JP3550565B1

JP3550565B1 - Imatinib resistant Philadelphia chromosome positive human acute lymphoblastic leukemia cell line and uses thereof

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Publication number: JP3550565B1
Application number: JP2003116279A
Authority: JP
Inventors: 裕子佐藤; 洋昌長尾
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-04-21
Filing date: 2003-04-21
Publication date: 2004-08-04
Anticipated expiration: 2023-04-21
Also published as: JP2004321012A; WO2004094628A1; AU2003280676A1

Abstract

【課題】
高濃度のメシル酸イマチニブに対する耐性を示し、且つ安定したヒト細胞株を樹立すること。また、かかるヒト細胞株を用いて、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】
少なくとも５μＭの濃度においてメシル酸イマチニブに耐性であることを特徴とするフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株を提供する。好ましい実施形態において、前記染色体はＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子を含み、当該遺伝子産物のＡＴＰ結合部位の点突然変異であって、配列番号２のアミノ酸配列において３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換された点突然変異を有することを特徴とする。本発明の特に好ましい実施形態において、細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒが提供される。
【選択図】
なし【Task】
To establish a stable human cell line that shows resistance to high concentrations of imatinib mesylate. It is another object of the present invention to provide a method for screening a therapeutic agent for human leukemia resistant to imatinib mesylate using such a human cell line.
[Solution]
A Philadelphia chromosome (Ph) -positive human acute lymphocytic leukemia cell line characterized by being resistant to imatinib mesylate at a concentration of at least 5 μM. In a preferred embodiment, the chromosome contains a BCR / ABL gene, and is a point mutation in the ATP binding site of the gene product, wherein the threonine at position 315 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with isoleucine. It is characterized by having. In a particularly preferred embodiment of the invention, a cell line TCC-Y / sr is provided.
[Selection diagram]
None

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィラデルフィア染色体陽性のヒト急性リンパ性白血病細胞から樹立された新規なメシル酸イマチニブ耐性細胞株、及びこの細胞株を用いるメシル酸イマチニブ耐性白血病治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、慢性骨髄性白血病に特徴的ながん細胞の増殖シグナルを遮断する薬剤に強い耐性を示すヒト細胞株が提供されるので、このシグナル伝達阻害剤とこれに対するがん細胞の耐性機構との関連性を明らかにして、新たな白血病治療薬の開発に貢献することができる。
【０００２】
【従来の技術】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者のほとんどには、フィラデルフィア染色体（以下「Ｐｈ」と称する。）と呼ばれる異常染色体が全ての白血病細胞に見出され、この異常染色体上のＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子によって生成されるＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質は非常に高いチロシンキナーゼ活性を示す。慢性骨髄性白血病における細胞の無限増殖は、この異常なＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質の持つ高チロシンキナーゼ活性によって引き起こされると考えられている。
【０００３】
選択的なチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブ（ＳＴＩ５７１、又はグリベック（登録商標））は、Ｐｈ陽性（Ｐｈ＋）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療において極めて有効であることが証明されている（例えば、非特許文献１参照）。メシル酸イマチニブは、ＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域においてＡＴＰの競合阻害剤として作用し、ＢＣＲ／ＡＢＬ発現細胞特異的に増殖を阻害する。しかしながら、慢性骨髄性白血病患者やＰｈ陽性急性リンパ性白血病患者においてはかなりの割合でメシル酸イマチニブに対する耐性が観察される。このメシル酸イマチニブ耐性については、いくつかの機構が考えられている。例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子増幅、及び／又はＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域における点突然変異によって、ＢＣＲ／ＡＢＬチロシンキナーゼが再活性化されることが主な原因ではないかと考えられている。公知のヒト細胞株から作製されたメシル酸イマチニブ耐性株の生育能は２〜３μＭのメシル酸イマチニブに３日間接触させることによって約５０％阻害され、しかも、これらの耐性株の増殖能は、感受性株に比べて約３０％低いことが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。更に、ＣＭＬ患者由来の細胞から得られた、より高濃度のメシル酸イマチニブに対して耐性となった細胞株ではＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子のコピー数増幅と共にＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域における点突然変異が見出されているが、これらの細胞株がメシル酸イマチニブ耐性の点で不安定なことから、メシル酸イマチニブ耐性機構が複数の原因によるのではないかと考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
つまり、高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても高い増殖能を示すと共に、この薬剤耐性を安定して保持するヒト細胞株は未だ得られていない。そこで、メシル酸イマチニブ耐性株に効果のある薬剤を効率よくスクリーニングするためには、当該薬剤に対する耐性が安定し、且つ高い増殖能を有するヒト細胞株の樹立が強く望まれている。
【０００５】
【非特許文献１】
ビー・ジェイ・ドウルカー（Ｂ．Ｊ．Ｄｒｕｋｅｒ）外７名、「ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ）」、２００１年、第３４４巻、ｐ．１０３８−１０４２
【非特許文献２】
フランソワ・ザビエル・マホーン（ＦｒａｎｃｏｉｓＸａｖｉｅｒＭａｈｏｎ）外６名「ブラッド（ＢＬＯＯＤ）」２０００年、第９６巻、ｐ．１０７０−１０７９
【非特許文献３】
クララ・リッチ（ＣｌａｒａＲｉｃｃｉ）外７名「キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」２００２年、第６２巻，ｐ．５９９５−５９９８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、高濃度のメシル酸イマチニブに対する耐性を示し、且つ安定したヒト細胞株を樹立することを目的とする。また、かかるヒト細胞株を用いて、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、種々のヒト白血病細胞、例えば、慢性骨髄性白血病や急性リンパ性白血病患者から分離した細胞の増殖能や生化学的特性を詳細に調べた結果、急性リンパ性白血病患者から分離された一つの細胞株ＴＣＣ−Ｙが株化細胞として安定して継代可能であることを見出した。そして、このＴＣＣ−Ｙ細胞株を、メシル酸イマチニブの存在下、当該薬剤の濃度を徐々に増加させて数ヶ月以上にわたり培養を続けたところ、高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても極めて生存能力が高く、かつ安定して増殖する複数のクローンを見出し、これらのメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株の生物学的な特性を明らかにすることによって本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の第一の視点において、少なくとも５μＭの濃度においてメシル酸イマチニブに耐性であることを特徴とするフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株が提供される。好ましい実施形態において、前記染色体はＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子を含み、当該遺伝子産物のＡＴＰ結合部位の点突然変異であって、配列番号２のアミノ酸配列において３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換された点突然変異を有することを特徴とする。本発明の特に好ましい実施形態において、細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ、及び細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒが提供される。
【０００９】
本発明の他の視点において、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病の治療薬をスクリーニングする方法であって、候補化合物を用意し、前記候補化合物の存在下で上記メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞株を培養し、前記候補化合物が前記細胞株の増殖を阻害するか否かを判定することを特徴とする、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法が提供される。本発明の好ましい１つの実施形態として、前記候補化合物は熱ショック蛋白質を標的にしてこれを阻害する化合物である。従って、本発明の方法により前記細胞株の増殖を阻害することが見出された薬剤はメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病の治療薬として極めて有効であることが示唆される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞株の樹立）
