New Chemistry Experiment Course 18 Cell Culture Technology, edited by The Biochemical Society of Japan, 1990, Tokyo Kagaku Doujin
4. Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed; edited by Sambrook J, etc., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989.
5. Introduction and Expression of Recombinant Genes into Cells, Now and Now, Ed., Special Issue on Protein Nucleic Acid Enzyme 28 (14), 1983
6. Comprehensive compilation of cell engineering techniques, supervised by Yoshio Okada, Special Issue on Experimental Medicine 7 (13), 1989
[0062]
【Example】
[Example 1] Culture of T98G cells and preparation of culture supernatant
T98G cells were suspended in DMEM / F-12 medium (1: 1) containing 10% fetal bovine serum (FBS), and ⁵ It was adjusted to cells / ml. 200 ml of this cell suspension was inoculated into an 800 ml roller bottle, and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide / 95% air. After culturing for 2 days, the culture solution was removed, and Ca and Mg-free 150 mM phosphate buffered saline (pH 7.2) (hereinafter PBS) ⁻ The cells were further washed using a DMEM / F-12 medium (1: 1). Next, 200 ml of a DMEM / F-12 medium (1: 1) was added per roller bottle again, and the culture was further continued for 2 days. Thereafter, the culture supernatant was collected from the roller bottle.
[0063]
[Example 2] Purification and analysis of novel protein of the present invention from culture supernatant of T98G cells
The novel protein of the present invention was analyzed from each culture supernatant obtained in Example 1 by the following method.
[0064]
(1) Salting out ammonium sulfate
Ammonium sulfate was added to 3.2 L of the culture supernatant obtained in Example 1 so as to achieve 80% saturation, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. After standing, the precipitate was collected by centrifugation at 9,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C, and dissolved in 25 ml of 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5. This was dialyzed against the same buffer overnight, centrifuged at 18,000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes to remove the precipitate, and then subjected to the following gel filtration.
[0065]
(2) Gel filtration
25 ml of the above sample was applied to a Cellulofine GCL-2000 (manufactured by Chisso Corporation) column (φ26 mm × 94 cm) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 0.5 M NaCl / 0.01% Brij35. Then, it was developed with the same buffer at a flow rate of 20 ml / hour (FIG. 1). Each fraction was collected in 5 ml portions, and a reverse zymography was performed using a part of the fraction by the method described below, and a band showing trypsin inhibitory activity was detected (FIG. 2). The fractions of fractions 65 to 74 were pooled and applied to the following trypsin-immobilized column.
[0066]
(3) Trypsin affinity chromatography
3.5 ml of trypsin sepharose 4B prepared by the method described later was packed in a column (φ10 mm × 4.5 cm), and equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 0.5 M NaCl / 0.01% Brij35. did. After applying 50 ml of the sample pooled in (2) to the column at a flow rate of 5 ml / hour, 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 1.0 M NaCl / 0.01% Brij35, followed by 20 mM Tris-HCl buffer Washed with pH 7.5 / 0.01% Brij35. Further, elution was performed with 0.05% trifluoroacetic acid at a flow rate of 10 ml / hour, and the eluted fraction was collected in 2 ml portions (FIG. 3). Reverse zymography was performed using a part of the fractionated fraction by the method described below. As a result, a band having trypsin inhibitory activity was observed in fraction 39 (FIG. 4).
[0067]
(4) amino acid sequence analysis
The partially purified preparation obtained in (3) was subjected to SDS-poly under reduction with reference to the method of Laemmli (Laemmli, UK, Nature, Vol. 227, 680-685, 1970). After subjecting to acrylamide gel electrophoresis (hereinafter abbreviated as SDS-PAGE), PVDF (polyvinylidene) according to the method of Matsudaira (Matsudaira, P., J. Biol. Chem., 262, 10035-10038, 1987). (fluoride) membrane. Subsequently, after cutting a band having a molecular weight of about 25 kD, the amino acid sequence was analyzed using Model 477A Protein Sequencing System-120APTH Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was confirmed.
[0068]

[0069]
[Example 3] Purification of novel protein of the present invention from T98G culture supernatant
The novel protein of the present invention was recovered and purified from the culture supernatant obtained in Example 1 by the following method.
