JP3516455B2 - 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、工業用酵素として有用な超耐熱性プロテア
ーゼ、それをコードする遺伝子および該酵素の遺伝子工
学的製造方法に関する。

背景技術 プロテアーゼは蛋白質中のペプチド結合を切断する酵
素であり、動物、植物、微生物より数多くの酵素が見い
出されている。その用途は研究用試薬、医薬の他、洗剤
への添加、食品の加工、逆反応を利用した化学合成とい
った工業的分野にも及び、産業上極めて重要な酵素とい
える。工業的分野で使用されるプロテアーゼには物理
的、化学的に高い安定性を要求されることから、特に耐
熱性の酵素が好んで使用されている。バチルス（Bacill
us）属細菌の生産するプロテアーゼは割合に高い耐熱性
を示すことから、現在、産業的に使用されているプロテ
アーゼの主流を占めている。しかし、さらに優れた酵素
が望まれており、高温で生育する微生物、例えば、好熱
性バチルス属細菌より酵素を取得しようとする試みもな
されている。

一方、超好熱菌と呼ばれる一群の微生物は高温環境に
よく適応しており、さまざまな耐熱性酵素の供給源とし
て期待されている。これら超好熱菌のひとつであるピロ
コッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）がプロ
テアーゼを生産することが知られている［アプライド・
アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー
（Appl.Environ.Microbiol.）第56巻、第1992〜1998頁
（1990）、エフ・イー・エム・エス・マイクロバイオロ
ジカル・レターズ（FEMS Microbiol.Letters）第71巻、
第17〜20頁（1990）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・
マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）第137巻、
第1193〜1199頁（1991）］。

また、ピロコッカス属に属する超好熱菌、KOD1株（Py
rococcus sp.Strain KOD1）はチオールプロテアーゼ
（システインプロテアーゼ）を生産することが報告され
ている［アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・
マイクロバイオロジー（Appl.Environ.Microbiol.）第6
0巻、第4559〜4566頁（1994）］。同じく超好熱菌であ
るサーモコッカス（Thermococcus）属、スタフィロサー
マス（Staphylothermus）属、サーモバクテロイデス（T
hermobacteroides）属の細菌についてもプロテアーゼの
生産が知られている［アプライド・マイクロバイオロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー（Appl.Microbiol.Bio
technol.）第34巻、第715〜719頁（1991）］。

発明の目的 これら超耐熱菌の生産するプロテアーゼは高い耐熱性
を持つことから、これまでの酵素にない用途へも応用が
期待されるが、上記の文献のほとんどにおいては無細胞
抽出液、あるいは培養液上清より得られた粗酵素液中に
耐熱性のプロテアーゼ活性が存在することが示されてい
るだけであり、精製、純化された酵素の性質等について
は明らかにされていない。唯一、KOD1株の生産するプロ
テアーゼは精製酵素が得られているが、システインプロ
テアーゼは酸化によって容易に失活するという欠点を有
しており、工業的な使用には不利である。また、これら
超好熱菌からの酵素の取得には高温での微生物培養操作
を要するため、工業的な酵素製造方法としては問題を有
している。

本発明の目的は上記の課題を解決するために、工業的
な使用に有利な超好熱菌のプロテアーゼを提供するこ
と、該超好熱菌のプロテアーゼをコードする遺伝子を単
離すること、および該遺伝子を用いた超耐熱性プロテア
ーゼの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。

発明の開示 本発明者らは超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を取得する
ため、独自にピロコッカス・フリオサスDSM3638菌体お
よび培養液上清プロテアーゼを精製し、酵素の部分アミ
ノ酸配列を決定することを試みた。しかし、菌体、培養
液上清のどちらの場合もプロテアーゼの精製は極めて困
難であり、部分アミノ酸配列を決定し得る純度の酵素標
品を得ることはできなかった。

目的とする酵素タンパクの一次構造に関する情報なし
に酵素遺伝子をクローニングする方法としては発現クロ
ーニング法があり、例えば、ピロコッカス・ボウゼイ
（Pyrococcus wosei）由来のプルラナーゼ遺伝子（WO92
/02614）はこの方法により取得されている。発現クロー
ニング法には一般にプラスミドベクターが使用される
が、この場合には目的遺伝子がその内部で切断されるこ
となく、かつプラスミドベクターに挿入可能な程度の比
較的小さなDNA断片に切断されるような制限酵素を用い
なければならず、必ずしもすべての酵素遺伝子のクロー
ニングに適用可能ではない。さらに数多くのクローンに
ついて酵素活性の発現を調べる必要があり、操作が繁雑
である。

本発明者らはプラスミドベクターにかえて、より大き
なDNA断片（30〜50kb）を保持できるコスミドベクター
を用いてピロコッカス・フリオサスのコスミドライブラ
リーを作成し、該ライブラリー中にプロテアーゼ活性を
発現するコスミドクローンを検索することにより、プロ
テアーゼ遺伝子を単離することを試みた。コスミドベク
ターを用いることにより酵素遺伝子内部が切断されるお
それが減るとともに、スクリーニングする形質転換体の
数を減らすことができる。その反面、コスミドベクター
はプラスミドベクターに比べて宿主内でのコピー数が高
くないため、酵素の発現量が低く活性を検出できない可
能性がある。

本発明者らは、まず、目的とする酵素が高い耐熱性を
有する点に着目し、コスミドライブラリー中の形質転換
体を個別に培養して得られた菌体から耐熱性の蛋白質の
みを含むライゼートを調製する工程を組み合わせ、この
ライゼートを酵素活性の検出に用いた。さらにプロテア
ーゼ活性の検出にゼラチンを含むSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法を用いることにより、ごく微量の酵
素活性の検出を可能にした。

かくして、本発明者らはピロコッカス・フリオサスの
コスミドライブラリーよりプロテアーゼ活性を発現する
数個のコスミドクローンを取得し、このクローン中に含
まれる挿入DNA断片よりプロテアーゼをコードする遺伝
子の単離に成功した。また、該遺伝子のコードするプロ
テアーゼが極めて高い耐熱性を有することも確認した。

該遺伝子の塩基配列から推定される超耐熱性プロテア
ーゼのアミノ酸配列と、既知の微生物由来プロテアーゼ
のアミノ酸配列との比較から、該超耐熱性プロテアーゼ
の前半部分のアミノ酸配列とサブチリシンに代表される
一群のアルカリ性セリンプロテアーゼとの間に相同性が
存在することが示され、特に酵素の触媒活性に重要とさ
れる４つのアミノ酸残基周辺で極めて高い相同性が認め
られた。このように常温菌由来のプロテアーゼが容易に
失活するような高温で活性を示すピロコッカス・フリオ
サスの生産するプロテアーゼに常温菌由来の酵素と類似
した構造が保存されていることが示されたことより、ピ
ロコッカス・フリオサス以外の超好熱菌においても同様
の構造が保存されたプロテアーゼが生産されていること
が示唆された。

そこで、本発明者らは得られた超耐熱性プロテアーゼ
遺伝子のうち、サブチリシンなどと相同性の高い領域を
コードする塩基配列が超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を探
索するプローブとして有用である可能性に着目し、該塩
基配列をもとに作成した合成DNAをプライマーに用いたP
CRによる超好熱菌由来のプロテアーゼ遺伝子の検出、お
よびそのクローニングを試みた。その結果、超好熱菌サ
ーモコッカス・セラー（Thermococcus celer）DSM2476
に上記の遺伝子と相同性を有する遺伝子断片の存在が認
められた。該遺伝子全長のクローニングは困難であり、
これは該遺伝子の産物が宿主に対して負荷になるためと
考えられた。

本発明者らは、クローニングの宿主に枯草菌（Bacill
us subtilis）を用いたところ、該遺伝子全長の保持が
可能であるとともに、発現されたプロテアーゼが菌体外
に分泌されることを見い出し、さらに発現されたプロテ
アーゼが95℃においてプロテアーゼ活性を示すこと、高
い耐熱性を有することを明らかにした。なお、該遺伝子
にコードされるプロテアーゼの分子量は上記のピロコッ
カス・フリオサス由来の高分子量プロテアーゼの半分以
下であった。

また、該遺伝子の断片をプローブとしたハイブリダイ
ゼーションにより、ピロコッカス・フリオサスに上記の
高分子プロテアーゼとは異なる第２のプロテアーゼ遺伝
子が存在することも見い出した。該遺伝子は上記のサー
モコッカス・セラー由来の超耐熱性プロテアーゼと同程
度の分子量のプロテアーゼをコードしており、該遺伝子
を単離して枯草菌に導入することにより、該遺伝子の発
現産物も菌体外に分泌された。発現されたプロテアーゼ
は95℃で酵素活性を示すとともに高い耐熱性を有してい
た。また、該プロテアーゼがプロセッシングを受けて生
成する成熟型プロテアーゼのアミノ酸配列も明らかにさ
れた。

これらの２種のプロテアーゼは、特別な操作をするこ
となく菌体外に分泌されており、その遺伝子自身にコー
ドされているシグナルペプチドが枯草菌内で機能してい
ると考えられる。両プロテアーゼの培養液当たりの発現
量は、上記のピロコッカス・フリオサス由来の高分子プ
ロテアーゼが大腸菌あるいは枯草菌において発現される
場合に比べて著しく高い。また、サブチリシン遺伝子の
プロモーター、およびシグナル配列を利用して該遺伝子
を発現させた場合にはさらにプロテアーゼの発現量が増
加した。

さらに、本発明者らはこれらの両プロテアーゼのキメ
ラ蛋白質であるハイブリッド・プロテアーゼをコードす
る遺伝子を作成し、該遺伝子により発現される酵素も、
また上記の超耐熱性プロテアーゼ同様に高温条件下でプ
ロテアーゼ活性を示すことを確認し、本発明を完成する
に至った。

発明の概要 本発明の第１の態様は、配列表の配列番号１に記載し
たアミノ酸配列を有する超耐熱性プロテアーゼまたはそ
の機能的同等物、ならびに、それらの超耐熱性プロテア
ーゼをコードする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、とりわ
け、配列表の配列番号２に記載した塩基配列を有する超
耐熱性プロテアーゼ遺伝子を提供するものである。さら
に、この超耐熱性プロテアーゼ遺伝子とハイブリダイズ
し、超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子も提供す
る。

また、本発明の第２の態様は、配列表の配列番号３に
記載したアミノ酸配列を有する超耐熱性プロテアーゼま
たはその機能的同等物、ならびに、それらの超耐熱性プ
ロテアーゼをコードする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
とりわけ、配列表の配列番号４に記載した塩基配列を有
する超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を提供するものであ
る。さらに、この超耐熱性プロテアーゼ遺伝子とハイブ
リダイズし、超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子
も提供する。

また、本発明の第３の態様は、配列表の配列番号５に
記載したアミノ酸配列を有する超耐熱性プロテアーゼま
たはその機能的同等物、ならびに、それらの超耐熱性プ
ロテアーゼをコードする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
とりわけ配列表の配列番号６に記載した塩基配列を有す
る超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を提供するものである。
さらに、この超耐熱性プロテアーゼ遺伝子とハイブリダ
イズし、超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子も提
供する。

さらに、本発明はこれらの本発明の超耐熱性プロテア
ーゼ遺伝子を含有する形質転換体を培養し、該培養物か
ら超耐熱性プロテアーゼを採取することを特徴とする該
超耐熱性プロテアーゼの製造方法も提供する。

本明細書において用いる「機能的同等物」なる語は以
下のようなものを意味する。

天然に存在するタンパクにはそれをコードする遺伝子
の多型や変異の他、生成後のタンパクの生体内および精
製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中に、１
または数個（例えば、全アミノ酸の５％程度まで）のア
ミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうる
が、それにもかかわらず変異を有しないタンパクと実質
的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが
知られている。このように構造的に若干の差違があって
もその機能については大きな違いが認められないものを
機能的同等物と呼ぶ。人為的にタンパクのアミノ酸配列
に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この
場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能
である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL−２）の
アミノ酸配列中のあるシステイン残基をセリンに置換し
たポリペプチドがインターロイキン２活性を保持するこ
とが知られている［サイエンス（Science）、第224巻、
1431頁（1984）］。

本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子より転写、翻訳
される遺伝子産物は、細胞外への分泌に必要なシグナル
ペプチドと、活性が発現する際には除去されるプロペプ
チドの２つの領域を含む前駆体酵素（プレプロ酵素）で
ある。上記の遺伝子を導入された形質転換体がこのシグ
ナルペプチドを切断できる場合には、シグナルペプチド
を除去された前駆体酵素（プロ酵素）が細胞外に分泌さ
れる。さらに、プロ酵素同志の自己消化反応によってプ
ロペプチドが除かれた活性型酵素が生成される。このよ
うに本発明の遺伝子から得られるプレプロ酵素、プロ酵
素、活性型酵素はいずれも最終的には同等の機能を有す
るタンパクであり、「機能的同等物」の範囲内に属する
ものである。

また、当業者には自明のとおり、シグナルペプチドは
目的遺伝子の発現に用いられる宿主に応じて適当なもの
を選んでも差し支えなく、また細胞外への分泌発現を望
まない場合にはこれを除去してもかまわない。したがっ
て、本発明に開示された超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の
うち、シグナルペプチドをコードする部分を除いたも
の、あるいはこれを他の塩基配列によって置き換えたも
のも、本質的に同等の活性を示すプロテアーゼをコード
するという意味において本発明の範囲内のものと解釈さ
れる。

本明細書において用いる、「超耐熱性プロテアーゼ遺
伝子にハイブリダイズ」する遺伝子とは、該超耐熱性プ
ロテアーゼ遺伝子と、ストリンジェントな条件、すなわ
ち、0.5％SDS、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1
％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400、0.01％
変性サケ精子DNAを含む６×SSC（１×SSCは0.15M NaC
l、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0を示す）中で、50
℃にて12〜20時間のインキュベーションを行うという条
件で、ハイブリダイズする遺伝子をいう。

図面の簡単な説明 図１は、プラスミドpTPR12、プラスミドpUBP13に含有
されるピロコッカス・フリオサス由来のDNA断片の制限
酵素地図を示す図である。

図２は、オリゴヌクレオチドPRO−1Fの設計を示す図
である。

図３は、オリゴヌクレオチドPRO−2FおよびPRO−2Rの
設計を示す図である。

図４は、オリゴヌクレオチドPRO−4Rの設計を示す図
である。

図５は、プラスミドp2F−4Rの制限酵素地図である。

図６は、プラスミドpTC3の制限酵素地図である。

図７は、プラスミドpTCS6の制限酵素地図である。

図８は、プラスミドpTC4の制限酵素地図である。

図９は、プラスミドpSTC3の構築操作を示す図であ
る。

図10は、プラスミドpSTC3の制限酵素地図である。

図11は、各種のプロテアーゼのアミノ酸配列を比較す
る図である。

図12は、図11のつづきである。

図13は、ピロコッカス・フリオサス染色体DNA上のプ
ロテアーゼPFUS遺伝子周辺の制限酵素地図を示す図であ
る。

図14は、プラスミドpSPT1の制限酵素地図である。

図15は、プラスミドpSNP1の制限酵素地図である。

図16は、プラスミドpPS1の制限酵素地図である。

図17は、プラスミドpNAPS1の制限酵素地図である。

図18は、酵素標品TC−３の至適温度を示す図である。

図19は、酵素標品NAPS−１の至適温度を示す図であ
る。

図20は、酵素標品TC−３の至適pHを示す図である。

図21は、酵素標品NP−１の至適pHを示す図である。

図22は、酵素標品NAPS−１の至適pHを示す図である。

図23は、酵素標品TC−３の熱安定性を示す図である。

図24は、酵素標品NP−１の熱安定性を示す図である。

図25は、活性化した酵素標品NP−１の熱安定性を示す
図である。

図26は、酵素標品NAPS−１の熱安定性を示す図であ
る。

図27は、酵素標品NP−１のpH安定性を示す図である。

図28は、酵素標品NP−１のSDSに対する安定性を示す
図である。

図29は、酵素標品NAPS−１のSDSに対する安定性を示
す図である。

図30は、酵素標品NAPS−１のアセトニトリルに対する
安定性を示す図である。

図31は、酵素標品NAPS−１の尿素に対する安定性を示
す図である。

図32は、酵素標品NAPS−１のグアニジン塩酸塩に対す
る安定性を示す図である。

発明の好ましい具体例 本発明に係る超耐熱性プロテアーゼ遺伝子は、超好熱
菌の遺伝子ライブラリーのスクリーニングによって得る
ことができる。超好熱菌としてはピロコッカス属に属す
る細菌が使用でき、ピロコッカス・フリオサスの染色体
のコスミドライブラリーより目的の遺伝子をスクリーニ
ングし、得ることができる。

ピロコッカス・フリオサスとしては、例えば、ピロコ
ッカス・フリオサスDSM3638が使用でき、該菌株はドイ
ッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・
ウント・ツェルクルチュウレンGmbH（Deutsche Sammlun
g von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）より
入手可能な菌株である。

ピロコッカス・フリオサスの染色体のコスミドライブ
ラリーの一例としてはピロコッカス・フリオサスDSM363
8の染色体DNAを制限酵素Sau3A I（宝酒造社製）で部分
消化して得られたDNA断片と、トリプルヘリックスコス
ミドベクター（ストラタジーン社製）とをライゲーショ
ンした後、イン・ビトロ・パッケージング法によってラ
ムダファージ粒子中にパッケージングすることにより得
ることができる。つぎに、該ライブラリーを適当なイー
・コリ（Escherichia coli）、例えば、イー・コリDH5
αMCR（BRL社製）に形質導入することによって得られる
形質転換体を培養した後、菌体を集めて熱処理（例、10
0℃、10分間）、超音波処理、再熱処理（例、100℃、10
分間）し、得られたライゼート中のプロテアーゼ活性の
有無をゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法を利用してスクリーニングすることができる。

これにより、上記の熱処理に耐性のプロテアーゼを発
現する超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むコスミドクロ
ーンを得ることができる。

さらに、このようにして得られたコスミドクローンよ
り調製したコスミドを適当な制限酵素で断片化し、各断
片を組み込んだ組換えプラスミドを作製することができ
る。ついで、該プラスミドで適当な微生物を形質転換
し、得られた形質転換体の発現するプロテアーゼ活性を
調べることにより、目的とする超耐熱性プロテアーゼ遺
伝子を含む組換えプラスミドを得ることができる。