本発明のメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞株は、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞を段階的に濃度を上げたメシル酸イマチニブおよび牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地でＣＯ_２存在下、３７℃で通常の細胞培養と同様に培養を行うことによって得ることができる。
【００１１】
３〜４日間ごとに培養液を交換しながら数ヶ月間細胞培養を行い、増殖してきた細胞を限界希釈法により９６ウェルマイクロプレートでクローニングする。種々の濃度のメシル酸イマチニブを添加して、さらに限界希釈法によりクローニングを行い、得られたクローンについて増殖速度と５０％増殖阻害に必要なメシル酸イマチニブ濃度（ＩＣ_５０）等を測定することによって高濃度のメシル酸イマチニブ存在下において増殖能の優れた細胞株を得ることができる。
【００１２】
ここで、「フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）」とは、慢性骨髄性白血病の９０％以上、急性リンパ性白血病の１５〜３５％程度の症例において認められる、９番染色体と２２番染色体の相互転座によって形成される異常染色体のことをいう。９番染色体の転座切断点にはＡＢＬという名の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１４７５２）が、２２番染色体の転座切断点にはＢＣＲという名の遺伝子が存在し、切断された９番染色体と２２番染色体が結合することによって、この２つの遺伝子が融合し、新たにＢＣＲ／ＡＢＬという融合遺伝子が形成される。このＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子はＢＣＲ遺伝子の切断部位によって大きさの異なる１９０、２１０、又は２３０ｋＤのＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白質をコードしている（Ｍｅｌｏ，Ｊ．Ｖ．Ｂｌｏｏｄ１９９６，８８，２３７５−２３８４）。これらすべての融合蛋白質に共通の性質は、高いチロシンキナーゼ活性であり、インビトロ実験や動物実験で高い造腫瘍能を示す。
【００１３】
このような背景のもと、２１０ｋＤのＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質に対する分子標的治療薬として開発されたメシル酸イマチニブ（コード番号：ＳＴＩ５７１、商品名：グリベック（登録商標））は、多くの慢性骨髄性白血病患者に顕著な効果を示し、さらに抗がん剤が効きにくいＰｈ陽性急性リンパ性白血病でも効果が認められたが、耐性株の出現による再発が問題となっている。これまで、メシル酸イマチニブに対する耐性を示した患者のＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質のＡＴＰ結合部位において、数多くの突然変異（例えば、Ｍ２４４Ｗ，Ｇ２５０Ｅ，Ｑ２５２Ｍ，Ｙ２５３Ｈ，Ｙ２５３Ｆ，Ｅ２５５Ｋ，Ｅ２５５Ｖ，Ｆ３１１Ｌ，Ｔ３１５Ｉ，Ｆ３１７Ｌ，Ｍ３５１Ｔ，Ｅ３５５Ｇ，Ｈ３９６Ｐ及びＦ４８６Ｓ、なお、アミノ酸残基の位置は配列番号２に示したヒトｃ−ＡＢＬ蛋白質のアミノ酸配列に基づく）が報告されているが、最も頻繁に見つかる変異の一つは、配列番号１に示したヒトｃ−ＡＢＬ遺伝子の９４４番目のシトシンがチミンに置換（９４４Ｃ＞Ｔ）されることによって、配列番号２に示したアミノ酸配列の３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換を引き起こす変異（Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ）である。この３１５番目のトレオニン残基は、メシル酸イマチニブの類似化合物とＡＢＬ蛋白質との複合体の立体構造から、ＡＴＰ結合能という点では最も重要なアミノ酸残基であることが知られている（ＳｃｈｉｎｄｌｅｒＴ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９，１９３８−１９４２）。メシル酸イマチニブの類似化合物と複合体を形成したＡＢＬ蛋白質キナーゼドメインの結晶構造解析の結果、３１５番目のトレオニン残基の側鎖に存在する酸素原子がメシル酸イマチニブの第２級アミノ基と水素結合を形成しており、変異型（Ｉｌｅ^３１５）では、この水素結合が消失すると共に、イソロイシン側鎖のメチル基がメシル酸イマチニブとの結合の立体障害になることが推測されている（Ｇｏｒｒｅ，Ｍ．Ｅ．ｅｔａｌ．，ＳｃＩｅｎｃｅ，２００１，２９３，８７６−８８０）。
【００１４】
従って、本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質のアミノ酸残基に突然変異（Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ）を有することによって、メシル酸イマチニブのＡＴＰ結合阻害効果が抑制されるため、極めて高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても生育可能となったものと考えられる。培養液中のメシル酸イマチニブ濃度としては、０〜５０μＭにおいて耐性であるが、好ましくは、３〜２０μＭ、より好ましくは少なくとも約５μＭ、更に好ましくは少なくとも約２０μＭにおいて良好な増殖性を示す。
【００１５】
メシル酸イマチニブに対する耐性機構としては、上記ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質におけるアミノ酸置換のほかにも種々の原因が考えられる。例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の増幅（コピー数の増加）や転写産物の増加、その他、ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質の活性に影響を与えるような細胞内の因子の存在も考えられる。あるいは、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の作用機序に非依存的な細胞内の反応である可能性も存在する。従って、本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、これらの他の原因を併せて有してもよいが、好ましくはこの耐性機構は白血病患者の生体内の条件ときわめて類似のものであり、且つ長時間安定して保持されるものである。従って、特に好ましくは、本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、ＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域においてＴｈｒ３１５Ｉｌｅの点突然変異を有し、且つＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の増幅や転写活性の増加を示さない細胞株である。本発明において、メシル酸イマチニブ耐性の安定性とは、当該薬剤を含まない培地中で長期間培養しても、上記ＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域のＴｈｒ３１５Ｉｌｅ点突然変異が復帰せず、メシル酸イマチニブへの耐性が損なわれないことをいう。
【００１６】
本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、当該薬剤の耐性機構の研究に用いることができるほか、種々の用途が存在するが、例えば、次に述べるヒト白血病治療薬のスクリーニング方法に用いることによって、医薬品開発における極めて高い有用性が示される。
【００１７】
（メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法）
本発明のメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法は、（ａ）候補化合物を用意し、（ｂ）前記候補化合物の存在下で本発明に係るメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ急性白血病細胞を培養し、（ｃ）前記候補化合物が前記細胞の増殖を阻害するか否かを判定することを含む。前記Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞は、本発明に係るメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ急性白血病細胞株に由来する細胞であれば、どのような細胞でも使用し得るが、好ましくは、スクリーニング実験の再現性や細胞培養の操作性を考慮すると試験管内で増殖が容易な株化細胞を用いる。さらに好ましくは、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ又はＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ（ｗｒ：低濃度耐性、ｓｒ：高濃度耐性）である。
【００１８】
前記候補化合物としては、蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられるが、これらに制限されない。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００１９】
前記候補化合物が前記細胞株の増殖を阻害するか否かの判定は、例えば、一定時間培養後に生存細胞数を測定することにより行うことができる。生存細胞数の測定は種々の方法があるが、例えば、トリパンブルー等の染色液の排出機能を測定する。あるいは、細胞内の蛋白質量やミトコンドリアにおける還元酵素の活性測定などにより代替することも可能である。
【００２０】
好ましい実施形態において、前記候補化合物は、ヒト熱ショック蛋白質を不安定化する化合物である。熱ショック蛋白質は細胞や個体が通常の生育温度よりも５〜１０℃高い環境におかれると合成が急激に誘導される一群の蛋白質のことをいう。温度のみならず，特定の化学物質などによっても誘導を受けるためストレス蛋白質とも呼ばれている。ヒトではＨＳＰ９０（分子量約９万）、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０等の低分子量の蛋白質が代表的である。例えば、ＨＳＰ９０は、ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質を初めとする細胞増殖・分化・発生に関与する多くの蛋白質の安定性と機能に影響を与える分子シャペロンであることが知られている（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０００，９５，３４９８−３５０５）。従って、ヒト熱ショック蛋白質、例えばＨＳＰ９０を阻害するような化合物を候補として本発明の方法によりメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞の治療薬をスクリーニングすることが極めて有効である。
【００２１】
例えば、ゲルダマイシン（ｇｅｌｄａｍｙｃｉｎ）は、ＨＳＰ９０蛋白質のアミノ末端部にあるＧＡ結合部位に結合することにより、ＨＳＰ９０蛋白に結合すべきｐ２１０^{ＢＣＲ／ＡＢＬ}やＲａｆ１及び細胞内のチロシンリン酸化蛋白質を不安定化させることが知られている。その他、大環状の抗真菌性抗生物質であるＲａｄｉｃｉｃｏｌやゲルダマイシンの誘導体１７−ａｌｌｙｌａｍｉｎｏｇｅｌｄａｍｙｃｉｎ（１７−ＡＡＧ）も同様な作用を有するＨＳＰ９０阻害剤である。
【００２２】