[0070]
(1) Salting out ammonium sulfate
Ammonium sulfate was added to the culture supernatant obtained in Example 1 so as to be 80% saturated, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. After standing, at 4 ° C., 9,000 r.p. p. m. The precipitate was collected by centrifugation for 30 minutes and dissolved in 60 ml of 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5. This was dialyzed against the same buffer overnight, and then incubated at 4 ° C. and 18,000 r.p. p. m. The mixture was centrifuged for 30 minutes to remove the precipitate, and then subjected to the following gel filtration.
[0071]
(2) Gel filtration
The above sample (60 ml) was applied to a Cellulofine GCL-2000 (previously described) column (φ50 mm × 100 cm 2) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 0.5 M NaCl, and the flow rate was 80 ml with the same buffer. / Time developed. 12 ml of each fraction was collected, and reverse zymography was performed using a part of the fraction by the method described below, and a band showing trypsin inhibitory activity was detected. The fractions showing activity here were pooled and applied to the following trypsin-immobilized column.
[0072]
(3) Trypsin affinity chromatography
3.5 ml of trypsin sepharose 4B prepared by the method described below was packed in a column (φ8 mm × 7 cm 2), and equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 0.5 M NaCl. After applying 80 ml of the sample pooled in (2) to the column at a flow rate of 10 ml / hour, the non-adsorbed fraction was re-chromatographed on a trypsin Sepharose 4B column. The column was washed with 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 1.0 M NaCl, followed by 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5.
Further, elution was performed with 0.05% trifluoroacetic acid at a flow rate of 10 ml / hour, and the eluted fractions were collected in 3.5 ml portions. Reverse zymography was performed using a part of the fractionated fraction by the method described below. As a result, a band having trypsin inhibitory activity was detected in the fraction eluted with 0.05% trifluoroacetic acid. The eluted fraction was dried under reduced pressure to obtain a purified sample of the novel protein of the present invention.
Using the obtained purified sample, the activity measurement shown in Example 8 and the following SDS-PAGE and amino acid sequence analyzes were performed.
[0073]
(4) SDS-PAGE
The purified sample obtained in (3) was subjected to SDS-PAGE by referring to the method of Laemli. As a result, a single band was observed at about 20 kD under non-reducing conditions and at about 25 kD under reducing conditions (FIG. 5).
[0074]
(5) Analysis of amino acid sequence
The amino acid sequence of the purified sample obtained in (3) was determined by the following method. That is, after the purified sample was dissolved in 50% acetic acid, the amino acid sequence was analyzed using Model 477A Protein Sequencing System-120 APTH Analyzer (described above). As a result, the following amino acid sequence was confirmed.
[0075]

[0076]
[Example 4] Culture of A431 cells
A431 cells were cultured in a DMEM / F-12 medium (1: 1) containing 10% FBS in a 90 mmφ dish until confluent. When the cells became confluent, the cells were washed using PBS containing no Mg and Ca and a DMEM / F-12 medium (1: 1). Next, 10 ml of DMEM / F-12 medium (1: 1) was added again, and after culturing for 2 days, the supernatant was recovered.
[0077]
[Example 5] Reverse zymography of A431 cell culture supernatant
10 ml of the culture supernatant obtained in Example 4 was subjected to ammonium sulfate salting-out according to Example 1 (1), and further subjected to reverse zymography by the method described later. As a result, a band was confirmed at around 20 kD, which was the same as the band of the novel protein of the present invention (FIG. 6).
[0078]
[Example 6] Trypsin inhibitory activity
The purified sample obtained in Example 3 was dissolved in 100 μl of distilled water, and the concentration was adjusted to about 56 nM based on the protein concentration estimated from the SDS-PAGE band density of Example 3 (4). It was diluted with 0.1% BSA / 0.2 M triethanolamine-hydrochloric acid buffer pH 7.8 to prepare a sample for measuring bovine trypsin inhibitory activity. The bovine trypsin inhibitory activity of this sample was determined using the synthetic substrate S-2444 (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) as a substrate by the method of Kascell (Kassell B, et al., Methods in Enzymol. 19, 844-852, (1970).