すなわち、上記のコスミドクローンの１つから調製し
たコスミドをNot I、Pvu II（ともに宝酒造社製）で消
化して得られる約7.5kbのDNA断片を単離して、あらかじ
めNot Iリンカー（宝酒造社製）を導入したプラスミド
ベクターpUC19（宝酒造社製）のNot I−Sma Iサイト間
に挿入することができる。該プラスミドはプラスミドpT
PR12と命名され、また、該プラスミドで形質転換された
イー・コリJM109はEscherichia coli JM109/pTPR12と命
名、表示され、平成６年５月24日（原寄託日）よりブダ
ペスト条約の下、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号の、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号FERM BP−5103として寄託されている。

該Escherichia coli JM109/pTPR12のライゼートは、
ゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲル上で、上
記のコスミドクローンと同様のプロテアーゼ活性を示
す。

さらに、該プラスミドpTPR12に挿入されたピロコッカ
ス・フリオサス由来のDNA断片の塩基配列は通常の方
法、例えば、ジデオキシ法によって決定することができ
る。プラスミドpTPR12の挿入DNA断片のうち、２つのDra
Iサイトではさまれた約4.8kb部分の塩基配列を配列表
の配列番号７に示す。また、該塩基配列より推定される
遺伝子産物のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に示
す。こうして、その遺伝子の塩基配列、さらにはそのア
ミノ酸配列が明らかにされたピロコッカス・フリオサス
由来の超耐熱性プロテアーゼはプロテアーゼPFULと命名
されている。配列表の配列番号８に示されるように、該
プロテアーゼPFULは1398残基からなり、分子量15万をこ
える高分子量のプロテアーゼである。

プロテアーゼPFUL遺伝子は枯草菌（Bacillus subtili
s）を宿主として発現させることができる。バチルス・
サブチリスとしてはバチルス・サブチリスDB104が使用
でき、該菌株はジーン（Gene）第83巻、第215〜233頁
（1989）記載の公知の菌株である。クローニングベクタ
ーとしてはプラスミドpUB18−P43が使用でき、該プラス
ミドはカルガリー大学、スイ−ラム・ウォン（Sui−Lam
Wong）博士より恵与されたプラスミドである。また、
該プラスミドは選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺
伝子を含んでいる。

上記プラスミドpTPR13よりDra I消化によって得られ
る約4.8kbのDNA断片が上記プラスミドベクターpUB18−P
43のSma Iサイトに導入されたプラスミドpUBP13があ
る。該プラスミド中、プロテアーゼPFUL遺伝子はバチル
ス・サブチリス中で機能するP43プロモーター［ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）第259巻、第8619〜8625頁（1984）］の下流に位
置している。該プラスミドで形質転換されたバチルス・
サブチリスDB104はBacillus subtilis DB104/pUBP13と
命名されている。該形質転換体のライゼートは上記のEs
cherichia coli JM109/pTPR12と同様のプロテアーゼ活
性を示す。

しかし、該形質転換体の培養液上清にはごく微量のプ
ロテアーゼ活性しか検出されない。これはプロテアーゼ
PFULの分子量が極めて大きく、バチルス・サブチリス中
で効率よく翻訳されないこと、およびプロテアーゼPFUL
遺伝子にコードされるシグナル配列がバチルス・サブチ
リス中でうまく機能しないこと等に起因すると考えられ
る。また、プロテアーゼPFULに存在するＣ末端側のペプ
チド鎖は細胞膜への結合領域であり、該酵素が膜結合型
のプロテアーゼである可能性も考えられる。

図１にピロコッカス・フリオサス染色体上のプロテア
ーゼPFUL遺伝子周辺の制限酵素地図、ならびにプラスミ
ドpTPR12、プラスミドpUBP13に挿入されたDNA断片を示
す。また、図中の矢印はプロテアーゼPFULをコードする
オープン・リーディング・フレームを示す。

配列表の配列番号８に示される上記のプロテアーゼPF
ULのアミノ酸配列を既知の微生物由来プロテアーゼのア
ミノ酸配列と比較することにより、プロテアーゼPFULの
前半部分のアミノ酸配列とサブチリシンに代表される一
群のアルカリ性セリンプロテアーゼ［プロテイン・エン
ジニアリング（Protein Engineering）第４巻、第719〜
737頁（1991）］との間に相同性が存在し、特にプロテ
アーゼの触媒活性に重要とされる４つのアミノ酸残基周
辺に極めて高い相同性が存在することがわかる。

このように超好熱菌ピロコッカス・フリオサスの生産
するプロテアーゼPFULのアミノ酸配列中に常温菌由来の
プロテアーゼに共通して存在する領域が保存されている
ことが明らかとなったことより、ピロコッカス・フリオ
サス以外の超好熱菌の生産する同種のプロテアーゼにも
この領域が存在していることが期待できる。

すなわち、配列表の配列番号７に示された塩基配列の
うち、サブチリシン等と相同性の高い領域のアミノ酸配
列をコードする部分の配列をもとに適当な長さのDNAを
調製し、これをハイブリダイゼーションのプローブ、あ
るいはPCR等の遺伝子増幅法のプライマーに用いること
により、各種の超好熱菌に存在する本酵素類似の超耐熱
性プロテアーゼ遺伝子をスクリーニングすることができ
る。

上記の方法では目的の遺伝子の一部のみを含むDNA断
片が得られることがあるが、その際には得られたDNA断
片の塩基配列を調べてそれが目的の遺伝子の一部である
ことを確かめた上、該DNA断片、あるいはその一部をプ
ローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、または
該DNA断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマー
を用いてPCRを行うことにより、目的の遺伝子全体を取
得することができる。

上記のハイブリダイゼーションは以下の条件で行うこ
とができる。すなわち、DNAを固定したメンブレンを0.5
％SDS、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％ポリビ
ニルピロリドン、0.1％フィコール400、0.01％変性サケ
精子DNAを含む６×SSC（１×SSCは0.15M NaCl、0.015M
クエン酸ナトリウム、pH7.0を示す）中で、50℃にて12
〜20時間、適当な標識を付したプローブとともにインキ
ュベートする。インキュベーション終了後、0.5％SDSを
含む２×SSC中、37℃での洗浄から始めて、SSC濃度は0.
1×までの範囲で、また、温度は50℃までの範囲で変化
させ、固定されたDNAにハイブリダイズしたプローブ由
来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようにな
るまでメンブレンを洗浄する。

また、こうして得られた新たな超耐熱性プロテアーゼ
遺伝子をもとにしたプローブ、あるいはプライマーを作
製し、上記同様の方法によってさらに別の超耐熱性プロ
テアーゼ遺伝子の取得が可能なことも当業者には自明の
ことである。

図２、３および４にプロテアーゼPFULのアミノ酸配列
のうちサブチリシン等と高い相同性を示す領域の配列、
その部分をコードするプロテアーゼPFUL遺伝子の塩基配
列、およびそれをもとに合成したオリゴヌクレオチドPR
O−1F、PRO−2F、PRO−2RおよびPRO−4Rの塩基配列の関
係を示す。さらに、配列表の配列番号９、10、11および
12にそれぞれオリゴヌクレオチドPRO−1F、PRO−2F、PR
O−2RおよびPRO−4Rの塩基配列を示す。すなわち、配列
表の配列番号９〜12は本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺
伝子のスクリーニングに使用されるオリゴヌクレオチド
の１例の塩基配列である。

該オリゴヌクレオチドを組み合わせてプライマーに用
い、各種の超好熱菌の染色体DNAを鋳型としたPCRにより
プロテアーゼ遺伝子を検出することができる。

超好熱菌としては、ピロコッカス属、サーモコッカス
属、スタフィロサーマス属、サーモバクテロイデス属等
に属する細菌が使用でき、サーモコッカス属に属する細
菌としては、例えば、サーモコッカス・セラー（Thermo
coccus celer）DSM2476が使用でき、該菌株はドイッチ
ェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウン
ト・ツェルクルチュウレンGmbHより入手可能な菌株であ
る。サーモコッカス・セラーDSM2476の染色体DNAを鋳型
とし、上記のオリゴヌクレオチドPRO−1FとPRO−2Rの組
み合わせ、あるいはPRO−2FとPRO−4Rの組み合わせをプ
ライマーに用いてPCRを行った場合には特異的なDNA断片
の増幅が認められ、プロテアーゼ遺伝子の存在を知るこ
とができる。また、これらのDNA断片を適当なプラスミ
ドベクターに挿入した組換えプラスミドを作製した後、
挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法で調べることに
より、該断片にコードされるアミノ酸配列を推定するこ
とができる。

オリゴヌクレオチドPRO−1FとPRO−2Rとを用いて増幅
された約150bpのDNA断片、あるいはオリゴヌクレオチド
PRO−2FとPRO−4Rとを用いて増幅された約550bpのDNA断
片をプラスミドベクターpUC18（宝酒造社製）のHinc II
サイトに挿入して作製された組換えプラスミドはそれぞ
れプラスミドp1F−2R（２）、プラスミドp2F−4Rと命名
されている。配列表の配列番号13にプラスミドp1F−2R
（２）の挿入DNA断片の塩基配列とそれから推定される
アミノ酸配列を、また、配列表の配列番号14にプラスミ
ドp2F−4Rの挿入DNA断片の塩基配列とそれから推定され
るアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列表の配列番号13に
示された塩基配列のうち１番目から21番目にかけてと、
113番目から145番目にかけての配列、および配列表の配
列番号14に示された塩基配列のうち１番目から32番目に
かけてと、532番目から564番目にかけての配列は、PCR
にプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド（それぞ
れオリゴヌクレオチドPRO−1F、PRO−2R、PRO−2Fおよ
びPRO−4Rに相当する）由来の配列である。配列表の配
列番号13および14に示されたアミノ酸配列中にはプロテ
アーゼPFUL、および各種微生物由来のアルカリ性セリン
プロテアーゼのアミノ酸配列と相同性のある配列が存在
しており、上記のPCR増幅DNA断片がプロテアーゼ遺伝子
を鋳型として増幅されたものであることを示している。

プラスミドp2F−4Rの制限酵素地図を図５に示す。図
中、太実線がプラスミドベクターpUC18への挿入DNA断片
である。

つぎに、上記のオリゴヌクレオチド、あるいは上記の
PCRにより得られた増幅DNA断片をプローブに用いて超好
熱菌の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることに
より、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、例えばサーモコッ
カス・セラーの生産する超耐熱性プロテアーゼの遺伝子
を得ることができる。

サーモコッカス・セラーの遺伝子ライブラリーの一例
としては、サーモコッカス・セラーDSM2476の染色体DNA
を制限酵素Sau3A Iで部分消化して得られたDNA断片と、
ラムダGEM−11ベクター（プロメガ社製）とをライゲー
ションした後、イン・ビトロ・パッケージング法によっ
てラムダファージ粒子中にパッケージングすることによ
って得られるライブラリーがある。つぎに、該ライブラ
リーを適当なイー・コリ（Escherichia coli）、例えば
イー・コリLE392（プロメガ社製）に形質導入してプレ
ート上でプラークを形成させた後、上記のPCRにより得
られた増幅DNA断片をプローブに用いたプラークハイブ
リダイゼーションを行い、目的の遺伝子を含むファージ
クローンを得ることができる。

さらに、このようにして得られたファージクローンよ
り調製したファージDNAを適当な制限酵素で消化し、上
記のプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを
行い、プロテアーゼ遺伝子を含むDNA断片を検出するこ
とができる。

上記のプラークハイブリダイゼーションによって得ら
れたファージクローンより調製されたファージDNAをKpn
IとBamH I（ともに宝酒造社製）で消化した場合には約
5kbのDNA断片がプローブとハイブリダイズしており、こ
の約5kbのDNA断片を単離してプラスミドベクターpUC119
（宝酒造社製）のKpn I−BamH Iサイト間に挿入した組
換えプラスミドを作製することができる。該プラスミド
はプラスミドpTC3と命名され、該プラスミドで形質転換
されたイー・コリJM109はEscherichia coli JM109/pTC3
と命名されている。プラスミドpTC3の制限酵素地図を図
６に示す。図中、太実線がプラスミドベクターpUC119へ
の挿入DNA断片である。

該プラスミドpTC3に挿入されたDNA断片のうち、プロ
テアーゼ遺伝子を含まない部分を以下に示す操作により
除くことができる。すなわち、プラスミドpTC3をSac I
（宝酒造社製）で消化した後に上記同様の操作でサザン
ハイブリダイゼーションを行うと、約1.9kbのDNA断片が
プローブとハイブリダイズすることがわかる。そこでこ
の約1.9kbのDNA断片を単離し、これをプラスミドベクタ
ーpUC118（宝酒造社製）のSac Iサイトに挿入した組換
えプラスミドを作製することができる。該プラスミドは
プラスミドpTCS6と命名され、該プラスミドで形質転換
されたイー・コリJM109はEscherichia coli JM109/pTCS
6と命名されている。プラスミドpTCS6の制限酵素地図を
図７に示す。図中太実線がプラスミドベクターpUC118へ
の挿入DNA断片である。

該プラスミドpTCS6に挿入されたDNA断片の塩基配列を
ジデオキシ法によって調べることにより、該DNA断片中
にプロテアーゼ遺伝子が存在することを確かめることが
できる。配列表の配列番号15に該断片の塩基配列を示
す。該塩基配列を、配列表の配列番号13および14に示さ
れるプラスミドp1F−2R（２）、プラスミドp2F−4Rの挿
入DNA断片の塩基配列と比較することにより、プラスミ
ドpTCS6に挿入されたDNA断片はプラスミドp2F−4Rと共
通のDNA断片を含んでいるが、プロテアーゼ遺伝子の5'
側領域を欠いていることがわかる。

このようにプラスミドpTCS6に含まれるサーモコッカ
ス・セラー由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子はその一
部を欠いてはいるが当業者に自明のとおり、（１）遺伝
子ライブラリーのスクリーニングをやり直す、（２）染
色体DNAを用いたサザンハイブリダイゼーションを行
う、（３）カセット、およびカセットプライマーを用い
るPCRで5'上流領域のDNA断片を取得する（宝酒造遺伝子
工学製品ガイド、1994−1995年版、第250〜251頁）等の
方法により超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長をカバーす
るDNA断片を得ることができる。

本発明者らは（３）の方法を選択した。すなわち、上
記のサーモコッカス・セラーの染色体DNAを数種の制限
酵素で完全消化し、使用した制限酵素に対応するカセッ
ト（宝酒造社製）とライゲーションを行う。このライゲ
ーション産物を鋳型とし、プライマーTCE6R（配列表の
配列番号16にプライマーTCE6Rの塩基配列を示す）およ
びカセットプライマーC1（宝酒造社製）をプライマーに
用いるPCRを行う。制限酵素Hind III（宝酒造社製）を
用いて上記の操作を行った場合には約1.8kbのDNA断片が
増幅され、この増幅断片をHind III、Sac Iで消化して
得られる約1.5kbのDNA断片をプラスミドベクターpUC119
のHind III−Sac Iサイト間に挿入した組換えプラスミ
ドを作製することができる。該プラスミドはpTC4と命名
され、該プラスミドで形質転換されたイー・コリJM109
はEscherichia coli JM109/pTC4と命名されている。プ
ラスミドpTC4の制限酵素地図を図８に示す。図中、太実
線がプラスミドベクターpUC119への挿入DNA断片であ
る。

該プラスミドpTC4に挿入されたDNA断片の塩基配列を
ジデオキシ法によって調べることにより、該DNA断片中
にプロテアーゼ遺伝子が存在することを確かめることが
できる。配列表の配列番号17に該断片の塩基配列を示
す。該塩基配列から推定されるアミノ酸配列と種々のプ
ロテアーゼとの比較から、上記プラスミドpTC4の挿入DN
A断片がプラスミドpTCS6に欠けていた超耐熱性プロテア
ーゼ遺伝子の5'側領域をカバーしていることがわかる。
該塩基配列と、配列表の配列番号15に示したプラスミド
pTCS6の挿入DNA断片の塩基配列とを総合することによ
り、サーモコッカス・セラー由来の超耐熱性プロテアー
ゼ遺伝子全長の塩基配列を知ることができる。得られた
塩基配列中に存在するオープン・リーディング・フレー
ムの塩基配列を配列表の配列番号２に、また、該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に
それぞれ示す。こうして、それをコードする遺伝子の塩
基配列、およびそのアミノ酸配列が明らかにされたサー
モコッカス・セラー由来の超耐熱性プロテアーゼはプロ
テアーゼTCESと命名されている。プロテアーゼTCES遺伝
子の全長は、プラスミドpTC4およびpTCS6の挿入DNA断片
を組み合わせることにより再構成することができる。

該遺伝子が発現するプロテアーゼ活性の確認は、pTC4
とpTCS6に含まれている２つのDNA断片からプロテアーゼ
TCES遺伝子全長を再構成し、これをlacプロモーターの
下流に挿入した発現プラスミドを大腸菌（Echerichia c
oli）に導入することによって行うことができると考え
られる。しかし、この方法では目的の発現プラスミドを
導入した形質転換体は得られず、菌体内に該遺伝子の発
現産物が生成されることが大腸菌にとって有害、または
致死的になることが予想される。このような場合には、
例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）を宿主としてプ
ロテアーゼを細胞外に分泌発現させ、その活性を確認す
ることが考えられる。

上記のプロテアーゼTCES遺伝子を枯草菌において発現
させるための宿主としては上記のバチルス・サブチリス
DB104が使用でき、また、クローニングベクターとして
はプラスミドpUB18−P43が使用できる。

ただし、大腸菌の宿主−ベクター系はベクターの種類
が豊富であり、形質転換を簡便、かつ高効率に行えると
いう利点を持つため、発現プラスミド構築の種々の操作
のうちの可能なものは大腸菌を用いて行うほうが望まし
い。すなわち、大腸菌内では、プロテアーゼTCES遺伝子
全長が再構成されないようにプラスミドpTC4およびpTCS
6由来の２つのプロテアーゼ遺伝子断片の間に終止コド
ンを含む任意の塩基配列を挿入し、該遺伝子産物の発現
を不可能とした状態でプラスミド構築操作を行うことが
できる。そして、構築の最終段階でこの挿入配列を除い
て図10に示してある目的の発現プラスミドpSTC3を作製
することができる。