あるいは、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅの変異を有するＡＢＬ蛋白質のキナーゼドメインの立体構造座標と、三次元分子モデルアルゴリズムとを用いて、インシリコスクリーニング方法により化合物ライブラリーより選択された化合物を候補化合物とすることができる。このインシリコスクリーニング方法は、標的蛋白質と候補化合物の結合を分子動力学計算などのドッキングスタディにより計算し、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異体ＡＢＬ蛋白質のＡＴＰ結合ポケットに結合する可能性の高いリード化合物を提示するものであるが、その精度は未だ確実とはいえない。従って、このような方法によって大量の化合物ライブラリーから１次スクリーニングされた比較的少数の候補化合物を、本発明の細胞株を用いて実際にメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞の増殖を阻害するか否かを検証することは極めて重要である。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、メシル酸イマチニブに耐性となったヒト白血病細胞の増殖を阻害する化合物であり、ヒト白血病の治療薬として用いることができる。特に、メシル酸イマチニブと組み合わせることが効果的な治療を行う上で有用である。この化合物をメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬として用いる場合には、一般に製薬的に許容される担体と混合することによって、医薬組成物を調製することができる。医薬組成物用担体としては、特に制限はなく、例えば，乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルアルコール、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖，酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エアステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース，卵黄、界面活性剤、単シロップ、クエン酸、蒸留水、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等があり、目的とする製剤、例えば、注射薬や錠剤等の形態に応じて、本発明の方法によって同定された化合物と混合して使用される。
【００２４】
【実施例】
本発明は以下の実施例において、より具体的に説明される。実施例は、Ｐｈ陽性急性リンパ性白血病患者の骨髄細胞から樹立されたＴＣＣ−Ｙ細胞株（栃木ガンセンターにて樹立、ＹａｓｕｈｉｋｏＫａｎｏｅｔａｌ．，ＢＬＯＯＤ，２００１，９７，１９９９−２００７参照）を用いて、本発明者らがメシル酸イマチニブ耐性能を獲得した細胞株を樹立し、得られた細胞株の種々の性質を調べたものである。
【００２５】
（実施例１）メシル酸イマチニブ耐性細胞株の樹立
メシル酸イマチニブはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した１０ｍＭ溶液を保存液とし、これを種々の濃度になるように培養液に添加して用いた。培養液中のＤＭＳＯ終濃度は０．１％以下であり、細胞増殖に対する阻害作用はないことを確認した。ＴＣＣ−Ｙ細胞株は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、ＩＣＮ社）と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＩＣＮ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）中で、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養した。この培養条件において、ＴＣＣ−Ｙ細胞の２倍増殖時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）は３１±１．５時間であった。ＴＣＣ−Ｙ細胞は、Ｐ２１０ＢＣＲ／ＡＢＬｍＲＮＡと、Ｐ１９０ＢＣＲ／ＡＢＬｍＲＮＡの両方の発現が確認されている。
【００２６】
ＴＣＣ−Ｙ細胞株を、メシル酸イマチニブの存在下、当該薬剤の濃度を徐々に増加させて（１００ｎＭ〜２００ｎＭ）数ヶ月以上にわたり培養を続けた。ＴＣＣ−Ｙ細胞の増殖を５０％阻害するメシル酸イマチニブ濃度（ＩＣ_５０）は１．３７±０．６μＭであった。ＴＣＣ−Ｙ細胞を長期間メシル酸イマチニブに接触させたところ、１〜５μＭのメシル酸イマチニブ存在下において９０％以上の生存能力を示す細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ（ＩＣ_５０＝５．１±０．９μＭ）が取得できた。このＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞を３μＭのメシル酸イマチニブ中で培養したときの倍加時間は３３±４．５時間であった。更に、このＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞株を種々の濃度のメシル酸イマチニブを添加して培養を行ったところ、更に高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても生育可能な一つのサブクローンＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ（ＩＣ_５０＝２２．１±０．９μＭ）が得られた。このＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞の２０μＭのメシル酸イマチニブ中で培養したときの倍加時間(doubling time)は３４±４時間であった。ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞は２０μＭのメシル酸イマチニブ存在下において、９０〜９８％の生細胞率で４ヶ月以上も増殖を続けた。このＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１４８（寄託日は平成１４年１２月１０日）として寄託され、平成１５年１０月２７日に国際寄託へ移管された（国際寄託についての受託番号はＦＥＲＭＢＰ−０８５３１である）。
【００２７】
（実施例２）ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物のＡＴＰ結合ドメインの塩基配列の決定これまでメシル酸イマチニブ耐性患者のＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物のＡＴＰ結合領域に数多くの突然変異が検出されていることから、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞におけるＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物のＡＴＰ結合領域部分のうちＡＴＰ結合ドメインから活性化ループにわたる９８９塩基対の配列を決定した。アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＡＳ−ＰＣＲ」という）により、ＢＣＲ／ＡＢＬアレル（対立遺伝子）のＡＴＰ結合ドメインを特異的に増幅して塩基配列を決定した。
【００２８】
すなわち、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞から、ＳｅｐｈａｚｏｌＩ（ナカライテスク社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、６塩基のランダムプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を用いて標準的なプロトコルにより、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＢＣＲ／ＡＢＬアレルのＡＢＬキナーゼドメインを増幅するために、正方向のプライマーＢＣＲ−Ｆ２：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣ３’（配列番号３）と、逆方向プライマーＡＴＰ−Ｒ２：５’ ＣＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧ３’（配列番号４）を用いて長距離ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクル条件は、９４℃で１分間処理した後、９４℃、４５秒間の熱変性、６８℃３分間のアニーリング、及び７２℃１０分間の伸長反応を３０サイクル繰り返した。ＡＢＬ遺伝子のコード領域の６５７〜１６２１番目の塩基配列を増幅するために、以下の２つのプライマーセットを用いた。
【００２９】
１）ＡＴＰ−Ｆ１：５’ ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ３’（配列番号５）
ＡＴＰ−Ｒ１：５’ ＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ３’（配列番号６）
２）ＡＴＰ−Ｆ２：５’ ＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧ３’（配列番号７）
ＡＴＰ−Ｒ２：５’ ＣＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧ３’（配列番号４）
【００３０】
ＰＣＲの条件は、Ｇｏｒｒｅ，ＭＥｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００１；２９３：８７６−８８０に記載された方法に従って行った。増幅したＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いて精製し、自動シーケンサ（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０、ＰＥアプライドバイオシステム社）により両方の鎖の塩基配列を決定した。
【００３１】
その結果、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞においては、９４４番目の塩基であるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に一塩基置換することにより、３１５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置き換わっていることが分かった（図１参照）。ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞には塩基の変異は検出されなかった。
【００３２】
（実施例３）蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子コピー数の検査
ＬＳＩｂｃｌ／ａｂｌエクストラシグナル（ＥＳ）二重染色転座プローブ（Ｖｙｓｉｓ社）を用いて、実施例１で得られた２種類のメシル酸イマチニブ耐性細胞株細胞（ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞とＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞）とＴＣＣ−Ｙ細胞から得られた分裂中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）細胞の蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。当該プローブを製造業者のプロトコルに従ってｍｅｔａｐｈａｓｅ細胞にハイブリダイズさせた。得られたｍｅｔａｐｈａｓｅ細胞及び間期細胞画像をマックタイプｖｅｒ．５．５．３ソフトウエアで解析した。その結果、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞から得たｍｅｔａｐｈａｓｅ細胞及び間期細胞において、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子シグナルの数及び大きさには差がなく、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子のコピー数はこれら３種類の細胞株で変化しないことが分かった。従って、メシル酸イマチニブに対する耐性はＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の増幅やＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白質の発現量が増加したためではないことが分かった。