First, bovine trypsin (Type XIII, manufactured by Sigma) was dissolved in 0.001 M hydrochloric acid to prepare 13600 (α-N-benzoyl-L-arginine, BAEE) U / ml, which was then dissolved in 0.1% BSA / The resultant was diluted with a 0.2 M triethanolamine-hydrochloric acid buffer (pH 7.8) to prepare a 1.2 BAEEU / ml trypsin solution.
Separately, the synthetic substrate S-2444 was dissolved in distilled water to prepare a 2 mM S-2444 solution. Next, 50 μl of the sample or 50 μl of 0.1% BSA / 0.2 M triethanolamine-hydrochloric acid buffer pH 7.8 as a control was mixed with 50 μl of each trypsin solution. After standing at 37 ° C. for 10 minutes, 25 μl of a 2 mM S-2444 solution, which had been kept at 37 ° C. in advance, was added to start the reaction. The absorbance at 405 nm for 15 minutes after the start of the reaction was measured with a spectrophotometer over time. As a result, it was confirmed that the novel protein of the present invention inhibited bovine trypsin by 84% at a reaction concentration of about 22 nM (FIG. 7).
[0079]
(Reference example)
(1) Reverse zymography
Reverse zymography is an assay in which inhibitory activity against proteases can be seen in SDS-PAGE gels. In ordinary SDS-PAGE, when staining with Coomassie brilliant blue, it is difficult to detect a band close to a band that stains deeply or a band that stains extremely lightly.
However, by using this assay, even a small amount of protein can be detected. The detection sensitivity of this assay is 1 μg or less, and a protein having a strong inhibitory activity can be detected even at several tens of ng.
[0080]
The principle will be briefly described. First, an SDS-gel containing gelatin is prepared in advance, and the sample is electrophoresed in the same manner as ordinary SDS-PAGE. The whole gel is then treated with trypsin. At this time, the protein having no trypsin inhibitory activity is digested together with the gelatin, and only the protein having trypsin inhibitory activity is left in the gel. Staining this gel with Coomassie Brilliant Blue allows identification of only the trypsin inhibitor.
Reverse zymography was performed as follows.
First, a 14% SDS-polyacrylamide gel containing 1 mg / ml gelatin was prepared. Next, the test substance was allowed to stand in 62.5 mM Tris-hydrochloride pH 7.5 / 2% SDS / 7% glycerol / 0.0025% bromophenol blue at 25 ° C. for 1 hour, applied to a gel, and electrophoresed.
[0081]
After the electrophoresis, the gel was immersed in 2.5% Triton X100 / 0.1 M NaCl / 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and shaken for 1.5 hours. Subsequently, the cells were placed in 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 10 ng / ml bovine trypsin, and the enzyme reaction was carried out at 37 ° C. overnight. After completion of the reaction, the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 for 30 minutes. After staining, the cells were soaked in 25% ethanol / 8% acetic acid for 20 minutes, and then destained in 5% ethanol / 7.5% acetic acid until the trypsin inhibitor of the present invention became detectable.
[0082]
(2) Preparation of trypsin sepharose 4B
2 g of Bromcian-activated Sepharose 4B (Pharmacia) was suspended in about 200 ml of 1 mM hydrochloric acid and allowed to swell. This was filtered on a glass filter, and the suspension and filtration with about 100 ml of 1 mM hydrochloric acid were repeated twice. Then 10 ml of 0.5 M NaCl / 0.1 M NaHCO ₃ Suspended in buffer pH 8.3. To this suspension, 10 ml of a 1 mg / ml trypsin solution was added and shaken at 4 ° C. overnight. Then, after reacting with a 0.2 M glycine solution (pH 8.3) at room temperature for 2 hours to block excess active groups, a 0.5 M NaCl / 0.1 M acetic acid-NaOH buffer (pH 4.0) was used, followed by a 0.05 M solution. The gel was washed with% trifluoroacetic acid.
[0083]
[Example 7] Cloning of cDNA encoding novel polypeptide of the present invention and determination of nucleotide sequence-1
(1) Culture of T98G cells
T98G cells (ATCC CRL 1690) were suspended in DMEM / F-12 medium (1: 1) containing 10% FBS, ⁴ It was adjusted to cells / ml. 50 ml of this cell suspension is cultivated for 150 cm. ² And cultured at 37 ° C. under the conditions of 5% carbon dioxide / 95% air. After culturing for 2 days, the culture solution is removed and PBS ⁻ , And the cells were further washed with a DMEM / F-12 (1: 1) medium. Next, 50 ml of DMEM / F-12 (1: 1) medium was added again, and culture was performed for about 24 hours. After that, remove the culture solution and add PBS ⁻ Washed with. Poly (A) using cells after washing as material ⁺ RNA extraction was performed.
