JP3535525B2

JP3535525B2 - 花器特異的遺伝子およびそのプロモーター配列

Info

Publication number: JP3535525B2
Application number: JP52650698A
Authority: JP
Inventors: 由光高倉; 剛井上; 秀章斎藤; 徹伊藤
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-26
Publication date: 2004-06-07
Anticipated expiration: 2017-12-26
Also published as: EP0913469A1; DE69738804D1; ATE399858T1; EP0913469B1; US6462185B1; WO1998029542A1; CN1154723C; KR19990087254A; EP0913469A4; CN1217021A; US20030106106A1; AU7891498A; AU739796B2; KR100557306B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の属する技術分野本発明は、単子葉植物の花器において特異的な発現を
示す性質を有する遺伝子およびそのプロモーター配列に
関するものである。本発明はまた、病原菌に対する防御
機構として機能するキチナーゼ、キチナーゼ遺伝子に関
するものである。

従来の技術従来、花器で特異的に発現する遺伝子として、葯特異
的なもの、雌蕊特異的なもの等いくつか単離例が報告さ
れている。しかしながら、単子葉植物から単離され、し
かもそのプロモーター配列まで明らかとなっている遺伝
子としては、葯特異的遺伝子の報告例が数例あるのみで
ある。

このような報告例としては、例えば、特開表６−5049
10号、ツチヤ等の文献（Tsuchiya et al.Plant Mol.Bio
l.26,1737−1746,1994）等が挙げられ、これらの文献に
おいては、イネ葯特異的遺伝子の塩基配列およびそれら
の発現プロファイル等が報告されている。

植物の花器、特に生殖器官の形態、あるいは生理的現
象を人為的に改良するため、あるいは様々な遺伝子の花
器における機能を解析するためには花器で特異的な発現
を示すプロモーターが必要不可欠である。しかしなが
ら、主要穀物の大部分を占める単子葉植物において、花
器においてのみ発現する遺伝子の単離例は非常に少な
く、特に雌性生殖器官である雌蕊および、あるいは開花
調節を司る鱗被において優勢な発現を示すプロモーター
配列は未だ報告されていない。

花器で発現する遺伝子の一つとして、病原菌に対する
防御機構として機能していると考えられているキチナー
ゼ（EC 3.2.1.14）が挙げられが、現在までに報告され
ている植物由来のキチナーゼの多くは、花器の他に根に
おいても構成的な発現をしている（例えば、Neale et a
l.The Plant Cell,2,673−684,1990）。ただし、例外的
にバレイショのSK2（Wemmer et al.Planta 194,264−27
3,1994）、あるいはトマトのChi2;1（Harikrishna et a
l.Plant Molecular Biology,30,899−911,1996）と呼ば
れるキチナーゼは雌蕊の花柱部特異的発現を示す。

一方、単子葉植物のキチナーゼもいくつか単離されて
いる。例えばZhu and Lamb（Mol.Gen.Genet.,226,289−
296,1991）はRCH10と呼ばれるキチナーゼをイネから単
離し、この遺伝子が無菌状態の根において構成的な発現
をしていることを示している。また、Zhu et al.（BIO/
TECHNOLOGY,12,807−812,1994）は、この遺伝子とアル
ファルファのグルカナーゼ遺伝子を用いて、病原菌耐性
の増加したタバコを作出している。

しかしながら未だ単子葉植物において、根における発
現がほとんど検出されず、花器でのみ発現することが確
認されたキチナーゼは報告されていない。

発明の概要本発明の目的は、従来特に単子葉植物において不可能
であった雌蕊もしくは鱗被を遺伝子工学的に操作するこ
とを可能にする新規な花器特異的プロモーター配列を提
供することである。

本発明の別の目的は、キチンを含有する植物病原菌に
対して、普遍的な抵抗性を付与することを可能にする新
規なキチナーゼを提供することである。

図面の簡単な説明図１は、RPC175遺伝子のノーザン分析の結果を示す写
真である。

図２は、RT−PCR分析によるRPC175遺伝子の各器官に
おける発現量解析の結果を示す写真である。図中、 A:鋳型RNA量１μｇ（柱頭および子房は200ng） B:1:鋳型RNA量１μｇ 2:鋳型RNA量30ng 3:鋳型RNA量1ng 4:鋳型RNA量30pg をそれぞれ示す。

図３は、RPC175遺伝子のゲノミックサザンハイブリダ
イゼーション分析の結果を示す写真である。図中、 B:BamH I,E:EcoR I,H:Hind III,P:Pst I,S:Sal I,X:X
ho I J:月の光、I:IR24 をそれぞれ示す。

図４は、RPC175遺伝子のプライマー伸長法による転写
開始点の決定実験の結果を示す写真である。２種のプラ
イマーP3FW2,C5FWを用いて雌蕊および葉のRNAを鋳型と
してプライマー伸長反応を行った。シークエンス反応産
物（G,A,T,C）を隣接してロードした。矢印が伸長産物
を示し、それに相当する塩基配列も併せて示した。

図５は、RPC175遺伝子のプロモーターの3'側の構造を
示す模式図である。塩基上の数字は一番上流の転写開始
点の位置を＋１とした時の相対的な位置を示している。

図６は、RPC175とRPG102の制限酵素地図の比較を示す
説明図である。太線がクローンの塩基配列、線がベクタ
ーの塩基配列、斜線がイントロンの塩基配列を示す。数
字は制限サイト間の距離を示し、単位はkbpで示してい
る。図中、 Ec:EcoR I,P:Pst I,pBS:pBluescript,AAAA...:ポリＡをそれぞれ示す。

図７は、プロモーター発現解析用ベクターの構築手順
を示す説明図である。

図８は、プロモーター発現解析用コンストラクトを導
入した形質転換体におけるGUS発現の器官特異性の解析
の結果を示すグラフである。横軸に調査した器官を、縦
軸に発現の見られた形質転換体数を示す。灰色はGUS発
現が斑点状の個体数を示す。

図９は、RPC175プロモーターの花器における発現組織
特異性の解析結果の一例を示す写真である。

図10は、RPC175プロモーターのイネ各器官における活
性測定結果を示すグラフである。横軸にイネの各器官
を、縦軸に形質転換次世代（R1）イネの各器官における
GUS活性を示した。縦軸の目盛りは対数目盛となってい
る。図中、○は非形質転換体を、●は形質転換体（R1）
をそれぞれ示す。

図11は、RPC175遺伝子のコードするタンパク質を発現
するためのベクターの構築手順を示す説明図である。

図12は、RPC175遺伝子のコードするタンパク質の大腸
菌による発現実験の結果を示すSDS−PAGEの写真であ
る。IPTGにより発現誘導をかけた区の不溶性画分をNi−
NTAレジンにより精製し、SDS−PAGEにより分画した。図
中、Ｍはマーカーを示す。

図13は、RPC175のコードするタンパク質の可溶化実験
の結果を示すウェスタン分析の写真である。SDS−PAGE
後、ECLによりバンドを検出した。

発明の詳細な説明本発明者等は、鋭意研究の結果、配列表の配列番号２
で表される塩基配列のうち、第１番目から第1234番目の
塩基から成る配列若しくはその一部、またはこれらの配
列のうち１または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿
入若しくは付加された配列を含むプロモーター活性を有
するDNA断片を見いだし、上記課題を解決したものであ
る。

また、本発明者等は、イネ由来のゲノムライブラリー
より配列表の配列番号１で表される塩基配列をプローブ
として用いて得られる配列から特定し得る単子葉植物の
花器特異的プロモーター配列により上記課題を解決する
ものである。

さらに、本発明者等は、配列表の配列番号１で表され
る塩基配列のうち、第114番目から第1097番目の塩基配
列から成るキチナーゼをコードするDNA配列、またはこ
れらの配列の一部、あるいは、これらの塩基配列のうち
１または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しく
は付加された配列を有し、かつ前記塩基配列から成るDN
Aがコードするタンパク質と同等の生物活性を有するタ
ンパク質をコードするDNA配列、あるいは、配列表の配
列番号３で表されるアミノ酸配列から成るキチナーゼの
配列、またはこの配列の一部、若しくはこれらのアミノ
酸配列のうち１または複数のアミノ酸が欠失、置換、挿
入若しくは付加された配列を有するキチナーゼのアミノ
酸配列により上記課題を解決するものである。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明者等が見いだした第１の発明は、上述したよう
に、配列表の配列番号２で表される塩基配列のうち、第
１番目から第1234番目の塩基から成る配列若しくはその
一部、またはこれらの配列のうち１または複数のヌクレ
オチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含
むプロモーター活性を有するDNA断片である。

本発明のプロモーター配列、すなわち配列番号２に記
載されている配列のうち、第１番目から第1234番目まで
の配列は、他の公知のプロモーター配列と相同性はない
ことから、新規なプロモーター配列であると考えられ
る。この配列を製造するには、たとえば後述実施例２の
方法に従って、天然の単子葉植物から単離する事が可能
である。

本発明のDNA断片が有するプロモーター活性は、花器
特異的である。本明細書において、プロモーター活性が
花器特異的であるとは、本発明のDNA断片は特に開花期
の花器（葯・花糸、雌蕊、鱗被）に存在する場合に、植
物の他の部分（少なくとも葉、根、カルス、発芽種子、
未熟種子、内・外穎）に存在する場合に比べて優勢にプ
ロモーター活性を発現することを意味する。本発明のDN
A断片は、単子葉植物において花器特異的であることが
確認されているが、他の植物においても花器特異的であ
る可能性がある。

この配列表の配列番号２で表される塩基配列には、以
下の特徴がある。

1.転写開始点が数ベースおきに３カ所存在し、その特徴
としてはこれらが全てTCの次のＡ（アデニン）であるこ
とである。具体的には、第1122番目、1125番目および11
29番目にしめされるＡ（アデニン）である。

2.最も上流の転写開始点の30塩基上流にTATAボックス
（Corden et al.Science 209,1406−1414,1980）様配列
（5'−TATATAA−3'）が存在する。

3.さらに、最も上流の転写開始点の77bp、113bp下流に
は２つのATGが同じ読み枠で存在する。

4.上流のATG（1stATG）の21bp上流には翻訳終止コドン
（TGA）が存在する。また転写終結配列内（この場合、
翻訳終止コドンより下流の領域を指す）にはポリＡシグ
ナル（Heidecker and Messing,Annu.Rev.Plant Physio
l.37,439−466,1986）様配列（5'−AATAAA−3'）が２ケ
所存在する。