【００３３】
（実施例４）定量的ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量の検出
ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株においてＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の増幅が認められなかったことから、次に、当該遺伝子のｍＲＮＡ量を定量的ＰＣＲによって調べた。７７００塩基配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、Ｔａｑｍａｎ法（アプライドバイオシステムズ社）によりＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡ量の測定を行った。ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡ検出のための主要なプライマー及びプローブは、それぞれ以下のとおりである。
【００３４】
ＢＣＲ−Ｆ：５’ ＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＧ３’（配列番号８）
ＡＢＬ−Ｒ：５’ ＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＧＣ３’（配列番号９）
ＡＢＬ−Ｐ：５’ ＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴ３’（配列番号１０）
【００３５】
一方、対照としたＧＡＰ遺伝子ｍＲＮＡ量測定のためのプライマー及び検出用プローブは、それぞれ以下のとおりである。
【００３６】
ＧＡＰ−Ｆ：５’ ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ３’（配列番号１１）
ＧＡＰ−Ｒ：５’ ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ３’（配列番号１２）
ＧＡＰ−Ｐ：５’ ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ３’（配列番号１３）
【００３７】
その結果、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞におけるＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡ量とＧＡＰ遺伝子ｍＲＮＡ量の比は、それぞれ０．１３３０、０．１６０３、及び０．０８７０であった。ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡ量は、親株であるＴＣＣ−Ｙ細胞に対して、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞では若干増加していたが、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞では逆に少し減少していた。
【００３８】
（実施例５）ウエスタンブロット法による蛋白質量の検査
実施例１で得られた２種類のメシル酸イマチニブ耐性細胞株細胞（ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞とＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞）とＴＣＣ−Ｙ細胞をそれぞれ２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１ｍＭＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）、２０Ｕ／ｍｌアプロチニン、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１００ｍＭＮａＦ、２ｍＭＮａ_３ＶＯ_４、及び０．０５％ＳＤＳを含む溶解バッファー中で溶解後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、細胞内のＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質及びアクチン蛋白質をそれぞれモノクローナル抗体Ａｂ−３（オンコジェン社製）又はウサギ抗アクチン抗血清を用いて検出し、ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス又は抗ウサギＩｇＧを２次抗体として用いて可視化した。その結果、ＴＣＣ−Ｙ細胞と比較して、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞中のＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白質の発現量は同等であった。
【００３９】
（実施例６）ＭＤＲ１遺伝子の発現
Ｐ−糖蛋白質（ＰＧＰ）をコードするＭＤＲ１遺伝子の発現がガン細胞における薬剤耐性機構の一つとして知られている。このＰＧＰは細胞膜を介して薬剤を細胞外に排出するトランスポーター蛋白質である。そこで、フローサイトメトリーにより、メシル酸イマチニブ感受性及び耐性細胞の細胞膜にＰＧＰが発現しているかどうか測定した。
【００４０】
それぞれの細胞株におけるＭＤＲ１遺伝子の発現を検出するためにＦＩＴＣ融合ネズミ抗ヒトＧＰＧモノクローナル抗体を用いた。それぞれの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、２ｘ１０^６個の細胞を１％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ５０μｌに懸濁した。この細胞を５０μｌの抗ＭＤＲ１で染色後、暗所で４℃、３０分間インキュベートした。１％ＦＢＳを含むＰＢＳ１ｍｌで細胞を２回洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。このようにして染色した細胞はＦＡＣＳスキャンによりＣｅｌｌＲｅｑｕｅｓｔソフトウエアを用いて解析した。
【００４１】
その結果、メシル酸イマチニブ感受性のＴＣＣ−Ｙ細胞に比べて、耐性株であるＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒの何れの細胞にも大きな違いは無かった。
【００４２】
（実施例７）Ｒａｄｉｃｉｃｏｌによる細胞増殖阻害
Ｒａｄｉｃｉｃｏｌはシグマ−アルドリッチ社から購入した。これをジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０ｍＭ溶液として保存した。ＴＣＣ−Ｙ、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞を、それぞれ種々の濃度のＲａｄｉｃｉｃｏｌと共に１．５〜２ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度で３ｍｌプレートで培養した。細胞数と生細胞率は、トリパンブルー染色液の排出能により、Ｒａｄｉｃｉｃｏｌの添加後２４時間ごとに測定した。培養開始後、２４，４８及び７２時間後のＴＣＣ−Ｙ、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株の細胞数と生細胞率を図２（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示した。図２に示された結果より、Ｒａｄｉｃｉｃｏｌによる細胞増殖阻害効果は、上記３種類の細胞株において有意差はないことが分かった。これらの結果をまとめると以下の表１のようになる。
【００４３】
【表１】

【００４４】
表１に表示した濃度は３回の実験の結果得られたＩＣ_５０の平均値と標準偏差を表す。この結果より、全ての細胞はＲａｄｉｃｉｃｏｌに対して感受性であり、メシル酸イマチニブ感受性細胞株と耐性細胞株とで差は認められなかった。
【００４５】
（実施例８）メシル酸イマチニブ耐性株の安定性
実施例１で得られたＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株の安定性を調べるために、メシル酸イマチニブを含まず、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、ＩＣＮ社）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＩＣＮ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社）で１ヶ月半継代培養し、２６継代めで一部の細胞をサンプリングした。この細胞から、実施例４と同様の方法によりＢＣＲ／ＡＢＬアレルのＡＴＰ結合ドメインを特異的に増幅して塩基配列を決定した。その結果、ＡＢＬの３１５番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＴ（イソロイシン）のままであり、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株において検出された一塩基置換変異が保存されていることが分かった。また、この細胞を用いて、メシル酸イマチニブに対する耐性濃度を測定したところ、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞の保存株との間で差は認められなかった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても安定して増殖することができる。したがって、これらの細胞株は、メシル酸イマチニブの耐性機構の解明やＳＴＩ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニングを行うために極めて有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株で見出されたＡＢＬ遺伝子のＡＴＰ結合部位における点突然変異（ＡＴＣ→ＡＴＴつまり、Ｔｈｒ→Ｉｌｅ）を示した図である。
【図２】種々の濃度のＲａｄｉｃｉｃｏｌ存在下における（ａ）ＴＣＣ−Ｙ、（ｂ）ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及び（ｃ）ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞の増殖曲線を示したグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel imatinib mesylate-resistant cell line established from Philadelphia chromosome-positive human acute lymphoblastic leukemia cells, and a method for screening a therapeutic drug for imatinib mesylate-resistant leukemia using this cell line. According to the present invention, a human cell line showing strong resistance to an agent that blocks a proliferation signal of a cancer cell characteristic of chronic myeloid leukemia is provided. By clarifying the relationship with the resistance mechanism, it can contribute to the development of new therapeutic agents for leukemia.