[0084]
(2) Poly from T98G cells (A) ⁺ RNA extraction
From the cells prepared in (1), use a total RNA separator kit and an mRNA separator kit (both from Clontech) according to the protocol to obtain poly (A) ⁺ RNA extraction was performed. The following buffers are provided with the above kit unless otherwise specified.
First, a denaturing solution was added to the cells prepared in (1), and the cells were collected and vigorously stirred. Further, 2M sodium acetate (pH 4.5), water-saturated phenol and chloroform were added, and the mixture was vigorously stirred again. After the sample was centrifuged, isopropanol was added to the supernatant to perform isopropanol precipitation. Further, the precipitate was dissolved in the above-mentioned denaturing solution, again subjected to isopropanol precipitation, and rinsed with 80% ethanol to obtain total RNA.
[0085]
Next, the obtained total RNA was dissolved in TE buffer, a sample buffer was added, and heat treatment was performed at 68 ° C. for 3 minutes. This was applied to an oligo (dT) -cellulose spin column equilibrated with a high salt concentration buffer included in the kit. After washing the column with a high-salt buffer and a low-salt buffer, elution was performed using an elution buffer that had been warmed to 65 ° C. The eluate is precipitated with ethanol to give poly (A) ⁺ RNA was obtained.
[0086]
(3) Synthesis of single-stranded cDNA
Poly (A) obtained in (2) ⁺ Using RNA as a template, single-strand cDNA was synthesized according to the protocol using a superscript preamplification system (SUPERSCRIPT ™ Preamplification System: BRL).
That is, 2 μg of the poly (A) obtained in (2) ⁺ The RNA was dissolved in 97.5 μl of distilled water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC), and 7.5 μl of oligo (dT) primer was added. The mixture was heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes, and then rapidly cooled in ice. did.
Next, 15 μl of 10 × reaction buffer, 7.5 μl of dNTP (10 mM each) solution, 15 μl of 0.1 MDTT, and 7.5 μl of superscript reverse transcriptase (200 U / ml) were added, and 150 μl of the reaction solution was added. did. After reacting at room temperature for 10 minutes, at 42 ° C. for 50 minutes, at 90 ° C. for 10 minutes and on ice for 10 minutes, 7.5 μl of RNase H was added, and the reaction was further performed at 37 ° C. for 20 minutes. The reaction solution (single-stranded cDNA) thus obtained was used as a template for PCR in subsequent experiments.
[0087]
(4) Cloning of new cDNA
Based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the novel polypeptide of the present invention confirmed in Example 2 (4), the following three types of sense primers were synthesized with a DNA synthesizer (Model 394, Applied Biosystems). Synthesized. Further poly (A) ⁺ One type of antisense primer that recognizes RNA was also synthesized.
[0088]

(In the sequence, Y indicates T or C, H indicates T or C or A, and R indicates A or G base)
[0089]
Next, PCR was performed three times in combination and in the order of sense primer 1 and antisense primer 1, sense primer 2 and antisense primer 1, and sense primer 3 and antisense primer 1. That is, the first PCR used the single-stranded cDNA prepared in (3) as the template, and the second PCR used the DNA amplification product obtained in the first PCR as a template. The third PCR was performed using the DNA amplification product obtained in the second PCR as a template.
In the PCR, 1 μl of the sense and antisense primers at a concentration of 0.1 μg / μl were added to 1 μl of the template, 3.2 μl of dNTP (1.25 mM each) solution, and Amplitac (AmpliTaqTM, 5 U / μl: Takara Shuzo Co., Ltd.). 0.2 μl, 2 μl of the 10 × reaction buffer included in the kit, and 11.6 μl of distilled water were added to make 20 μl of the reaction solution at 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 120 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds. The reaction was defined as one cycle, and the reaction was performed for 40 cycles using a thermal cycler (GeneAmp ™ PCR System 9600: Perkin-Elmer).