以下、図９に示したプラスミドpSTC3の構築操作を説
明する。

まず、プラスミドpTCS6に挿入された約1.8kbのHind I
II−Ssp I断片をプラスミドベクターpBR322（宝酒造社
製）のHind III−EcoR Vサイト間に挿入した組換えプラ
スミドpBTC5を作製し、さらに、該プラスミドに含まれ
るプラスミドベクターpUC118のマルチクローニングサイ
ト由来のHind III−Kpn I間のDNA断片、およびプラスミ
ドベクターpBR322上に存在するBamH Iサイトを除いたプ
ラスミドpBTC5HKBを作製する。

つぎに、上記のプロテアーゼTCES遺伝子の塩基配列を
もとに、プロテアーゼTCESの開始コドンの直前にEcoR
I、BamH Iサイトを導入できるプライマーTCE12、および
該塩基配列中に１箇所だけ存在するSac Iサイトの3'側
にCla Iサイトと終止コドンを導入できるプライマーTCE
20Rを合成する。配列表の配列番号18および19にそれぞ
れプライマーTCE12およびプライマーTCE20Rの塩基配列
を示す。

この２つのプライマーを用い、サーモコッカス・セラ
ーの染色体DNAを鋳型としたPCRによって増幅される約0.
9kbのDNA断片をEcoR I、Cla I（宝酒造社製）で消化し
た後、上記プラスミドpBTC5HKBのEcoR I−Cla Iサイト
間に挿入することにより得られるプラスミドpBTC6は、
プロテアーゼTCES遺伝子のSac Iサイトに終止コドンを
含む69bpの塩基配列が挿入された変異遺伝子を有してい
る。

バチルス・サブチリスのP43プロモーター由来のリボ
ソーム結合部位配列［ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第259巻、第8619〜8
625頁（1984）］をプラスミドベクターpUC18のKpn I−B
amH Iサイト間に導入したプラスミドpUC−P43を作製す
る。該配列の導入に用いられた合成オリゴヌクレオチド
BS1、およびBS2の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号
20および21に示す。つぎに、上記プラスミドpBTC6をBam
H I、Sph I（宝酒造社製）で消化して得られる、プロテ
アーゼTCESの変異遺伝子を含む約3kbのDNA断片を、上記
プラスミドpUC−P43のBamH I−Sph Iサイト間に挿入し
たプラスミドpTC12を構築することができる。

以上のプラスミド構築操作はすべて大腸菌を宿主とし
て行うことができる。

バチルス・サブチリスへのクローニングに用いられる
プラスミドベクターpUB18−P43に存在するSac Iサイト
をあらかじめ除去しておき、該プラスミドのKpn I−Sph
Iサイト間に上記のpTC12より得られる約3kbのKpn I−S
ph I DNA断片を挿入したプラスミドpSTC2をバチルス・
サブチリスDB104を宿主として作製することができる。
該プラスミドにはその5'側にP43プロモーターおよびリ
ボソーム結合部位配列を持ったプロテアーゼTCESの変異
遺伝子を含んでいる。該プラスミドpSTC2をSac Iで消化
した後、分子内ライゲーションを行って得られる組換え
プラスミドは上記の変異遺伝子のSac Iサイトに含まれ
ている挿入塩基配列が除かれている。該組換えプラスミ
ドはプラスミドpSTC3と命名され、該プラスミドで形質
転換されたバチルス・サブチリスDB104はBacillus subt
ilis DB104/pSTC3と命名、表示され、平成７年12月１日
（原寄託日）よりブタペスト条約の下、日本国茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の、工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号FERM BP−5635として寄託されてい
る。該形質転換体を培養し、培養液上清、および菌体抽
出物についてプロテアーゼ活性を調べると、どちらにも
耐熱性のプロテアーゼ活性が認められる。

図10に、プラスミドpSTC3の制限酵素地図を示す。図
中、太実線がプラスミドベクターpUB18−P43への挿入DN
A断片である。

プロテアーゼPFUL、プロテアーゼTCES、およびサブチ
リシンのアミノ酸配列を、図11および12に示したように
相同性のある領域が一致するように並べてみると、プロ
テアーゼPFULにはそのＣ末端側だけではなく、相同性が
ある領域の間にも、プロテアーゼTCES、およびサブチリ
シンには認められない配列が存在することがわかる。こ
れより、ピロコッカス・フリオサスには、プロテアーゼ
PFULのほかに、それよりも分子量が小さいプロテアーゼ
TCES、またはサブチリシンのようなプロテアーゼが存在
する可能性も考えられる。このようなプロテアーゼをコ
ードする遺伝子を探索するために、プロテアーゼTCESの
遺伝子のうち、３種のプロテアーゼ間でよく保存されて
いるアミノ酸配列をコードしている塩基配列を含む断
片、例えば、上記のプラスミドp1F−2R（２）に挿入さ
れている約150bpのDNA断片をプローブに用い、ピロコッ
カス・フリオサスより調製した染色体DNAをターゲット
にしてサザンハイブリダイゼーションを行うことができ
る。プローブに用いているDNA断片はプロテアーゼPFUL
の遺伝子とも相同性があるので、ハイブリダイゼーショ
ンの条件によってはその遺伝子断片もシグナルとして検
出されるが、プロテアーゼPFUL遺伝子の塩基配列、およ
び制限酵素地図の情報から、染色体DNAの切断に用いた
それぞれの制限酵素について該遺伝子に由来するシグナ
ルの位置を予め知ることができる。いくつかの制限酵素
を用いた場合にはプロテアーゼPFUL遺伝子について予想
される位置の他にほぼ同じくらいの強度の別のシグナル
が認められ、ピロコッカス・フリオサスにプロテアーゼ
PFUL以外に、少なくとも、もう１つのプロテアーゼが存
在する可能性が示される。

上記の新規なシグナルに対応する遺伝子を単離するに
あたっては、プロテアーゼTCESの場合のように発現産物
が大腸菌にとって有害、または致死的となり、その結果
遺伝子が単離できないということが起こらないように、
まず遺伝子の一部分だけをクローニングする。例えば、
ピロコッカス・フリオサスの染色体DNAを制限酵素Sac I
およびSpe I（宝酒造社製）で消化し、これを用いて上
記と同様にプロテアーゼTCES遺伝子の部分断片をプロー
ブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うと、Sac
Iだけで切断した場合に得られた、新規の遺伝子に由来
する約3kbに相当するシグナルが消失し、それに代わっ
て約0.6kbの新たなシグナルが生じていることがわかっ
た。この約0.6kbのSpe I−Sac I断片は最大でも200残基
程度のアミノ酸配列をコードするにすぎず、活性を有す
るプロテアーゼを発現できるとは考えられない。Sac I
およびSpe Iで消化したピロコッカス・フリオサス染色
体DNAをアガロース電気泳動に供し、約0.6kbに相当する
DNA断片をゲルより回収する。

つぎに、該断片をプラスミドベクターpBluescriptSK
（−）（ストラタジーン社製）のSpe I−Sac Iサイト間
に挿入し、得られる組換えプラスミドでイー・コリJM10
9を形質転換する。この形質転換体より、上記のサザン
ハイブリダイゼーションに使用したものと同じプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーションによって目的
の断片が組込まれたクローンを取得することができる。
得られたクローンの保持するプラスミドがプロテアーゼ
をコードする配列を有するかどうかは、上記の各種プロ
テアーゼに共通のアミノ酸配列をもとに作製されたプラ
イマー1FP1、1FP2、2RP1、および2RP2を用いたPCR（配
列表の配列番号22、23、24、および25にプライマー1FP
1、1FP2、2RP1、および2RP2の塩基配列を示す）、ある
いは該クローンより調製したプラスミドの挿入DNA断片
の塩基配列を調べることによって確認することができ
る。こうしてプロテアーゼ遺伝子の存在が確認されたプ
ラスミドはプラスミドpSS3と命名されている。該プラス
ミドの挿入DNA断片の塩基配列、およびそれから推定さ
れるアミノ酸配列を配列表の配列番号26に示す。

該プラスミドpSS3に挿入されたDNA断片の塩基配列よ
り推定されるアミノ酸配列にはサブチリシン、プロテア
ーゼPFUL、プロテアーゼTCES等の配列と相同性があるこ
とが示される。こうしてピロコッカス・フリオサスより
新たにその一部が得られた、プロテアーゼPFUL遺伝子と
は異なるプロテアーゼ遺伝子の産物は、プロテアーゼPF
USと命名されている。該プロテアーゼのＮ末端側をコー
ドする領域、すなわち、上記のSpe Iサイトの5'側の領
域、およびＣ末端側をコードする領域、すなわち、上記
のSac Iサイトの3'側の遺伝子断片は、インバースPCR法
によって得ることができる。あらかじめプロテアーゼPF
US遺伝子、およびその近傍の染色体中の制限酵素サイト
が明らかであれば、適切な制限酵素を用いてインバース
PCRを行うことができる。該制限酵素サイトは、ピロコ
ッカス・フリオサスの染色体DNAを種々の制限酵素で切
断したうえ、上記プラスミドpSS3の挿入DNA断片をプロ
ーブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行うこと
によって知ることができ、上記のSpe Iサイトの5'側約3
kbの位置にSac Iサイトが、また、Sac Iサイトの3'側約
5kbの位置にXba Iサイトがあることが示される。

インバースPCRに使用するプライマーは、上記のプラ
スミドpSS3に含まれるSpe I−Sac I断片の末端付近に設
定することができる。Sac Iサイト付近に設定したプラ
イマーをNPF−１、およびNPF−２、Spe Iサイト付近に
設定したプライマーをNPR−３とし、その塩基配列をそ
れぞれ配列表の配列番号27、28、および29に示す。

ピロコッカス・フリオサスの染色体DNAをSac I、ある
いはXba I（宝酒造社製）でそれぞれ消化した後、分子
内ライゲーションを行い、この反応液をインバースPCR
の鋳型とすることができる。染色体DNAをSac Iで消化し
た場合にはインバースPCRによって約3kbの断片が増幅さ
れ、これをプラスミドベクターpT7BlueT（Novagen社
製）に挿入して得られる組換えプラスミドはプラスミド
pS322と命名されている。一方、Xba Iで消化した染色体
DNAでは約9kbの断片が増幅される。該増幅断片をXba I
で消化して得られる約5kbの断片を回収し、これをプラ
スミドベクターpBluescriptSK（−）に挿入して得られ
る組換えプラスミドはプラスミドpSKX5と命名されてい
る。上記のプラスミドpSS3に含まれるSpe I−Sac I断片
をプローブに用いて行ったサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果、およびプラスミドpS322とpSKX5を制限酵素で
解析した結果を総合することによって、プロテアーゼPF
US遺伝子、およびその近傍の染色体の制限酵素地図を得
ることができる。該制限酵素地図を図13に示す。

また、プラスミドpS322に挿入されている5'側の断片
の塩基配列をSpe Iサイトから5'向きに解析し、その領
域にコードされている酵素タンパクのアミノ酸配列を推
定することができる。得られた塩基配列、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号30に示
す。この領域のアミノ酸配列はサブチリシン等のプロテ
アーゼの配列と相同性があることから、この相同性に基
づいてプロテアーゼPFUSの開始コドンを推定することが
でき、プロテアーゼPFUSの開始コドンの直前にBamH Iサ
イトが導入できるプライマーNPF−４を設定することが
できる。一方、プラスミドpSKX5に挿入されているプロ
テアーゼPFUS遺伝子の3'側の断片の塩基配列をXba Iサ
イトから5'向きに解析することにより決定された塩基配
列を配列表の配列番号31に示す。該塩基配列に基づいて
Xba Iサイト近傍にSph Iサイトを導入できるプライマー
NPR−４を設定することができる。上記のプライマーNPF
−４およびNPR−４の塩基配列を配列表の配列番号32お
よび33に示す。この２種のプライマーを用い、ピロコッ
カス・フリオサスの染色体DNAを鋳型にしてプロテアー
ゼPFUS遺伝子の全長を増幅することができる。

プロテアーゼPFUSもプロテアーゼTCESと同様に、枯草
菌の系で発現させることができる。プロテアーゼPFUSを
発現させるためのプラスミドは、プロテアーゼTCESの発
現プラスミドpSTC3をもとにして構築できる。まず、上
記のPCRによって増幅されるプロテアーゼPFUS遺伝子全
長を含むDNA断片をBamH IとSac Iで消化した後、酵素の
Ｎ末端側をコードする約0.8kbの断片を回収する。そし
てこの断片をプラスミドpSTC3の、同じくプロテアーゼT
CESのＮ末端側をコードするBamH I−Sac I断片と置き換
える。得られたプロテアーゼTCES遺伝子とプロテアーゼ
PFUS遺伝子とのハイブリッドタンパクをコードする発現
プラスミドはプラスミドpSPT1と命名されている。図14
に、プラスミドpSPT1の制限酵素地図を示す。

つぎに、上記のPCR増幅DNA断片をSpe IとSph Iで消化
して得られる約5.7kbの断片を単離し、上記プラスミドp
SPT1中のプロテアーゼTCESのＣ末端側をコードするSpe
I−Sph I断片と置き換える。このようにして構築された
発現プラスミドはプラスミドpSNP1と命名され、また、
該プラスミドで形質転換されたバチルス・サブチリスDB
104はBacillus subtilis DB104/pSNP1と命名、表示さ
れ、平成７年12月１日（原寄託日）より、ブタペスト条
約の下、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の、工
業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP−5
634として寄託されている。図15にプラスミドpSNP1の制
限酵素地図を示す。

上記のBacillus subtilis DB104/pSNP1を培養し、培
養液上清、および菌体抽出物についてプロテアーゼ活性
を調べると、どちらにも耐熱性のプロテアーゼ活性が認
められる。

プロテアーゼPFUSをコードする遺伝子の塩基配列は、
上記のプラスミドpSNP1に挿入されたDNA断片を制限酵素
で適当なサイズに断片化し、該断片を適当なクローニン
グベクターにサブクローニングした後、これを鋳型とし
たジデオキシ法によって決定することができる。配列表
の配列番号34にこうして得られた塩基配列中に存在する
オープン・リーディング・フレームの塩基配列を示す。
また、配列表の配列番号35に該塩基配列から推定される
プロテアーゼPFUSのアミノ酸配列を示す。

さらに、上記のプラスミドpSPT1で形質転換されたバ
チルス・サブチリスDB104、Bacillus subtilis DB104/p
SPT1を培養した場合も、培養液上清、および菌体抽出物
の両方にプロテアーゼ活性が見い出される。配列表の配
列番号６に該プラスミドの挿入DNA断片上に存在する、
プロテアーゼTCESとプロテアーゼPFUSのハイブリッド・
プロテアーゼをコードするオープン・リーディング・フ
レームの塩基配列を示す。また、配列表の配列番号５に
該塩基配列から推定されるハイブリッド・プロテアーゼ
のアミノ酸配列を示す。

本発明のプロテアーゼの発現量は、バチルス・サブチ
リスで高発現される遺伝子、特に分泌タンパクの遺伝子
を利用することによって増加させることができる。この
ような遺伝子としてはα−アミラーゼや種々の菌体外プ
ロテアーゼの遺伝子等が使用でき、例えばサブチリシン
のプロモーターとシグナル配列を利用してプロテアーゼ
PFUSの発現量を増加させることができる。すなわち、サ
ブチリシン遺伝子のシグナル配列をコードする領域の後
にプロテアーゼPFUS遺伝子全長を両遺伝子の翻訳のフレ
ームが一致するように連結することにより、サブチリシ
ン遺伝子のプロモーターの制御下に融合タンパクとして
プロテアーゼPFUSを発現させることができる。

サブチリシンのプロモーターとシグナル配列はジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第171
巻、第2657〜2665頁（1989）に記載のプラスミドpKWZに
挿入されているサブチリシン遺伝子のものを使用するこ
とができる。該遺伝子の塩基配列は、プロモーター配列
を含む5'上流領域については上記の文献に、また、サブ
チリシンをコードする領域についてはジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第158巻、第411〜
418頁（1984）にそれぞれ記載されている。これらの配
列をもとに、該遺伝子のプロモーター配列上流にEcoR I
サイトを導入するためのプライマーSUB4と、サブチリシ
ンのシグナル配列をコードする領域の後ろにBamH Iサイ
トを導入するためのプライマーBmR1をそれぞれ合成す
る。配列表の配列番号36および37にそれぞれプライマー
SUB4、BmR1の塩基配列を示す。プライマーSUB4、BmR1を
用い、プラスミドpKWZを鋳型としたPCRによってサブチ
リシン遺伝子のプロモーター〜シグナル配列コード領域
を含む約0.3kbのDNA断片を増幅することができる。

該DNA断片の下流に接続されるプロテアーゼPFUS遺伝
子は、PCR法によってピロコッカス・フリオサスの染色
体DNAより取得することができる。該遺伝子の5'側にハ
イブリダイズするプライマーとしては上記のプライマー
NPF−４が使用できる。また、3'側にハイブリダイズす
るプライマーは、該遺伝子の終止コドン下流の塩基配列
を確認したうえで作製することができる。すなわち、上
記のプラスミドpSNP1をBamH Iで消化して生じる約0.6kb
の断片をプラスミドベクターpUC119のBamH Iサイトにサ
ブクローニングして得られるプラスミドpSNPDの塩基配
列の一部を決定する（該塩基配列を配列表の配列番号38
に示す）。該配列をもとに、プロテアーゼPFUS遺伝子の
3'側にハイブリダイズし、かつSph Iサイトを導入でき
るプライマーNPM−１を合成する。配列表の配列番号39
にプライマーNPM−１の配列を示す。

一方、BamH Iサイトを利用してプロテアーゼPFUS遺伝
子を上記の0.3kbDNA断片に接続する場合には、該遺伝子
中に１箇所存在するBamH Iサイトが操作の支障となる。
このBamH IサイトをPCR−mutagenesis法によって除くた
めのプライマーmutRR、mutFRは配列表の配列番号34に示
されるプロテアーゼPFUS遺伝子の塩基配列をもとに作製
することができる。プライマーmutRR、mutFRの塩基配列
をそれぞれ配列表の配列番号40、41に示す。なお、これ
らのプライマーを用いてBamH Iサイトを除去した場合に
は、該サイトに導入される塩基置換のためにそこにコー
ドされるアミノ酸、すなわち配列表の配列番号35に示さ
れるプロテアーゼPFUSのアミノ酸配列中、560番目に存
在するグリシンがバリンに置換される。

