JP3506434B2 - ブレビバクテリウム・ステロリカム由来のコレステロールオキシダーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はブレビバクテリウム・ステロリカム（Brevib
acterium sterolicum）由来のコレステロールオキシダ
ーゼ、ブレビバクテリウム・ステロリカム由来の組換え
コレステロールオキシダーゼの産生方法、宿主細菌中に
組換えコレステロールオキシダーゼの細胞質発現をもた
らす、上記方法に適切なDNA、およびこのようにして取
得される組換えコレステロールオキシダーゼに関する。

コレステロールオキシダーゼはコレステロールの酵素
的測定にとって極めて重要である。それはコレステロー
ルのコレステン−３−オンおよびH₂O₂への酸化を触媒す
る。シュードモナス（Pseudomonas）、マイコバクテリ
ウム（Mycobacterium）、ノカルジア（Nocardia）、ア
ースロバクター（Arthrobacter）およびブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）等の種々の生物由来のコレステ
ロールオキシダーゼがこれまでに記述されている（T.Uw
ajimaら,Agr.Biol.Chem.37（1973）,2345−2350）。こ
れら公知のコレステロールオキシダーゼはすべて分泌タ
ンパク質である。土壌細菌であるブレビバクテリウム・
ステロリカムKY 3643（ATCC 21387）は、特に高いコレ
ステロールオキシダーゼ活性を有する。この細菌に由来
するコレステロールオキシダーゼの３つのイソ酵素が公
知であり、それらは等電点、種々のステロイドに対する
基質特異性、最適pHにおけるコレステロールに対する親
和性、並びにDNA及びアミノ酸配列において異なってい
る（ヨーロッパ特許出願第0 452 112号および第560 983
号）。ブレビバクテリウム・ステロリカム由来のコレス
テロールオキシダーゼＩはコレステロールに対する親和
性が低く（K_M1.1 X 10^-3mol/l）、またブレビバクテリ
ウム・ステロリカムから低い収率でしか得ることができ
ない。コレステロールオキシダーゼＩをコードする完全
なDNAを大腸菌において発現させることが試みられた
が、まだ成功していない（K.Fujishiroら,Biochem.Biop
hys.Res.Com.172（1990）,721−727,T.Ohtaら,Gene 103
（1991）,93−96）。lac z遺伝子のいくつかの部分と融
合させた、コレステロールオキシダーゼＩをコードする
DNAの特別な欠失突然変異体の発現もまた大腸菌におい
て満足すべき発現をもたらしていない（E.Ohtaら,Biosc
i.,Biotech.Biochem.56（1992）,1786−1791）。ブレビ
バクテリウム・ステロリカム由来の別のコレステロール
オキシダーゼのクローニングおよび発現がヨーロッパ特
許出願第0 452 112号に記述されている。しかし、これ
らのDNAの発現もまた同様に十分な量の活性コレステロ
ールオキシダーゼをもたらしていない。

本発明の目的は、コレステロールに対する高い親和性
を有するコレステロールオキシダーゼを大量に、しかも
活性な形で提供することであった。

この目的は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るコレステロールオキシダーゼによって達成される。こ
のコレステロールオキシダーゼは、ブレビバクテリウム
・ステロリカムから取得可能であり、また組換え手段に
よっても産生しうる。

驚くべきことに、そのようなコレステロールオキシダ
ーゼは組換えによって大量に、しかも活性な形で産生し
うることが判明した。このコレステロールオキシダーゼ
は分子量が60kDで、等電点が約5.5（それぞれPharmacia
LKB製Phast Systemを用いて測定）、およびコレステロ
ールに対するK_M値が1 x 10^-4mol/l（25℃でpH7.5の0.5m
ol/lリン酸カリウム緩衝液中）であり、そしてpHが5.5
〜8.0の範囲内において活性である。