When the reaction solution after the third PCR was analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis, a DNA fragment having a chain length of about 700 bp was amplified. The DNA fragment was recovered from the agarose gel, and M13mp18 was recovered. And cloned.
[0090]
(5) Confirmation of base sequence
The nucleotide sequence of the DNA fragment of about 700 bp cloned in (4) was confirmed. That is, after performing a sequencing reaction using a Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Taq Dye Deoxy ™ Terminator Cycle Sequencing Kit: Applied Biosystems) according to the protocol, a DNA sequencer (Model 373A Applied Biosystems) Was analyzed. As a result, it was found that the DNA fragment of about 700 bp cloned into M13 mp18 had a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence encoding a novel protein in the same open reading frame. .
[0091]
[Example 8] Cloning of cDNA encoding novel polypeptide of the present invention and determination of nucleotide sequence-2
(1) Cloning of cDNA
To determine the nucleotide sequence of the cDNA encoding the novel polypeptide of the present invention, PCR was performed using a part of the nucleotide sequence obtained in Example 7 (5) as a primer, and the DNA was cloned again. That is, based on the base sequence downstream of the termination codon of the base sequence confirmed in Example 7 (5), the following two types of antisense primers were synthesized by a DNA synthesizer (described above). Further, the following sense primers were synthesized using a DNA synthesizer (described above) with reference to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[0092]

(In the sequence, Y indicates T or C, H indicates T or C or A, and R indicates A or G base)
[0093]
Using a human placenta cDNA library (Clontech) and T98G single-stranded cDNA as templates, according to the method performed in Example 7 (4), sense primer 1 and antisense primer 2, and sense primer 4 and antisense primer 4 PCR was performed twice in the order of the combination of sense primer 3 and the order. A DNA fragment of about 600 bp amplified from each template was inserted into the multiple cloning site of plasmid pUC118. Using these, the method of Hanahan (Hanahan D., Techniques for Transformation of E. FIG. coli , In: DNA cloning, vol. 1, Grover, D.S. M. (Glover, DM), pp. 109-136, IRL Press (IRL Press), 1985) to transform Escherichia coli JM109 strain and give 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D. LB plates containing -galactoside (X-gal) and isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside (IPTG). White colonies were selected to obtain the desired transformant. Plasmid DNA was recovered from these colonies by the SDS-alkali method.
[0094]
(2) Confirmation of base sequence
Example 7 (5): Confirmation of the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in (1), that is, the DNA fragment amplified from the template of the human placenta cDNA library (Clontech) and the template of each single-stranded cDNA of T98G cell. Was carried out according to the method described above. The confirmed nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively. The cloned DNA had a nucleotide sequence encoding the 11th and subsequent amino acid sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. This sequence was confirmed both in the DNAs amplified from the two types of templates.
Escherichia coli JM109 strain was transformed with plasmid pUC118 (referred to as plasmid pM1200) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 by the method of Hanahan et al. (Described above), and the resulting transformant Escherichia coli JM109 (pM1200) was commercialized. It was deposited on February 2 at the Patent Microorganisms Depositary Center of the Research Institute of Microbial Industry, Ministry of Industry (Deposit No. P-14105).
[0095]
[Example 9] Cloning of cDNA encoding novel polypeptide of the present invention and determination of nucleotide sequence-3
(1) Cloning of cDNA
In order to confirm the sequence further upstream of the nucleotide sequence confirmed in Example 8, 5'-RACE-Ready cDNA (5'-RACE-ReadyTM cDNA, human placenta cDNA: Clonetech) was used according to the protocol. PCR was performed. First, the following two antisense primers were synthesized using a DNA synthesizer (described above) based on the nucleotide sequences of the novel protein cDNAs shown in SEQ ID NOs: 4 and 5.
[0096]

[0097]
Using the 5'-RACE-ready cDNA attached to the kit as a template, the anchor primer included in the kit and the above-mentioned antisense primer 4 and antisense primer 5 were combined, and Example 7 (4) was used in this order. PCR was performed twice according to the method described in (1). The amplified DNA fragment of about 280 bp was incorporated into plasmid pUC118 according to the method of Example 8 (1) to obtain a transformant of Escherichia coli JM109 strain, and the plasmid DNA was recovered.