また、第1135番目から第1140番目までにはSnaB I切断
部位があり、第1223番目から1228番目までにはPst I切
断部位がある。さらに1235番目以降は、構造遺伝子領域
となっている。

本発明においては、この配列番号２の塩基配列のう
ち、構造遺伝子領域の上流部位、すなわち第１番目から
第1234番目の塩基から成る配列をプロモーター配列とし
て特定したものであるが、この配列の一部であってもプ
ロモーター活性を有する場合は、本発明の範囲に含まれ
るものである。

例えば、後述する実施例で示すように、第１番目から
第1228番目までの領域および第１番目から1140番目まで
の領域においては花器特異的なプロモーターとしての活
性を有するものであることから本発明の範囲に含まれ
る。また、上述したように、第1122番目に転写開始点が
存在することから、第１番目から第1121番目までの領域
もプロモーター活性を有することが予想される。

さらに、この配列においては、たまたま第１番目から
６番目までにEcoR Iの切断領域があったため、ここから
の配列をプロモーター配列として特定したものである
が、これより下流の領域から始まる配列であってもプロ
モーター活性を有することが当然予想される。即ちこれ
までに植物から単離されたプロモーターのなかでその転
写開始点より上流0.3kbないし0.4kbの領域が当該プロモ
ーターの組織・時期特異性あるいは誘導性をほぼ完全に
保持していることが明らかにされた例が数多く報告され
ている。例えばイネのタイプIIグルテリン遺伝子のプロ
モーターでは胚乳における組織および時期特異的発現は
転写開始点上流441bpの断片だけで十分実現される（Tak
aiwa et al.Plant Mol.Biol.16:49−58,1991）。また、
Brassica oleraceaの自家不和合性関連遺伝子SLG13のプ
ロモーターでは転写開始点より上流411bpの範囲が雌ず
いと花粉における発現を規定している（Dzelzkalns et
al.The Plant Cell 5:855−863,1993）。あるいはトマ
トのanionic peroxidase遺伝子のプロモーターでは転写
開始点上流358bpが器官特異性の他、傷害・病原菌誘導
性を決定している（Mohan et al.Plant Mol.Biol.22:47
5−490,1993）。このようにプロモーターは、報告され
た塩基配列の一部であっても、転写開始点の上流域数百
bpであればそのプロモーターとしての機能をほぼ完全に
保持することが少なくない。

したがって、本発明のプロモーター配列において、本
発明において特徴づけられた花器特異性を有する、転写
開始点より上流数百bp、好ましくは転写開始点より上流
約500bpのDNA断片を含む配列も本発明の範囲に含まれる
ものである。例えば本発明の塩基配列を基に設計された
プライマーを用いて、PCRによりイネゲノムから容易に
単離された転写開始点より上流数百bpの領域が、本発明
のプロモーターの本来有する花器特異性を保持していた
場合、この短いプロモーター配列は本発明に含まれるも
のである。

本発明は、これらの配列のうち１または複数のヌクレ
オチドが欠失、置換、挿入若しくは付加されたプロモー
ター活性を有するDNA断片もその範囲に含むものであ
る。

一般に、生理活性を有するDNAの塩基配列が小さく変
更された場合、すなわち、該塩基配列の中の１又は複数
のヌクレオチドが置換され若しくは欠失し又は１又は複
数のヌクレオチドが付加若しくは挿入された場合でも、
該DNAの生理活性が維持される場合があることは周知の
事実である。従って、上記した本発明のプロモーター配
列にこのような修飾が加えられ、かつ、プロモーター活
性を有するDNA配列も本発明の範囲内に含まれる。すな
わち、配列表の配列番号２で表される塩基配列のうち、
第１番目〜第1234番目の塩基から成る配列若しくはプロ
モーター活性を有するその一部、例えば転写開始点より
上流数百bpから成る配列に加え、これらの配列のうち少
数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に
少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、プロモ
ーター活性を有するDNA配列も本発明の範囲に含まれ
る。

また、同様に、配列表の配列番号２で表される塩基配
列のうち、第１番目〜第1140番目の塩基から成る配列、
第１番目〜第1121番目の塩基から成る配列に加え、これ
らの配列のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又
はこれらの配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付
加された、プロモーター活性を有するDNA配列も本発明
の範囲に含まれる。

ヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換は、例え
ば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えばNucl.A
cids Res.10:6487−6500,1982）により実施することが
でき、本明細書において「１又は複数のヌクレオチド」
とは、部位特異的変異誘発法により付加、挿入、欠失又
は置換できる程度の数のヌクレオチドを意味する。

部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変異である特
定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖ファージDNA
に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて
次のように行うことができる。すなわち、プライマーと
して上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相
補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖DNAでファージ担
持性宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の培
養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞
からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的に
は、50％の新コロニーが単鎖として変異を有するファー
ジを含有し、残りの50％が元の配列を有する。得られた
プラークを、上記所望の変異を有するDNAと完全に一致
するものとはハイブリッド形成するが、もとの鎖を有す
る不一致のものとはハイブリッド形成しない温度におい
て、キナーゼ処理された合成プローブとハイブリッド形
成せしめる。次に該プローブとハイブリッド形成するプ
ラークを拾い、培養し、DNAを回収する。

なお、プロモーター配列に、その活性を喪失せしめな
い１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、付加又は挿
入の方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他に
も、遺伝子を変異原で処理する方法及び遺伝子を選択的
に切断し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、
又は置換し、次いで連結する方法が考えられる。

さらにPCR法を用いた部位特異的変異導入（Mikaelian
et al.Nucl.Acids Res.20:376,1992）による特定ヌク
レオチドの置換、欠失、付加又は挿入や、Taq DNAポリ
メラーゼの忠実度の低さを利用したランダムなヌクレオ
チドの置換（Zhou et al.Nucl.AcidsRes.19:6052,199
1）も考えられる。

次に、本発明者等が見いだした第２の発明について説
明する。

第２の発明は、イネ由来のゲノムライブラリーより配
列表の配列番号１で表される塩基配列をプローブとして
用いて得られる配列から特定し得る単子葉植物の花器特
異的プロモーター配列である。

この、配列表の配列番号１で表される塩基配列は、イ
ネ（Oryza sativa）の穎花あるいは雌蕊よりcDNAライブ
ラリーを構築し、ディファレンシャルスクリーニングを
行い、雌蕊、葯および鱗被で特異的に発現するcDNAを単
離し、全塩基配列を決定することにより得られる。この
決定された塩基配列は、その全体をプローブとして用い
てもよく、またその一部をプローブとして用いても良
い。この場合、ハイブリダイゼーションの条件として
は、特定されるDNAの塩基配列と配列番号１で表される
塩基配列が80％以上の相同性を有していれば分子雑種を
形成しうる全てのハイブリダイゼーション、及び洗浄条
件が考えられる。

イネ由来のゲノムライブラリーの構築は、これに限定
されるものではないが、イネ（Oryza sativa）の緑葉を
用いて構築する。このように得られたライブラリーよ
り、上記プローブを用いてプロモーター配列を特定する
のであるが、この配列が花器特異的であるか否かの判断
は、このプロモーター配列にβ−glucuronidase（GUS）
遺伝子を接続したキメラ遺伝子を構築し、イネへ導入
し、発現部位を確認することにより行なうことができ
る。

上記配列番号１で表される塩基配列の決定、イネ由来
のゲノムライブラリーの構築、特異的プロモーター活性
の有無の判断に関しては、これに限定されるものではな
いが、後述する実施例に詳しく記載されている。

配列表の配列番号２で表される塩基配列、特にその第
１番目から第1234番目の塩基から成る配列は、先述のと
おり本発明者らによって単離された新規DNA断片であ
る。遺伝子工学の技術分野に精通した技術者にとって、
本発明の開示に基ずいて、配列番号２の第１番目から第
1234番目の塩基の少なくとも一部分をプローブとして用
い、種々の単子葉植物のゲノムライブラリーから、本発
明と同様の花器特異的プロモーター活性を有するDNA断
片を単離する事は容易である。その際、プローブとのハ
イブリダイゼーション条件も適宜決定することが出来
る。よって、配列番号２の第１番目から第1234番目の塩
基の少なくとも一部分とハイブリダイズし、且つ本発明
と同質の花器特異的プロモーター活性を有するDNA断片
は、本発明の範囲内である。

本発明の花器特異的プロモーターは、葯に加え、従来
特に単子葉植物において不可能であった雌ずいもしくは
鱗被を遺伝子工学的に操作・改良することを可能にする
新規な花器特異的プロモーター配列であることから、例
えば下記の用途に用いることができる。

（１）本発明のプロモーター配列またはその一部に不稔
化を引き起こす構造遺伝子を接続することによる雌性不
稔植物の作出。

（２）本発明のプロモーター配列またはその一部に植物
細胞の伸長または分裂を促進する構造遺伝子を連結する
ことによる、花器の部位特異的増大、伸長。

（３）鱗被における発現を利用することによる遺伝子工
学的な開花制御。

（４）除草剤耐性あるいは病害抵抗性を賦与する遺伝子
を繋げることによる花器全体またはその一部への抵抗性
の賦与。

本発明のプロモーターは開花期のイネの柱頭・花柱
部、葯壁・花糸及び鱗被で発現するが、例えば雄性不稔
イネの改良に本プロモーターを利用する場合、葯壁・花
糸における発現は無視することが出来る。また連結する
構造遺伝子によってはその産物に対する各器官の感受性
が異なることが想定される。これらのような場合、本発
明のプロモーターを利用して例えば柱頭・花柱部だけ、
あるいは鱗被だけを特異的に改良することが可能となる
場合があると考えられる。

最後に、本発明者等が見いだした第３の発明について
説明する。

第３の発明は、配列表の配列番号１で表される塩基配
列のうち、第114番目から第1097番目の塩基配列から成
る配列、もしくはこの配列の一部、またはこれらの塩基
配列のうち１または複数のヌクレオチドが欠失、置換、
挿入若しくは付加された配列を有し、かつ前記塩基配列
から成るDNAがコードするタンパク質と同等の生物活性
を有するタンパク質をコードするDNA配列。あるいは、
配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列から成る配
列、またはその一部、若しくはこれらのアミノ酸配列の
うち１または複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しく
は付加された配列を有し、かつ前記アミノ酸配列から成
るタンパク質と同等の生物活性を有するアミノ酸配列で
ある。