このコレステロールオキシダーゼは、下記のDNAを異
種発現に使用すると、大量に、しかも活性な形で取得で
きることが判明した。すなわち、コレステロールオキシ
ダーゼ活性を有するペプチドをコードし、かつ下記の
群： ａ）配列番号１に記載のDNA配列、またはそれに相補的
なDNA配列、 ｂ）配列番号１に記載のDNA配列またはその断片とハイ
ブリダイズするDNA配列、 ｃ）遺伝暗号の縮重なしに上記ａ）またはｂ）に記載の
配列とハイブリダイズし、かつ同一のアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするDNA配列、 より選択されるDNAであって、配列番号３、４および／
または５に記載の配列のうち１つを有するDNAである。
好ましくは、配列番号１に記載の配列を有するDNAが使
用される。しかし、当業者に周知の方法により、縮重し
たコドンを、同一アミノ酸をコードする他のコドンに置
き換えることもまた可能である。さらに、取得されるDN
A変異体が配列番号１に記載の配列と通常の条件下でハ
イブリダイズするならば、付加的アミノ酸をコードする
コドンを5'末端、3'末端、または配列番号１に記載の配
列内に加えることが可能である（T.Maniatisら,Molecul
ar Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor
Laboratory,Cold Spring Harbor,New York 1989参
照）。さらに、使用されるDNAは配列番号３、４および
／または５に記載の配列のうち１つを持っていなければ
ならず、またコレステロールオキシダーゼ活性を有する
ペプチドをコードしていなければならない。コレステロ
ールオキシダーゼ活性を有するペプチドとは、コレステ
ロール（５−コレステン−３−β−オール）の４−コレ
ステン−３−オンおよびH₂O₂への酸化を触媒するペプチ
ドと理解される。

それゆえ、本発明はまたコレステロールオキシダーゼ
活性を有するペプチドをコードし、かつ下記の群： ａ）配列番号１に記載のDNA配列、またはそれに相補的
なDNA配列、 ｂ）配列番号１に記載のDNA配列またはその断片とハイ
ブリダイズするDNA配列、 ｃ）遺伝暗号の縮重なしに上記ａ）またはｂ）に記載の
配列とハイブリダイズし、かつ同一のアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするDNA配列、 より選択されるDNAであって、配列番号３、４および／
または５に記載の配列のうち１つを有するDNAに関す
る。

このようなDNAを用いると、先に記述した方法および
コレステロールオキシダーゼを用いるのと比べ、粗抽出
物中の組換え産生コレステロールオキシダーゼの少なく
とも10倍高い活性を得ることができる。

さらに、本発明は、適切な発現系に存在する本発明の
DNAを用いて適切な宿主細胞を形質転換し、形質転換さ
れた宿主細胞を培養し、形質転換細胞の細胞質より形成
されたたコレステロールオキシダーゼを単離することに
よる、組換えコレステロールオキシダーゼの産生方法に
関する。

この方法を用いると、驚くべきことに形質転換された
宿主細胞の細胞質から、組換えコレステロールオキシダ
ーゼを大量に、しかも活性な形で得ることが可能であ
る。この方法において、使用されるDNAは、翻訳開始コ
ドンを持つが終始コドンは持たない付加的ヌクレオチド
配列を5'末端に含有することができ、この付加的ヌクレ
オチド配列は読み枠の変更をもたらさず、また形成され
る組換え酵素の分泌のための機能的に活性なシグナル配
列を表さないものである。このヌクレオチド配列の長さ
は約３から90塩基対である。

上記の付加的ヌクレオチド配列は、好ましくは天然の
シグナル配列の代わりに配列プロトコール６、８、10、
12、14および16に記載の配列のうち１つを有する。

したがって、本発明の好ましい主題は、配列番号６、
８、10、12、14または16に記載の配列のうち１つを5'末
端に有する本発明のDNAを使用する、組換えコレステロ
ールオキシダーゼの産生方法である。

