JP3488670B2

JP3488670B2 - 酵素等を抗体等に結合させるホモバイファンクショナル試薬

Info

Publication number: JP3488670B2
Application number: JP2000038092A
Authority: JP
Inventors: ビエニアルズクリストファー; ウエルチクリストファー
Original assignee: アボットラボラトリーズ
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2004-01-19
Anticipated expiration: 2019-01-19
Also published as: EP0555336B1; GR3021097T3; CA2094397A1; DE69121108D1; DE69121108T2; AU657284B2; JP2000229926A; US5380873A; KR930702683A; AU8905991A; EP0555336A4; JPH06502411A; CA2094397C; ES2092579T3; JP3360174B2; EP0555336A1; ATE140795T1; WO1992007268A1; DK0555336T3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素等を抗体等に
結合させる、あるいは酵素等をホモバイファンクショナ
ル試薬で抗体等に結合させた酵素等に結合させるホモバ
イファンクショナル試薬に関するものである。特に、こ
のホモバイファンクショナル試薬は抗体、細胞、酵素、
補酵素、蛋白、ハプテン、小分子を、酵素、補酵素、抗
体、蛋白、固相、ポリマ−、リポソ−ムに結合させるの
に使用でき、本明細中で時々「コンジュゲ−ト」と呼ぶ
結合化合物は酵素、補酵素、抗体、蛋白、固相、ポリマ
−、リポソ−ムに結合した抗体、細胞、酵素、補酵素、
蛋白、ハプテン、小分子である。

【０００２】

【従来の技術】本明細書の開示および請求の範囲の項の
理解を容易にするため、免疫アッセイに関する説明およ
び免疫アッセイでよく用いられる用語の定義を、背景と
して以下に記載する。

【０００３】用語「アナライト」はタンパク質であり、
検出されるべき抗体でもあり得るが、必ずしもそうとは
限らない。用語「テストサンプル」は、通常、血漿、血
清、腹水、リンパ液、脳脊髄液、乳頭分泌液、尿、興味
あるアナライトを含む可能性のあるその他の体液等の体
液サンプルである。テストサンプルは、特別な免疫アッ
セイに必要とされる体積量にするため、血清成分を含む
リン酸緩衝液のような適当な希釈緩衝液で任意に希釈す
ることができる。

【０００４】用語「特異的結合メンバ−」は、特異的結
合ペアのメンバ−、すなわち分子のうちのひとつが化学
的あるいは物理的にもうひとつの分子に結合しているふ
たつの異なる分子である。アレルゲンと抗体とのペアの
ような抗原と抗体との特異的結合ペアに加え、他の特異
的結合ペアには、ビオチンとアビジン、炭水化物とレク
チン、相補的塩基配列や相補的ペプチド配列やエフェク
タ−とリセプタ−分子、酵素コファクタ−と酵素、酵素
阻害剤と酵素、ペプチド配列と蛋白配列に特異的な抗
体、多酸と塩基、染料と蛋白結合体、ペプチドと特異的
蛋白結合体（例えば、リボヌクレア−ゼにおけるＳ−ペ
プチドとリボヌクレア−ゼＳ−蛋白）等がある。さら
に、特異的結合ペアには、例えばアナライトアナログの
ような、もとの特異的結合メンバ−のアナログであるメ
ンバ−を含めることができる。特異的結合メンバ−が免
疫反応物ならば、特異的結合メンバ−は例えば抗体、抗
原、ハプテン、あるいはそれらの複合体となる。抗体を
使用したときは、特異的結合メンバ−は、モノクロ−ナ
ル抗体あるいはポリクロ−ナル抗体、組み換え蛋白ある
いは組み換え抗体、それらの断片の混合物、抗体と他の
特異的結合メンバ−の混合物となる。このような抗体の
詳細な調製法や、特異的結合メンバ−として使用するの
に適当な抗体は、当業者達によく知られている。