これらのプライマーを使用することにより、サブチリ
シン遺伝子のプロモーター〜シグナル配列コード領域に
接続するためのプロテアーゼPFUS遺伝子を得ることがで
きる。すなわち、ピロコッカス・フリオサスの染色体DN
Aを鋳型とし、プライマーmutRRとNPF−４、およびプラ
イマーmutFRとNPM−１の２通りのプライマー対と、鋳型
としてピロコッカス・フリオサスの染色体DNAとを使用
する２種類のPCRを行う。さらに、両PCRで増幅されたDN
A断片を混合して形成されるヘテロ・デュープレックス
（hetero duplex）を鋳型とし、プライマーNPF−４およ
びNPM−１を用いて２回目のPCRを行う。こうして、その
内部にBamH Iサイトを含まない約2.4kbのプロテアーゼP
FUS遺伝子全長を増幅することができる。

上記のPCR増幅DNA断片をBamH I、Sph Iで消化して得
られる約2.4kbのDNA断片を単離し、上記プラスミドpSNP
1中のプロテアーゼPFUS遺伝子を含むBamH I−Sph I断片
と置き換える。このようにして構築された発現プラスミ
ドはプラスミドpPS1と命名され、該プラスミドで形質転
換されたバチルス・サブチリスDB104はBacillus subtil
is DB104/pPS1と命名されている。該形質転換体を培養
した場合、培養液上清、および菌体抽出物の両方にプラ
スミドpSNP1を使用した場合と同様のプロテアーゼ活性
が見い出され、上記のアミノ酸置換が酵素活性に影響を
与えていないことが確認される。図16に、プラスミドpP
S1の制限酵素地図を示す。

上記のサブチリシンのプロモーターからシグナル配列
を含む約0.3kbのDNA断片をEcoR I、BamH Iで消化し、上
記プラスミドpPS1中のP43プロモーターとリボソーム結
合部位配列を含むEcoR I−BamH I断片と置き換える。こ
のようにして構築された発現プラスミドはpNAPS1と命名
され、該プラスミドで形質転換されたバチルス・サブチ
リスDB104はBacillus subtilis DB104/pNAPS1と命名さ
れている。該形質転換体を培養し、培養液上清および菌
体抽出物についてプロテアーゼ活性を調べると、どちら
にも耐熱性のプロテアーゼ活性が認められ、その発現量
はBacillus subtilis DB104/pSNP1に比べて増加してい
る。図17にプラスミドpNAPS1の制限酵素地図を示す。

プロテアーゼTCES遺伝子、およびプロテアーゼPFUS遺
伝子の場合と同様の方法により、これらの遺伝子に相同
性を有するプロテアーゼ遺伝子をプロコッカス・フリオ
サス、サーモコッカス・セラー以外の超好熱菌より取得
することができる。しかしながら、上記したオリゴヌク
レオチドPRO−1F、PRO−2F、PRO−2R、PRO−4Rをプライ
マーに用い、スタフィロサーマス・マリナス（Staphylo
thermus marinus）DSM3639およびサーモバクテロイデス
・プロテオリティカス（Thermobacteroides proteoliti
cus）DSM5265の染色体DNAを鋳型に用いたPCRでは、サー
モコッカス・セラーで見られるようなDNA断片の増幅は
見られなかった。

なお、PCRによる遺伝子増幅の効率はプライマー3'末
端部分と鋳型DNAとのアニーリングの効率に大きく左右
されることが知られている。上記のPCRによってDNAの増
幅が見られない場合でも、今回用いたものと塩基配列は
異なるが、同じアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレ
オチドを合成してプライマーに用いることにより、プロ
テアーゼ遺伝子を検出することができる。あるいは、上
記したオリゴヌクレオチドや他の超耐熱性プロテアーゼ
遺伝子の一部をプローブとし、染色体DNAを用いたサザ
ンハイブリダイゼーションを行うことによってもプロテ
アーゼ遺伝子を検出することができる。

配列表の配列番号８に示されたプロテアーゼPFULのア
ミノ酸配列の323番目の残基から650番目の残基までの配
列をコードする約1kbのDNA断片を調製し、これをプロー
ブとしてスタフィロサーマス・マリナスDSM3639および
サーモバクテロイデス・プロテオリティカスDSM5265の
染色体DNAを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼー
ションを行うことができる。その結果、Pst I（宝酒造
社製）で消化したスタフィロサーマス・マリナス染色体
DNAを用いた場合には約4.8kbの位置に、また、Xba Iで
消化したサーモバクテロイデス・プロテオリティカス染
色体DNAでは約3.5kbの位置にシグナルが認められる。

これより、スタフィロサーマス・マリナスおよびサー
モバクテロイデス・プロテオリティカスの染色体DNAに
もプロテアーゼPFUL、プロテアーゼPFUS、およびプロテ
アーゼTCES等の遺伝子と相同性のある配列が存在するこ
とが明らかになった。こうして検出されたDNA断片よ
り、プロテアーゼTCES、およびプロテアーゼPFUSをコー
ドする遺伝子を単離、同定したときと同様の方法を用い
ることによって、スタフィロサーマス・マリナスおよび
サーモバクテロイデス・プロテオリティカスに存在する
超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子を単離、同定
することができる。

本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子であるプロテア
ーゼTCES遺伝子を導入された形質転換体、Bacillus sub
tilis DB104/pSTC3は通常の条件、例えば、10μg/mlの
カナマイシンを含むLB培地中、37℃で培養することによ
り培養液中に超耐熱性プロテアーゼを発現する。培養終
了後、遠心分離によって集めた培養液上清について硫酸
アンモニウムによる塩析処理、および透析処理を行って
粗精製酵素標品を得ることができる。こうしてBacillus
subtilis DB104/pSTC3より得られた粗精製酵素標品はT
C−３と命名されている。

同様の操作によってプロテアーゼPFUS遺伝子を導入さ
れた形質転換体Bacillus subtilis DB104/pSNP1、およ
びプロテアーゼTCESとプロテアーゼPFUSとのハイブリッ
ドプロテアーゼをコードする遺伝子を導入された形質転
換体Bacillus subtilis DB104/pSPT1より粗精製酵素標
品を得ることができる。Bacillus subtilis DB104/pSNP
1、およびBacillus subtilis DB104/pSPT1より得られた
粗精製酵素標品はそれぞれNP−１、PT−１と命名されて
いる。

また、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子であるプ
ロテアーゼPFUS遺伝子を導入された形質転換体、Bacill
us subtilis DB104/pNAPS1も通常の条件、例えば、10μ
g/mlのカナマイシンを含むLB培地中、37℃で培養するこ
とにより菌体内および培養液中に超耐熱性プロテアーゼ
を発現する。培養終了後、遠心分離により菌体と培養液
上清とを分け、そのそれぞれから以下に示す操作によっ
て、プロテアーゼPFUSの精製標品を得ることができる。

菌体より酵素を精製する場合には、まずリゾチーム処
理によって菌体を溶菌させ、さらに熱処理を行った後、
遠心分離によって上清を回収する。この上清について硫
酸アンモニウム分画、続いて疎水クロマトグラフィーを
行うことで、精製標品を得ることができる。こうしてBa
cillus subtilis DB104/pNAPS1より得られた精製酵素標
品はNAPS−１と命名されている。

また、培養液上清は透析処理した後、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを行う。溶出された活性画分を集めて
熱処理した後に硫酸アンモニウム分画を行い、さらに疎
水クロマトグラフィーを行い、プロテアーゼPFUSの精製
標品を得ることができる。該標品はNAPS−1Sと命名され
ている。

こうして得られた精製標品NAPS−１、NAPS−1Sについ
てSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、両
酵素標品とも分子量約45kDaの単一のバンドを示す。こ
れらの２つの酵素標品は、ともに精製操作中の熱処理に
よりプロ配列が除去されて成熟型（活性型）酵素に転換
された、実質的に同一の酵素標品である。

本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を
導入された形質転換体が生産する超耐熱性プロテアーゼ
標品、例えば、TC−３、NP−１、PT−１、NAPS−１およ
びNAPS−1Sの酵素化学的および理化学的性質は、つぎの
とおりである （１）作用 本発明で得られる酵素はゼラチンを分解し、短鎖ポリ
ペプチドを生成する。さらに、カゼインを分解し、短鎖
ポリペプチドを生成する。

また、本発明で得られる酵素はスクシニル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシン−４−
メチルクマリン−７−アミド（Suc−Leu−Leu−Val−Ty
r−MCA）を加水分解し蛍光物質（７−アミノ−４−メチ
ルクマリン）を生成する。

また、本発明で得られる酵素はスクシニル−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラ
ニン−ｐ−ニトロアニリド（Suc−Ala−Ala−Pro−Phe
−ｐ−NA）を加水分解し黄色物質（ｐ−ニトロアニリ
ン）を生成する。

（２）酵素活性測定方法 本発明で得られる酵素標品の酵素活性は合成ペプチド
基質を使用して測定することができる。

本発明で得られる酵素標品TC−３の酵素活性は、Suc
−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA（ペプチド研究所社製）を
基質に用いて測定される。すなわち、酵素活性を検出し
ようとする酵素標品を適度に希釈し、その試料溶液20μ
ｌに62.5μＭのSuc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCAを含む0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）80μｌを加え、75
℃で30分間保温した。20μｌの30％酢酸を加えて反応を
停止した後、励起波長355nm、蛍光波長460nmでの蛍光強
度を測定して生成した７−アミノ−４−メチルクマリン
量を定量し、この値を酵素標品を加えずに保温したもの
と比較して酵素活性を調べた。本発明により得られる酵
素標品TC−３は測定されたpH7.0、75℃においてSuc−Le
u−Leu−Val−Tyr−MCA分解活性を有していた。

また、本発明で得られる酵素標品NP−１、PT−１、NA
PS−１およびNAPS−1Sの酵素活性は、Suc−Ala−Ala−P
ro−Phe−ｐ−NA（シグマ社製）を基質に用いて分光光
学的に測定される。すなわち、酵素活性を検出しようと
する酵素標品を適度に希釈し、その試料溶液50μｌにSu
c−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−NAを含む0.1Mリン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.0）（Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−
NA溶液）50μｌを加え、95℃で30分間保温した。氷冷し
て反応を停止した後、405nmにおける吸光度を測定して
生成したｐ−ニトロアニリン量を定量し、この値を酵素
標品を加えずに保温したものと比較して酵素活性を調べ
た。なお、このときSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−NA
溶液は、酵素標品NP−１、およびPT−１については0.2m
M、酵素標品NAPS−１およびNAPS−1Sについては1mMの濃
度のものを使用した。本発明により得られる酵素標品NP
−１、PT−１、NAPS−１およびNAPS−1Sは測定されたpH
7.0、95℃においてSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−NA分
解活性を有していた。

（３）各種基質に対する活性の検出 本発明で得られる酵素標品の合成ペプチド基質に対す
る活性は、上記の（２）に記載した酵素活性測定方法に
より確認される。すなわち、本発明により得られる酵素
標品TC−３はSuc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA分解活性
を、また酵素標品NP−１、PT−１、NAPS−１およびNAPS
−1SはSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−NA分解活性を、
それぞれ有している。なお、酵素標品NP−１、PT−１、
NAPS−１およびNAPS−1Sについて酵素標品TC−３に用い
られる上記（２）に記載の酵素活性測定方法によってSu
c−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA分解活性を調べたところ、
これらの酵素標品が該基質を分解する活性を有している
ことが示された。さらに、酵素標品TC−３について酵素
標品NP−１、PT−１に用いられる上記（２）に記載の酵
素活性測定方法によってSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ
−NA分解活性を調べたところ、該基質を分解する活性が
認められた。また、本発明で得られる酵素標品のゼラチ
ンに対する活性は、酵素によるゼラチンの分解をSDS−
ポリアクリルアミドゲル上で確認する方法により検出さ
れる。すなわち、酵素活性を検出しようとする酵素標品
を適度に希釈し、その試料溶液10μｌに2.5μｌの試料
用緩衝液（50mMトリス−HCl、pH7.5、５％SDS、５％２
−メルカプトエタノール、0.005％ブロモフェノールブ
ルー、50％グリセロール）を加えて100℃、５分間処理
した後、0.05％のゼラチンを含む0.1％SDS−10％ポリア
クリルアミドゲルを用いて電気泳動した。泳動終了後、
ゲルを50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）中に浸し、9
5℃で３時間保温して酵素反応を行い、ついで、ゲルを
2.5％クーマシーブリリアントブルーＲ−250、25％エタ
ノール、10％酢酸中で30分間染色し、さらに、25％メタ
ノール、７％酢酸中にゲルを移し、３〜15時間かけて余
分の色素を除いた。プロテアーゼによってペプチドに分
解されたゼラチンは酵素反応中にゲル外に拡散し、ゲル
のその部分がクーマシーブリリアントブルーで染色され
なくなることから、プロテアーゼ活性の存在を検出し
た。本発明により得られる酵素標品、TC−３、NP−１、
PT−１、NAPS−１およびNAPS−1Sは95℃においてゼラチ
ン分解活性を有していた。

なお、プロテアーゼPFUS遺伝子に由来する酵素標品NP
−１、NAPS−１およびNAPS−1Sは上記の活性検出方法に
おいてゲル上のほぼ同一の位置にゼラチン分解活性が認
められる。このことから、これらの標品においては同様
の様式で前駆体酵素から成熟型酵素へのプロセッシング
が起こっていることが示される。

また、カゼインに対する分解活性は、0.05％のカゼイ
ンを含む0.1％SDS−10％ポリアクリルアミドゲルを用い
る以外は上記のゼラチンに対する活性の検出に用いられ
たものと全く同じ方法により、検出することができる。
本発明により得られる酵素標品、TC−３、NP−１、PT−
１、NAPS−１およびNAPS−1Sは95℃においてカゼイン分
解活性を有していた。

また、本発明により得られる酵素標品、TC−３、NP−
１、NAPS−１およびNAPS−1Sのカゼイン分解活性を以下
に示す方法によって測定することができる。0.2％カゼ
インを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）100μｌ
に適度に希釈した酵素標品100μｌを加え、95℃で１時
間保温した後、100μｌの15％トリクロロ酢酸を加えて
反応を停止した。この反応液を遠心分離して得られる上
清中に含まれる酸可溶性の短鎖ポリペプチド量を280nm
における吸光度から測定し、酵素標品を加えずに保温し
たものと比較して酵素活性を調べた。本発明により得ら
れる酵素標品、TC−３、NP−１、NAPS−１およびNAPS−
1Sは測定されたpH7.0、95℃においてカゼイン分解活性
を有していた。

（４）至適温度 本発明により得られる酵素標品TC−３の至適温度を、
上記の（２）に示した酵素活性測定方法を使用し、ただ
し反応温度を種々の温度に変更することによって調べ
た。図18に示すように酵素標品TC−３は37〜95℃で活性
を示し、その至適温度は70〜80℃であった。すなわち、
図18は本発明で得られる酵素標品TC−３の活性と温度と
の関係を示す図であり、縦軸は最大活性に対する相対活
性（％）、横軸は温度を示す。

また、本発明で得られる酵素標品NAPS−１の至適温度
を上記の（２）に示した酵素活性測定方法を使用し、た
だし反応温度を種々の温度に変更することによって調べ
た。図19に示すように酵素標品NAPS−１は測定条件pH7.
0において40〜110℃の間で活性があり、その至適温度は
80〜95℃であった。すなわち、図19は本発明により得ら
れる酵素標品NAPS−１の活性と温度の関係を示す図であ
り、縦軸は最大活性に対する相対活性（％）、横軸は温
度を示す。

（５）至適pH 本発明により得られる酵素標品、TC−３の至適pHを上
記（２）に示した酵素活性測定方法により調べた。すな
わち、Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA溶液を種々のpHの
緩衝液を用いて調製し、これらの溶液を使用して得られ
る酵素活性の比較を行った。緩衝液には、pH3〜６にお
いては酢酸ナトリウム緩衝液、pH6〜８においてはリン
酸ナトリウム緩衝液、pH8〜９においてはホウ酸ナトリ
ウム緩衝液、pH10〜11においてはリン酸ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液を用いた。図20に示されるように
酵素標品TC−３はpH5.5から９の間で活性を示し、その
至適pHはpH7〜８であった。すなわち、図20は本発明で
得られる酵素標品TC−３の活性とpHとの関係を示す図で
あり、縦軸は相対活性（％）、横軸はpHを示す。

また、本発明で得られる酵素標品NP−１の至適pHを上
記の（２）に示した酵素活性測定方法により調べた。す
なわち、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNA溶液を種々のpH
の緩衝液を用いて調製し、これらの溶液を使用して得ら
れる酵素活性の比較を行った。緩衝液には、pH4〜６に
おいては酢酸ナトリウム緩衝液、pH6〜８においてはリ
ン酸カリウム緩衝液、pH8.5〜10においてはホウ酸ナト
リウム緩衝液、pH10.5においてはリン酸ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液を用いた。図21に示されるように
酵素標品NP−１はpH5〜10の間で活性を示し、その至適p
HはpH5.5〜８であった。すなわち、図21は本発明で得ら
れる酵素標品NP−１の活性とpHとの関係を示す図であ
り、縦軸は相対活性（％）、横軸はpHを示す。

さらに、本発明で得られる酵素標品NAPS−１の至適pH
を上記の（２）に示した酵素活性測定方法により調べ
た。すなわち、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNA溶液を種
々のpHの緩衝液を用いて調製し、これらの溶液を使用し
て得られる酵素活性の比較を行った。緩衝液には、pH4
〜６においては酢酸ナトリウム緩衝液、pH6〜８におい
てはリン酸カリウム緩衝液、pH8.5〜10においてはホウ
酸ナトリウム緩衝液を用いた。図22に示されるように酵
素標品NAPS−１はpH5〜10の間で活性を示し、その至適p
HはpH6〜８であった。すなわち、図22は本発明で得られ
る酵素標品NAPS−１の活性とpHとの関係を示す図であ
り、縦軸は相対活性（％）、横軸はpHを示す。

（６）熱安定性 本発明により得られる酵素標品TC−３の熱安定性を調
べた。すなわち、酵素標品を20mMトリス−HCl、pH7.5
中、80℃で種々の時間保温した後、そのうちの適当量を
とって上記（２）に示した方法により酵素活性を測定
し、熱処理を行わなかったものと比較した。図23に示さ
れるように本発明により得られる酵素標品、TC−３は80
℃、３時間の熱処理の後も90％以上の活性を有してお
り、上記の熱処理に対して安定であった。すなわち、図
23は本発明で得られる酵素標品TC−３の熱安定性を示す
図であり、縦軸は熱処理後の残存活性（％）、横軸は時
間を示す。