本発明のDNA配列、すなわち第114番目から第1097番目
の塩基配列から成る配列、およびアミノ酸配列は、公知
のイネクラスＩキチナーゼとそれぞれ67〜69％、および
54〜61％の相同性を有する新規なキチナーゼである。

配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列には以下
の特徴がある。

種々のクラスＩキチナーゼとの相同性から、タンパクの
Ｎ末端側から以下のような構造を有していると考えられ
る。即ち、Ｎ末には疎水性アミノ酸が連なるリーダー配
列（配列番号３のアミノ酸番号１〜20）が存在し、その
後の成熟タンパクのＮ末にはシステインに富むキチン結
合領域（同21〜61）があり、その下流にスペーサー領域
（同62〜83）を介して、触媒領域（同84〜328）が存在
している。そして、この触媒領域の中にはキチナーゼの
活性部位と考えられているNYNYG（配列番号３のアミノ
酸番号198〜202）の最初のチロシン残基（Verburg et a
l.J.Biol.Chem.、267、3886−3893、1992、配列番号３
のアミノ酸番号199番目のＹ）が保存されていた。な
お、Ｃ末には他のイネキチナーゼとは相同性を有さない
特徴的なアミノ酸（同318〜328）が連なっていた。成熟
タンパク質領域（配列番号２のアミノ酸配列番号21〜32
8）の分子量はおよそ32kD、等電点は7.24と算出され
た。

成熟タンパク領域（配列表の配列番号３のアミノ酸番
号21〜328）を大腸菌内で発現させ、その生物活性の一
つであるキチナーゼ活性を測定すると、実際にキチナー
ゼ活性が検出される。

植物のクラスＩキチナーゼには上述したようにその成
熟タンパク質のＮ末にキチン結合領域であるシステイン
に富む領域、およびそれに続くスペーサー領域が存在す
るが、Iseli et al.（Plant Physiol.103,221−226,199
3）によれば、これらの領域を含まなくともキチナーゼ
活性や抗菌活性は保持される。従って、本発明のキチナ
ーゼもキチン結合領域とスペーサー領域を除いた、触媒
領域だけでキチナーゼ活性を有している可能性が高い。
従って、配列表の配列番号３のアミノ酸番号84〜328の
触媒領域も、同１〜328の全175タンパクや、同21〜328
の成熟タンパク質と同等の生物活性が期待されるので、
この領域も本発明に含まれるものである。

上述のように、本発明の新規キチナーゼは、キチナー
ゼ活性を有することから、下記の用途に用いることが出
来る。

（１）本発明の配列表の配列番号１で表されるDNA配列
のうち、第114番目から第1097番目のDNA配列、もしくは
この配列の一部のDNA配列に、構成的、組織特異的、時
期特異的あるいは誘導性のプロモーターを接続、植物細
胞を形質転換することによる病虫害抵抗性植物の作出。

（２）キチナーゼにより生産されるキトオリゴ糖の食
品、化粧品、医療品工業の原材料への利用。

実施例実施例１花器特異的cDNAの単離水稲品種「アキヒカリ」、「月の光」および「IR24」
を温室で栽培し、以下の実験に供試した。

（１）RNAの抽出「IR24」の葉、雌蕊、葯、鱗被、内・外穎、未熟種
子、発芽種子、根、カルス、および「アキヒカリ」の穎
花（長さ4.5〜6.0mm）を採取後直ちに液体窒素中で凍結
し−80℃で保存した。また雌蕊に関しては一部を柱頭部
と子房部に分割した。

これらの組織よりSDS−フェノール法（Watanabe and
Price,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79,6304−6308,1982）
により全RNAを抽出した。ただし、抽出緩衝液へ酸化防
止剤βメルカプトエタノールを最終濃度10％（V/V）に
なるように添加した。また、逆転写PCR実験に供試する
組織については微量のDNAの混入を極力抑えるために、
塩化リチウム沈澱の代わりにRNaseインヒビター（RNAgu
ard Pharmacia社）存在下でDNase I（FPLCpure Pharmac
ia社）処理を行った。葉、根（後述の図２、表１では根
（土）と表記）は播種後１ケ月の温室育成の株より、雌
蕊、葯、鱗被、内外穎は開花直前〜数日前、未熟種子は
開花後１〜２週間の株より採取した。また発芽種子、根
はN6培地（Chuet al.Scientia Sinica,18,659−668,197
5）上でそれぞれ播種後１、３週間無菌的に育成した植
物体のものを用いた。

カルスは2,4−Ｄを2mg/l添加したN6固形培地上で種子
より誘導し、同じ組成の液体培地中で１週間振盪培養を
したものを用いた。雌蕊および葉の全RNAはOligotex−d
T30 super（宝酒造）を用いて説明書に従ってポリA⁺RNA
にまで精製した。

（２）穎花、雌蕊cDNAライブラリーの構築穎花および雌蕊より単離精製したそれぞれ約2.2μ
ｇ、１μｇのポリA⁺RNAをcDNA合成の鋳型に用いた。cDN
A合成はZAP−cDNA合成キット（STRATAGENE社）を用いて
行った。RIの取り込み率による定量の結果、oligo−dT
プライミングにより逆転写された第一鎖cDNAは穎花、雌
蕊でそれぞれ約462ng、約55ng、そこから直接合成され
た第二鎖cDNAはそれぞれ約1022ng、約72ngであった。キ
ット添付の説明書に従ってcDNAにEcoR Iアダプターをつ
なぎ、Xho Iで消化した後、ベクターUni−ZAPXPへ連結
した。その後ファージDNAをGiga−pack Gold packaging
extract（STRATAGENE社）を用いてファージ粒子へパッ
ケージングした。次いで大腸菌PLK−F'を宿主細胞とし
てプレートへ播き、ライブラリーサイズを調べたとこ
ろ、穎花cDNAライブラリーで１×10⁶pfu（plaque formi
ng unit）、雌蕊cDNAライブラリーで３×10⁶pfuと算出
された。

（３）ディファレンシャルスクリーニング基本的にはGasser et al.（The Plant Cell 1,15−2
4,1989）の方法に従った。穎花cDNAライブラリーから約
2,000pfuのファージを感染用の大腸菌PLK−F'を使って1
4×10cm角型シャーレへ播いた。各々のプレートについ
てナイロンメンブレンフィルターHybond−N⁺（Amersham
社）を用いてレプリカフィルターを作り、添付の説明書
に従ってフィルターを処理した。

ハイブリダイゼーション用プローブは雌蕊と葉のポリ
A⁺ RNA約100ng（または全RNA約２μｇ）より合成した一
本鎖cDNAを用いた。２μｌのRNA溶液に0.5mMのｄ（AT
G）TP、10mMのDTT、１×Ｍ−MuLV緩衝液（BRL社）を加
え、30ng/μｌのランダムDNAヘキサマー（Pharmacia
社）（または80ng/μｌのオリゴdTプライマー（Amersha
m社））を加えた（濃度はいずれも最終濃度）。65℃で
５分間処理しRNAの二次構造を解離させた後、室温でプ
ライマーをアニーリングさせた。さらに1.5unit/μｌの
RNaseインヒビター（RNAguard Pharmacia社）、10unit/
μｌの逆転写酵素Ｍ−MuLV（BRL社）、４μCi/μｌの
［α−32P］dCTPを加え（いずれも最終濃度）、計20μ
ｌの反応液を37℃で１時間保温した。その後さらにRIラ
ベルしていないdCTPを最終濃度0.5mMになるように加
え、30分間反応を続けた。

ラベルしたDNAプローブの精製はQuick SpinカラムＧ
−50 Sephadex（BOEHRINGER MANNHEIM社）を用いて行っ
た。プローブの融解は2NのNaOHを等量（最終濃度1N）加
えることにより行った。フィルターはあらかじめプレハ
イブリダイゼーション緩衝液（0.25M Na₂HPO₄ pH7.2、
７％ SDS、1mM EDTA、１×デンハルト溶液）中で68℃、
10分間処理しておき、そこへ一本鎖化したプローブ（0.
2−0.3×10⁷cpm/ml終濃度）とキャリアーDNA（0.1mg/ml
サケ精巣DNA、0.1μg/mlλDNA、0.1μg/mlイネDNA）を
加え、68℃で一晩（16〜24時間）ハイブリダイゼーショ
ンを行った。

フィルターの洗浄は緩衝液（20mM Na₂HPO₄ pH7.2、１
％ SDS、1mM EDTA）中で室温、68℃で15分を２回ずつ行
った。その後フィルターはKodak X−Omatフィルムに４
〜５日間−70℃で露光させた。約20,000個のプラークを
選抜した結果、雌蕊プローブでハイブリダイゼーション
シグナルが強く検出され、しかも葉プローブではシグナ
ルが弱いかまたはバックグラウンド程度にしか検出され
ないプラークが一次選抜で114個選抜され、プラーク精
製を兼ねた三次選抜までに41個に絞られた。

このうち葉プローブでのシグナルが特に弱い（バック
グラウンドと区別できない）プラークの一つをクロロフ
ォルムを一滴滴下した200μｌのSM緩衝液（0.1M NaCl、
7mM MgSO₄、50mM Tris−Cl pH7.5、0.01％ゼラチン）中
で４℃で保存した。この保存液を希釈し、プラークがご
く低密度（10〜100pfu/プレート）になるようにファー
ジを播き、互いに離れたプラークを１つ単離し、同じ緩
衝液中で保存した。この保存液からファージを高濃度で
含むプレート溶菌液を用意し、ZAPcDNA合成キットの説
明書に従ってin vivo excisionを行い、ファージゲノム
よりプラスミド（pBluescriptSK（−））を切り出し
た。制限酵素EcoR I及びXho I（宝酒造）で消化するこ
とによりcDNAインサート（約0.8kb）を単離精製した。

（４）cDNAクローンの発現器官特異性の解析ｉ）ノーザンハイブリダイゼーション分析上記（３）で選抜されたcDNAクローンについて各器官
での発現パターン及びその発現量を見るためにノーザン
ハイブリダイゼーションを行った。フィルターの作製は
以下のように行った。まず上述（１）の各器官の全RNA2
0μｇをSambrook et al.（Molecular Cloning,1982）の
方法に従って、脱イオンしたGlyoxalとDMSOを用いて二
次構造を融解させた後、１％アガロースゲル中で分画し
た。次いで常法のキャピラリートランスファーによりRN
AをナイロンメンブレンGene Screen Plus（DU PONT
社）にブロッティングした。バキュームドライオーブン
で80℃、１時間乾燥させた後、フィルターを20mM Tris
−Cl pH8.0中で５分間煮沸しGlyoxalを除去した。プロ
ーブは上記cDNAのEcoR I0.8kb断片をマルチプライムラ
ベリングシステム（Amersham社）でRIラベルしたものを
用いた。

プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー
ションはフィルター添付の説明書に従い行った。洗浄は
２×SSC、１％ SDS及び0.2×SSC、１％ SDSを各々室温
で５分、0.16×SSC、１％ SDS、65℃で15分を２回行っ
た後、２×SSC、室温で１分間という条件で行った。そ
の後フィルターはKodak X−Omatフィルムに一晩−70℃
で露光させた。その結果、図１に示したハイブリダイゼ
ーションパターンの様に、シグナルは雌蕊と葯、および
鱗被のレーンのみに検出され、その他のレーンには検出
されなかった。従って単離されたディファレンシャルク
ローンは、雌蕊と葯、および鱗被で強く発現し、そのほ
かの各器官においては極く低レベルに発現するか、また
はほとんど発現しないことが明らかとなった。また転写
物のサイズは約1.5kbと推定された。

デンシトメーターによりシグナルの濃淡を測定し発現
量を定量化したところ雌蕊を１とした場合、葯で約２、
鱗被で約４であった。

ii）逆転写PCR分析 cDNAクローンの器官特異的発現をより高い感度で解析
するためにイネ各器官のRNAを鋳型とした逆転写PCRを行
った。そのためにまずcDNAの部分塩基配列の決定を行っ
た。GENESIS 2000蛍光シークエンサー（DuPont社）を用
いて、プラスミドpBluescript SK（−）に挿入されたcD
NAの塩基配列を決定した。シークエンサー添付の説明書
に従い、M13のRVおよびM4プライマー（宝酒造）よりT7
DNA polymerase反応を行い、６％アクリルアミドゲルで
電気泳動を行った。5'（EcoR I）側、3'（Xho I）側の
両方向からの塩基配列の決定を行った。

このうち5'側の約300ヌクレオチド分のDNA塩基配列か
ら適当なプライマーをDNA合成機（ABI社）により合成し、OPCカートリッジ
（ABI社）により精製し、逆転写PCR実験に供試した。こ
のプライマーにより101bpの産物が増幅される。

また、イネアクチン１遺伝子（Rac1,McElroy et al.
Plant Mol.Biol.14,163−171,1990）の配列を基に合成
したプライマーも対照として用いた。このプライマーはイントロンを挟
んだ形で設計してあるので鋳型DNAにゲノムDNAが混入し
ている場合、cDNA由来の267bpの産物の他にゲノムDNA由
来の350bpの産物が増幅される。

上述の各器官の全RNAについて希釈系列（１μg,30ng,
1ng,30pg）を作製し65℃,5分間処理し二次構造を解離さ
せ、氷上で急冷した後、１×Perkin Elmer Gene Ampbuf
fer、1mM dNTPmix、5ng/μｌオリゴdT15プライマー（Am
ersham社）、2.5mM MgCl₂、3units/μl RNaseインヒビ
ター（RNAguard Pharmacia社）、10units/μｌ逆転写酵
素Ｍ−MuLV（BRL社）（濃度はいずれも最終濃度）の10
μｌの反応カクテル中で37℃、30分間保温した。続いて
95℃で５分間処理しRNA−cDNAハイブリッドを解離させ
た後、氷上で冷却した。ここへ10−20pmolesの一組のプ
ライマー、10×buffer、1unitのAmpliTaqポリメラーゼ
゛（Perkin Elmer社）を加え、総量50μｌの反応液でPC
R反応（94℃１分、60℃１分、72℃２分30秒を40回）を
行った。

まず対照実験としてイネにおいて全ての器官で構成的
に発現していると考えられるRac1遺伝子のプライマーを
用いて各器官より調製した全RNAの逆転写産物についてP
CRを行った。その結果、調べた全ての器官で期待された
267bpのPCR産物が検出された。従って鋳型cDNA中にはゲ
ノムDNAの混入はほとんどないと考えられた。またその
検出限界（鋳型RNA量）は発芽種子で0.5μｇ、根で1n
g、それ以外の器官では30ngであった。もし、Rac1遺伝
子が本発明において供試した全ての器官において同レベ
ルの発現をしていると仮定すると、器官による逆転写PC
Rの効率は雌蕊を１とした場合、発芽種子で約1/17、根
では約30倍弱、それ以外の器官では雌蕊とほぼ同程度と
予想された。

次に、予めプラスミドクローンを使って期待される分
子量の産物が増幅されることを確認したクローン特異的
プライマーを用いて逆転写PCR実験を行った。その結
果、まず図2Aに示したように１μｇのRNAから逆転写し
たcDNAをPCRの鋳型にした場合に、期待される101bpの産
物が検出されたのは雌蕊、葯の他、未熟種子と内・外穎
であった。その他の器官のcDNAからはPCR産物は増幅さ
れなかった。また、雌蕊に関しては柱頭と子房の両方で
発現が見られた。次にPCR産物の検出された各々の器官
について鋳型RNAを希釈して、発現量の推定を行った。
その結果、雌蕊（柱頭、花柱）と葯では鋳型RNA量が最
少の30pgまで産物が検出されたのに対して、内・外穎で
は30ng、未熟種子では１μｇまでしかPCR産物が検出さ
れなかった（図2B）。

従って、それぞれの器官における発現量は雌蕊（柱
頭、花柱）を１とした場合、葯で１程度、内・外穎、未
熟種子ではそれぞれ10^-3、３×10^-5程度と算出され、花
器以外での発現は非常に低レベルな発現であることが示
された。以上逆転写PCRの結果とノーザン分析の結果を
表１にまとめた。

（５）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション分析水稲品種月の光、IR24のゲノミックDNAを播種後約一
ヶ月の植物体からフェノールSDS法（Komari et al.Theo
r.Appl.Genet.77,547−552,1989）により単離精製し
た。約５μｇのDNAを制限酵素BamH I、EcoR I、Hind II
I、Pst I、Sal I、Xho I（宝酒造）で消化後、0.8％ア
ガロースゲル中でDNA断片を分画した。次にDNAをナイロ
ンメンブレンフィルターHybondN⁺（Amersham社）にブロ
ッティングした後、前記0.8kbのcDNA断片を前記（４）
ｉ）と同様にRIラベルしたものをプローブとしてゲノミ
ックサザンハイブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、フィルタ
ー添付の説明書きに従った。その結果、プローブとゲノ
ムDNA間で高い相同性がなければ分子雑種を形成しない
条件下にもかかわらず、１〜２本のメインの濃いバンド
の他に数本の薄いバンドが認められた（図３）。例えば
EcoR Iで消化した場合、2.6kbの強いシグナルのバンド
に加え、1.6kbの他３本の弱いシグナルのバンドが検出
された。これら薄いバンドはプローブとの相同領域があ
まり長くないか、プローブとの相同性があまり高くない
ためと考えられ、クローニングした遺伝子にはイネゲノ
ム中に類縁配列が少数ながら存在する可能性が示唆され
た。

（６）完全長cDNAの単離雌蕊cDNAライブラリー（実施例１（２））を0.8kb cD
NAクローンをプローブに使用して、スクリーニングし
た。雌蕊cDNAを含むファージ約16万Pfuを実施例１
（３）と同様にして８枚の角型シャーレに分けてプレー
ティングし、レプリカフィルターを作製した。このフィ
ルターに対して、0.8kb cDNAをマルチプライムラベリン
グシステム（Amersham社）を用いてRIラベルしたものを
ハイブリダイズさせた。その結果、一次選抜で40個の陽
性プラークを得、このうち20プラークについてin vivo
excisionを行い、cDNAを含むプラスミドをファージDNA
から切り出した。

続いて制限酵素EcoR Iで消化し、クローン化されたcD
NAを切り出し、そのサイズを比較した。その結果、最も
長いcDNAのサイズは約1.25kbで、３つのクローンがこの
サイズを有していた。このうち代表１クローンの3'側約
300bpの塩基配列を決定し、プローブとして用いたアキ
ヒカリ由来の0.8kbクローンの相当領域と比較したとこ
ろ、両クローンの塩基配列は3'非翻訳領域を含めほぼ10
0％一致していた。

さらに得られた1.25kbクローンが0.8kbクローンと同
じ遺伝子由来か否かを精査するため、決定した塩基配列
内で一組のプライマーを合成し、実施例１（４）ii）のようにイネ全器官に対
して逆転写PCRを行った。ただし、サイクル数は30回と
した。その結果、0.8kbクローンの場合と全く同様な結
果が得られた。

即ち、本発明の遺伝子の発現器官は主として雌蕊と
葯、および鱗被に限定され、内・外穎、未熟種子ではそ
れらのおよそ千分の一以下、及びその他の器官における
発現量は検出限界以下であった。以上のことから選抜さ
れた1.25kbのcDNAクローンは、ディファレンシャルスク
リーニングによって単離された0.8kb cDNAクローンと同
一遺伝子由来であることが明らかとなり、以下に示すゲ
ノミッククローン単離の際のプローブに供試した。また
この1.25kb cDNAクローンを「RPC175」と命名した。

（７）RPC175の塩基配列の決定花器特異的発現を示すcDNAクローンRPC175（約1.25kb
p）の全塩基配列を、蛍光シークエンサー（モデル373
A、Applied Biosystems社）を用いて以下のように決定
した。RPC175が組み込まれているプラスミドベクターpB
luescript SK（−）上のM13プライマーRV（cDNAの5'
側、センス鎖を解読）およびM4（cDNAの3'側、アンチセ
ンス鎖を解読）を利用して、まず5'および3'側の約250
〜300bpの塩基配列を決定した。

得られた塩基配列の情報を基に内部プライマーを作成
し、センス鎖、アンチセンス鎖の両方向からの塩基配列
の解読を行った。解読された部分塩基配列を基にプライ
マーを合成して次々にセンス鎖、アンチセンス鎖の解読
塩基配列の領域を伸ばしていった。最終的に逆転写PCR
で用いたプライマーを含め、合計９本（センス鎖４本、
アンチセンス鎖５本）の遺伝子内部プライマーを用い
た。また、制限酵素分析から、RPC175内部には２つのAp
a Iサイトがあることが分かっていたので、これらのサ
イトを利用してRPC175を３つに分断して、プラスミドベ
クターpBluescript SK（−）の同サイトへサブクローニ
ングし、M13プライマーを用いて塩基配列を決定した。