【０００５】用語「インディケ−タ−試薬」は、特異的
結合メンバ−に直接的あるいは間接的に結合した検出可
能なラベルを含み、直接的あるいは間接的にアナライト
に結合することができ、それによってテストサンプル中
のアナライトの存否や量を示すことができるアッセイ試
薬である。ラベルあるいは特異的結合メンバ−のうちい
ずれかを変えることにより、さまざまな異なるインディ
ケ−タ−試薬を調製することができる。一般には、イン
ディケ−タ−試薬がアナライトあるいは相補的特異的結
合メンバ−と複合体を形成した後、インディケ−タ−試
薬を検出するが、結合していないインディケ−タ−試薬
を検出することもできる。

【０００６】用語「ラベル」は、特異的結合メンバ−に
付着し、視覚的あるいは計器を用いて検出できるシグナ
ルを発する物質である。ラベルには、色原体；触媒；蛍
光化合物；化学発光化合物；放射活性アイソト−プ；コ
ロイド金属粒子やコロイド非金属粒子、染料粒子、酵素
や基質、あるいは有機ポリマ−ラテックス粒子等の直接
的な視覚的ラベル；リポソ−ムや小胞を含む他のシグナ
ルを発する物質等を含む。

【０００７】ラベルとして使用するのに適当な酵素は、
米国特許４，２７５，１４９、１９−２３欄に多数開示
されており、本明細書に参考として取り入れてある。例
えば、４−メチルウンベリフェリルリン酸に有用な酵素
／基質シグナル産生系は、酵素アルカリフォスファタ−
ゼである。ウマ−ハツカダイコンペルオキシダ−ゼを使
用するならば、ｏ−フェニレンジアミンを酵素基質とし
て加えて、視覚的あるいは計器を用いて検出測定可能な
着色産物を生成させる。

【０００８】別のシグナル産生系に、検出可能なシグナ
ルを得るためにラベルを酵素処理する必要のない、ラベ
ルとして蛍光化合物を使用するものがある。例えばフル
オレセイン、クマリン、フィコビリ蛋白質、ロ−ダミ
ン、それらの誘導体やアナログなどの蛍光分子は、この
系のラベルとして使用するのに適当である。その他の種
類のラベルに視覚的に検出可能な着色粒子があり、シグ
ナル産生試薬を追加使用せずに、テストサンプル中のア
ナライトの存在や濃度を直接着色測定できる。このよう
な粒子として使用する材料には、米国特許第４，３１
３，７３４号明細書と第４，３７３，９３２号明細書に
開示しているような、金などのコロイド金属や染料粒子
などがある。コロイド状セレン粒子などの非金属コロイ
ドの調製と使用は、１９８７年６月９日に出願した共願
で現在審査中の米国特許出願第０７２，０８４号に開示
してあり、本明細書に参考として取り入れてある。ラベ
ルとして有機ポリマ−ラテックスを使用することは、１
９８８年９月２３日に出願した共願で現在審査中の米国
特許出願第２４８，８５８号に開示してあり、本明細書
に参考として取り入れてある。ラベル自身が、あるいは
ラベルがひとつあるいはそれ以上の追加のシグナル産生
物質と結合することにより検出可能なシグナルを発する
限り、特定のラベルを選択することは重要ではない。

【０００９】用語「シグナル産生構成成分」は、他のア
ッセイ試薬やアナライトと反応し、アナライトの存在を
示す視覚的あるいは計器で検出できる反応産物やシグナ
ルを産生できる物質である。本明細で使用する「シグナ
ル産生系」は、希望の反応産物やシグナルを産生するた
めに必要な一群のアッセイ試薬である。例えば、ひとつ
あるいはそれ以上のシグナル産生構成成分を使用してラ
ベルと反応させ、検出可能なシグナルを発生させること
ができる。すなわち、ラベルが酵素ならば、酵素をひと
つあるいはそれ以上の基質や別の酵素と反応させて検出
可能な産物を産生させることにより、検出可能なシグナ
ルを増幅できる。

【００１０】用語「捕獲結合メンバ−」は、直接的ある
いは間接的にアナライトあるいはインディケ−タ−試薬
に結合することができる特異的結合メンバ−であり、捕
獲結合メンバ−をテストサンプルや他のアッセイ試薬か
ら分離できるように、固相に結合している、あるいは固
相に結合させることができる、あるいは沈殿させること
ができる。