[0002]
[Prior art]
In most patients with chronic myeloid leukemia (CML), an abnormal chromosome called the Philadelphia chromosome (hereinafter “Ph”) is found in all leukemia cells and is produced by the BCR / ABL gene on this abnormal chromosome. The resulting BCR / ABL protein shows very high tyrosine kinase activity. It is believed that the infinite proliferation of cells in chronic myeloid leukemia is caused by the high tyrosine kinase activity of this abnormal BCR / ABL protein.
[0003]
Imatinib mesylate (STI571, or Gleevec®), a selective tyrosine kinase inhibitor, is extremely effective in the treatment of Ph-positive (Ph +) chronic myeloid leukemia (CML) and acute lymphocytic leukemia (ALL) It has been proved that this is the case (for example, see Non-Patent Document 1). Imatinib mesylate acts as a competitive inhibitor of ATP in the ATP-binding region of the ABL protein, and inhibits proliferation specifically in BCR / ABL-expressing cells. However, a significant proportion of patients with chronic myeloid leukemia and Ph-positive acute lymphocytic leukemia exhibit resistance to imatinib mesylate. Several mechanisms have been considered for this imatinib mesylate resistance. For example, it is thought that the main cause is that BCR / ABL tyrosine kinase is reactivated by BCR / ABL gene amplification and / or point mutation in ATP binding region of ABL protein. The growth ability of imatinib mesylate-resistant strains prepared from known human cell lines is inhibited by about 50% by exposure to 2-3 μM imatinib mesylate for 3 days, and the growth ability of these resistant strains is sensitive. It is reported that it is about 30% lower than that of the strain (for example, see Non-Patent Document 2). Furthermore, a point mutation in the ATP binding region of the ABL protein was found along with the BCR / ABL gene copy number amplification in a cell line obtained from CML patient-derived cells that became resistant to higher concentrations of imatinib mesylate. However, since these cell lines are unstable in terms of imatinib mesylate resistance, it is thought that the imatinib mesylate resistance mechanism may be due to multiple causes (for example, see Non-Patent Document 3). .
[0004]
That is, a human cell line that shows high proliferation ability even in the presence of high concentration of imatinib mesylate and stably retains this drug resistance has not yet been obtained. Therefore, in order to efficiently screen a drug that is effective against an imatinib mesylate-resistant strain, it is strongly desired to establish a human cell line that has stable resistance to the drug and high proliferative ability.
[0005]
[Non-patent document 1]
"B New York Journal of Medicine" (N Engl J Med), 2001, Vol. 344, p. 1038-1042
[Non-patent document 2]
Francois Xavier Mahon, 6 others, "Blood" 2000, Vol. 96, p. 1070-1079
[Non-Patent Document 3]
Clara Ricci, 7 others, "Cancer Research", 2002, Vol. 62, p. 5959-5998
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made to solve such a problem, and an object of the present invention is to establish a stable human cell line which shows resistance to a high concentration of imatinib mesylate. It is another object of the present invention to provide a method for screening a therapeutic drug for human leukemia resistant to imatinib mesylate using such a human cell line.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have investigated the proliferative ability and biochemical characteristics of various human leukemia cells, for example, cells isolated from chronic myeloid leukemia and acute lymphocytic leukemia patients, and found that the cells were isolated from acute lymphocytic leukemia patients. One cell line TCC-Y was found to be able to be stably subcultured as a cell line. When the TCC-Y cell line was cultured for several months or more with the concentration of the drug gradually increased in the presence of imatinib mesylate, the viability was extremely high even in the presence of high concentration of imatinib mesylate. The present invention was completed by finding a plurality of clones having high and stable growth and clarifying the biological characteristics of these imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell lines.
[0008]
That is, in a first aspect of the present invention, there is provided a Philadelphia chromosome (Ph) -positive human acute lymphoblastic leukemia cell line that is resistant to imatinib mesylate at a concentration of at least 5 μM. In a preferred embodiment, the chromosome contains a BCR / ABL gene, and is a point mutation in the ATP binding site of the gene product, wherein the threonine at position 315 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with isoleucine. It is characterized by having. In particularly preferred embodiments of the invention, a cell line TCC-Y / sr and a cell line TCC-Y / wr are provided.
[0009]
In another aspect of the present invention, there is provided a method for screening a therapeutic agent for imatinib mesylate-resistant human leukemia, comprising preparing a candidate compound, and culturing the imatinib mesylate-resistant human leukemia cell line in the presence of the candidate compound. A method for screening a therapeutic agent for human leukemia resistant to imatinib mesylate, which comprises determining whether the candidate compound inhibits the growth of the cell line. In a preferred embodiment of the present invention, the candidate compound is a compound that targets and inhibits a heat shock protein. Therefore, it is suggested that an agent found to inhibit the growth of the cell line by the method of the present invention is extremely effective as a therapeutic agent for imatinib mesylate-resistant human leukemia.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(Establishment of imatinib mesylate-resistant human leukemia cell line)
The imatinib mesylate-resistant human leukemia cell line of the present invention can be obtained by using CO2 in RPMI1640 medium containing imatinib mesylate and a fetal bovine serum (FBS) in which Philadelphia chromosome (Ph) -positive human acute lymphoblastic leukemia cells are gradually increased in concentration. ₂ It can be obtained by culturing in the presence at 37 ° C. in the same manner as ordinary cell culture.
[0011]
The cells are cultured for several months while changing the culture medium every 3 to 4 days, and the cells that have grown are cloned by a limiting dilution method in a 96-well microplate. Various concentrations of imatinib mesylate were added, followed by cloning by the limiting dilution method. The resulting clones had a growth rate and a concentration of imatinib mesylate required for 50% growth inhibition (IC ₅₀ ) Can be used to obtain a cell line with excellent growth ability in the presence of high concentration of imatinib mesylate.