組換え産生に使用される宿主細胞は、公知の方法によ
り形質転換される（例えば、Sambrook,FritschおよびMa
niatis,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,
1989参照）。次に、形質転換した宿主細胞を、コレステ
ロールオキシダーゼ遺伝子の発現を可能とする条件下で
培養する。使用する発現ベクターによっては、温度を上
昇させるため、またはグルコースの供給を制限するため
に、周知の方法で培地に誘導剤（例えばラクトースまた
はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド
（IPTG））を添加することが適当であろう。次に、公知
の方法によって、形質転換細胞の細胞質から組換えコレ
ステロールオキシダーゼを単離する。

この産生方法を用いると、本発明のコレステロールオ
キシダーゼを組換え酵素として８〜20U/mlの収率で得る
ことが可能である。対照的に、シグナル配列を含有する
完全なコレステロールオキシダーゼ遺伝子の発現は0.1U
/ml未満の収率しかもたらさない。

本発明の好ましい主題は、配列番号６、８、10、12、
14および16に記載の配列のうち１つを5'末端に持つ、コ
レステロールオキシダーゼ活性を有するペプチドをコー
ドする本発明のDNAである。配列プロトコール18、20、2
2、24、26および28に記載の配列が特に好ましい。本発
明によるこれらのDNA配列は、好ましくは発現ベクター
中にクローン化されて存在する。このDNAは、本発明の
コレステロールオキシダーゼを任意の量で、タンパク質
の組換え産生に従来用いられている細菌を用いて取得す
るために使用できる。このDNAの発現は、好ましくは大
腸菌中で実施される。

それゆえ本発明はまた、本発明のDNAによってコード
され、かつ配列番号７、９、11、13、15または17に記載
のアミノ酸配列のうち１つをＮ末端に有する組換えコレ
ステロールオキシダーゼに関する。

この組換えコレステロールオキシダーゼは、現在当分
野の技術において公知の他のコレステロールオキシダー
ゼと同等にコレステロール測定のための酵素的試験に適
切である。必要であれば、コレステロールオキシダーゼ
の細胞質発現が上記Ｎ末端配列を通過して進んだ後でも
そのようなＮ末端融合配列を切断できるように、特定の
プロテアーゼ（例えばIgAプロテアーゼ、エンテロキナ
ーゼまたはXa因子）の認識配列を、上記Ｎ末端配列と成
熟コレステロールオキシダーゼのアミノ酸配列との間に
当業者に周知の方法でin vitroの突然変異誘発で組み込
むことが可能である。

本発明の好ましい主題は、配列番号21、23、25、27ま
たは29に記載のアミノ酸配列を有する組換えコレステロ
ールオキシダーゼ、ならびにコレステロール検出のため
の酵素的試験におけるそのようなコレステロールオキシ
ダーゼの使用である。この方法では、コレステロールオ
キシダーゼ反応によって形成されるH₂O₂が、好ましくは
次の指示薬反応において試料中に存在するコレステロー
ルの尺度として定量される。

実施例に記載のプラスミドpUC−chol−B2−BB（DSM 8
274）、pmgl−Sph I（DSM 8272）およびpfl−20AT1−SD
（DSM 8273）は、1993年５月５日に"Deutsche Sammlung
fur Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH",Masche
roder Weg 1b,D−3300 Braunschweigに寄託された。

本出願は以下に述べる実施例および配列プロトコール
ならびに図によってより詳細に説明される。

配列番号１ 本発明のコレステロールオキシダーゼの核
酸配列を示す。

配列番号２ 本発明のコレステロールオキシダーゼのア
ミノ酸配列を示す。

配列番号３〜５ コレステロールオキシダーゼ活性を有
するペプチドをコードする本発明のDNA由来のヌクレオ
チド配列を示す。

配列番号６〜17 本発明の組換えコレステロールオキシ
ダーゼ遺伝子のＮ末端配列（配列番号６、８、10、12、
14および16）ならびにそのＮ末端アミノ酸配列（配列番
号７、９、11、13、15および17）を示す。