【００１１】用語「捕獲剤」は、直接的あるいは間接的
に固相物質に付着した捕獲結合メンバ−であり、捕獲結
合メンバ−に結合したアナライトやインディケ−タ−試
薬を、結合していないアナライトやアッセイ試薬から分
離できるようにする。通常、捕獲結合メンバ−と固相物
質との結合は、実質的に不可逆的であり、共有結合機構
を含めることができる。捕獲結合メンバ−が間接的に固
相に付着している捕獲剤は、簡便な本発明の結合試薬を
固相材料と捕獲剤に反応させることにより製造すること
ができ；このような反応の産物例が「コンジュゲ−ト」
である。凝集アッセイにおいて、捕獲剤の捕獲結合メン
バ−は、ウシ血清アルブミンのような可溶性担体物質に
結合できる。

【００１２】アッセイに使用する捕獲剤の製造におい
て、捕獲結合メンバ−（例えばアナライト特異的抗体）
をひとたび固相に固定化したら、固相の残りの表面領域
を、一般にウシ血清アルブミンのような可溶性蛋白質溶
液でブロックし、担体に蛋白質が非特異的に結合するの
を防ぐ。その後、固体の担体を適当な溶液で洗浄し、余
分なブロッキング溶液や結合していない捕獲結合メンバ
−を除去する。

【００１３】アッセイ構成成分間にひとたび複合体が生
成したら、固相を分離手段として使用できる。例えば、
反応混合物を固相物質に接触させることができ、固相物
質は新しく生成した反応複合体を保持する。この分離の
段階に別の方法を使用することもできる。それ自身が捕
獲結合メンバ−に結合する固相を使用する方法；捕獲結
合メンバ−に特異的な結合メンバ−を固相に結合させる
方法；１９８８年１月２９日に出願した共願で現在審査
中の米国特許出願１５０，２７８号に開示した荷電した
物質などの反応試薬を固相に結合させ、捕獲結合メンバ
−に結合させた反対の荷電をもつ物質を誘引結合する方
法で、本明細書に参考として取り入れた。捕獲結合メン
バ−に特異的な結合メンバ−と反応試薬（例えば荷電し
た物質）はどちらも、固相物質と結合あるいは化学的に
反応した結合試薬と、本発明の方法により結合あるいは
化学的に反応させることができ；これらもコンジュゲ−
トの例である。

【００１４】アッセイ装置はさまざまな外形をもち、そ
のうちいくつかは選択した固相物質に依存する。用語
「固相物質」は、特異的結合メンバ−を固定するために
使用する、当業者達によく知られた適当なクロマトグラ
フィ−物質、吸収性物質、浸透性物質、キャピラリ−物
質、あるいは他の常套的固体物質である。固相物質は、
ひとつあるいはそれ以上のアッセイ試薬を含むひとつあ
るいはそれ以上の層をもつフロ−スル−アッセイ装置で
は、ファイバ−ガラス、セルロ−ス、ナイロンパッドで
あり；ディップアッセイやリ−ドアッセイでは、ディッ
プスティックであり；クロマトグラフィ−（例えば紙あ
るいはガラスファイバ−）技術あるいは薄層クマトグラ
フィ−（例えばニトロセルロ−ス）技術では、ひとつあ
るいはすべての試薬が１枚の固層物質のストリップの別
々の領域に含まれている試験ストリップであり；あるい
は当業者達によく知られた吸収剤を含む。さらに固相物
質は制限されることなく、ポリアクリルアミドビ−ズ、
ポリスチレンビ−ズあるいはポリスチレンチュ−ブ、磁
気ビ−ズ、ひとつあるいはそれ以上の反応ウェルのある
マイクロタイタ−プレ−ト、微粒子、ガラス製あるいは
プラスチック製試験管も含めることができる。