また、本発明により得られる酵素標品NP−１の熱安定
性を調べた。すなわち、酵素標品を20mMトリス−HCl、p
H7.5中、95℃で種々の時間保温した後、そのうちの適当
量をとって上記（２）に示した方法で酵素活性を測定
し、熱処理を行わなかったものと比較した。図24に示さ
れるように本発明により得られる酵素標品NP−１は95℃
で保温した場合には酵素活性の著しい増加が観察され
る。これは前駆体として生産されたプロテアーゼが熱処
理中に自己触媒的な活性化を起こすためと考えられる。
また、３時間までの熱処理において活性の低下はまった
く認められなかった。すなわち、図24は本発明で得られ
る酵素標品NP−１の熱安定性を示す図であり、縦軸は熱
処理後の残存活性（％）、横軸は時間を示す。

また、上記の酵素標品、NP−１を熱処理によって活性
化したものについて熱安定性を調べた。すなわち、酵素
標品NP−１を95℃で30分間熱処理して活性化した後、さ
らに95℃で種々の時間保温し、上記同様に活性を測定し
て熱処理を行わなかったものと比較した。同時に緩衝液
も種々のpHのもの（pH5においては酢酸ナトリウム緩衝
液、pH7においてはリン酸カリウム緩衝液、pH9において
はホウ酸ナトリウム緩衝液、pH11においてはリン酸ナト
リウム−水酸化ナトリウム緩衝液、すべて20mM）を用い
た。図25に示されるように本発明により得られる活性化
した酵素標品NP−１はpH9の緩衝液中で処理した場合、
８時間の熱処理の後では90％以上の活性を、また24時間
の熱処理の後でもほぼ50％程度の活性を有しており、上
記の熱処理に対して非常に安定であった。すなわち、図
25は本発明で得られる酵素標品NP−１の熱安定性を示す
図であり、縦軸は熱処理後の残存活性（％）、横軸は時
間を示す。

また、本発明により得られる酵素標品NAPS−１の熱安
定性を調べた。すなわち、酵素標品を20mMトリス−HC
l、pH7.5中、95℃で種々の時間保温した後、そのうちの
適当量をとって上記（２）に示した方法で酵素活性を測
定し、熱処理を行わなかったものと比較した。図26に示
されるように本発明により得られる酵素標品NAPS−１は
95℃、３時間の熱処理の後も80％以上の活性を有してお
り、上記の熱処理に対して安定であった。すなわち、図
26は本発明で得られる酵素標品NAPS−１の熱安定性を示
す図であり、縦軸は熱処理後の残存活性（％）、横軸は
時間を示す。

（７）pH安定性 本発明により得られる酵素標品NP−１のpH安定性を以
下に示す操作によって調べた。95℃で30分間熱処理を行
うことで活性化した酵素標品NP−１を含む20mMの各種pH
の緩衝液50μｌを95℃で60分間処理した後、そのうちの
適当量をとって上記（２）に示した方法によって酵素活
性を測定し、処理を行わなかったものと比較した。緩衝
液には、pH4〜６においては酢酸ナトリウム緩衝液、pH6
〜８においてはリン酸カリウム緩衝液、pH9〜10におい
てはホウ酸ナトリウム緩衝液、pH11においてはリン酸ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ用いた。
図27に示されるように本発明により得られる酵素標品NP
−１はpH5〜11の間では95℃、60分間の処理後も95％以
上の活性を保持していた。すなわち、図27は本発明によ
り得られる酵素のpH安定性を示す図であり、縦軸は残存
活性（％）、横軸はpHを示す。

（８）界面活性剤に対する安定性 本発明により得られる酵素標品NP−１の界面活性剤に
対する安定性を、界面活性剤としてSDSを使用して調べ
た。95℃、30分間の熱処理によって酵素標品NP−１を活
性化し、該標品のみを含む溶液、およびこれに終濃度0.
1％あるいは１％のSDSを添加した溶液50μｌずつを調製
した。これらの溶液を95℃で種々の時間保温した後、そ
のうちの適当量をとって上記（２）に記載の方法で酵素
活性を測定し、処理を行わなかったものと比較した。図
28に示されるように本発明により得られる活性化した酵
素標品、NP−１はSDSの有無にかかわらず、95℃、８時
間の熱処理の後では80％以上の活性を、24時間の熱処理
の後でもほぼ50％程度の活性を有しており、SDS存在下
においても高い安定性を有していた。すなわち、図28は
本発明により得られる酵素標品NP−１のSDSに対する安
定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は時
間を示す。

また、本発明により得られる酵素標品NAPS−１の界面
活性剤に対する安定性を界面活性剤としてSDSを使用し
て調べた。酵素標品NAPS−１のみを含む溶液、およびこ
れに終濃度0.1％あるいは１％のSDSを添加した溶液50μ
ｌずつを調製し、これらの溶液を95℃で種々の時間保温
した後、そのうちの適当量をとって上記（２）に記載の
方法で酵素活性を測定し、処理を行わなかったものと比
較した。図29に示されるように本発明により得られる酵
素標品、NAPS−１はSDSの有無にかかわらず、95℃、３
時間の熱処理の後もほぼ80％程度の活性を有していた。
すなわち、図29は本発明により得られる活性化した酵素
標品NAPS−１のSDSに対する安定性を示す図であり、縦
軸は残存活性（％）、横軸は時間を示す。

上記の結果を比較した場合、酵素標品NAPS−１は酵素
標品NP−１に比べて残存活性の低下が著しいことが示さ
れる。しかしながらこの現象は両標品中に含まれる酵素
タンパク自体のSDSに対する安定性の差とは考えにく
い。精製酵素標品であるNAPS−１はNP−１に比べて夾雑
タンパク量が少なく、そのために自己消化による不活化
が起こりやすいことが上記の現象の原因と考えられる。

（９）有機溶剤に対する安定性 本発明により得られる酵素標品NAPS−１の有機溶剤に
対する安定性をアセトニトリルを使用して調べた。終濃
度25％、あるいは50％のアセトニトリルを含む酵素標品
NAPS−１溶液50μｌを95℃で種々の時間保温した後、そ
のうちの適当量をとって上記（２）に記載の方法で活性
を測定し、処理を行わなかったものと比較した。図30に
示されるように本発明により得られる酵素標品NAPS−１
は50％アセトニトリルの存在下、95℃、１時間の処理の
後も処理前の80％以上の活性を有していた。すなわち、
図30は本発明により得られる酵素標品NAPS−１のアセト
ニトリルに対する安定性を示す図であり、縦軸は残存活
性、横軸は時間を示す。

（10）変性剤に対する安定性 本発明により得られる酵素標品NAPS−１の各種変性剤
に対する安定性を尿素、グアニジン塩酸塩を使用して調
べた。終濃度3.2M、6.4Mの尿素、あるいは終濃度1M、3.
2M、6.4Mのグアニジン塩酸塩を含む酵素標品NAPS−１溶
液50μｌを調製した。これらの溶液を95℃で種々の時間
保温した後、そのうちの適当量をとって上記（２）に記
載の方法で活性を測定し、処理を行わなかったものと比
較した。図31に示されるように本発明により得られる酵
素標品、NAPS−１は尿素に対しては耐性を示し、終濃度
6.4Mの尿素の存在下、95℃、１時間処理後も処理前の70
％以上の活性を有していた。すなわち、図31は尿素に対
する安定性を、また図32はグアニジン塩酸塩に対する安
定性を示す図であり、それぞれ縦軸は残存活性、横軸は
時間を示す。

（11）各種試薬の影響 本発明により得られる酵素標品TCES、およびNAPS−１
について、プロテアーゼ阻害剤として知られている各種
の試薬の影響を調べた。すなわち、上記の酵素標品を終
濃度1mMの各種試薬の存在下、37℃、30分間処理した
後、その一部をとってそれぞれ上記（２）に記載の方法
で酵素活性を測定し、試薬を加えなかった場合（対照）
の活性と比較した。結果を表１に示す。

表１に示されるように、PMSF（フェニルメタンスルフ
ォニルフルオライド）、およびキモスタチンで処理した
場合には両酵素標品ともその活性が著しく低下した。ま
た、アンチパイン処理ではTCESに、EDTA処理ではNAPS−
１にそれぞれ活性の低下が認められた。それ以外の試薬
では大きな活性の低下は見られなかった。

（12）分子量 本発明により得られる酵素標品NAPS−１の分子量を0.
1％SDS−10％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAG
Eにより測定した。酵素標品NAPS−１はSDS−PAGE上で約
45kDaの分子量を示した。また、酵素標品NAPS−1Sも酵
素標品NAPS−１と同一の分子量を示した。

（13）Ｎ末端アミノ酸配列 本発明により得られる酵素標品NAPS−１を用いてプロ
テアーゼPFUSの成熟型酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定
した。0.1％SDS−10％ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動した酵素標品NAPS−１をPVDF膜に転写した後、膜上
の酵素タンパクのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシー
ケンサーを用いた自動エドマン法により決定した。こう
して決定されたプロテアーゼPFUSの成熟型酵素のＮ末端
アミノ酸配列を配列表の配列番号42に示す。該配列は配
列表の配列番号35に示されたプロテアーゼPFUSのアミノ
酸配列の133番目〜144番目の配列に一致しており、成熟
型のプロテアーゼPFUSはこの部分以降のポリペプチドか
らなる酵素であることが示された。こうして明らかとな
ったプロテアーゼPFUSの成熟型酵素のアミノ酸配列を配
列表の配列番号３に示す。なお、上記のように、該配列
中、428番目のアミノ酸（配列表の配列番号35に示され
たアミノ酸配列では560番目のアミノ酸にあたる）はグ
リシン、バリンのどちらであってもプロテアーゼPFUSの
酵素活性には影響ない。さらに、配列表の配列番号34に
示されたプロテアーゼPUFS遺伝子の塩基配列のうち、上
記の成熟型酵素をコードする領域の塩基配列を配列表の
配列番号４に示す。該配列中1283番目の塩基はグアニ
ン、チミンのどちらであってもかまわない。

PCRによるイン・ビトロの遺伝子増幅では伸長反応中
に間違った塩基の取り込みが起こり、得られたDNAの配
列に塩基置換が生じることがある。この頻度はPCRに用
いる酵素の種類、反応液の組成、反応条件、増幅するDN
Aの塩基配列などによって大きく左右されるが、通常行
われるような、単純にある遺伝子の領域を増幅するとい
う場合には、その頻度は多くても400塩基中に１塩基程
度である。本発明において、プロテアーゼTCESやプロテ
アーゼPFUSの遺伝子の単離やその発現プラスミドの構築
のためにPCRを用いたが、得られた遺伝子の塩基配列中
に塩基置換が起こっていたとしてもその数は数塩基程度
であり、翻訳コドンの縮重のために遺伝子上の塩基置換
が必ずしも発現蛋白のアミノ酸の置換に結びつかないこ
とを考慮に入れると、生じうるアミノ酸置換の数は全残
基中多くても、２〜３個と見積もることができる。本発
明で開示されるプロテアーゼTCESやプロテアーゼPFUSの
遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列が天然のものと異
なる可能性は否定できないが、本発明の目的は、高温下
で高い活性を有する超耐熱性プロテアーゼおよびそれを
コードする遺伝子を開示するところにあり、これは天然
のものと同一の酵素、およびそれをコードする遺伝子に
限定されるものではない。そして、上記のように塩基置
換が含まれる可能性のある遺伝子であっても、それが十
分厳密な条件で天然の遺伝子とハイブリダイズしうるこ
とは、当業者には自明のことである。

さらに、本明細書には、（１）超好熱菌の染色体DNA
より発現クローニングのためのライブラリーを作製し、
プロテアーゼ活性の発現をスクリーニングする、（２）
アミノ酸配列の相同性に基づいてハイブリダイゼーショ
ンまたはPCRにより超耐熱性プロテアーゼの活性を発現
する可能性のある遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発
現産物の酵素作用、すなわち、超耐熱性プロテアーゼの
活性を適当な微生物を宿主に用いて確認する、という目
的の遺伝子の取得方法が明確に開示されてある。したが
って公知の変異導入方法を用いて本発明の超耐熱性プロ
テアーゼ遺伝子に種々の変異を導入した後、変異を導入
された遺伝子配列が超耐熱性プロテアーゼをコードしう
るかどうかは上記の方法を用いることによって容易に知
ることができる。導入する変異の種類は、変異導入の結
果得られた遺伝子配列が本発明の超耐熱性プロテアーゼ
と実質上同等の超耐熱性プロテアーゼ活性を発現するも
のであれば特に限定はないが、発現タンパクがプロテア
ーゼ活性を保持するためにはセリンプロテアーゼに共通
して保存されている４カ所の領域以外に導入されること
が望ましい。

変異は、超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子の
任意の領域にランダムに導入することができ（random m
utagenesis）、また、予め定めておいた特定の位置に望
み通りの変異を導入することもできる（部位特異的変異
導入、site−directed mutagenesis）。ランダムに変異
を導入する方法としては、例えば、DNAを化学的に処理
する方法があり、この場合にはまず変異を導入したい領
域が部分的に一本鎖となっているプラスミドを作製し、
この一本鎖部分に亜硫酸水素ナトリウムを作用させるこ
とによって塩基のシトシンをウラシルに変換しC:G→T:A
のトランジション変異を導入する。また、一本鎖とした
部分を［α−Ｓ］dNTP存在下で２本鎖に修復する過程で
塩基置換を生じさせる方法も知られている。これらの方
法の詳細は、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・USA（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA）第79巻、第1408〜1412頁（198
2）、およびジーン（Gene）第64巻、第313〜319頁（198
8）に記載されている。

ランダムな変異は、ヌクレオチド取込みの忠実度が低
くなるような条件下でPCRを行うことによっても導入す
ることができる。特に反応系にマンガンを加えると有効
であり、この方法の詳細はアナリティカル・バイオケミ
ストリー（Anal.Biochem.）第224巻、第347〜353頁（19
95）に詳記されている。部位特異的変異導入を行う方法
としては、例えば、目的の遺伝子を一本鎖化し、この一
本鎖部分に導入したい変異に応じてデザインしたプライ
マーを合成してアニールさせた後、これを変異を導入し
た方のストランドのみが選択的に複製されるイン・ビボ
の系に導入する系を利用する方法がある。この方法の詳
細はメソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymology）、第154巻、第367頁（1987）に記載されて
おり、例えば、宝酒造社製の変異導入キット、ミュータ
ンＫを用いることができる。部位特異的変異導入も、PC
Rを利用して行うことができ、その方法の詳細は、エー
リッヒ編、ストックトン社発行、PCRテクノロジー（PCR
Technology）第61〜70頁（1989）に記載されており、
また例えば、宝酒造社製のLA−PCRイン ビトロ ミュ
ータジェネシスキットを用いることができる。そして上
記の方法を用いることによって、置換、欠失、挿入の変
異を導入することができる。

このようにして本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子
をベースにして変異を導入することにより、本発明の超
耐熱性プロテアーゼと同様の耐熱性や至適温度を有する
が、たとえば至適pH等の性質が少し異なっているような
酵素を宿主に生産させることも可能である。この場合、
もとになる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は必
ずしも１つの超耐熱性プロテアーゼに由来する配列だけ
に限定する必要はない。本発明で開示したような配列に
相同性がある２つ、またはそれ以上の超耐熱性プロテア
ーゼの遺伝子を相同性のある領域でつなぎかえてハイブ
リッド遺伝子を作成し、該遺伝子がコードするハイブリ
ッド酵素を宿主に生産させることができる。ハイブリッ
ド遺伝子の場合にも遺伝子の発現産物の酵素作用、すな
わちプロテアーゼ活性をテストすることによって超耐熱
性プロテアーゼ遺伝子であるかどうかを知ることができ
る。例えば、上記のプラスミドpSPT1を用いれば、Ｎ末
端側がプロテアーゼPFUSに由来し、Ｃ末端側がプロテア
ーゼTCESに由来するハイブリッド・プロテアーゼを枯草
菌に生産させることができ、このハイブリッド・プロテ
アーゼは95℃でプロテアーゼ活性を有している。

ハイブリッド酵素には、そのもとになっている２つま
たはそれ以上の酵素の特性を合わせ持つことが期待でき
る。例えば、本発明で開示されるプロテアーゼTCESとプ
ロテアーゼPFUSを比較すると、細胞外への分泌効率に関
してはプロテアーゼTCESがすぐれ、耐熱性に関してはプ
ロテアーゼPFUSがすぐれている。細胞外への分泌の効率
には蛋白質のＮ末端にあるシグナル配列が大きく影響を
与えるので、pSPT1の場合とは逆にＮ末端側がプロテア
ーゼTCESに由来し、Ｃ末端側がプロテアーゼPFUSに由来
する蛋白質ができるように発現プラスミドを構築すれ
ば、プロテアーゼPFUSと同等の耐熱性を有する超耐熱性
プロテアーゼをプロテアーゼTCESと同等の分泌効率で枯
草菌を用いて分泌生産することができる。また、シグナ
ル配列は酵素蛋白質が細胞外へ分泌されるときに本体の
酵素と切り離されてしまうので、酵素そのものの性質に
関してはさほど重要ではない。したがって、常温菌を用
いて超耐熱性プロテアーゼを生産させる場合には、その
シグナル配列は必ずしも超耐熱菌由来である必要はな
く、目的の蛋白質が高い効率で細胞外に分泌されるもの
であれば常温菌由来のものでも問題はない。

特に、使用する宿主で高発現されている分泌タンパク
のシグナルペプチドを用いた場合に高い分泌効率が期待
される。

上記のハイブリッド遺伝子を作製するにあたって、そ
のつなぎかえは必ずしも部位特異的に行う必要はない。
例えば、ハイブリッド遺伝子の作製の材料となる２つ、
またはそれ以上の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子のDNAを
混合した後、これらをDNA分解酵素で断片化し、イン・
ビトロの系でこれらの断片をDNAポリメラーゼを用いて
再構成することによってもハイブリッド遺伝子を作製す
ることができる。この方法の詳細はプロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・USA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第91
巻、第10747〜10751頁（1994）に記載されている。この
場合にも、得られたハイブリッド遺伝子の中から上記同
様にその発現蛋白質の超耐熱性プロテアーゼ活性を調べ
ることによって超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝
子の配列を単離、同定することができる。また、このよ
うにして得られた遺伝子の配列にはセリンプロテアーゼ
に共通の４カ所の領域をコードする配列が保存されてい
ることが期待される。