配列番号18〜29 本発明のコレステロールオキシダーゼ
の核酸配列およびそのアミノ酸配列。

これらは以下のものを表す。シグナル配列 完全な配列 構築物
配列番号6 〜７ 配列番号18〜19 plac−Chol−cyt
配列番号8 〜９ 配列番号20〜21 ppfl−Chol−cyt
配列番号10〜11 配列番号22〜23 ppfl−MSN3H−Chol
−cyt 配列番号12〜13 配列番号24〜25 ppfl−MSN4H−Chol
−cyt 配列番号14〜15 配列番号26〜27 ppfl−MSN4R2K−Cho
l−cyt 配列番号16〜17 配列番号28〜29 ppfl−MVM3H−Chol
−cyt 配列番号30〜33 本発明のコレステロールオキシダーゼ
遺伝子の断片を増幅するための４つのオリゴヌクレオチ
ドを示す。

配列番号34 実施例５のコレステロールオキシダーゼ遺
伝子をin vitro突然変異誘発するためのアダプターオリ
ゴヌクレオチドの配列を示す。

図１はプラスミドpUC−Chol−B2−BBを示す。

図２はプラスミドplac−Chol−cytを示す。

図３はプラスミドppfl−Chol−cytを示す。

図４はプラスミドppfl−MSN3H−Chol−cytを示す。

実施例１ ブレビバクテリウム・ステロリカム由来のコレステロー
ルオキシダーゼ遺伝子のクローニング ブレビバクテリウム・ステロリカム（BMTU 2407）を5
00mlの栄養ブイヨン（Difco）中で、30℃で20時間培養
する。細胞を遠心により集める。このようにして得た細
胞ペレットを、20mmol/l Tris/HCl pH8.0にミリリット
ルあたり細胞湿重量が0.4gとなるように再懸濁する。こ
の懸濁液2.5mlに、5mlの24％（w/v）ポリエチレングリ
コール6000、2.5mlの20mmol/l Tris/HCl pH8.0および10
mgのリゾチームを加え、４℃で14時間インキュベートす
る。次に、1mlの20％（w/v）SDSおよび2mgのプロテアー
ゼＫを加えて37℃で１時間インキュベートすることによ
り、細胞を溶解する。等容量の20mmol/l Tris/HCl pH8.
0をこの溶液に加え、次にミリリットルあたり1gのCsCl
および0.8gの臭化エチジウムを加える。この溶液を、TV
850垂直ローター（DuPont）を用いて40,000rpmで24時間
超遠心分離する。次に注射器を用いてDNAバンドを取り
出す。臭化エチジウムの除去およびDNAのエタノール沈
殿を、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Ma
nual（1989）の記述にしたがって実施する。

このようにして得たDNAの７μｇを制限エンドヌクレ
アーゼNla III（New England Biolab）を用いて部分切
断し、0.8％アガロースゲルを用いて電気泳動により分
離し、約２〜12kbのサイズ領域を切り出す。DNA断片を
ゲルから単離し、Sph Iで切断し、次にウシ腸由来のア
ルカリホスファターゼで処理したプラスミドベクターpU
C19に連結する。この連結調製物を、コンピテント大腸
菌K12 XL1−blue（Stratagene,カタログ番号200268）に
導入する。形質転換細胞を、100μg/mlアンピシリンを
含有するLB培地を用いた寒天プレートにまき、37℃で１
晩インキュベートする。十分増殖したコロニーをニトロ
セルロースフィルター（Schleicher and Schull）上に
移し、トルエン／クロロホルム蒸気で処理して溶解し、
フィルターのコロニー面を指示薬プレートに移す（下記
参照）。室温で15〜30分間インキュベートすることによ
り、コレステロールオキシダーゼ活性をこれらの指示薬
プレート上で試験する。

呈色反応を示すクローンを選択し、単離する。対照と
して、これらの大腸菌クローンを、100μg/mlアンピシ
リンを含有するLB培地を用いた寒天プレートに画線し、
１晩37℃でインキュベートする。検証のため、増殖した
コロニーを再度２枚の異なるニトロセルロースフィルタ
ー上に移し、上記のようにトルエン／クロロホルム蒸気
を用いて溶解する。一方のフィルターを再度、上記の指
示薬プレート上に置き、他方のフィルターをコレステロ
ールを含有しない指示薬プレート上に置く。陽性呈色反
応は基質コレステロールを含有する指示薬プレートにお
いてのみ見られた。したがって、これは対応する大腸菌
クローンによって引き起こされた呈色反応が実際活性な
コレステロールオキシダーゼによるものであることを実
証する。