こうして内部プライマーおよびサブクローニングによ
ってRPC175の全塩基配列を決定した。次に決定した塩基
配列をGENETYX−MAC8.0塩基配列・アミノ酸列解析ソフ
トを用いて解析した。その結果、RPC175の全塩基配列数
は1258bpで、5'側に２ヶ所の翻訳開始コドンATGが36bp
を挟んで同じ読み枠で存在しており、上流のATGはステ
ムループをとり得る配列の直後にあることが判明した。

ORF検索から読み枠を決定し、アミノ酸に翻訳したと
ころ、上流のATGから翻訳が開始される場合は340個のア
ミノ酸、下流のATGから翻訳される場合は328個のアミノ
酸をコードしていた。また翻訳終止コドンの下流には２
ヶ所のポリＡシグナル（5'−AATAAA−3'）が存在してい
た。RPC175の全塩基配列を配列番号１に示す。ただしは
じめの60bpは後述のゲノムクローンに由来し、配列番号
１は転写開始点からポリＡまでの全塩基配列を含んでい
る。

RPC175がコードするアミノ酸配列を配列番号３に示し
た。後述の通り、２つあるATGのうち下流のATGが翻訳開
始点であることが強く示唆されたので、配列番号３では
下流のATGから終止コドンに到る総計328個のアミノ酸配
列を示した。配列番号３のアミノ酸配列のうちアミノ酸
番号１〜20のアミノ酸は、後述のようにリーダー配列と
考えられ、それ以降は成熟タンパク質のアミノ酸配列と
考えられた。

GENETYX−/MAC/CD 32解析ソフトおよびインターネッ
ト上の塩基配列検索プログラムBLASTを用いて相同性検
索を行った結果、RPC175はイネをはじめコムギ、オオム
ギ、トウモロコシ、バレイショ、トマトのクラスＩキチ
ナーゼと相同性を示した。相同性はクラスＩキチナーゼ
の可変領域（配列番号３のアミノ酸番号62〜83）を除
き、疎水性アミノ酸が連なるリーダー配列（同１〜2
0）、システインに富むキチン結合領域（同21〜61）、
触媒領域（同84〜328）全体に渡っていた。触媒領域に
は多くの塩基性キチナーゼで保存され、活性部位と考え
られているNYNYGの最初のチロシン残基（配列番号３の
アミノ酸番号198〜202の中の199番目のチロシン
（Ｙ））が存在していた。また、Ｃ末には他のイネキチ
ナーゼとは異なる特徴的なアミノ酸（配列番号３のアミ
ノ酸番号318〜328）が連なっていた。種々のイネクラス
Ｉキチナーゼとの相同性の程度は核酸レベルでおよそ67
〜69％、アミノ酸レベルでおよそ54〜61％であった。

また成熟タンパク質領域（配列番号２のアミノ酸配列
番号21〜328）の分子量はおよそ32kD、等電点は7.24と
算出された。

実施例２プロモーターの単離（１）ゲノミックライブラリーの作製ゲノミックDNAを播種後約２ヶ月のイネの葉からSDS−
フェノール法と塩化リチウム沈殿法で単離精製した後、
まず予備試験として制限酵素Mbo I（宝酒造）で部分分
解し、見かけ上16〜23kbのサイズの断片を多く含む酵素
反応条件を決定した。続いてこの決定した反応条件でゲ
ノミックDNAを消化した後、ショ糖密度勾配遠心を行っ
た。ショ糖は緩衝液（20mM Tris−HCl pH8.0,1mM EDTA,
200mM NaCl）へ溶解し、濃度を５段階（10、17.5、25、
32.5、40％）作成した。このショ糖溶液を遠心管（40P
A、日立）へ下からこの順で重層し、最後に部分分解DNA
溶液を重層した。SRP28 SA（日立）ローターを用いて2
0,000rpm、17時間、20℃で遠心後、ペリスタポンプ（AC
−2110、アトー）を用いて0.5mlずつ80画分に分け、16
〜23kbのDNAを最も多く含む画分を調製した。

このDNA画分をベクターLAMBDA DASH II/BamH I（STRA
TAGENE社）とT4 DNAリガーゼ（BOEHRINGER MANNHEIM
社）を用いてライゲーションし、Giagapack II Gold pa
ckaging extract（STRATAGENE社）でファージ粒子へパ
ッケージングした。以上の手順でイネゲノミックライブ
ラリーを構築した。ライブラリーサイズは約500万pfuと
算出された。

（２）クローンの選抜約10,000pfuのファージを感染用の大腸菌SRBP2と混合
し、14X10cm角型シャーレへ播き、39℃で一晩培養した
後、ナイロンメンブレンフィルターHybondN⁺（Amersham
社）をプラーク表面と接触させ、フィルター添付の説明
書に従ってフィルターを処理した後、プローブはイネ花
器特異的cDNA（RPC175）EcoR I 1.2kb断片をマルチプラ
イムラベリングシステム（Amersham社）でRIラベルした
ものを用い、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は実施例１
（３）に従った。但し、１×デンハルト液とキャリアー
DNAの使用は省略した。約16万個のプラークから一次選
抜で35個の陽性クローンを選抜し、二次選抜で12個に絞
った。

次にこれらのプラークからファージDNAを調製し、こ
れらを鋳型に逆転写PCRで用いたRPC175特異的プライマ
ー175FW1、175RV1でPCRを行い、さらに目的クローンの
選抜を行った。その結果、12クローン中８クローンにお
いて期待される約200bpの産物が増幅された。さらにこ
のうち５クローンについて別のプライマーセット75FW
1、75RV1でPCR反応を行ったところ、全てのクローンに
ついてcDNAを鋳型に用いた場合よりも約90bp長い産物が
増幅された。

続いて、これら５つのクローンについて２ヶ所、計約
400bpのPCR産物の塩基配列を決定し、cDNAの塩基配列と
比較した。その結果、５つのゲノミッククローン全てに
ついて対照のcDNAの塩基配列とイントロン配列を除き99
％以上の相同性を示した。従って、これらのクローンは
目的のゲノムクローンである可能性が極めて高いと結論
づけられた。

なお、75FW1、175RV1による産物については、この領
域内に5'−GT−AG−3'を両端に持つ85bpのイントロンが
存在するために、ゲノミッククローンのDNAを鋳型にし
た場合に、cDNAを鋳型にした場合よりも長いPCR産物が
増幅されたことが判明した。またこのイントロンの3'末
にはPst Iサイトが存在していた。

（３）遺伝子領域のサブクローニングイネ全ゲノムDNAを制限酵素EcoR Iで消化し、RPC175
遺伝子をプローブにゲノミックサザンを行うと、シグナ
ルの強い約2.6kbのバンドの他に約1.6kbのシグナルの弱
いバンドが現れる（図３）。一方、上記５つのクローン
についてファージDNAを抽出し、EcoR Iで消化し、RPC17
5をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行
ったところ、RPC175と分子雑種を形成するDNA断片はク
ローンにより2.6kbpか1.6kbpのうちのどちらかであり、
ゲノムDNAのサザン分析の結果と良く一致した。塩基配
列データからRPC175は3'末端（ポリＡサイト）から約70
bp上流に唯一のEcoR Iサイトを持つことが分かっている
ので、シグナルの弱い1.6kbp断片はプローブとしたRPC1
75cDNAの3'領域のEcoR IからポリＡサイトまでの約70bp
という短い領域とゲノムDNA断片との相同性に由来する
と考えられた。

さらにゲノミックサザンにおけるシグナルの強さから
2.6kbp EcoR I断片には、大きなイントロンが存在しな
い限り、構造遺伝子の全領域と、その上流域を1kbp程度
は含むと予想された。そこでこの断片をプラスミドベク
ターBluescript SK（−）へサブクローニングし、「RPG
102」と命名した。さらにRPG102を詳しく解析するため
に、制限酵素Pst Iで消化し、アガロースゲル電気泳動
を行った。その結果、RPG102は約1.2、0.8、0.45、0.1k
bpの４つの断片に分断された。

続いてこれらのDNAをフィルターに転写し、RPC175を
プローブとしたサザン分析を行った。その結果、４つの
断片のうち、約0.8、0.45、0.1kbp断片にシグナルが検
出された。塩基配列データから、RPC175上には5'末端か
らおよそ45bp下流にPst Iサイトがあり、さらにそこか
らおよそ120bp下流にもPst Iサイトがあることが分かっ
ているので、サザン分析で検出された３本のバンドのう
ち、0.1kbpのサイズのバンドはこの領域に相当すると考
えられた。また、3'末端のEcoR Iサイトからおよそ50bp
上流にもPst Iサイトがあることが分かっており、制限
酵素分析から5'側から２つ目のPst Iサイトとこの3'側
のPst Iサイトの間の長さはおよそ0.95kbpであった。従
って、RPG102内には前述の85bpのイントロンの他におよ
そ200bp程度のイントロンが存在し、また、85bpのイン
トロンの中のPst Iサイトにより1.25kbp断片が0.8と0.4
5kbp断片に分断されたと予想された。

以上のことからサザン分析で検出された３本のバンド
は全て構造遺伝子領域に相当することが予想され、RPC1
75cDNAと分子雑種を形成しなかった1.2kbp Pst I断片中
にプロモーター領域が存在すると考えられた。