したがって、得られたハイブリッド遺伝子も、適切な
ハイブリダイゼーションの条件を設定することによっ
て、例えば、配列表の配列番号９、10、11および12に表
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドPRO−1F、P
RO−2F、PRO−2RおよびPRO−4Rから選択されるDNAにハ
イブリダイズ可能であることは、当業者には自明であ
る。また、上記の変異導入によって得ることができる新
規の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子は、適切なハイブリダ
イゼーションの条件を設定することによって配列番号
９、10、11、および12に表される塩基配列から選択され
るDNA配列を含有する遺伝子、たとえばプロテアーゼPFU
L遺伝子とハイブリダイズしうることも明らかである。

本明細書においては、耐熱性プロテアーゼ遺伝子を得
ることに焦点をあてて記載しているが、本発明の超耐熱
性プロテアーゼ遺伝子と配列に相同性があるが超耐熱性
ではないプロテアーゼ遺伝子、例えば、サブチリシンの
遺伝子とのハイブリッド遺伝子を作製することによって
サブチリシンの耐熱性を向上させ、サブチリシンが本来
持っている特性と高い耐熱性とを兼ね備えた新規なプロ
テアーゼをコードする遺伝子を作製することも可能であ
る。

本発明では、遺伝子がコードする蛋白質の有するプロ
テアーゼ活性の検出、および酵素標品の生産のために遺
伝子を導入する宿主として大腸菌または枯草菌を用いた
が、形質転換の方法が確立されているものであれば遺伝
子を導入する宿主に特に限定はなく、例えば、バチルス
・ブレビス（Bacillus brevis）、乳酸菌、酵母、糸状
菌、動物細胞、植物細胞、昆虫等を用いることができ
る。ここでは、発現された蛋白質が活性型になるように
ポリペプチドがうまくフォールディングし、しかも、そ
れが宿主に対して有害、または致死的にならないことが
重要である。また、ここであげた宿主の中でも、特にそ
の発現産物を培地中に分泌させることが知られ、容易、
かつ低コストで培養できるバチルス・ブレビス、乳酸菌
および糸状菌等は、枯草菌に加えて目的のプロテアーゼ
を工業レベルで大量に生産するための宿主として用いる
ことができる。

実施例 以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ （１）超耐熱性プロテアーゼ遺伝子検出用オリゴヌクレ
オチドの作製 配列表の配列番号８に示したプロテアーゼPFULのアミ
ノ酸配列と、既知の微生物由来アルカリ性セリンプロテ
アーゼのアミノ酸配列との比較から、これらに共通して
存在する相同アミノ酸配列が明らかとなった。このうち
３つの領域を選び、PCRによる超耐熱性プロテアーゼ遺
伝子の検出にプライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ドの設計を行った。

図２、３および４に上記の３つの領域にあたるプロテ
アーゼPFULのアミノ酸配列、その部分をコードするプロ
テアーゼPFUL遺伝子の塩基配列、およびそれをもとに合
成したオリゴヌクレオチドPRO−1F、PRO−2F、PRO−2R
およびPRO−4Rの塩基配列の関係を示す。また、配列表
の配列番号９、10、11および12にオリゴヌクレオチドPR
O−1F、PRO−2F、PRO−2RおよびPRO−4Rの塩基配列を示
す。

（２）サーモコッカス・セラーの染色体DNAの調製 ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニス
メン・ウント・ツェルクルチュウレンGmbHより入手した
サーモコッカス・セラーDSM2476培養液10mlより遠心分
離にて菌体を集め、25％スクロースを含む50mMトリス−
HCl（pH8.0）100μｌに懸濁した。この懸濁液に20μｌ
の0.5M EDTA、10μｌのリゾチーム（10mg/ml）を加えて
20℃、１時間保温した後、800μｌのSET溶液（150mM Na
Cl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl、pH8.0）、50μｌの10
％SDS、10μｌのプロテイナーゼＫ（20mg/ml）を加え、
さらに37℃、１時間保温した。フェノール−クロロホル
ム抽出を行って反応を停止した後、エタノール沈殿を行
って回収したDNAを50μｌのTE緩衝液（10mMトリス−HC
l、pH8.0、1mM EDTA）に溶かして染色体DNA溶液とし
た。

（３）PCRによる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出 上記のサーモコッカス・セラーの染色体DNAとオリゴ
ヌクレオチドPRO−1FおよびPRO−2R、あるいは、PRO−2
FおよびPRO−4Rを含むPCR反応液を調製し、94℃、１分
〜55℃、１分〜72℃、１分を１サイクルとした35サイク
ルの反応を行った。この反応液の一部を用いてアガロー
スゲル電気泳動を行うと、オリゴヌクレオチドPRO−1F
およびPRO−2Rを用いたもので３種類、オリゴヌクレオ
チドPRO−2FおよびPRO−4Rを用いたもので１種類のDNA
断片の増幅が認められた。これらの増幅断片をアガロー
スゲルより回収し、DNAブランティングキット（宝酒造
社製）を用いてDNAの末端を平滑化した後、さらに、T4
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いて末端
をリン酸化した。ついで、プラスミドベクターpUC19
（宝酒造社製）をHinc II（宝酒造社製）で消化し、ア
ルカリホスファターゼ（宝酒造社製）処理して末端を脱
リン酸化した後、上記のPCR増幅DNA断片と混合してライ
ゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得ら
れた形質転換体よりプラスミドを調製し、適当な大きさ
のDNA断片が挿入されているものを選んでジデオキシ法
により挿入断片の塩基配列を決定した。

これらのプラスミドのうち、オリゴヌクレオチドPRO
−1FおよびPRO−2Rを用いて増幅された約150bpのDNA断
片を含むプラスミドp1F−2R（２）、およびオリゴヌク
レオチドPRO−2FおよびPRO−4Rを用いて増幅された約55
0bpのDNA断片を含むプラスミドp2F−4Rについて得られ
た塩基配列より推定されるアミノ酸配列にはプロテアー
ゼPFUL、およびサブチリシン等のアミノ酸配列と相同性
のある配列が含まれていた。配列表の配列番号13にプラ
スミドp1F−2R（２）の挿入DNA断片の塩基配列とそれか
ら推定されるアミノ酸配列を、また、配列表の配列番号
14にプラスミドp2F−4Rの挿入DNA断片の塩基配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列表の
配列番号13に示された塩基配列のうち１番目から21番目
にかけてと、113番目から145番目にかけての配列、およ
び配列表の配列番号14に示された塩基配列のうち１番目
から32番目にかけてと、532番目から564番目にかけての
配列は、PCRにプライマーとして用いられたオリゴヌク
レオチド（それぞれオリゴヌクレオチドPRO−1F、PRO−
2R、PRO−2FおよびPRO−4Rに相当する）由来の配列であ
る。

図５にプラスミドp2F−4Rの制限酵素地図を示す。

（４）サーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子
のスクリーニング 上記のサーモコッカス・セラーの染色体DNAを制限酵
素Sau3A I（宝酒造社製）で部分消化し、dATP、dGTP存
在下でクレノウ・フラグメント（宝酒造社製）を作用さ
せてDNA末端を部分修復した。このDNA断片をラムダGEM
−11 Xho Iハーフサイトアームベクター（プロメガ社
製）と混合してライゲーションを行った後、ガイガーパ
ックゴールド（ストラタジーン社製）を用いたイン・ビ
トロ・パッケージングを行い、サーモコッカス・セラー
の染色体DNA断片を含むラムダファージライブラリーを
作製した。このライブラリーの一部をイー・コリLE392
（プロメガ社製）に形質導入してプレート上にプラーク
を形成させた後、プラークをハイボンド−Ｎ＋メンブレ
ン（アマシャム社製）上にトランスファーした。トラン
スファー後のメンブレンを1.5M NaClを含む0.5N NaOH、
ついで、3M NaClを含む0.5Mトリス−HCl（pH7.5）で処
理し、さらに６×SSCで洗浄後、風乾し、UVトランスイ
ルミネーター上で紫外線照射してファージDNAをメンブ
レンに固定した。

一方、プラスミドp2F−4RをPmaC IおよびStu I（とも
に宝酒造社製）で消化後、１％アガロースゲル電気泳動
を行い、分離された約0.5kbのDNA断片を回収した。該断
片を鋳型とし、ランダムプライマーDNAラベリングキッ
トVer.2（宝酒造社製）および［α−³²P］dCTP（アマシ
ャム社製）を用いて³²P−標識されたDNAプローブを作製
した。

上記のDNAを固定したメンブレンをハイブリダイゼー
ション緩衝液（0.5％SDS、0.1％BSA、0.1％ポリビニル
ピロリドン、0.1％フィコール400、0.01％変性サケ精子
DNAを含む６×SSC）中、50℃で２時間処理した後、³²P
−標識したDNAプローブを含む同緩衝液に移し、50℃で1
5時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイ
ゼーション終了後、メンブレンを0.5％SDSを含む２×SS
C中、室温で洗浄し、ついで0.5％SDSを含む１×SSCを用
いて50℃で洗浄した。さらにメンブレンを１×SSCです
すいだ後に風乾し、Ｘ線フィルムを当てて−80℃で６時
間露光し、オートラジオグラムを作製した。約3000個の
ファージクローンをスクリーニングした結果、プロテア
ーゼ遺伝子を含む１つのファージクローンを得た。オー
トラジオグラム上のシグナルの位置からこのファージク
ローンの位置を調べ、メンブレンへのトランスファーに
用いられたプレート上の対応するプラークを１％のクロ
ロホルムを含む1mlのSM緩衝液（50mMトリス−HCl、pH7.
5、1M NaCl、8mM MgSO₄、0.01％ゼラチン）中に単離し
た。

（５）サーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子
を含むファージDNA断片の検出 上記のファージクローンを用いて形質導入されたイー
・コリLE392をNZCYM培地（Bio101社製）中、37℃で15時
間培養して得られる培養液より上清を集め、キアゲンー
ラムダキット（QIAGEN社製）を用いてファージDNAを調
製した。得られたファージDNAをBamH I、EcoR I、EcoR
V、Hinc II、Kpn I、Nco I、Pst I、Sac I、Sal I、Sma
IおよびSph I（以上、宝酒造社製）でそれぞれ消化
し、１％アガロースゲル電気泳動を行った。続いてマニ
アティス（T.Maniatis）ら編集、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー発行のモレキュラー・クロー
ニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual）第２版（1986）に記載の
サザントランスファー法によって泳動後のゲルからハイ
ボンド−Ｎ＋メンブレン上にDNAをトランスファーし
た。

得られたメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液
中、50℃で４時間処理した後、上記の実施例１−（４）
で使用した³²P−標識したDNAプローブを含む同緩衝液に
移し、50℃で18時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを0.5％SDS
を含む１×SSC中、50℃で洗浄し、ついで１×SSCですす
いだ後に風乾した。メンブレンにＸ線フィルムを当てて
−80℃で２時間露光し、オートラジオグラムを作製し
た。このオートラジオグラムより、Kpn Iで消化したフ
ァージDNAでは約9kbのDNA断片にプロテアーゼ遺伝子が
含まれていることが示された。

つぎに、上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージDN
AをKpn Iで消化した後、さらにBamH I、Pst I、およびS
ph Iでそれぞれ消化し、１％アガロースゲル電気泳動を
行った。上記同様の操作によりサザンハイブリダイゼー
ションを行い、約5kbのKpn I−BamH I断片にプロテアー
ゼ遺伝子が含まれていることが示された。

（６）サーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子
を含むDNA断片のクローニング 上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージDNAをKpn I
およびBamH Iで消化して１％アガロースゲル電気泳動を
行い、分離された約5kbのDNA断片をゲルより回収した。
ついでプラスミドベクターpUC119（宝酒造社製）をKpn
IおよびBamH Iで消化し、上記の約5kbのDNA断片と混合
してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入し
た。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記
の約5kbのDNA断片が含まれているものを選んでこれをプ
ラスミドpTC3と命名した。

図６にプラスミドpTC3の制限酵素地図を示す。

（７）サーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子
を含むプラスミドpTCS6の調製 上記プラスミドpTC3をSac Iで消化後、１％アガロー
スゲルを用いて電気泳動し、実施例１−（５）に記載の
プロテアーゼ遺伝子を含むファージDNA断片の検出と同
じ操作により、サザンハイブリダイゼーションを行っ
た。得られたオートラジオグラム上のシグナルより、プ
ラスミドpTC3をSac Iで消化して得られる約1.9kbのDNA
断片に超耐熱性プロテアーゼ遺伝子が含まれていること
が示された。

そこで、プラスミドpTC3をSac Iで消化した後、１％
アガロース電気泳動を行い、約1.9kbのDNA断片を単離し
た。ついで、プラスミドベクターをpUC118（宝酒造社
製）をSac Iで消化し、アルカリホスファターゼを用い
て脱リン酸化した後、上記の約1.9kb断片と混合してラ
イゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得
られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約1.
9kb断片１分子のみが含まれているものを選んで、これ
をプラスミドpTCS6と命名した。

図７にプラスミドpTCS6の制限酵素地図を示す。

（８）プラスミドpTCS6に含まれるサーモコッカス・セ
ラー由来DNA断片の塩基配列の決定 上記プラスミドpTCS6に挿入されたサーモコッカス・
セラー由来プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定するた
めに、キロ−シークエンス用デレーションキット（宝酒
造社製）を用いて、該プラスミドの挿入DNA断片部分を
種々の長さに欠失させたデレーションミュータントを作
製した。これらのうち、適当な長さの欠失が起こったも
のをいくつか選び、ジデオキシ法によりそれぞれの挿入
DNA断片部分の塩基配列を解読したうえ、これらの結果
を総合してプラスミドpTCS6に含まれる挿入DNA断片の塩
基配列を決定した。配列表の配列番号15に得られた塩基
配列を示す。

（９）カセットおよびカセットプライマーを用いたPCR
によるサーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子
の5'上流領域のクローニング サーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子の5'
上流領域はLAPCRイン・ビトロ クローニングキット
（宝酒造社製）を使用して得た。

配列表の配列番号15に示されたプラスミドpTCS6に含
まれる挿入DNA断片の塩基配列をもとにカセットPCRに使
用するプライマーTCE6Rを合成した。配列表の配列番号1
6にプライマーTCE6Rの塩基配列を示す。

次に、上記のサーモコッカス・セラーの染色体DNAをH
ind III（宝酒造社製）で完全消化し、ライゲーション
反応によりHind IIIカセット（宝酒造社製）につない
だ。これを鋳型としてプライマーTCE6Rおよびカセット
プライマーC1（宝酒造社製）を含むPCR反応液を調製
し、94℃、１分を１サイクル、続いて94℃、30秒〜55
℃、１分〜72℃、３分を30サイクル、72℃、10分を１サ
イクルの一連の反応を行った。この反応液の一部を用い
てアガロース電気泳動を行うと、約1.8kbの増幅断片が
認められた。この増幅断片をHind IIIおよびSac Iで消
化し、生じた約1.5kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳
動の後にゲルより回収した。Hind IIIおよびSac Iで消
化したプラスミドベクターpUC119を上記の約1.5kbのDNA
断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM10
9に導入した。得られた形質転換体に保持されているプ
ラスミドを調べ、上記の1.5kb断片が１分子だけ挿入さ
れたプラスミドを選び、これをプラスミドpTC4と命名し
た。

図８にプラスミドpTC4の制限酵素地図を示す。

（10）プラスミドpTC4に含まれるサーモコッカス・セラ
ー由来DNA断片およびプロテアーゼTCES遺伝子の塩基配
列の決定 上記プラスミドpTC4に挿入されたサーモコッカス・セ
ラー由来プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定するため
に、キロ−シークエンス用デレーションキットを用い
て、該プラスミドの挿入DNA断片部分を種々の長さに欠
失させたデレーションミュータントを作製した。これら
のうち、適当な長さの欠失が起こったものをいくつか選
び、ジデオキシ法によりそれぞれの挿入DNA断片部分の
塩基配列を解読したうえ、これらの結果を総合してプラ
スミドpTC4に含まれる挿入DNA断片の塩基配列を決定し
た。配列表の配列番号15に得られた塩基配列を示す。

該配列と実施例１−（８）で得られたプラスミドpTCS
6に含まれる挿入DNA断片の塩基配列とを総合し、サーモ
コッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子の全塩基配列
を決定した。該塩基配列中に存在するオープン・リーデ
ィング・フレームの塩基配列、および該配列から推定さ
れるサーモコッカス・セラー由来プロテアーゼのアミノ
酸配列をそれぞれ配列表の配列番号２、および１に示
す。該遺伝子にコードされるサーモコッカス・セラー由
来プロテアーゼをプロテアーゼTCESと命名した。

（11）プロテアーゼTCES遺伝子を含むプラスミドpBTC6
の調製 上記プラスミドpTCS6をHind III、Ssp I（宝酒造社
製）で消化した後、１％アガロース電気泳動を行い、分
離された約1.8kbのDNA断片を回収した。ついで、プラス
ミドベクターpBR322（宝酒造社製）をHind III、EcoR V
で消化し、上記の約1.8kbのDNA断片と混合してライゲー
ションを行った後、イー・コリJM109に導入した。得ら
れた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約1.8k
b断片１分子のみが含まれているものを選んで、これを
プラスミドpBTC5と命名した。

つぎに、プラスミドpBTC5をHind III、Kpn Iで完全に
消化し、平滑末端化した後、分子内ライゲーションを行
い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体
よりプラスミドを調製し、上記の２つの制限酵素サイト
が除去されているものを選んでプラスミドpBTC5HKと命
名した。

さらに、プラスミドpBTC5HKをBamH Iで消化し、平滑
末端化した後、分子内ライゲーションを行い、イー・コ
リJM109に導入した。得られた形質転換体よりプラスミ
ドを調製し、BamH Iサイトが除去されているものを選ん
でプラスミドpBTC5HKBと命名した。

プロテアーゼTCESプロテアーゼ遺伝子上の開始コドン
の直前にEcoR IサイトおよびBamH Iサイトが導入できる
プライマーTCE12、およびプラスミドpTCS6のSac Iサイ
トの3'側に16bp相補的でCla Iサイトと終止コドンを導
入できるプライマーTCE20Rを合成した。プライマーTCE1
2、およびプライマーTCE20Rの塩基配列を配列表の配列
番号18および19に示す。これら２つのプライマーを用
い、サーモコッカス・セラーの染色体DNAを鋳型としたP
CR反応液を調製し、94℃、30秒〜55℃、１分〜72℃、１
分を１サイクルとした25サイクルの反応を行い、この２
つのオリゴヌクレオチドを両端に持ち、プロテアーゼTC
ES遺伝子の一部を含む約0.9kbのDNA断片を増幅した。