指示薬プレートの調製： コレステロールオキシダーゼ活性を測定するプレート
試験のため、100mlの２％低融点アガロース（Sea Plaqu
e BIOzym 50113）を融解し、あらかじめ42℃まで温めた
以下のものより成る溶液： − 48mgの４−アミノアンチピリン（Boehringer Mannh
eim GmbH,カタログ番号073474） − 306mgのEST（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホエチル−３−
メチルアニリンカリウム塩（Boehringer Mannheim Gmb
H,カタログ番号586854）） − 2.5mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ、純度II（約2
60U/mg（Boehringer Mannheim GmbH,カタログ番号00509
6）） − 60μｌのアジ化ナトリウム溶液（20％） − 10mlの1mol/lリン酸カリウムpH7.2 − 150mgのコール酸ナトリウム塩（Merck,カタログ番
号12448） − 10mlのコレステロール基質溶液（下記参照） − 溶液を100mlとするH₂O を溶解したアガロースに加え、注意深く混合し、10mlず
つペトリ皿に注ぎ、暗所に保存する。

コレステロール基質溶液： 500mgのコレステロール（Boehringer Mannheim GmbH,
カタログ番号121312）を12.5mlの１−プロパノール（Me
rck,カタログ番号997）に溶解し、10gのThesit（Boehri
nger Mannheim GmbH,カタログ番号006190）を加えたの
ち良く混合し、溶液が100mlになるまで水を加える。こ
の基質溶液は室温で数カ月保存できる。

実施例２ コレステロールオキシダーゼ遺伝子の特徴付け 実施例１によって得たクローンのプラスミド（pUC−c
hol−B2）を標準的方法によって単離し、制限エンドヌ
クレアーゼBamH I、EcoR I、Kpn I、Xho IおよびPst I
を用いる制限酵素地図作成に付す。大きさが約5.5kbの
ブレビバクテリウムのゲノム由来のDNA断片をプラスミ
ドpUC−Chol−B2に挿入する。この5.5kb断片の種々の部
分断片をサブクローニングし、次に、得られた大腸菌ク
ローンのコレステロールオキシダーゼ活性を測定するこ
とにより、コレステロールオキシダーゼ遺伝子を大きさ
が2.3kbのBamH I断片にしぼることが可能である。この
断片を有するプラスミドをpUC−Chol−B2ーBB（図１）
と名付ける。この断片のDNA配列を決定し、コレステロ
ールオキシダーゼをコードする読み枠について調べる。
成熟コレステロールオキシダーゼのこの読み枠の配列
は、配列番号１に記載されている。

実施例３ 異種シグナル配列を有するコレステロールオキシダーゼ
遺伝子発現のためのプラスミドの構築 ブレビバクテリウムから単離したコレステロールオキ
シダーゼのＮ末端アミノ酸配列を、pUC−Chol−B2−BB
由来のコレステロールオキシダーゼをコードする全読み
枠と比較すると、遺伝子配列の最初の52個のコードされ
ているアミノ酸が成熟タンパク質には存在しないことが
分かる。これら52アミノ酸は、グラム陽性原核細胞の典
型的な排出（export）シグナル配列の構造を有する（vo
n Heijne,Biochim.Biophys.Acta 947（1988）,307−33
3）。このシグナル配列が他の配列に置換されている組
換えコレステロールオキシダーゼ遺伝子を構築するため
に、まずプラスミドpUC−Chol−B2−BB由来の387bpのDN
A断片を配列番号30または31に記載のオリゴヌクレオチ
ドを用いてPCRによって増幅する。この断片は、成熟酵
素のアミノ酸配列のＮ末端の前に直接接して新規なSph
I切断部位を有する、成熟オキシダーゼのＮ末端部分を
コードする領域を含有する。このPCR断片をSph Iおよび
Pst Iによって切断し、コレステロールオキシダーゼ遺
伝子の残りの部分を含有するpUC−Chol−B2−BB由来のP
st I EcoR I断片と共に、Sph IおよびEcoR Iによって切
断された発現ベクターpmglSph Iに連結する。このよう
にして、pmgl−Chol−SBが得られる。このベクターにお
いて、コレステロールオキシダーゼ遺伝子は大腸菌中で
機能するネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）由
来のシグナル配列（WO 88/093773に記載されている）を
含有する。