[0012]
Here, the “Philadelphia chromosome (Ph)” is a reciprocal translocation between chromosome 9 and chromosome 22, which is observed in about 90% or more cases of chronic myeloid leukemia and about 15 to 35% of acute lymphocytic leukemia. An abnormal chromosome formed by A gene named ABL (GenBank Acc. No. M14752) is present at the translocation breakpoint of chromosome 9, and a gene named BCR is present at the translocation breakpoint of chromosome 22. And chromosome 22 are linked, and the two genes are fused to form a new fusion gene called BCR / ABL. This BCR / ABL gene encodes a 190, 210, or 230 kD BCR / ABL fusion protein that differs in size depending on the cleavage site of the BCR gene (Melo, JV Blood 1996, 88, 2375-2384). A common property of all these fusion proteins is high tyrosine kinase activity, which shows high tumorigenicity in in vitro experiments and animal experiments.
[0013]
Against this background, imatinib mesylate (code number: STI571, trade name: Gleevec (registered trademark)), which has been developed as a molecular target therapeutic for the 210 kD BCR / ABL protein, is used in many chronic myeloid leukemia patients. The effect was also observed in Ph-positive acute lymphocytic leukemia, in which anticancer drugs are difficult to work, but recurrence due to the emergence of resistant strains is a problem. A number of mutations (eg, M244W, G250E, Q252M, Y253H, Y253F, E255K, E255V, F311L, T315I, F317L, etc.) in the ATP binding site of the BCR / ABL protein of patients who have shown resistance to imatinib mesylate. M351T, E355G, H396P and F486S, where the positions of the amino acid residues are based on the amino acid sequence of the human c-ABL protein shown in SEQ ID NO: 2), but one of the most frequently found mutations is Mutation in which threonine at position 315 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with isoleucine by replacing cytosine at position 944 of the human c-ABL gene represented by SEQ ID NO: 1 with thymine (944C> T) (Thr315Ile). This 315 th threonine residue is known to be the most important amino acid residue in terms of ATP binding ability from the three-dimensional structure of a complex of an imatinib mesylate analog and an ABL protein (Schindler T). Et al., Science, 2000, 289, 1938-1942). Crystal structure analysis of the ABL protein kinase domain complexed with a similar compound of imatinib mesylate revealed that the oxygen atom present in the side chain of threonine residue at position 315 was hydrogen bonded to the secondary amino group of imatinib mesylate. And the mutant (Ile) ³¹⁵ ), It is speculated that this hydrogen bond disappears and that the methyl group of the isoleucine side chain becomes a steric hindrance to the bond with imatinib mesylate (Gorre, ME et al., ScIence, 2001). 293, 876-880).
[0014]
Therefore, the imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphocytic leukemia cell line of the present invention has a mutation (Thr315Ile) in an amino acid residue of the BCR / ABL protein, whereby the ATP binding inhibitory effect of imatinib mesylate is suppressed. Therefore, it is considered that growth was possible even in the presence of extremely high concentration of imatinib mesylate. The concentration of imatinib mesylate in the culture solution is resistant at 0 to 50 μM, but preferably shows good proliferation at 3 to 20 μM, more preferably at least about 5 μM, and still more preferably at least about 20 μM.
[0015]
As a mechanism of resistance to imatinib mesylate, various causes can be considered in addition to the amino acid substitution in the BCR / ABL protein. For example, BCR / ABL gene amplification (increase in copy number), increase in transcripts, and the presence of other intracellular factors that affect BCR / ABL protein activity are also conceivable. Alternatively, there is a possibility that the intracellular reaction is independent of the mechanism of action of the BCR / ABL gene. Therefore, the imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell line of the present invention may have these other causes in combination, but preferably, this resistance mechanism is extremely compatible with in vivo conditions of leukemia patients. They are similar and are stably held for a long time. Therefore, it is particularly preferable that the imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell line of the present invention has a Thr315Ile point mutation in the ATP-binding region of the ABL protein, and that the BCR / ABL fusion gene be amplified or transcribed. Cell line that does not show an increase in In the present invention, the stability of imatinib mesylate resistance means that even when cultured in a medium not containing the drug for a long time, the Thr315Ile point mutation in the ATP-binding region of the ABL protein is not restored, and It means that resistance is not impaired.
[0016]
The imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell line of the present invention can be used for studying the resistance mechanism of the drug, and has various uses. Use in screening methods shows extremely high utility in drug development.
[0017]
(Screening method of therapeutic agent for imatinib mesylate-resistant human leukemia)
The method for screening a therapeutic agent for imatinib mesylate-resistant human leukemia of the present invention comprises the steps of (a) preparing a candidate compound, and (b) preparing imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia of the present invention in the presence of the candidate compound. Culturing the cells and (c) determining whether the candidate compound inhibits proliferation of the cells. The Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell may be any cell as long as it is derived from the imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic acute leukemia cell line according to the present invention. Considering the reproducibility of the experiment and the operability of cell culture, a cell line that can be easily grown in a test tube is used. More preferably, it is TCC-Y / wr or TCC-Y / sr (wr: low concentration tolerance, sr: high concentration tolerance).
[0018]
The candidate compounds include, but are not limited to, proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
[0019]
The determination as to whether or not the candidate compound inhibits the growth of the cell line can be made, for example, by measuring the number of viable cells after culturing for a certain period of time. There are various methods for measuring the number of viable cells. For example, the function of discharging a stain such as trypan blue is measured. Alternatively, it can be replaced by measuring the amount of protein in cells or the activity of reductase in mitochondria.
[0020]
In a preferred embodiment, the candidate compound is a compound that destabilizes human heat shock protein. Heat shock proteins refer to a group of proteins whose synthesis is rapidly induced when cells or individuals are placed in an environment 5 to 10 ° C. higher than normal growth temperature. Because it is induced by not only temperature but also specific chemical substances, it is also called stress protein. In humans, low molecular weight proteins such as HSP90 (molecular weight: about 90,000), HSP70 and HSP60 are typical. For example, HSP90 is known to be a molecular chaperone that affects the stability and function of many proteins involved in cell growth, differentiation and development, including the BCR / ABL protein (Weisberg, E., et al.). et al., Blood, 2000, 95, 3498-3505). Therefore, it is extremely effective to screen a therapeutic agent for imatinib mesylate-resistant human leukemia cells by the method of the present invention using a compound that inhibits human heat shock protein, for example, HSP90 as a candidate.
[0021]
For example, geldamycin binds to the GA-binding site at the amino terminus of the HSP90 protein, thereby binding p210 to the HSP90 protein. ^{BCR / ABL} And destabilize Raf1 and intracellular tyrosine phosphorylated proteins. In addition, Radicicol, a macrocyclic antifungal antibiotic, and a derivative of geldamycin 17-allylaminogeldamycin (17-AAG) are also HSP90 inhibitors having the same action.