（４）プロモーター領域の特定 RPC175cDNAの5'側の塩基配列の解析から、RPC175のこ
の領域には同じ読み枠で２つのATGが存在することが分
かった。

このうち下流のATGを含むプライマーを合成し、RPG102のプロモーター領域の3'側約300bpの
塩基配列を決定した。

プライマー伸長法による転写開始点の決定を確実に行
うためC5FWの約40bp上流にもう一つのプライマーを合成した。

両プライマー10pmolesをMEGARABEL（宝酒造）キット
に従って、［γ−³²P］ATPを用いてリン酸化反応により
5'末端をRIラベルした。この末端ラベルされたプライマ
ー0.1pmole（0.3×10⁶cpm）と雌蕊と葉の全RNA20μｇと
を、3units/μｌのRNaseインヒビター（RNAguard,Pharm
acia社）存在下で緩衝液（0.25M KCl,2mM Tris−HCl pH
8.0,0.2mM EDTA）中で10μｌの反応系で40℃、２時間ア
ニーリングさせた。その後緩衝液（66mM Tris−HCl pH
8.3,6.6mM MgCl₂,1.3mM DTT,0.66mM dNTP,130μg/mlア
クチノマイシンＤ）を30μｌ、逆転写酵素（Ｍ−MuLV,B
RL社）を１μｌ（200units）加え、37℃で１時間保温し
た。さらに酢酸アンモニウムを用いたエタノール沈殿を
行い、70％エタノールで洗浄後、風乾し泳動用緩衝液
（T7 Sequencing kit（Pharmacia社）の反応停止液と0.
1M NaOH,1mM EDTAを2:1に混合したもの）に溶解した。1
/3量を95℃で３分間加熱した後、６％アクリルアミドゲ
ルで電気泳動を行った。また同じプライマーを用い、RP
G102を含むプラスミドを鋳型にT7 Sequencing kitでシ
ーケンス反応を行った産物も同時に泳動した。

その結果、図４に示したように、この遺伝子が発現し
ていない葉のRNAからは伸長産物が得られなかったのに
対し、雌ずいの全RNAを鋳型にした場合には、C5FWプラ
イマーで２本、P3FW2プライマーで３本の伸長産物のバ
ンドが検出された。隣接して泳動したシーケンスラダー
の比較から、産物の検出された位置は両プライマーとも
同じ位置であった。

この結果からRPG102の転写は数塩基おきに離れた３ヶ
所のＡ（アデニン）から開始されることが示された。最
も5'側の転写開始点のアデニンの30bp上流には5'−TATA
TAA−3'というTATAボックス様配列が存在し、植物にお
ける他の遺伝子の例（Joshi,Nucleic Acids Res.,15,6
643−6653,1987）とよく一致した。またこの転写開始点
のアデニンの77bpおよび113bp下流には前述の通り２つ
翻訳開始点のATGが36bpを挟んで同じ読み枠で存在して
いた（図５）。

（５）RPG102の全塩基配列の決定実施例２（３）のRPG102 Pst I消化物のうち1.2、0.
8、0.45kb断片をpBluescriptの同サイトへサブクローニ
ングした。このうちプロモーター配列を含むPst I 1.2k
p断片に関してはキロシークエンス用ディレーションキ
ット（宝酒造）を用いて100bp〜200bpの段階的な欠失を
持ったディレーションクローンを両鎖合わせて20クロー
ン作成し、M13プライマー（宝酒造）を用いて蛍光シー
クエンサー（モデル373A、Applied Biosystems社）で塩
基配列を決定した。また、構造遺伝子を含む0.8kbおよ
び0.45kb断片に関してはM13プライマー（宝酒造）、お
よび実施例１（７）の内部プライマーを用いて塩基配列
を決定した。これらに加えRPG102それ自体についても、
M13プライマーおよび内部プライマーを用いて3'領域の
塩基配列を決定し、最終的にRPG102の全塩基配列を明ら
かにした。

その結果、RPG102クローンの総塩基配列数は2636bp
で、cDNAクローンRPC175との塩基配列の比較から、構造
遺伝子領域には85bpと199bpの長さの２つのイントロン
が存在していることが明らかとなった。イントロンの両
末端の塩基配列5'GTおよびAG3'は２つのイントロンとも
に保存されていた。またこのイントロン以外の領域の塩
基配列はゲノミッククローンRPG102とcDNAクローンRPC1
75とで完全に一致した。3'側のEcoR Iサイトのおよそ90
bp上流、翻訳終止コドンTAGのおよそ40bp下流にはポリ
Ａシグナル様配列5'−AATAAA−3'（Heidecker and Mess
ing,Annu.Rev.PlantPhysiol.37,439−466,1986）が位置
していた。

RPG102の全塩基配列を配列番号２に示す。なお、配列
中の括弧内はイントロン配列を示すものである。さらに
RPG102とRPC175の制限酵素地図の比較を図６に示した。

実施例３プロモーター発現部位解析（１）プロモーター発現解析用ベクターの構築とイネの
形質転換単離したプロモーターの発現をin vivoで解析するた
めに、GUS（β−glucuronidase）レポーター遺伝子を連
結したベクターの構築を以下のように行った。先述の通
りRPC175にはその最も上流の転写開始点の77bpと113bp
下流に同じ読み枠で２つのATGが存在する。このうちど
ちらのATGが真の翻訳開始点かを実験的に示すことが困
難であったため、両方のATGに関してプロモーター発現
解析用ベクターを構築した。

２つのATGのうち上流のATG（1st ATG）の64bp上流に
はSnaB Iサイト（最も上流の転写開始点の13bp下流）が
あり、また下流のATG（2ndATG）の12bp上流にはPst Iサ
イトが存在する（配列番号１および２）。これらのサイ
トを用いて遺伝子構築を行った。そのために塩基配列の
決定の際に構築した、RPC175のプロモーター部分を含む
1.2kb Pst I断片をpBluescriptのPst Iサイトに組み込
んだプラスミドを利用した。1stATG用プロモーターでは
このプラスミドを制限酵素Pst I、SnaB Iで消化し、プ
ロモーター断片（約1.1kb）を切り出した後、DNA Blunt
ing Kit（宝酒造）を用いて両端を平滑末端化した。ま
た2nd ATG用プロモーターでは、Pst Iサイトの外側にあ
るpBluescript上の制限サイトHind IIIとXba Iで消化
し、プロモーター断片（約1.2kb）を切り出した。

一方、ベクター側はAgrobacterium用のスーパーバイ
ナリーベクターpSB24（Komari et al.Plant J.10,165−
174,1996）を利用した。このベクターはCaMV35Sプロモ
ーターの下流に、ヒマカタラーゼ第一イントロンが組み
込まれたGUS構造遺伝子が配置されており、イントロン
による発現量の増強が図られている。このベクターをHi
nd III、Xba Iで消化し、35Sプロモーターを除いた後、
1st ATG用では末端を平滑化し、2nd ATG用では突出末端
のまま、それぞれ1.1kb Pst I−SnaB I断片（平滑末端
化したもの）、1.2kb Hind III−Xba I断片とライゲー
ションし、RPC175プロモーター＋IGUS＋NOSターミネー
ターの構造をもつベクターpYOT175IG−１とpYOT175IG−
２を構築した。また、イントロンによる組織特異性の変
化が危惧されたため、特に2nd ATG用プロモーターに関
してはイントロンが組み込まれていないタイプのベクタ
ーも構築した。そのためにイントロンが組み込まれてい
ないタイプのスーパーバイナリーベクターpSB21（Komar
i et al.Plant J.10,165−174,1996）を利用した。

このプラスミドをHind IIIおよびXba Iで消化し、35S
プロモーターを除去したところへ、前述の1.2kb Hind I
II−Xba I断片をライゲーションし、RPC175プロモータ
ー＋GUS＋NOSターミネーターの構造をもつベクターpYOT
175G−２を構築した。以上３つの発現解析用ベクターの
構築手順を図７に模式的に示した。このうちpYOT175IG
−２およびpYOT175G−２では、形質転換イネの細胞内に
おけるRPC175の翻訳が上流のATGから開始された場合、
それぞれ−１タイプおよび、＋１タイプのフレームシフ
トが起こり、GUSタンパクが翻訳されない。

構築が完了したベクターは大腸菌からAgrobacterium
tumefaciensへ三菌系接合により移行した後、Hiei et a
l.（PlantJ.,6,271−282,1994）の方法に従い、イネ品
種「月の光」の未熟胚由来カルスを材料にAgrobacteriu
mを介してハイグロマイシン抵抗性遺伝子とともに各コ
ンストラクトを同時導入した。PCRにより遺伝子導入を
確認後、温室栽培した。

（２）GUSの組織学的観察によるプロモーター発現部位
解析 Jefferson et al.（EMBO J.,6,3901−3907,1987）の
方法に従い、形質転換イネの各器官に対してＸ−gluc.
（５−bromo−４−chloro−３−indolylβ−Ｄ−glucur
onide）を基質としたGUS染色を行い、実体顕微鏡および
光学顕微鏡下で細胞組織学的観察を行った。その結果、
イントロン挿入タイプのコンストラクト（pYOT175IG−
１および２）ではほとんどの形質転換体において、雌蕊
柱頭部、葯や花糸、および鱗被におけるRPC175プロモー
ターによるGUS発現が認められた。また一部の個体にお
いて内外穎や葉、根のいずれかにおいてもGUS発現が見
られた（図８）。

イントロンを含まないタイプ（pYOT175G−２）では、
PCRやサザン分析によって遺伝子導入が確認されている
にもかかわらず、調査したいずれの器官においてもGUS
発現が肉眼観察されない個体の割合が多かった。また、
その発現も斑点状のものが多かったが、発現部位特異性
に関してはイントロンを含むものとよく一致した（図
８）。従ってイントロンによる組織特異性の変化はほと
んどないと考えられた。

pYOT175IG−２とpYOT175G−２でGUS発現が見られたこ
とから、RPC175遺伝子の翻訳開始点は２つ目のATG（2nd
ATG）であることが強く示唆された。

いずれかの組織でGUS発現の見られた形質転換体のう
ち雌蕊、葯や花糸、鱗被の全ての組織でGUS発現が観察
された形質転換体の比率はpYOT175IG−１で81％、pYOT1
75IG−２で94％、pYOT175G−２で25％であった。このう
ちノーザン分析やRT−PCR分析の結果と一致した、即ち
内・外穎や葉、根における発現の見られない個体の比率
は３つのコンストラクトともに約５割であった。なお、
図８においては縦軸に、ある組織で発現の見られた形質
転換体の数を示している。

雌蕊におけるGUSの発現部位は柱頭軸および分岐部
で、毛状の柱頭末端部の細胞では発現していなかった
（図9A）。一方子房でのGUS発現も肉眼観察からは全く
見られなかった。雌蕊に関しては葯の他花糸においても
高頻度でGUS発現が認められた（図9B）。さらに、鱗被
内の維管束組織およびそれを取り囲む細胞群における高
発現が見られた（図9C）。

次に、花器の発達段階における発現時期特異性を調査
した。その結果、出穂開花期の雌蕊において最も強い発
現が見られ、葉耳間長−５から5cmの生育ステージの雌
蕊ではイントロン挿入コンストラクトではGUS発現が見
られたが、イントロン無しのコンストラクトではGUS発
現は見られなかった。このことは、毛状の柱頭組織が分
化する時期の雌蕊においてはRPC175プロモーターの発現
量は開花期の雌蕊ほどは強くはないことを示唆してい
る。