実施例４ シグナルペプチドをコードする配列を持たないコレステ
ロールオキシダーゼ遺伝子をlacUV5プロモーターの制御
下で発現させるためのプラスミドの構築 成熟コレステロールオキシダーゼのコード配列の全部
分を含有するがシグナルペプチドをコードする配列を含
有しない大きさ約1.85kbのDNA断片を、制限エンドヌク
レアーゼSph IおよびBamH Iで処理することによりプラ
スミドpmgl−Chol−SBから切り出す。この断片を、あら
かじめSph IおよびBamH Iで切断したプラスミドベクタ
ーpUC19に挿入する。このようにして得られたプラスミ
ドplac−Chol−cytにおいて、コレステロールオキシダ
ーゼ遺伝子は正しい読み枠内に存在し、pUC19由来のlac
Z'遺伝子の最初の10コドンに融合させ、lacUV5プロモー
ターの制御下におかれる（図２参照）。

実施例５ シグナルペプチドをコードする配列を持たないコレステ
ロールオキシダーゼ遺伝子を酸素によって調節されるpf
lプロモーターの制御下で発現させるためのプラスミド
の構築 ATG開始コドンの前に接してCla I切断部位を含有する
大きさが432bpのDNA断片を、配列番号32および33に記載
のオリゴヌクレオチドを用いてPCR技法によりプラスミ
ドplac−Chol−cytから作成する。このPCR断片をCla I
およびPst Iで切断する。さらに、コレステロールオキ
シダーゼ遺伝子の残りのＣ末端部分を有する断片を、制
限エンドヌクレアーゼPst IおよびBamH Iを用いて処理
することによりプラスミドplac−Chol−cytから切り出
す。両方の断片を同時に、BamH IおよびCla Iで切断し
た発現ベクターpfl 20 AT1−SDに連結する。正しい連結
産物は、pUC19由来のlacZ'遺伝子の最初の10コドンに融
合しており、酸素によって調節されるpflプロモーター
の制御下にある成熟コレステロールオキシダーゼの読み
枠を含有する（図３参照）。このプラスミドをppfl−Ch
ol−cytと名付ける。