[0022]
Alternatively, a compound selected from a compound library by an in silico screening method using the three-dimensional structure coordinates of the kinase domain of the ABL protein having a mutation of Thr315Ile and a three-dimensional molecular model algorithm can be used as a candidate compound. This in silico screening method calculates the binding between a target protein and a candidate compound by a docking study such as molecular dynamics calculation, and presents a lead compound having a high possibility of binding to the ATP binding pocket of the Thr315Ile mutant ABL protein. However, its accuracy is not yet certain. Therefore, a relatively small number of candidate compounds, which were primarily screened from a large library of compounds by such a method, were used to determine whether the cell lines of the present invention would actually inhibit the growth of imatinib mesylate-resistant human leukemia cells. It is extremely important to verify that
[0023]
The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound that inhibits the growth of human leukemia cells that have become resistant to imatinib mesylate, and can be used as a therapeutic agent for human leukemia. In particular, combination with imatinib mesylate is useful for effective treatment. When this compound is used as a therapeutic agent for imatinib mesylate-resistant human leukemia, a pharmaceutical composition can be prepared by mixing the compound with a pharmaceutically acceptable carrier. The carrier for the pharmaceutical composition is not particularly limited. For example, lactose, glucose, D-mannose, starch, crystalline cellulose, calcium carbonate, kaolin, gelatin, hydroxypropyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, ethanol, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose Salt, magnesium stearate, talc, acetylcellulose, sucrose, titanium oxide, benzoic acid, paraoxybenzoic acid air ester, sodium dehydroacetate, gum arabic, tragacanth, methylcellulose, egg yolk, surfactant, single syrup, citric acid, distilled water, Glycerin, propylene glycol, macrogol, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sodium phosphate, sodium chloride, etc. Depending on the form of and tablets such as are used in admixture with the compounds identified by the methods of the present invention.
[0024]
【Example】
The present invention will be more specifically described in the following examples. In Examples, a TCC-Y cell line established from bone marrow cells of a Ph-positive acute lymphoblastic leukemia patient (established at Tochigi Cancer Center, see Yasukiko Kano et al., BLOOD, 2001, 97, 1999-2007). Thus, the present inventors have established a cell line that has acquired the resistance to imatinib mesylate, and examined various properties of the obtained cell line.
[0025]
(Example 1) Establishment of imatinib mesylate-resistant cell line
Imatinib mesylate was used as a stock solution of a 10 mM solution dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), which was added to a culture solution to have various concentrations. The final concentration of DMSO in the culture solution was 0.1% or less, and it was confirmed that there was no inhibitory effect on cell proliferation. The TCC-Y cell line was prepared in an RPMI1640 medium (Sigma) containing 10% fetal bovine serum (FBS, ICN), 100 U / ml penicillin, and 0.1 mg / ml streptomycin (ICN). 5% CO ₂ The cells were cultured at 37 ° C in the presence. Under these culture conditions, the doubling time of the TCC-Y cells was 31 ± 1.5 hours. In TCC-Y cells, expression of both P210BCR / ABL mRNA and P190BCR / ABL mRNA has been confirmed.
[0026]
The TCC-Y cell line was cultured in the presence of imatinib mesylate for several months with increasing concentrations of the drug (100 nM-200 nM). Imatinib mesylate concentration that inhibits the growth of TCC-Y cells by 50% (IC ₅₀ ) Was 1.37 ± 0.6 μM. When TCC-Y cells were exposed to imatinib mesylate for a long time, a cell line TCC-Y / wr (ICC) showing 90% or more viability in the presence of 1-5 μM imatinib mesylate ₅₀ = 5.1 ± 0.9 μM). The doubling time when the TCC-Y / wr cells were cultured in 3 μM imatinib mesylate was 33 ± 4.5 hours. Furthermore, when this TCC-Y / wr cell line was cultured by adding various concentrations of imatinib mesylate, one subclone TCC-Y / w was able to grow in the presence of even higher concentrations of imatinib mesylate. sr (IC ₅₀ = 22.1 ± 0.9 μM). The doubling time when the TCC-Y / sr cells were cultured in 20 μM imatinib mesylate was 34 ± 4 hours. TCC-Y / sr cells continued to grow for more than 4 months at a viable cell rate of 90-98% in the presence of 20 μM imatinib mesylate. The TCC-Y / sr cells were deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, the Patent Organism Depositary (No. 1-1, Higashi 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture 305-8566, Japan) under the accession number FERM P-19148 (Deposit Date). Was deposited on December 10, 2002). Was transferred to the International Deposit on October 27, 2003 (the deposit number for the International Deposit is FERM BP-08531) .
[0027]
(Example 2) Determination of base sequence of ATP-binding domain of BCR / ABL gene product Since a large number of mutations have been detected in the ATP-binding region of BCR / ABL gene product of imatinib mesylate-resistant patients so far, TCC The sequence of 989 base pairs ranging from the ATP binding domain to the activation loop in the ATP binding domain portion of the BCR / ABL gene product in -Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cells was determined. The ATP-binding domain of the BCR / ABL allele (allele) was specifically amplified by the allele-specific polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as “AS-PCR”) to determine the nucleotide sequence.
[0028]
That is, total RNA was extracted from TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cells using Sephazol I (Nacalai Tesque). 1 μg of total RNA was subjected to RT-PCR according to a standard protocol using a random primer of 6 bases and Super Script II-Reverse Transcriptase (manufactured by GIBCO BRL). In order to amplify the ABL kinase domain of the BCR / ABL allele, the forward primer BCR-F2: 5 'CAGTGCCATAGAGGCACC 3' (SEQ ID NO: 3) and the reverse primer ATP-R2: 5 'CAGGCACGTCAGTGGTGTCTCTTGTG 3' (SEQ ID NO: 4) ) Was used to perform long distance PCR. The PCR cycle conditions were as follows: after treating at 94 ° C for 1 minute, heat denaturation at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 68 ° C for 3 minutes, and extension reaction at 72 ° C for 10 minutes were repeated 30 cycles. The following two primer sets were used to amplify the nucleotide sequence at positions 657 to 1621 in the coding region of the ABL gene.
[0029]
1) ATP-F1: 5 ′ GCGCAACAAGCCCACTGTCTATGG 3 ′ (SEQ ID NO: 5)
ATP-R1: 5 ′ CCAGGCTCTCGGGTGCAGTCC 3 ′ (SEQ ID NO: 6)
2) ATP-F2: 5 'GGACTGCACCCGAGAGCCTGG 3' (SEQ ID NO: 7)
ATP-R2: 5 'CAGGCACGTCAGGTGGTGTCTCTGTG 3' (SEQ ID NO: 4)
[0030]
PCR conditions are described in Gorre, ME et al. , Science 2001; 293: 876-880. The amplified DNA fragment was purified using a QIAquick gel extraction kit (Qiagen), and the base sequences of both strands were determined by an automatic sequencer (ABI PRISM310, PE Applied Biosystems).
[0031]
As a result, in the TCC-Y / sr cells, cytosine (C), which is the 944th base, is replaced with thymine (T), whereby the 315th threonine (Thr) is replaced with isoleucine (Ile). (See FIG. 1). No base mutation was detected in the TCC-Y / wr cells.
[0032]
(Example 3) Inspection of BCR / ABL gene copy number by fluorescence in situ hybridization (FISH)
Using the LSI bcl / abl extra signal (ES) double staining translocation probe (Vysis), the two types of imatinib mesylate-resistant cell line cells obtained in Example 1 (TCC-Y / wr cells and TCC- Y / sr cells) and metaphase cells obtained from TCC-Y cells were subjected to fluorescence in situ hybridization (FISH). The probe was hybridized to metaphase cells according to the manufacturer's protocol. The obtained images of metaphase cells and interphase cells were converted to Mac type ver. Analysis was performed using 5.5.3 software. As a result, there was no difference in the number and magnitude of BCR / ABL gene signals between metaphase cells and interphase cells obtained from TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cells. The gene copy number was found to be unchanged in these three cell lines. Therefore, it was found that the resistance to imatinib mesylate was not due to an increase in the BCR / ABL gene amplification or the expression level of the BCR / ABL fusion protein.