[0098]
(2) Confirmation of base sequence
The nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in (1) was confirmed according to the method of Example 7 (5). As a result, it was confirmed that the clone obtained in (1) contained the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing. This nucleotide sequence encoded an amino acid sequence obtained by adding 37 amino acids to the C-terminal thereof in addition to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 8). The nucleotide sequence confirmed here and the amino acid sequence encoded thereby were consistent with the results obtained in Example 8.
A transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain with plasmid pUC118 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 (referred to as plasmid pM1201), Escherichia coli JM109 (pM1201) The deposited microorganism was deposited on February 2 (Deposit No. P-14106).
[0099]
[Example 10]
(1) Cloning of cDNA
For the purpose of cloning the full length of the cDNA encoding the novel protein, two types of sense primers located upstream of the N-terminus of the novel protein were synthesized based on the nucleotide sequence confirmed in Example 9. On the other hand, based on the nucleotide sequence confirmed in Example 7, an antisense primer located downstream of the stop codon was also synthesized. The primers were synthesized using a DNA synthesizer (described above), and their sequences are shown below.
[0100]

[0101]
Next, using the single-stranded cDNA of the T98G cell as a template, PCR was performed twice in combination with the sense primer 5 and the antisense primer 2 and the sense primer 6 and the antisense primer 6 in that order. The amplified DNA fragment of about 660 bp was inserted into plasmid pUC118 according to the method of Example 8 (1) to obtain a transformant of Escherichia coli JM109 strain, and the plasmid DNA was recovered.
[0102]
(2) Confirmation of base sequence
The nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in (1) was confirmed according to the method of Example 7 (5). As a result, it was confirmed that the clone obtained in (1) contained the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing (SEQ ID NO: 9). This sequence encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and it was confirmed that the clone obtained in (1) encodes the full length of the novel polypeptide.
A transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain with plasmid pUC118 (referred to as plasmid pM1202) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, Escherichia coli JM109 (pM1202) Deposited at the Patented Microorganisms Depositary (Accession No. P-14202)
[0103]
[Example 11] Preparation of polyclonal antibody
20 μg of the novel protein prepared in the same manner as in Example 3 was dissolved in 200 μl of physiological saline, and this was mixed with an equal amount of FCA to prepare an emulsion. BALB / c mice (male, 4 weeks old, Charles Charles Japan) River Co., Ltd.) was administered subcutaneously four times at weekly intervals. After the final administration, whole blood was collected and serum was separated to obtain an antiserum.
The column was packed with 2 mL of protein A-Sepharose CL4B and equilibrated with 1.5 M glycine-NaOH buffer pH 8.9 containing 3 M NaCl (hereinafter abbreviated as equilibration buffer).
The obtained antiserum was diluted 2-fold with the equilibration buffer, applied to the column, and washed with the equilibration buffer. After washing, elution was carried out with 0.1 M citrate-NaOH buffer pH 4.0 to obtain a polyclonal antibody.
[0104]
[Example 12]
(1) Preparation of antigen-insoluble plate
The novel protein obtained in Example 3 is diluted with 0.076 M phosphate buffered saline, pH 6.4 (hereinafter abbreviated as PBS), and adjusted to 1 μg / ml. 100 μl of the diluted novel protein solution was dispensed into a 96-well microplate, and left at 4 ° C. overnight. After washing each well 5 times with a physiological saline solution containing 0.005% Tween 20 (hereinafter abbreviated as a washing solution), 150 μl of PBS containing 0.5% BSA is dispensed, and left standing at 4 ° C. overnight to block. Then, an antigen insolubilized plate was prepared.
[0105]
(2) Preparation of monoclonal antibody
20 μg of the novel protein purified in the same manner as in Example 3 was dissolved in 200 μl of physiological saline, and this was mixed with an equal amount of FCA to prepare an emulsion, and a BALB / c mouse (male, 4 weeks old, Charles Charles Japan) was prepared. (River Co., Ltd.) subcutaneously three times at one week intervals. One week later, a final immunization was performed by intravenously administering only 20 μg of the antigen solution.