上記の約0.9kb DNA断片をEcoR I、Cla I（宝酒造社
製）で消化し、EcoR I、Cla Iで消化した上記のプラス
ミドpBTC5HKBと混合してライゲーションした後、イー・
コリJM109に導入した。得られた形質転換体よりプラス
ミドを調製し、上記の約0.9kb断片１分子のみが含まれ
ているものを選んで、これをプラスミドpBTC6と命名し
た。

（12）プロテアーゼTCES遺伝子を含むプラスミドpTC12
の調製 上記プラスミドpBTC6をBamH I、Sph Iで消化した後、
１％アガロース電気泳動を行い、分離された約3kbのDNA
断片を回収した。ついで、プラスミドベクターpUC18
（宝酒造社製）のKpn I、BamH Iサイト間にバチルス・
サブチリスP43プロモーター由来のリボソーム結合部位
配列（該配列の導入に用いられた合成オリゴヌクレオチ
ドBS1、およびBS2の塩基配列を配列表の配列番号20、お
よび21に示す）を導入したプラスミドpUC−P43SDをBamH
I、Sph Iで消化し、先に回収した約3kbのDNA断片と混
合してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入
した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上
記の約3kbのDNA断片１分子のみが含まれているものを選
んで、これをプラスミドpTC12と命名した。

（13）バチルス・サブチリスを形質転換するためのプロ
テアーゼTCES遺伝子を含むプラスミドpSTC3の調製 上記プラスミドpTC12をKpn I、Sph Iで消化した後、
１％アガロース電気泳動を行い、分離された約3kbのDNA
断片を回収した。次に、プラスミドベクターpUB18−P43
をSac Iで消化した後、末端を平滑化した後にセルフラ
イゲーションさせることによってSac Iサイトが除去さ
れたプラスミドベクターpUB18−P43Sを調製した。これ
をKpn I、Sph Iで消化した後、先に回収した約3kbのDNA
断片と混合してライゲーションを行い、バチルス・サブ
チリスDB104に導入した。得られたカナマイシン耐性の
形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約3kbのDNA
断片１分子のみが含まれているものを選んで、これをプ
ラスミドpSTC2と命名した。

ついで、上記プラスミドpSTC2をSac Iで消化した後、
分子内ライゲーションを行い、バチルス・サブチリスDB
104に導入した。得られたカナマイシン耐性の形質転換
体よりプラスミドを調製し、Sac Iサイトを１つしか持
たないものを選んで、これをプラスミドpSTC3と命名し
た。

次に該プラスミドpSTC3を保有するバチルス・サブチ
リスDB104をBacillus subtilis DB104/pSTC3と命名し
た。

図10にプラスミドpSTC3の制限酵素地図を示す。

実施例２ （１）ピロッコッカス・フリオサスの染色体DNAの調製 ピロッコッカス・フリオサスDSM3638の培養は以下の
とおりに行った。１％トリプトン、0.5％酵母エキス、
１％可溶性デンプン、3.5％ジャマリンＳ・ソリッド
（ジャマリンラボラトリー社製）、0.5％ジャマリンＳ
・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）、0.003％M
gSO₄、0.001％NaCl、0.0001％FeSO₄・7H₂O、0.0001％Co
SO₄、0.0001％CaCl₂・7H₂O、0.0001％ZnSO₄,0.1ppm CuS
O₄・5H2O、0.1ppm H₃BO₃、0.1ppm KAl（SO₄）_２、0.1pp
m Na₂MoO₄・2H₂O、0.25ppm NiCl₂・H₂Oの組成の培地を
２リットル容のメディウムボトルに入れ、120℃、20分
間殺菌した後、窒素ガスを吹き込んで溶存酸素を除去し
た後、これに上記菌株を接種して95℃、16時間静置培養
した。培養終了後、遠心分離によって菌体を集めた。

つぎに、得られた菌体を25％スクロースを含む50mMト
リス−HCl（pH8.0）4mlに懸濁し、この懸濁液に2mlの0.
2M EDTA、0.8mlのリゾチーム（5mg/ml）を加えて20℃、
１時間保温した後、24mlのSET溶液（150mM NaCl、1mM E
DTA、20mMトリス−HCl、pH8.0）、4mlの５％SDS、400μ
ｌのプロテイナーゼＫ（10mg/ml）を加え、さらに37
℃、１時間保温した。フェノール−クロロホルム抽出を
行って反応を停止した後、エタノール沈殿を行って約3.
2mgの染色体DNAを得た。

（２）ピロッコッカス・フリオサスの染色体DNAのゲノ
ミックサザンハイブリダイゼーション ピロコッカス・フリオサスの染色体DNAをSac I、Not
I、Xba I、EcoR I、およびXho I（以上、宝酒造社製）
でそれぞれ消化した。反応液の一部をさらにSac I、お
よびEcoR Iで消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行
った後、実施例１−（５）に記載の操作でサザンハイブ
リダイゼイションを行った。なお、プローブには上記プ
ラスミドp1F−2R（２）をEcoR IとPst Iで消化して得ら
れる約0.3kbのDNA断片を鋳型とし、BcaBEST DNAラベリ
ングキット（宝酒造社製）および［α−³²P］dCTPを用
いて調製した³²P−標識DNAを用いた。また、メンブラン
は最終的に0.5％のSDSを含む２×SSC中、室温で洗浄
し、２×SSCですすいだ後にオートラジオグラムを作製
した。この結果、ピロコッカス・フリオサスの染色体DN
AをSac Iで消化して生じる約5.4kb、および約3.0kbの２
つのDNA断片にシグナルが認められ、このそれぞれの断
片上にプロテアーゼ遺伝子が存在することが示された。
Sac I消化断片をさらにSpe I（宝酒造社製）で消化した
場合、上記の約5.4kbの断片に変化はないが、約3.0kbの
断片に見られたシグナルは消失し、新たに約0.6kbの断
片にシグナルが認められた。配列表の配列番号７に示さ
れたプロテアーゼPFUL遺伝子中にはSpe Iサイトは存在
しないことから、Sac IとSpe Iで消化して得られる約0.
6kbのDNA断片上のシグナルは新規な超耐熱性プロテアー
ゼ（以下プロテアーゼPFUSと記載する）遺伝子に由来す
るものであることが示唆された。また、ピロコッカス・
フリオサスの染色体DNAをXba Iで消化したものでは約3.
3kb、および約9.0kbの二つのDNA断片にシグナルが認め
られた。図１に示されたプロテアーゼPFUL遺伝子の制限
酵素地図より上記の約3.3kbの断片にはプロテアーゼPFU
L遺伝子が含まれ、約9.0kbの断片にはプロテアーゼPFUS
遺伝子が含まれていることが推定された。上記染色体DN
AをXba IとSac Iで消化すると、シグナルは約2.0kbと約
3.0kbの断片に認められた。配列表の配列番号７に示さ
れたプロテアーゼPFUL遺伝子中に存在するSac I、Xba I
の切断部位の位置より、約2.0kbのSac I−Xba I断片中
にプロテアーゼPFUL遺伝子が存在することが推定され
た。一方、約3.0kbの断片にはプロテアーゼPFUS遺伝子
が存在することが推定され、上記のSac I消化の結果と
あわせて、Sac I単独の消化で得られる上記の約0.3kbの
DNA断片中にはXba Iサイトは存在しないことが示され
た。

（３）プロテアーゼPFUS遺伝子を含む0.6kb Spe I−Sac
I断片のクローニング ピロコッカス・フリオサスの染色体DNAをSac IとSpe
Iで消化し、１％アガロースゲルを用いて電気泳動した
後、約0.6kbに相当するDNA断片をゲルより回収した。つ
いで、プラスミドpBluescriptSK（−）（ストラタジー
ン社製）をSac IとSpe Iで消化し、上記の約0.6kbのDNA
断片と混合してライゲーションを行った後、イー・コリ
JM109に導入し、染色体DNA断片を含むプラスミドライブ
ラリーを作製した。形質転換したイー・コリJM109をプ
レートにまいてコロニーを形成させた後、生じたコロニ
ーをハイボンド−Ｎ＋メンブレンにトランスファーし、
新しいLBプレート上で37℃、２時間保温した。このメン
ブランを0.5M NaClを含む0.5N NaOH、ついで1.5M NaCl
を含む0.5Mトリス−HCl（pH7.5）で処理し、さらに２×
SSCで洗浄後、風乾し、UVトランスイルミネーター上で
紫外線照射してプラスミドDNAをメンブランに固定し
た。このメンブランをハイブリダイゼーション緩衝液
中、50℃で２時間処理した後、実施例２−（２）に記載
のサザンハイブリダイゼーションに用いられたものと同
じ³²P−標識したDNAプローブを含む同緩衝液に移し、50
℃で18時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリ
ダイゼーション終了後メンブランを1.5％SDSを含む２×
SSC中、室温で洗浄し、ついで、37℃で洗浄した。さら
に、メンブランを２×SSCですすいだ後、風乾し、Ｘ線
フィルムを当てて−80℃で12時間露光し、オートラジオ
グラムを作製した。約500個のクローンをスクリーニン
グした結果、プロテアーゼ遺伝子を含む３個のクローン
を得た。オートラジオグラム上のシグナルからこれらの
クローンの位置を調べ、メンブランのトランスファーに
用いたプレート上の対応するコロニーをLB培地中に単離
した。

（４）PCRによるプロテアーゼPFUS遺伝子の検出 プロテアーゼPFUL遺伝子のうち、既知の微生物由来ア
ルカリ性セリンプロテアーゼのアミノ酸配列と相同性の
高い二つの領域をコードする塩基配列を選び、PCRによ
る超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出にプライマーとし
て用いるオリゴヌクレオチドの設計を行った。図２およ
び図３に示されるプロテアーゼPFULのアミノ酸配列をも
とにプライマー1FP1、1FP2、2RP1および2RP2を合成し
た。配列表の配列番号22、23、24および25にオリゴヌク
レオチド1FP1、1FP2、2RP1および2RP2の塩基配列を示
す。

上記の３クローンから調製したプラスミドとオリゴヌ
クレオチド1FP1および2RP1、あるいは、1FP1および2RP
2、あるいは、1FP2および2RP1、あるいは、1FP2および2
RP2を含むPCR反応液を調製し、94℃、30秒〜37℃、２分
〜72℃、１分を１サイクルとした30サイクルの反応を行
った。この反応液の一部を用いてアガロースゲル電気泳
動を行うと、上記の３つのプラスミドすべてにおいてプ
ライマー1FP2および2RP2を用いたもので約150bpのDNA断
片の増幅が認められ、これらのプラスミド上にプロテア
ーゼ遺伝子が存在することが示された。

上記の３クローンのうち１つを選んで、これをプラス
ミドpSS3と命名した。

（５）プラスミドpSS3に含まれるプロテアーゼPFUS遺伝
子の塩基配列の決定 上記のプラスミドpSS3を鋳型とし、プライマーM4およ
びプライマーRV（共に宝酒造社製）を用いたジデオキシ
法により該プラスミドの挿入DNA断片の塩基配列を決定
した。配列表の配列番号26に得られた塩基配列および該
塩基配列がコードしていると推定されるアミノ酸配列を
示す。該アミノ酸配列を、プロテアーゼPFUL、プロテア
ーゼTCESおよびサブチリシンのアミノ酸配列と比較する
ことによって、プラスミドpSS3に挿入されたDNA断片は
これらのプロテアーゼと相同性のあるアミノ酸配列をコ
ードすることが推定された。

（６）インバースPCR法によるプロテアーゼPFUSのＮ末
端側コード領域およびＣ末端側コード領域のクローニン
グ プロテアーゼPFUSのＮ末端側、およびＣ末端側のアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子を得るためにインバースPC
R法を実施した。インバースPCRに用いるプライマーは上
記のプラスミドpSS3の挿入DNA断片の塩基配列をもとに
合成した。配列表の配列番号27、28および29にプライマ
ーNPF−１、NPF−２およびNPR−３の塩基配列を示す。

ピロコッカス・フリオサスの染色体DNAをSac Iおよび
Xba Iで消化した後、分子内ライゲーションを行った。
ライゲーション反応液の一部とプライマーNPF−１およ
びNPR−３、あるいはNPF−２およびNPR−３を含むPCR反
応液を調製し、94℃、30秒〜67℃、10分を１サイクルと
した30サイクルの反応を行った。この反応液の一部を用
いてアガロースゲル電気泳動を行うと、Sac Iで消化し
て得たDNAを鋳型とし、プライマーNPF−２およびNPR−
３を用いたもので約3kbの増幅断片が認められた。この
増幅断片をアガロースゲルより回収し、プラスミドベク
ターpT7BlueT（Novagen社製）と混合してライゲーショ
ンを行い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質
転換体よりプラスミドを調製し、約3kbのDNA断片が含ま
れているものを選んで、これをプラスミドpS322と命名
した。

一方、Xba Iで消化して得たDNAを鋳型とし、プライマ
ーNPF−１およびNPR−３を用いたもので約9kbの増幅断
片が認められた。この増幅断片をアガロースゲルより回
収し、DNAブランティングキットを用いてDNAの末端を平
滑化した後、さらにXba Iで消化した。これをXba IとHi
nc IIで消化したプラスミドベクターpBluescriptSK
（−）と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM
109に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを
調製し、約5kbのDNA断片が挿入されているものを選び、
これをプラスミドpSKX5と命名した。

（７）プラスミドpS322およびpSKX5に含まれるプロテア
ーゼPFUS遺伝子の塩基配列の決定 プラスミドpS322を鋳型とし、プライマーNPR−３を用
いたジデオキシ法により、プロテアーゼPFUSのＮ末端領
域をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。配列表の
配列番号30に得られた塩基配列の一部、および該塩基配
列がコードしていると推定されるアミノ酸配列を示す。

さらに、プラスミドpSKX5と鋳型とし、プライマーRV
を用いたジデオキシ法によりプロテアーゼPFUS遺伝子の
3'側にあたる領域の塩基配列を決定した。配列表の配列
番号31に得られた塩基配列の一部を示す。

（８）プロテアーゼPFUS遺伝子全長の増幅に用いるプラ
イマーの合成 実施例２−（７）で得られた塩基配列をもとに、プロ
テアーゼPFUS遺伝子全長の増幅に用いるプライマーの設
計を行った。配列表の配列番号30に示されるプロテアー
ゼPFUSのＮ末端部分をコードする塩基配列をもとにプロ
テアーゼPFUS遺伝子の開始コドン直前にBamH Iサイトを
導入できるプライマーNPF−４を合成した。配列表の配
列番号32にプライマーNPF−４の塩基配列を示す。ま
た、配列表の配列番号31に示されるプロテアーゼPFUSの
3'側領域に存在するXba Iサイト近傍の塩基配列をもと
に、該塩基配列に相補的な配列とSph Iの認識配列とを
有するプライマーNPR−４を合成した。配列表の配列番
号33にプライマーNPR−４の塩基配列を示す。

（９）バチルス・サブチリスを形質転換するためのピロ
コッカス・フリオサス由来のプロテアーゼとプロテアー
ゼTCESのハイブリッド遺伝子を含有するプラスミドpSPT
1の調製 LA PCR キット（宝酒造社製）を使用し、上記のプ
ライマーNPF−４、NPR−４とピロコッカス・フリオサス
の染色体DNAとを含むPCR反応液を調製し（以後、LA PC
R キットを使用して調製されたPCR反応液をLA−PCR反
応液とする）、94℃、30秒〜55℃、１分〜68℃、７分を
１サイクルとして20サイクルの反応を行い、この２つの
プライマーを両端に持ち、プロテアーゼPFUS遺伝子のコ
ード領域を含む約6kbのDNA断片を増幅した。

上記の約6kbのDNA断片をBamH I、Sac Iで消化した
後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約
0.8kbのDNA断片を回収した。この断片をBamH I、Sac I
で消化した上記プラスミドpSTC3と混合してライゲーシ
ョンした後、バチルス・サブチリスDB104に導入した。
得られたカナマイシン耐性の形質転換体よりプラスミド
を調製し、上記の約0.8kb断片１分子のみが挿入された
プラスミドを選び、これをプラスミドpSPT1と命名し
た。

また、該プラスミドpSPT1を保有するバチルス・サブ
チリスDB104をBacillus subtilis DB104/pSPT1と命名し
た。

図14にプラスミドpSPT1の制限酵素地図を示す。

（10）バチルス・サブチリスを形質転換するためのプロ
テアーゼPUFS遺伝子を含有するプラスミドpSNP1の調製 実施例２−（９）で増幅された上記の約6kbのDNA断片
をSpe I、Sph Iで消化した後、１％アガロース電気泳動
を行い、分離された約5.7kbのDNA断片を回収した。これ
をSpe I、Sph Iで消化した上記プラスミドpSPT1と混合
してライゲーションした後、バチルス・サブチリスDB10
4に導入した。得られたカナマイシン耐性の形質転換体
よりプラスミドを調製し、上記約5.7kb断片１分子のみ
が挿入されたプラスミドを選び、これをプラスミドpSNP
1と命名した。また、該プラスミドpSNP1で形質転換され
たバチルス・サブチリスDB104をBacillus subtilis DB1
04/pSNP1と命名した。

図15にプラスミドpSNP1の制限酵素地図を示す。

（11）プラスミドpSNP1に含まれるプロテアーゼPFUS遺
伝子の塩基配列の決定 上記プラスミドpSNP1に挿入されたプロテアーゼ遺伝
子を含む約6kbのDNA断片を種々の制限酵素で適当なサイ
ズに断片化し、該断片をプラスミドベクターpUC119また
はpBluescriptSK（−）にサブクローニングした。得ら
れた組換えプラスミドを鋳型とし、市販のユニバーサル
プライマーを用いたジデオキシ法により塩基配列の決定
を行なった。適当なサイズの断片が得られない部分につ
いては合成プライマーを利用するプライマーウォーキン
グ法を用いた。こうして決定されたプラスミドpSNP1に
挿入されたDNA断片の塩基配列中に存在するオープン・
リーディング・フレームの塩基配列、および該配列から
推定されるピロコッカス・フリオサス由来プロテアーゼ
のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号34および35
に示す。