葉や根、あるいは内・外穎における発現が見られた原
因は不明であるが、Ｔ−DNAがイネゲノムへ挿入される
部位の違いによる位置効果や導入遺伝子の再編成などが
考えられる。

（３）GUSの蛍光アッセイによるプロモーター活性の測
定形質転換当代において、GUSの組織学的観察によるプ
ロモーターの発現部位が、ノーザンブロット分析やRT−
PCRの結果とよく一致した系統をpYOT175G−１とpYOT175
G−２から１系統ずつ選び、その次世代（R1世代）のGUS
発現をMUG（４−methylumbelliferylβ−Ｄ−glucuroni
de）を基質とした蛍光法により解析した。非形質転換
体、及び、pYOT175IG−１に関しては１個体、pYOT175G
−２に関しては４個体のR1世代の植物から、葉、根、雌
蕊、葯（＋花糸）、鱗皮、内・外穎を採取し、タンパク
を抽出し、GUSアッセイを行った。その結果、図10に示
したように、形質転換体のGUS活性は、葉、根に関して
は非形質転換体のそれと同レベル（18〜210ユニット）
であったのに対し、雌蕊、葯および鱗皮においては個体
間差はあるものの、非形質転換体のほぼ10〜1000倍の活
性が検出された。活性の値はmgタンパク当たり雌蕊で48
6〜38829ユニット、鱗皮で1044〜14496ユニット、葯で1
808〜203910ユニットとなり、非常に高い活性があった
（１ユニット;1分間でMUGから1pmoleの４−MU（４−met
hylumbelliferone）を生産する活性）。また内・外穎に
ついても非形質転換体の１〜10倍の活性（64〜650ユニ
ット）が認められた。このことから、形質転換体後代に
おいても、175プロモーターは安定して花器特異的に発
現することが示された。

以上、形質転換当代および次世代のGUS解析から、本
プロモーターは花器で特異的に発現するプロモーターで
あることが確認された。

実施例４ 175タンパクのキチナーゼ活性の測定（１）RPC175のコードするタンパク質の大腸菌内発現 RPC175のコードするキチナーゼ様タンパク質が、実際
にキチナーゼ活性を有しているか否かを調べるために、
まず175タンパクを大腸菌内で発現させた。これに関し
てはキアゲン社のThe QIAexpressionistシステムを用い
た。

ｉ）発現ベクターの構築発現ベクターは、pQE30を用いた。このベクターに
は、マルチクローニングサイトの上流に６個のヒスチジ
ンが配置されている。従って、このベクターでタンパク
を発現させると、Ｎ末にヒスチジンのタグが付加された
形の、融合タンパクとして発現される。

構築手順を図11に示した。RPC175は、キチナーゼ様タ
ンパクをコードしている。他のキチナーゼとの構造比較
から、Ｎ末には20アミノ酸のリーダー配列が存在すると
考えられる。遺伝子構築の際には、このリーダー配列を
除去した形で構築した。まず、RPC175をPst Iで消化
し、成熟タンパクのＮ末の一部が欠けるが、その他のほ
とんどの領域を含む約1kbの断片を調製した。次に２つ
のプライマーを合成し、PCRを行い、欠けているＮ末部分を増幅し
た。産物をBamH I、Pst I消化し、pBS IIへサブクロー
ニングした。塩基配列を確認後、このプラスミドをPst
Iで消化し、CIP処理した後、先述の1kb Pst I断片を挿
入し、RPC175成熟タンパクの全領域を含むプラスミドを
作製した。これをBamH I、Hind IIIで消化し、同酵素で
消化したベクターpQE30へクローニングした。完成した
ベクター（pQE30−175△Ｎと命名）は、塩基配列を確認
後、大腸菌内発現実験に供試した。

ii）大腸菌内発現と、タンパク質精製大腸菌M15のコンピテントセルを調製し、構築した発
現ベクターで形質転換した。形質転換コロニーからプラ
スミドを抽出し、発現ベクターが導入されていることを
確認した。その後の大腸菌の培養条件、IPTGによる誘導
はキット添付のプロトコールに従った。基本的にはアン
ピシリンとカナマイシンと添加した2XYT液体培地50ml
へ、一晩培養した大腸菌懸濁液を50分の１量加え、2.5
時間培養し、A₆₀₀＝0.5程度になっているのを確認後、
２〜4mMのIPTGを添加し、さらに4.5時間培養した。対照
としてIPTGによる誘導をかけない区と、ベクター（pQE3
0）のみを持つ大腸菌の区を設けた。これらの菌体を遠
心分離により回収し、−80℃で保存した。タンパクの粗
抽出、およびNi−NTAアガロース（キアゲン社）による
タンパクの精製は、添付のプロトコールに従った。タン
パク粗抽出液および精製タンパクはLaemmli（Narure 22
7,680−685,1970）の方法に従い、12.5％〜15％ SDSポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動し、その後、クマシー
ブリリアントブルー（CBB）R250で染色した。その結
果、可溶性タンパク質画分には、RPC175由来のタンパク
質と考えられるバンドは、どの区においても検出されな
かった。それに対し、不溶性画分には、pQE30−175△Ｎ
で誘導をかけた区においてのみ、予想された33kDよりも
若干大きいサイズのバンドが検出された。このようにRP
C175のコードするタンパクは、そのほとんどが不溶性と
なり、不溶化させるためには8Mの尿素を緩衝液に加える
必要があった。しかしながらこの不溶性タンパクの発現
量は非常に多く、しかもNi−NTAアガロースで精製でき
た。図12には50mlのスケールで培養した菌体から精製し
た175タンパク全量の1/2を電気泳動した結果を示した。
次に、抗体作製用の試料を得るために、250mlスケール
で大腸菌の培養を行い、上記と同じ条件で、不溶性175
タンパクを抽出・精製し、ポリアクリルアミドゲルから
発現タンパクのバンドを切り出した。切り出したアクリ
ルアミドゲルは、剃刀で細断した後、エッペンチューブ
へ移し、ホモジェナイザーでさらに粉々にした。ここへ
10倍量の緩衝液（20mM Tris pH8.0,1％ SDS）を加え、
１〜２晩、室温で振とうし、タンパク質をアクリルアミ
ドゲルから、溶出させた。遠心でゲルを落とし、上清を
80％アセトン中で１晩透析した。透析チューブは、Spec
tra/Por1 MWCO:6−8,000（Spectrum Medical Industrie
s社）を用いた。その後、透析チューブから、タンパク
溶液を回収し、乾燥させた。

タンパクサンプルは1X SDSサンプルバッファー（Mani
atis et al.1982）へ懸濁し、95℃、５分処理した後、1
5％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。その
後、Ni−NTA HRP conjugate（キアゲン社）を抗体とし
たウエスタンブロットを行い、切り出したタンパク質サ
ンプルが、確かに目的のタンパク質であることを確認し
た。また、電気泳動後にCBB染色し、濃度の分かってい
るマーカー（Prestained SDS−PAGE standards Low Ran
ge、BIORAD社）と比較し、タンパク濃度を推定した。

iii）抗体の作製抗体作製は、（株）サワディーテクノロジー社へ依頼
した。完成したウサギ抗体のELISAによるタイターは、2
3,600と算出された。HRPを２次抗体としたウェスタン分
析の結果、本抗体は送付したタンパクサンプルと感度よ
く反応した。

iv）RPC175のコードするタンパクの可溶化上述のように、大腸菌で発現させたRPC175のコードす
るタンパク質は、そのほとんど（99％以上）が不溶性に
なる。一方、可溶性の画分を上記抗体でウェスタン分析
すると、175タンパクが少量ながら検出される。しかも
この微量に存在する175タンパク質はNi−NTAアガロース
で精製されうることが分かった。一般に、大腸菌で異種
タンパク質を発現させる際、急激な発現誘導に伴い、タ
ンパク質が正しい折りたたみ構造をとれず、不溶性の封
入体が形成されることが多い。これを回避するための方
策として、誘導条件を緩やかにすることが挙げられる。
そこで、可溶性の175タンパク質を多く得る目的で、誘
導条件の主要素であるIPTG濃度と培養温度に着目して以
下の実験を行った。即ち、IPTG濃度が2mMで培養温度が3
7℃、IPTG濃度が0.5mMで培養温度が25℃、IPTG濃度が0.
1mMで培養温度が15℃と３つの誘導条件を設定した。こ
の場合、培養時間は、培養温度が37℃あるいは25℃の時
は4.5時間、15℃の時は18時間とした。各誘導条件下で
培養した後の菌の濁度をA₆₀₀により測定したところ、37
℃、25℃、15℃の順に、1.04、0.89、0.85となった。こ
れらの条件でタンパク質発現を誘導した大腸菌（培養液
50ml）を遠心分離により集菌し、−80℃で保存した。こ
の菌体をキアゲン社のプロトコールに従って、尿素を加
えない緩衝液でタンパクを抽出し、Ni−NTAアガロース
でHISタグのついた175タンパクを精製した。最終的に10
mMのTrisを含んだpH4.5の0.1Mリン酸緩衝液300μｌで、
175タンパクをNi−NTAアガロースから溶出した。溶出液
10μｌをSDS−PAGEにより電気泳動し、175タンパクに対
応する上記抗体により、ウェスタン分析を行った。この
際、175タンパクの量が非常に微量であることが予想さ
れたため、ウェスタン分析はECL＋plus（Amersham社）
の系を用いた。一次抗体、二次抗体は、ともに1/10000
の濃度で加え、分画タンパクがブロットされたECLニト
ロセルロース膜と１時間ずつ反応させた。また基質との
反応時間は５分とし、Ｘ線フィルムを２〜20分間感光さ
せた。その結果、図13に示すように、IPTG濃度及び大腸
菌の培養温度を低下させるにつれ、可溶性精製175タン
パクに由来するバンドの濃度が増加した。これらのバン
ドの濃度と、隣接して泳動した濃度の分かっている上記
175タンパク（抗体作製用に調整した、不溶性画分を8M
尿素で溶解したもの、10ng）のバンドの濃度をデンシト
メーターにより、比較・定量した。その結果、各培養条
件における可溶性175タンパク量は、誘導条件の緩い順
に97.6ng、12.4ng、2.1ngとなった。また、Ni−NTAアガ
ロースからの全溶出タンパク10μｌ分をBio−Rad Prot
ein Assay（BIORAD社）により定量したところ、それぞ
れ38μｇ、24μｇ、34μｇとなった。従って、全溶出タ
ンパク中に含まれる175タンパクの比率は、それぞれ2.5
7％、0.52％、0.06％と算出された。これは、IPTG濃度
及び大腸菌の培養温度を低下させることで、可溶性175
タンパクの比率を増加させることができたことを示して
いる。