実施例６ 別のＮ末端融合配列を有するコレステロールオキシダー
ゼ遺伝子発現のためのプラスミドの構築 コレステロールオキシダーゼ遺伝子の3'非翻訳領域に
位置するプラスミドppfl−Chol−cytのSph I切断部位を
除去するため、プラスミドDNAをSam IおよびEcoR Vで切
断して再度連結する。次に、このようにして形成したプ
ラスミドppfl−Chol−cyt−△termの100ngを制限酵素Cl
a IおよびSph Iで切断する。形成された大きさが4.76kb
のDNA断片を電気泳動により低融点アガロース中で分離
し、切断し、溶出する（Glassmilk^TM−Kit,Bio 101）。
このようにして精製されたDNA断片の100ngを、配列番号
34に記載の配列（ここで"N"は４塩基全ての等モル混合
物を表す）を有するアダプターオリゴヌクレオチド50pm
olと混合し、37℃で２時間T4 DNAリガーゼを用いて処理
する。次に、この混合物を４つのdNTPの混合物（最終濃
度0.125mmol/l）と混合し、37℃で40分間クレノウDNAポ
リメラーゼを用いて処理する。このようにして得たプラ
スミドDNAを大腸菌XL1−blue（Stratagene）に導入す
る。得られたクローンの各コロニーを、実施例１に記載
のコロニー活性試験によりコレステロールオキシダーゼ
活性について比較する。高いコレステロールオキシダー
ゼ活性を有するクローンを単離し、そのプラスミドDNA
を制限分析およびDNA配列決定により特徴付ける。特に
高いコレステロールオキシダーゼ活性を有するクローン
のプラスミドは、配列番号23の配列を有することが判明
した。このプラスミドをppfl−MSM3H−cyt−△termと名
付けた。上記の方法で十分な数の異なるクローンを単離
および特徴付けするならば、特に高い発現に適するさら
なるクローンが見いだされることが予想される。3'非翻
訳部分を再び完全にするため、プラスミドppfl−MSM3H
−Chol−cyt−△termをCla IおよびXho Iで切断する。
コレステロールオキシダーゼ遺伝子の翻訳開始領域およ
びＮ末端部分を有する約1.1kbのDNA断片を単離し、同じ
くCla IおよびXho Iで切断されたプラスミドppfl−Chol
−cytに連結する（図４参照）。得られたプラスミドをp
pfl−MSN3H−Chol−cytと名付ける。

実施例７ 種々の発現プラスミドによる大腸菌におけるコレステロ
ールオキシダーゼ形成の比較 プラスミドpUC−Chol−B2、pUC−Chol−B2−BB、pmgl
−Chol−SB、plac−Chol−cyt、ppfl−Chol−cytおよび
ppfl−MSN3H−Chol−cytをそれぞれ大腸菌K12 XL1−blu
eに導入する。形成される酵素の量を比較するため、各
クローンをそれぞれ200μg/mlのアンピシリンおよび下
記の添加物を含有するLB培地で30℃で15時間培養する：
コレステロールオキシダーゼ遺伝子がそれぞれlacUV5プ
ロモーターの制御下にあるプラスミドpUC−Chol−B2、p
UC−Chol−B2−BBおよびplac−Chol−cytを含有するク
ローンにはさらに1mmol/lのIPTGを添加し；グルコース
に抑制されるmglプロモーターを有するプラスミドpmgl
−Chol−SBを含有するクローンにはそれ以上の添加物を
加えず；酸素によって調節されるpflプロモーターを有
するプラスミドppfl−Chol−cytおよびppfl−MSN3H−Ch
ol−cytを含有するクローンには0.4％のグルコースを加
え、窒素ガスで処理した密閉血清フラスコ（そこではKO
Hを用いて培地のpHを7.0に調節してある）内で増殖させ
る。培養完了後、420nmにおける濁度を光学的に測定す
ることにより、達成された細胞密度を測定する。次に、
培養ブイヨン1mlの細胞を微小遠心機を用いて10,000gで
遠心して沈殿させ、0.5mlの再蒸留水に再懸濁する。2 x
30秒の超音波処理により細胞破壊を実施する（Branson
Sonifier、モデル450、標準マイクロチップ、円錐
形）。このようにして得た細胞抽出物を適切に希釈した
のち下記の酵素試験に使用する。この目的のため、以下
のものを石英セルにピペットで移す。

− 0.4％Thesit^TM（Boehringer Mannheim GmbH,カタロ
グ番号006190）を含有する3mlのリン酸カリウム緩衝液
（0.5mol/l,pH7.5）、 − 0.1mlのコレステロール溶液（0.4％コレステロー
ル、10％１−プロパノール、10％Thesit^TM）、 − 0.02mlのH₂O₂（再蒸留水中0.49mol/l）。

これらを混合し、0.02mlのカタラーゼ（ウシ肝臓由来、
mlあたりタンパク質20mg、比活性約65,000U/mg、Boehri
nger Mannheim GmbH,カタログ番号0156744,測定前に0.4
％Thesitを含有する氷冷リン酸カリウム緩衝液で直ちに
0.075〜0.15U/mlに希釈）の添加後に再度混合し、溶液
を25℃にし、次に0.05mlの試料溶液を加えることにより
反応を開始する。注意深く混合したのち、240nmにおけ
る吸光度の変化をモニターし、吸光度曲線の直線領域か
らコレステロールオキシダーゼ活性を決定する： ここでε250＝15.5mmol^-1x 1 x cm^-1である。