（12）プロテアーゼPFUS遺伝子を増幅するためのプライ
マーの合成 プロテアーゼPFUS遺伝子全長の増幅に使用される、該
遺伝子の3'側にハイブリダイズするプライマーを設計す
るために、該遺伝子の3'側領域の塩基配列を決定した。
まず、上記のプラスミドpSNP1をBamH Iで消化して得ら
れる、プロテアーゼPFUS遺伝子の3'側領域を含む約0.6k
bのDNA断片を、予めBamH Iで消化し、アルカリホスファ
ターゼで脱リン酸化したプラスミドベクターpUC119にサ
ブクローニングした。得られた組換えプラスミドはプラ
スミドpSNPDと命名され、これを鋳型としたジデオキシ
法によりプロテアーゼPFUS遺伝子の3'側にあたる領域の
塩基配列を決定した。配列表の配列番号38に該領域に存
在するBamH Iサイトより上流80bpまでの塩基配列（相補
鎖の配列）を示す。つぎに、該配列をもとにしてプロテ
アーゼPFUS遺伝子の3'側にハイブリダイズし、Sph Iの
認識配列を含むプライマーNPM−１を合成した。配列表
の配列番号39にプライマーNPM−１の塩基配列を示す。

また、プロテアーゼPFUS遺伝子の内部、開始コドンか
ら約1.7kb下流に存在するBamH Iサイトを除くためのプ
ライマーmutRR、mutFRを合成した。配列表の配列番号4
0、41にそれぞれプライマーmutRR、mutFRの塩基配列を
示す。

（13）プロテアーゼPUFS遺伝子を全長を含有するプラス
ミドpPS1の調製 鋳型としてピロコッカス・フリオサスの染色体DNA
を、またプライマーとして上記プライマーNPF−４とmut
RRの組合せ、あるいはプライマーmutFRとNPM−１の組合
せを含む２組のLA−PCR反応液を調製し、それぞれ94
℃、30秒〜55℃、１分〜68℃、３分を１サイクルとした
30サイクルの反応を行った。この反応液の一部を用いて
アガロース電気泳動を行うと、プライマーNPF−４およ
びmutRRを用いた場合は約1.8kbの、プライマーmutFRお
よびNPM−１を用いた場合は約0.6kbのDNA断片が増幅し
た。

上記の２種類のPCR反応液よりSUPREC−02（宝酒造社
製）を用いてプライマーが除去された増幅DNA断片を調
製した。これらの両増幅DNA断片を含み、プライマー、
およびLA Taqは含まないLA−PCR反応液を調製して94
℃、10分間の熱変性を行い、30分かけて30℃まで冷却し
た後、30℃で15分間保温してヘテロ・デュープレックス
（hetero duplex）を形成させた。次にこの反応液にLA
Taqを添加して72℃で３分間反応させた後、さらにプ
ライマーNPF−４、NPM−１を添加して94℃、30秒〜55
℃、１分〜68℃、３分を１サイクルとして25サイクルの
反応を行った。この反応液中には約2.4kbのDNA断片の増
幅が見られた。

上記約2.4kbのDNA断片をBamH I、Sph Iで消化し、こ
の断片を予めBamH I、Sph Iで消化してプロテアーゼPFU
S遺伝子全長を除去した実施例２−（11）に記載のプラ
スミドpSNP1と混合してライゲーションを行った後、バ
チルス・サブチリスDB104に導入した。得られたカナマ
イシン耐性の形質転換体よりプラスミドを調製し、上記
の約2.4kb断片１分子のみが挿入されたプラスミドを選
び、これをプラスミドpPS1と命名した。また、該プラス
ミドpPS1で形質転換されたバチルス・サブチリスDB104
をBacillus subtilis DB104/pPS1と命名した。

図16にプラスミドpPS1の制限酵素地図を示す。

（14）サブチリシン遺伝子のプロモーター〜シグナル配
列領域のDNA断片の増幅 サブチリシン遺伝子のプロモーター〜シグナル配列領
域を得るためのプライマーを合成した。まず、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第171
巻、第2657〜2665頁（1989）に記載のサブチリシン遺伝
子のプロモーター領域部分の塩基配列を参考に、該領域
の上流にハイブリダイズし、EcoR Iサイトを含むプライ
マーSUB4（配列表の配列番号36にプライマーSUB4の塩基
配列を示す）を合成した。次にジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（J.Bacteriol.）第158巻、第411〜418頁
（1984）に記載のサブチリシンをコードする領域の塩基
配列を参考に、シグナル配列の直後にBamH1サイトを導
入できるプライマーBmR1（配列表の配列番号37にプライ
マーBmR Iの塩基配列を示す）を合成した。

ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.）第171巻、第2657〜2665頁（1989）に記載のサブチ
リシン遺伝子を含むプラスミドpKWZを鋳型とし、上記の
プライマーSUB4、BmR1を含むPCR反応液を調製し、94
℃、30秒〜55℃、１分〜68℃、２分を１サイクルとする
30サイクルの反応を行った。この反応液の一部を用いて
アガロース電気泳動を行うと、約0.3kbのDNA断片が増幅
していることが確認された。

（15）バチルス・サブチリスを形質転換するためのプロ
テアーゼPFUS遺伝子を含有するプラスミドpNAPS1の調製 上記約0.3kbのDNA断片をEcoR I、BamH Iで消化した
後、予めEcoR I、BamH Iで消化した実施例２−（13）の
プラスミドpPS1と混合してライゲーションした後、バチ
ルス・サブチリスDB104に導入した。得られたカナマイ
シン耐性の形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の
約0.3kb断片１分子のみが挿入されたプラスミドを選
び、これをプラスミドpNAPS1と命名した。また、該プラ
スミドpNAPS1で形質転換されたバチルス・サブチリスDB
104をBacillus subtilis DB104/pNAPS1と命名した。

図17にプラスミドpNAPS1の制限酵素地図を示す。

実施例３ （１）超耐熱性プロテアーゼ遺伝子検出のためのプロー
ブの調整 プロテアーゼPFUL遺伝子を含有する上記のプラスミド
pTPR12をBal IとHinc II（ともに宝酒造社製）で消化
後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約
1kbのDNA断片を回収した。該DNA断片を鋳型とし、BcaBE
ST DNAラベリングキットおよび［α−³²P］dCTPを用い
て³²P−標識されたDNAプローブを調製した。

（２）超好熱菌スタフィロサーマス・マリナスおよびサ
ーモバクテロイデス・プロテオリティカスに存在する超
耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出 ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニス
メン・ウント・ツェルクルチュウレンGmbHより入手した
スタフィロサーマス・マリナスDSM3639およびサーモバ
クテロイデス・プロテオリティカスDSM5265培養液それ
ぞれ10mlより、実施例１−（３）に記載の操作にしたが
って染色体DNAを調製した。両染色体DNAをEcoR I、Pst
I、Hind III、Xba IおよびSac Iでそれぞれ消化し、１
％アガロースゲルを用いて電気泳動した後、実施例１−
（５）に記載の操作でサザンハイブリダイゼーションを
行った。なお、プローブには実施例３−（１）で調製し
た³²P−標識DNAプローブを用いた。また、メンブランは
最終的に0.5％のSDSを含む２×SSC中、37℃で洗浄し、
２×SSCですすいだ後にオートラジオグラムを作製し
た。このオートラジオグラムより、Pst Iで消化したス
タフィロサーマス・マリナスの染色体DNAで約4.8kbのDN
A断片、Xba Iで消化したサーモバクテロイデス・プロテ
オリティカスの染色体DNAで約3.5kbのDNA断片にシグナ
ルが認められ、プロテアーゼPFUL遺伝子とハイブリダイ
ズする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子がスタフィロサーマ
ス・マリナスおよびサーモバクテロイデス・プロテオリ
ティカスの染色体DNA中に存在することが示された。

実施例４ （１）プロテアーゼPFUSおよびTCES粗精製酵素標品の調
製 実施例１で得られた、本発明の超耐熱性プロテアーゼ
遺伝子を含有するプラスミドpSTC3を導入したバチルス
・サブチリスDB104、Bacillus subtilis DB104/pSTC3を
10μg/mlのカナマイシンを含むLB培地（トリプトン10g/
リットル、酵母エキス5g/リットル、NaCl 5g/リット
ル、pH7.2）5ml中、37℃で８時間培養した。１リットル
容の三角フラスコに同様の培地250mlを準備し、上記の
培養液5mlを接種して37℃で16時間培養した。培養液を
遠心分離して得られた上清に75％飽和となるよう硫酸ア
ンモニウムを加え、生じた沈澱物を遠心分離によって回
収した。回収した沈殿物を4mlの20mMトリス−HCl、pH7.
5に懸濁した後、同緩衝液に対して透析し、得られた透
析内液を粗精製酵素標品（酵素標品 TC−３）とした。

また本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有する
プラスミドpSNP1、あるいはプラスミドpSPT1を導入した
バチルス・サブチリスDB104、Bacillus subtilis DB104
/pSNP1あるいはBacillus subtilis DB104/pSPT1より、
上記同様の操作で粗精製酵素標品を調製し、それぞれNP
−１、PT−１と命名した。

これらの酵素標品を用いて、上記のゼラチンを含むSD
S−ポリアクリルアミドゲルを用いる酵素活性検出法、
あるいはその他の活性測定方法によってプロテアーゼ活
性を調べた。

（２）プロテアーゼPFUS精製酵素標品の調製 実施例２−（18）で得られた本発明の超耐熱性プロテ
アーゼ遺伝子を含有するプラスミドpNAPS1を導入したバ
チルス・サブチリスDB104、Bacillus subtilis DB104/p
NAPS1を、10μg/mlのカナマイシンを含むLB培地5mlを含
む試験管２本に接種し、37℃で７時間振とう培養した。
同様の培地125mlずつを含む500ml容の三角フラスコ計６
本を準備し、フラスコ１本当たり上記培養液を1ml接種
して37℃で17時間振とう培養した。培養液は遠心分離し
て、菌体と培養液上清を得た。

菌体は15mlの50mMトリス−HCl、pH7.5に懸濁し、30mg
のリゾチーム（シグマ社製）を加えた後に、37℃で1.5
時間消化した。消火液をさらに95℃で15分間加熱処理し
た後、遠心分離して上清を集めた。得られた上清12mlに
飽和硫酸アンモニウム溶液4mlを加え、0.45μｍフィル
ターユニット（ステリベックスHV:ミリポア社製）を用
いてろ過を行った後、ろ液を25％飽和の硫酸アンモニウ
ムを含む25mMトリス−HCl、pH7.5で平衡化したPOROS P
Hカラム（4.6mm×150mm:パーセプティブ社製）に負荷し
た。カラムを平衡化に使用した緩衝液で洗浄した後、硫
酸アンモニウム濃度を25％飽和から０％飽和に低下させ
ると同時にアセトニトリル濃度を０％から20％に増加さ
せる直線濃度勾配溶出を行い、PFUSプロテアーゼを溶出
させ、精製酵素標品NAPS−１を得た。

培養液上清750mlは25mMトリス−HCl、pH8.0に対して
透析し、同じ緩衝液で平衡化したEcono−Pack Ｑカー
トリッジ（5ml:バイオラッド社製）に吸着させた。つい
で、吸着した酵素を０〜1.5M NaClの直線濃度勾配によ
り溶出させた。得られた活性画分を95℃で１時間加熱処
理した後、３分の１量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加
えた。0.45μｍフィルターユニット（ステリベックスH
V）を用いてろ過を行った後、ろ液を25％飽和の硫酸ア
ンモニウムを含む25mMトリス−HCl、pH7.5で平衡化した
POROS PHカラム（4.6mm×150mm）に負荷した。上記の
酵素標品NAPS−１の場合と同様の操作によってカラムに
吸着したPFUSプロテアーゼを溶出させ、精製酵素標品NA
PS−1Sを得た。

精製酵素標品NAPS−１、およびNAPS−1Sの適量に終濃
度8.3％のトリクロロ酢酸を加えて標品中のタンパク質
を沈殿させ、これを遠心分離によって回収した。回収さ
れたタンパク質沈殿物を蒸留水に溶解した後、1/4量の
試料用緩衝液（50mMトリス−HCl、pH7.5、５％SDS、５
％２−メルカプトエタノール、0.005％ブロモフェノー
ルブルー、50％グリセロール）を添加し、100℃、５分
間処理した後に0.1％SDS−10％ポリアクリルアミドゲル
を用いて電気泳動を行った。泳動終了後、2.5％クーマ
シー・ブリリアントブルーＲ−250、25％エタノール、1
0％酢酸中で30分間染色を行い、続いて25％メタノー
ル、７％酢酸中にゲルを移し、３〜15時間かけて余分の
色素を除いた。精製酵素標品NAPS−１、NAPS−1Sはどち
らも単一のバンドを示し、泳動距離からの推定分子量は
約45kDaであった。

（３）成熟型のプロテアーゼPUFSのＮ末端の決定 実施例４−（２）で調製した精製酵素標品NAPS−１を
0.1％SDS−10％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳
動した後、セミドライブロッター（日本エイドウ社製）
を用いてゲル上のタンパクをPVDF膜（ミリポア社製）に
転写した。転写操作はエレクトロフォレシス（Electrop
horesis）、第11巻、第573〜580頁（1990）に記載の方
法に準じた。転写後の膜を0.1％クーマシーブリリアン
トブルーＲ−250、50％メタノール溶液により染色した
後、60％メタノールで脱色した。膜上に現れた染色され
た部分を切り取ってG1000Aプロテインシーケンサー（ヒ
ューレット パッカード社製）を用いた自動エドマン法
によりＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。配列表の配
列番号42に得られたＮ末端アミノ酸配列を示す。

配列表 配列番号:1 配列の長さ:659 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号:2 配列の長さ:1977 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：サーモコッカス・セラー 株名:DSM2476 配列： 配列番号:3 配列の長さ:522 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴:428番目のXaaはGlyかVal 配列： 配列番号:4 配列の長さ:1566 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：ピロコッカス・フリオサス 株名:DSM3638 配列の特徴:1283番目のＮはＧかＴ 配列： 配列番号:5 配列の長さ:659 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号:6 配列の長さ:1977 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列： 配列番号:7 配列の長さ:4765 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：ピロコッカス・フリオサス 株名:DSM3638 配列： 配列番号:8 配列の長さ:1398 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号:9 配列の長さ:35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:10 配列の長さ:32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:11 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:12 配列の長さ:34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:13 配列の長さ:145 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（PCR断片） 配列： 配列番号:14 配列の長さ:564 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（PCR断片） 配列： 配列番号:15 配列の長さ:1859 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：サーモコッカス・セラー 株名:DSM2476 配列： 配列番号:16 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:17 配列の長さ:1464 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列： 配列番号:18 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:19 配列の長さ:28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:20 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:21 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:22 配列の長さ:19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:23 配列の長さ:19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:24 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:25 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:26 配列の長さ:507 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：ピロコッカス・フリオサス 株名:DSM3638 配列： 配列番号:27 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:28 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:29 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:30 配列の長さ:420 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（PCR断片） 配列： 配列番号:31 配列の長さ:420 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（PCR断片） 配列： 配列番号:32 配列の長さ:28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:33 配列の長さ:28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:34 配列の長さ:1962 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：ピロコッカス・フリオサス 株名:DSM3638 配列： 配列番号:35 配列の長さ:654 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号:36 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:37 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:38 配列の長さ:80 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源：ピロコッカス・フリオサス 株名:DSM3638 配列： 配列番号:39 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:40 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:41 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:42 配列の長さ:12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三田 正範 京都府京田辺市草内鐘鉦割４−14−２− 321 (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県甲賀郡甲南町希望ヶ丘３−20−９ (72)発明者 綱澤 進 滋賀県大津市一里山４丁目15−３ (72)発明者 加藤 郁之進 京都府宇治市南陵町１−１−150 (56)参考文献 特開 平６−197770（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，1995，Ｖｏｌ．152，Ｎｏ. １，ｐ．103−106 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配
   列、もしくは該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、
   挿入、付加、置換がなされたアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする、95℃で活性を示すプロテアーゼ。
2. 【請求項２】請求項１記載のプロテアーゼをコードする
   プロテアーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】配列表の配列番号２に示される塩基配列を
   有することを特徴とする請求項２記載のプロテアーゼ遺
   伝子。
4. 【請求項４】請求項３記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝
   子に0.5％SDS、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリビ
   ニルピロリドン、0.1％フィコール400、0.01％変性サケ
   精子DNAを含む６×SSC中、50℃でハイブリダイズし、か
   つ95℃で活性を示すプロテアーゼをコードすることを特
   徴とする遺伝子。
5. 【請求項５】配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配
   列、もしくは該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、
   挿入、付加、置換がなされたアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする、95℃で活性を示すプロテアーゼ。
6. 【請求項６】請求項５記載のプロテアーゼをコードする
   プロテアーゼ遺伝子。
7. 【請求項７】配列表の配列番号４に示される塩基配列を
   有することを特徴とする請求項６記載のプロテアーゼ遺
   伝子。
8. 【請求項８】請求項７記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝
   子に0.5％SDS、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリビ
   ニルピロリドン、0.1％フィコール400、0.01％変性サケ
   精子DNAを含む６×SSC中、50℃でハイブリダイズし、か
   つ95℃で活性を示すプロテアーゼをコードすることを特
   徴とする遺伝子。
9. 【請求項９】配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配
   列、もしくは該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、
   挿入、付加、置換がなされたアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする、95℃で活性を示すプロテアーゼ。
10. 【請求項１０】請求項９記載のプロテアーゼをコードす
    るプロテアーゼ遺伝子。
11. 【請求項１１】配列表の配列番号６に示される塩基配列
    を有することを特徴とする請求項10記載のプロテアーゼ
    遺伝子。
12. 【請求項１２】請求項11記載の超耐熱性プロテアーゼ遺
    伝子に0.5％SDS、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリ
    ビニルピロリドン、0.1％フィコール400、0.01％変性サ
    ケ精子DNAを含む６×SSC中、50℃でハイブリダイズし、
    かつ95℃で活性を示すプロテアーゼをコードすることを
    特徴とする遺伝子。
13. 【請求項１３】請求項２〜４、６〜８および10〜12いず
    れか１項に記載のプロテアーゼ遺伝子を含有させた形質
    転換体を培養し、該培養物からプロテアーゼを採取する
    ことを特徴とする、95℃で活性を示すプロテアーゼの製
    造方法。