[0033]
(Example 4) Detection of mRNA amount by quantitative PCR method
Since no amplification of the BCR / ABL gene was observed in the TCC-Y / wr and TCC-Y / sr cell lines, the mRNA level of the gene was next examined by quantitative PCR. Using a 7700 base sequence detection system (Applied Biosystems), the amount of BCR / ABL gene mRNA was measured by the Taqman method (Applied Biosystems). The main primers and probes for BCR / ABL gene mRNA detection are as follows, respectively.
[0034]
BCR-F: 5 ′ GATGCTGACCAACTCGTGTGTG 3 ′ (SEQ ID NO: 8)
ABL-R: 5 'TGGCCACAAAAATCATACAGTGC 3' (SEQ ID NO: 9)
ABL-P: 5 'CCTCAGGCGGCCAGTAGCATCTGACTTT 3' (SEQ ID NO: 10)
[0035]
On the other hand, primers and detection probes for measuring the amount of GAP gene mRNA as controls were as follows.
[0036]
GAP-F: 5 ′ GAAGGTGAAGGTCGGGAGTC 3 ′ (SEQ ID NO: 11)
GAP-R: 5 'GAAGATGGTGATGGGGATTTC 3' (SEQ ID NO: 12)
GAP-P: 5 'CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 3' (SEQ ID NO: 13)
[0037]
As a result, the ratios of BCR / ABL gene mRNA amount and GAP gene mRNA amount in TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cells were 0.1330, 0.1603, and 0.0870, respectively. there were. The amount of BCR / ABL gene mRNA was slightly increased in TCC-Y / wr cells compared to parent TCC-Y cells, but slightly decreased in TCC-Y / sr cells.
[0038]
(Example 5) Inspection of protein content by Western blotting
The two types of imatinib mesylate-resistant cell line cells (TCC-Y / wr cell and TCC-Y / sr cell) and TCC-Y cell obtained in Example 1 were respectively subjected to 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, % Glycerin, 1% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 20 U / ml aprotinin, 10 mM EDTA, 10 μg / ml leupeptin, 100 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO ₄ After lysis in a lysis buffer containing 0.05% SDS and SDS-PAGE, the intracellular BCR / ABL protein and actin protein were isolated by monoclonal antibody Ab-3 (manufactured by Oncogen) or rabbit anti-actin antiserum, respectively. And visualized using horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse or anti-rabbit IgG as a secondary antibody. As a result, the expression levels of the BCR / ABL fusion protein in the TCC-Y / wr and TCC-Y / sr cells were equivalent to those in the TCC-Y cells.
[0039]
(Example 6) Expression of MDR1 gene
Expression of the MDR1 gene encoding P-glycoprotein (PGP) is known as one of drug resistance mechanisms in cancer cells. This PGP is a transporter protein that excretes drugs out of cells via cell membranes. Therefore, it was determined by flow cytometry whether PGP was expressed in the cell membrane of imatinib mesilate sensitive and resistant cells.
[0040]
A FITC-fused murine anti-human GPG monoclonal antibody was used to detect expression of the MDR1 gene in each cell line. After washing each cell three times with PBS, 2 × 10 ⁶ Individual cells were suspended in 50 μl of PBS containing 1% fetal bovine serum (FBS). The cells were stained with 50 μl of anti-MDR1, and then incubated at 4 ° C. for 30 minutes in the dark. The cells were washed twice with 1 ml of PBS containing 1% FBS, and then resuspended in 1 ml of PBS. Cells stained in this manner were analyzed by FACS scan using Cell Request software.
[0041]
As a result, there was no significant difference between the TCC-Y / wr and TCC-Y / sr cells, which are resistant strains, as compared to imatinib mesylate-sensitive TCC-Y cells.
[0042]
Example 7 Cell Growth Inhibition by Radicicol
Radicicol was purchased from Sigma-Aldrich. This was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and stored as a 10 mM solution. TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cells were plated with 1.5 to 2 x 10 cells with various concentrations of Radidicol, respectively. ⁵ Cultured in 3 ml plates at a concentration of cells / ml. The number of cells and the viable cell rate were measured every 24 hours after the addition of Radidicol by the ability to discharge trypan blue stain. The cell numbers and viable cell rates of the TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cell lines at 24, 48, and 72 hours after the start of culture are shown in FIGS. 2 (a) to 2 (c), respectively. Was. From the results shown in FIG. 2, it was found that the cell growth inhibitory effect of Radicicol did not differ significantly between the above three types of cell lines. The results are summarized in Table 1 below.
[0043]
[Table 1]

[0044]
The concentrations shown in Table 1 are the ICs obtained as a result of three experiments. ₅₀ Mean and standard deviation. From these results, all cells were sensitive to Radicicol, and no difference was observed between imatinib mesylate-sensitive cell lines and resistant cell lines.
[0045]
(Example 8) Stability of imatinib mesylate resistant strain
To examine the stability of the TCC-Y / sr cell line obtained in Example 1, 10% fetal calf serum (FBS, ICN), 100 U / ml penicillin and 0.1 mg without imatinib mesylate The cells were subcultured for one and a half months in RPMI1640 medium (Sigma) containing 1 / ml streptomycin (ICN), and some cells were sampled at the 26th passage. From these cells, the ATP-binding domain of the BCR / ABL allele was specifically amplified in the same manner as in Example 4 to determine the nucleotide sequence. As a result, it was found that the codon corresponding to the 315rd amino acid of ABL remained ATT (isoleucine), and the single nucleotide substitution mutation detected in the TCC-Y / sr cell line was conserved. In addition, when the resistance concentration to imatinib mesylate was measured using these cells, no difference was observed between the cells and the preserved TCC-Y / sr cells.
[0046]
【The invention's effect】
The imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell line of the present invention can stably grow even in the presence of high concentration of imatinib mesylate. Therefore, these cell lines are extremely useful for elucidating the resistance mechanism of imatinib mesylate and for screening therapeutic agents for STI-resistant human leukemia.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a point mutation (ATC → ATT, ie, Thr → Ile) in the ATP binding site of the ABL gene found in the TCC-Y / sr cell line.
FIG. 2 is a graph showing the growth curves of (a) TCC-Y, (b) TCC-Y / wr, and (c) TCC-Y / sr cells in the presence of various concentrations of Radidicol.

Claims

A Philadelphia chromosome (Ph) positive human acute lymphoblastic leukemia cell line TCC-Y / sr (FERM BP-08531) that is resistant to imatinib mesylate at a concentration of at least 5 μM.

Prepare candidate compounds,
Culturing the cell line of claim 1 in the presence of the candidate compound,
A method for screening a drug for treating imatinib mesylate-resistant human leukemia, comprising determining whether the candidate compound inhibits the proliferation of the cell.

The method according to claim 2 , wherein the candidate compound is a compound that inhibits a heat shock protein.