Four days after the final immunization, the mouse was sacrificed and the spleen was removed. After chopping this, it was suspended in RPMI1640 medium through a stainless mesh to obtain a spleen cell suspension. The spleen cells and mouse myeloma cells (P3X63Ag8U1) were mixed at a ratio of 10: 1 and centrifuged (at 1,400 rpm for 8 minutes). To the resulting precipitate, quickly add 0.5 ml of RPMI 1640 containing 42.5% polyethylene glycol 1540 and 15% dimethyl sulfoxide, shake the cells vigorously for 1 minute, and slowly add 10 ml of RPMI 1640. After that, centrifugation (800 rpm for 5 minutes) was performed.
This precipitate was washed with HAT medium (hypoxanthine 1 × 10 ^-4 M, aminopterin 4 × 10 ^-7 M, thymidine 1.6 × 10 ^-5 M, RPMI 1640 medium containing 10% FBS) ⁵ The cells were suspended to give cells / ml, and 0.2 ml was dispensed per well of a 96-well microplate. Half of the medium was replaced every 2-3 days, and then HT medium (hypoxanthine 1 × 10 ^-4 M, thymidine 1.6 × 10 ^-5 M, RPMI 1640 medium containing 10% FBS).
[0106]
When the growth of the hybridoma cells was confirmed, screening was performed by the ELISA method. That is, the 96-well plate in which the novel protein prepared in Example 10 (1) was insolubilized was washed twice with a washing solution, and then diluted 10-fold with PBS containing 10% rabbit serum and 0.1% BSA. 100 μl was added to each well and reacted at room temperature for 2 hours. After the completion of the reaction, the plate was washed five times with a washing solution, and a peroxidase-labeled rabbit anti-mouse Igs antibody diluted 200-fold with PBS containing 10% rabbit serum and 0.1% BSA as the second antibody (DAKO PATS Demmmark) 100 μl) and reacted at room temperature for 2 hours.
After completion of the reaction, the well was washed 5 times with a washing solution, and 100 μl of 0.1 M McKilvain buffer pH 5.0 containing 3 mg / ml orthophenylenediamine and 0.027% hydrogen peroxide was added, and an enzyme reaction was carried out at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped with 100 μl of 2N sulfuric acid, and the absorbance at 490 nm was measured.
Hybridomas in wells that were positive in the ELISA method were diluted using RPMI1640 containing 10% FBS so that the number of hybridomas in a 96-well microplate was 2, 1, or 0.5 per well. Wistar rat thymocytes were added as feeder cells, seeded into each well of the plate, and cloned. Observation under a microscope was performed to select wells that were single cell colonies, and their culture supernatants were screened by the above-mentioned ELISA method to obtain 5 hybridoma strains producing monoclonal antibodies.
[0107]
Next, in order to produce monoclonal antibodies in large quantities, about 10 hybridoma cells producing the antibodies were produced. ⁷ Cells were administered intraperitoneally to BALB / c mice, each pretreated with pristane. The ascites fluid collected on day 9 was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain monoclonal antibodies 1B6, 3D4, 3G1, 4A7 and 4C3.
The class of the resulting monoclonal antibodies was determined in an octalony gel diffusion test using class-specific anti-mouse serum. As a result, the class of monoclonal antibody 1B6 was IgM, and the other four antibodies were IgG.
[0108]
(3) Western blotting
Western blotting was performed using the monoclonal antibody 3D4 obtained in Example 12 (2). The novel protein purified in Example 3 was subjected to SDS-PAGE by referring to the method of Ramelli. After completion of the electrophoresis, the gel was placed on a nitrocellulose membrane and placed in a transfer buffer (25 mM Tris-HCl / 192 mM glycine, pH 8.3) at a constant current of 150 mA. Transfer was performed for 5 hours. The membrane to which the protein of each cell was transferred was immersed in PBS containing 1.5% blocking reagent (Boehringer Mannheim GmbH) to perform blocking for 3 hours.
The monoclonal antibody obtained as described above was diluted 5,000-fold with PBS containing 1% BSA, and the blocking membrane was added thereto and reacted for 1 hour at room temperature. Thereafter, the plate was rinsed lightly once with distilled water and washed with PBS containing 0.05% Tween 20 for 10 minutes with gentle shaking. After repeating this washing operation five times, EIA-grade affinity-purified goat anti-mouse IgG (H + L) horseradish peroxidase (EIA Grade Affinity Purified Goat Anti-mouse IgG (HIA)) diluted 5,000-fold with PBS containing 1% BSA was used. + L) Reaction was carried out by slightly shaking the membrane in Horseradish peroxidase, Bio-Rad (BIO RAD), USA) for 1 hour.