細胞密度および酵素活性について得られた数値を表１
に示す。

得られた結果は、コレステロールオキシダーゼの細胞
質発現を引き起こす構築物を用いると、組換え産生コレ
ステロールオキシダーゼの分泌をもたらす構築物を使用
するよりも、組換え産生コレステロールオキシダーゼの
かなり高い活性が得られることを示している。

配列プロトコール （１）省略 （２）配列番号１に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1683塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..1683 （xi）配列記述：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:561アミノ酸 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:48塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:48塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:46塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:17..46 （xi）配列記述：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:10アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号7: （２）配列番号８に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:49塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..49 （xi）配列記述：配列番号8: （２）配列番号９に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:10アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号9: （２）配列番号10に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..43 （xi）配列記述：配列番号10: （２）配列番号11に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号11: （２）配列番号12に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:19..45 （xi）配列記述：配列番号12: （２）配列番号13に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:9アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号13: （２）配列番号14に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:58塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..58 （xi）配列記述：配列番号14: （２）配列番号15に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:13アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号15: （２）配列番号16に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:48塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:25..48 （xi）配列記述：配列番号16: （２）配列番号17に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号17: （２）配列番号18に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1729塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:17..1729 （xi）配列記述：配列番号18: （２）配列番号19に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:571アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号19: （２）配列番号20に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1732塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..1732 （xi）配列記述：配列番号20: （２）配列番号21に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:571アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号21: （２）配列番号22に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1726塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..1726 （xi）配列記述：配列番号22: （２）配列番号23に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:569アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号23: （２）配列番号24に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1728塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:19..1728 （xi）配列記述：配列番号24: （２）配列番号25に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:570アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号25: （２）配列番号26に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1741塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..1741 （xi）配列記述：配列番号26: （２）配列番号27に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:574アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号27: （２）配列番号28に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:1731塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:20..1731 （xi）配列記述：配列番号28: （２）配列番号29に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:569アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列記述：配列番号29: （２）配列番号30に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号30: （２）配列番号31に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号31: （２）配列番号32に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:39塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号32: （２）配列番号33に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号33: （２）配列番号34に関する情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列記述：配列番号34:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の群から選択される組換えコレステロ
   ールオキシダーゼタンパク質をコードするDNA: （ａ）配列番号１で表される配列の5'末端に配列番号
   ６、８または10で表される配列が付加されたDNA配列か
   らなるDNA、 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１も
   しくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されて
   おりかつコレステロールオキシダーゼ活性を有するタン
   パク質をコードするDNAの5'末端に配列番号６、８また
   は10で表される配列が付加されたDNA配列からなるDNA。
2. 【請求項２】配列番号18、20または22で表されるDNA配
   列のうち１つを有する、請求項１に記載のDNA。
3. 【請求項３】適切な発現系にクローン化されて存在する
   請求項１または２に記載のDNAを用いて適切な宿主細胞
   を形質転換し、形質転換された宿主細胞を培養し、該形
   質転換細胞より形成されたコレステロールオキシダーゼ
   タンパク質を単離することによる、組換えコレステロー
   ルオキシダーゼタンパク質の産生方法。
4. 【請求項４】請求項１または２に記載のDNAによりコー
   ドされる組換えコレステロールオキシダーゼタンパク
   質。
5. 【請求項５】配列番号19、21または23で表される配列の
   うち１つを有する、請求項４に記載の組換えコレステロ
   ールオキシダーゼタンパク質。
6. 【請求項６】コレステロール測定のための酵素的試験に
   おける請求項４または５に記載の組換えコレステロール
   オキシダーゼタンパク質の使用方法。