（２）キチナーゼ活性の測定キチナーゼ活性は、コロイダルキチンを基質として可
溶化した糖をReissig法により定量した。コロイダルキ
チンは以下のように作製した。キチン粉末2gを冷濃塩酸
100mlに温度を上げながら徐々に溶解し、Ｇ−３ガラス
フィルターで濾過した。濾液を10倍量の滅菌水に徐々に
加え、４℃で一晩静置し、キチンを再沈殿させた。上清
を除いた後、滅菌水に再懸濁し、6000g、10分間遠心し
た。上清のpHが中性になるまでこの洗浄操作を繰り返
し、最終的に150mlの滅菌水に懸濁し、これをコロイダ
ルキチン溶液とした。

キチナーゼ活性は以下のように測定した。酵素液100
μｌとコロイダルキチン100μｌを混合し、37℃で２時
間保温した。6000rpm、５分遠心し、上清150μｌを回収
した。一方、同じ酵素液だけを同様に37℃で２時間保温
し、コロイダルキチンを加えた後直ちに遠心した区も設
け、ブランクとした。これらの上清に15μｌの1Mリン酸
緩衝液（pH7.2）を加え、pHを調整した後、10μｌの３
％ヘリカーゼ（SIGMA社）を加え、37℃で１時間保温し
キチンオリゴマーを加水分解させた。その後、0.8Mホウ
酸カリウム−KOH（pH10.2）を30μｌ加え、上記アッセ
イ試薬に溶解した標準曲線作成用の25、50、100nmolの
Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc、SIGMA社）ととも
に３分間煮沸した。煮沸後直ちに氷冷し、1mlのｐ−ジ
メチルアミノベンツアルデヒド（DMAB、和光純薬）溶液
（1gのDMABを１％塩酸を含む100mlの酢酸に溶解したも
の）を加え、37℃で20分間保温し、A₅₈₅の吸光度を測定
し、標準曲線からGlcNAc量を算定した。活性は１分間に
１μmolのＮ−アセチルグルコサミンに相当する糖を可
溶化させる単位を１単位とした。

このアッセイ系により、上記の３つの発現誘導条件で
培養した、大腸菌由来のHISタグ精製175タンパクのキチ
ナーゼ活性を測定した。対照としてベクター（pQE30）
のみを有する大腸菌由来のタンパクと、IPTGによる誘導
をかけない区のタンパクも同時に抽出・精製し、活性測
定を行った。その結果、表２に示したように、培養温度
15℃、IPTG濃度0.1mMの実験区において、pQE30−175△
Ｎに発現誘導をかけた場合に、明らかなキチナーゼ活性
が検出された、活性の値は1.9mU/mgタンパク質で、対照
区（０〜0.51mU/mgタンパク）の３〜４倍であった。た
だし、これはNi−NTAアガロースから溶出された全タン
パク質当たりの活性の値である。上述の通り、175タン
パク質の全溶出タンパク質に占める比率はおよそ2.57％
である。従って、175タンパク質本来の酵素活性は、mg
当たり少なくとも数十mUと推定される。なお、培養温度
25℃の区においても、対照区に比べわずかなキチナーゼ
活性が検出されたが、培養温度37℃の区では活性はみら
れなかった。これはおそらく活性測定に供試される175
タンパク質の濃度が低いためであると考えられた。

以上のことからRPC175のコードするキチナーゼ様タン
パク質は、実際にキチナーゼ活性を有することが明らか
となった。

発明の効果本発明によれば、植物の葯に加え、雌蕊や鱗被などの
花器諸器官に対しても遺伝子工学的操作が可能となる。
したがって、例えば雌性不稔や柱頭露出イネの作出、あ
るいは開花特性の生理的な制御などを行うことができ
る。また、本発明によれば、キチンを含有する病原菌に
対する抵抗性植物を作出する事が可能となる。

配列表配列番号:1 配列の長さ:1318 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA to mRNA 起源：生物名：オリザサティバ（Oryza sativa L.）品種名:IR24 組織の種類：雌蕊直接の起源：ライブラリー名：雌蕊mRNA由来λZAP II cDNAライブ
ラリークローン名:RPC175 配列の特徴配列配列番号:2 配列の長さ:2636 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノムDNA 起源：生物名：オリザサティバ（Oryza sativa L.）品種名:IR24 組織の種類：緑葉直接の起源：ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λdash IIゲノミ
ックライブラリークローン名:RPG102 配列の特徴配列配列番号:3 配列の長さ:328 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：起源：生物名：オリザサティバ（Oryza sativa L.）品種名:IR24 組織の種類：雌蕊直接の起源：ライブラリー名：雌蕊mRNA由来λZAP II cDNAライブ
ラリークローン名:RPC175 配列の特徴配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者伊藤徹静岡県磐田郡豊田町東原700番地日本たばこ産業株式会社遺伝育種研究所内 (56)参考文献特表平６−510662（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／002319（ＷＯ，Ａ１) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，1993 年，第241巻，第１−２号，ｐ．１−10 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，1991 年，第226巻，第１−２号，ｐ．289− 296 ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，1996年１月，第30巻, 第３号，ｐ．387−401 Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1994年，第58巻，第６号，ｐ．1164−1166 ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，1996年５月，第97巻，第１号，ｐ．39−46 ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，2000年，第42巻，ｐ. 883−897 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 A01H 1/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号２で表される塩基配列の
うち、第１番目から第1234番目の塩基から成る配列、ま
たはこの配列のうち１または複数のヌクレオチドが欠
失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモー
ター活性を有するDNA。
【請求項２】配列表の配列番号２で表される塩基配列の
うち、第１番目から第1140番目の塩基から成る配列、ま
たはこの配列のうち１または複数のヌクレオチドが欠
失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモー
ター活性を有するDNA。
【請求項３】配列表の配列番号２で表される塩基配列の
うち、第１番目から第1121番目の塩基から成る配列、ま
たはこの配列のうち１または複数のヌクレオチドが欠
失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモー
ター活性を有するDNA。
【請求項４】配列表の配列番号２で表される塩基配列の
うち、第１番目から第1234番目の塩基から成る配列、ま
たはこの配列のうち１または複数のヌクレオチドが欠
失、置換、挿入若しくは付加された配列を含む花器特異
的プロモーター活性を有するDNA断片に、下記のハイブ
リダイズ条件： 0.25M Na₂HPO₄、pH7.2、７％ SDS、1mM EDTA、１×デン
ハルト溶液からなる緩衝液中で、68℃の条件で16〜24時
間ハイブリダイズさせる；および 20mM Na₂HPO₄、pH7.2、１％ SDS、1mM EDTAからなる緩
衝液中で、68℃の条件で15分間の洗浄を２回行う、でハイブリダイズし、上記花器特異的プロモーター活性
を保持する塩基配列から成るDNA。
【請求項５】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第114番目から第1097番目の塩基配列から成る配
列、若しくは前記塩基配列と下記のハイブリダイズ条
件： 0.25M Na₂HPO₄、pH7.2、７％ SDS、1mM EDTA、１×デン
ハルト溶液からなる緩衝液中で、68℃の条件で16〜24時
間ハイブリダイズさせる；および 20mM Na₂HPO₄、pH7.2、１％ SDS、1mM EDTAからなる緩
衝液中で、68℃の条件で15分間の洗浄を２回行う、でハイブリダイズし、キチナーゼ活性を有するタンパク
質をコードするDNA。
【請求項６】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第114番目から第1097番目の塩基配列から成る配
列、若しくは前記塩基配列のうち１または複数のヌクレ
オチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を有
し、キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDN
A。
【請求項７】配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配
列から成る配列、若しくは前記アミノ酸配列のうち１ま
たは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加さ
れた配列を有する、キチナーゼ活性を持つペプチド。
【請求項８】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第174番目から第1097番目の塩基配列から成る配
列、若しくは前記塩基配列と下記のハイブリダイズ条
件： 0.25M Na₂HPO₄、pH7.2、７％ SDS、1mM EDTA、１×デン
ハルト溶液からなる緩衝液中で、68℃の条件で16〜24時
間ハイブリダイズさせる；および 20mM Na₂HPO₄、pH7.2、１％ SDS、1mM EDTAからなる緩
衝液中で、68℃の条件で15分間の洗浄を２回行う、でハイブリダイズし、キチナーゼ活性を有するタンパク
質をコードするDNA。
【請求項９】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第174番目から第1097番目の塩基配列から成る配
列、若しくは前記塩基配列のうち１または複数のヌクレ
オチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を有
し、キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDN
A。
【請求項１０】配列表の配列番号１で表される塩基配列
のうち、第363番目から第1097番目の塩基配列から成る
配列、若しくは前記塩基配列と下記のハイブリダイズ条
件： 0.25M Na₂HPO₄、pH7.2、７％ SDS、1mM EDTA、１×デン
ハルト溶液からなる緩衝液で、68℃の条件で16〜24時間
ハイブリダイズさせる；および 20mM Na₂HPO₄、pH7.2、１％ SDS、1mM EDTAからなる緩
衝液中で、68℃の条件で15分間の洗浄を２回行う、でハイブリダイズし、キチナーゼ活性を有するタンパク
質をコードするDNA。
【請求項１１】配列表の配列番号１で表される塩基配列
のうち、第363番目から第1097番目の塩基配列から成る
配列、若しくは前記塩基配列のうち１または複数のヌク
レオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を
有し、キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードする
DNA。
【請求項１２】配列表の配列番号３で表されるアミノ酸
配列のうち第21番目から第328番目のアミノ酸配列から
成る配列、若しくは前記アミノ酸配列のうち１または複
数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された配
列を有する、キチナーゼ活性を持つペプチド。
【請求項１３】配列表の配列番号３で表されるアミノ酸
配列のうち第84番目から第328番目のアミノ酸配列から
成る配列、若しくは前記アミノ酸配列のうち１または複
数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された配
列を有する、キチナーゼ活性を持つペプチド。