Thereafter, the plate was washed five times with PBS containing 0.05% Tween 20 for 10 minutes while gently shaking, and similarly washed once with PBS. Subsequently, a luminescence reagent solution of an ECL western blotting detection system (Amersham, UK) was prepared immediately before use, the membrane treated as described above was immersed, and reacted at room temperature for 1 minute. The membrane was taken out from the luminescent reagent solution, exposed to Hyperfilm-ECL (Amersham, UK) and developed.
As a result, a single band was observed at about 20 KD in non-reducing SDS-PAGE.
[0109]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel polypeptide. Since the polypeptide has trypsin inhibitory activity, it can be used for the development of a therapeutic agent for trypsin-related diseases such as pancreatitis, shock, multiple organ failure, disseminated intravascular coagulation (DIC), and the like.
[0110]
[Sequence list]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]

[0118]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing an elution profile of gel filtration.
FIG. 2 is a drawing substitute photograph showing the morphology of microorganisms, and is a photograph showing the result of reverse zymography after gel filtration of the culture supernatant of T98G cells.
FIG. 3 is a graph showing an elution profile of trypsin affinity chromatography.
FIG. 4 is a photograph as a substitute of a drawing, showing the morphology of microorganisms, and is a photograph showing the results of reverse zymography after trypsin affinity chromatography of the culture supernatant of T98G cells.
FIG. 5 is a drawing substitute photograph showing the morphology of microorganisms, and is a photograph showing the result of SDS-PAGE of the novel protein of the present invention purified from T98G cells.
FIG. 6 is a drawing substitute photograph showing the morphology of the microorganism, and is a photograph showing the result of reverse zymography of the culture supernatant of A431 cells.
FIG. 7 is a graph showing the trypsin inhibitory activity of the novel protein of the present invention.

Claims (20)

A novel polypeptide having the following amino acid sequence:

The novel polypeptide according to claim 1, which satisfies the following (1) to (3).
(1) the N-terminal amino acid is

(2) having trypsin inhibitory activity,
(3) The molecular weight is 25 ± 3 kD on reducing SDS-PAGE and 20 ± 3 kD on non-reducing SDS-PAGE. The novel polypeptide according to claim 1 or 2, which is essentially free of contaminating proteins derived from humans. The novel polypeptide according to any one of claims 1 to 3, which is obtained by culturing T98G cells and purifying the culture supernatant. It is obtained by culturing a transformant transformed with a DNA or a recombinant DNA molecule having a nucleotide sequence encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 3, and purifying the culture mixture. A novel polypeptide according to any one of claims 1 to 3. A novel DNA having a base sequence encoding the novel polypeptide according to any one of claims 1 to 3. The novel DNA according to claim 6, which has at least a part of the following nucleotide sequence.

A novel DNA having the following nucleotide sequence:

A recombinant DNA molecule comprising the novel DNA according to any one of claims 6 to 8. A transformant transformed with the novel DNA according to any one of claims 6 to 8. A transformant transformed with the recombinant DNA molecule according to claim 9. The novel polypeptide according to any one of claims 1 to 3, wherein T98G cells are cultured, and the novel polypeptide according to any one of claims 1 to 3 is purified from the culture supernatant. A method for producing a peptide. A transformant according to claim 10 or 11, wherein the transformant is cultured, and the novel polypeptide according to any one of claims 1 to 3 is recovered and purified from the culture mixture. A method for producing a novel polypeptide according to any one of the above. The method according to claim 13, wherein the transformant is a eukaryotic cell. The method according to claim 13, wherein the transformant is a prokaryotic cell. The method for purifying a novel polypeptide according to any one of claims 1 to 5, wherein at least trypsin affinity chromatography is performed. The purification method according to claim 16, comprising at least the following steps.
a) Ammonium sulfate salting out is performed to recover the precipitate.
b) Perform gel filtration.
c) Perform trypsin affinity chromatography. A novel antibody that recognizes the novel polypeptide according to any one of claims 1 to 5. 19. The novel antibody according to claim 18, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 19. The novel antibody according to claim 18, wherein said antibody is a polyclonal antibody.

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