【００１５】天然物質、合成物質、合成的に修飾された
天然由来物質を固相物質として使用することができ、
紙、セルロ−ス、酢酸セルロ−スやニトロセルロ−スや
酢酸／硝酸セルロ−スなどのセルロ−ス誘導体を含むセ
ルロ−ス材料などの多糖；シリカ；ファイバ−ガラス；
不活性化アルミナ、珪藻土、あるいは塩化ビニルや塩化
ビニル／プロピレン共重合体や塩化ビニル／酢酸ビニル
共重合体などのポリマ−の浸透性ポリマ−マトリックス
中に均一に分散した他の無機純物質などの無機物質；天
然起源（例えば綿）や合成起源（例えばナイロン）の繊
維；シリカゲル、アガロ−ス、デキストラン、ゼラチン
などの浸透性ゲル；ポリアクリルアミドのようなポリマ
−フィルム；磁気粒子；マイクロタイタ−プレ−ト、ポ
リスチレンチュ−ブ；蛋白質結合膜；セファデックス
（ファルマシアファインケミカルズ社、Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ、ＮＪ）；トリスアクリル（Ｐｏｉｎｔｅｔ−Ｇ
ｉｒａｒｄ、フランス）；シリコン粒子；浸透性繊維状
マトリックス等を含む。固相物質は適度な固有の強さを
もたなければならず、あるいは担体によって適度な強度
を与えられてもよい。そして固相物質は、検出可能なシ
グナルの産生を妨害してはならない。

【００１６】捕獲剤の特異的結合メンバ−が微粒子に結
合したとき、それらの粒子はカラム中に保持されるか、
可溶性試薬とテストサンプルの混合物に懸濁されるか、
あるいは保持されて別の固相基礎物質により固定化され
る。「保持され固定化される」とは、固相基礎物質に結
合している粒子が、実質的にその物質内でその位置を動
くことができない状態を意味している。粒子の大きさは
重要ではないが、固相基礎物質を用いるときは粒子の平
均直径が固相基礎物質の平均ポアサイズより小さいこと
が望ましく、凝集アッセイに使用するときは適当な液体
に懸濁できるような大きさであることが必要である。

【００１７】用語「補助的特異的結合メンバ−」は、捕
獲結合メンバ−とインディケ−タ−試薬に加えて使用
し、検出可能な結合複合体の一部となる特異的結合メン
バ−である。アッセイには、ひとつあるいはそれ以上の
補助的特異的結合メンバ−を使用することができる。例
えば、捕獲結合メンバ−が補助的特異的結合メンバ−と
結合することができ、同時に固相にも結合することがで
きるようなアッセイに、補助的特異的結合メンバ−を使
用することができる。

【００１８】本発明において、記載されたラベル、補助
的特異的結合メンバ−、固相物質を選択することは、一
般に重要ではないことが、当業者達に理解される。選択
したアッセイ系から得られる結果を最適化するように、
材料が選択される。ジカルボキシル酸ジスクシニミジル
エステルを用いてペプシンを固定化したアミノ基を含む
親水性ゲルをインキュベ−トすることにより、静脈内投
与に適した免疫原を製造できることが、１９８７年５月
１３日に公表された欧州特許出願公開第０２２１５
０５号に開示されている。ここで開示されたジスクシニ
ミジルエステルは、鎖の両端に以下の構造をもつスクシ
ニミジル基をもっており、

【００１９】

【化８】

【００２０】ここでＲは、直鎖状あるいは分岐状の炭素
原子１から２０までのアルキレンラジカルである。その
明細書中では、このような化合物をたったひとつだけ明
確に開示しており；それは上記のＲが炭素原子数４の直
鎖状アルキレン基であるアジピン酸ジスクシニミジルエ
ステルである。

【００２１】さまざまなバイファンクショナル結合試薬
が（例えばＰｉｅｒｃｅ社から）市販されており、典型
的なバイファンクショナル結合試薬はこの会社のカタロ
グに記載されている。ジスクシニミジルスベレ−トやエ
チレングリコビス（スクシニミジルスクシネ−ト）は、
そのカタログに記載されたそのような結合試薬の例であ
る。後者の化合物では、上記の式中のＲは、

【００２２】

【化９】

【００２３】である。

【００２４】コバラミンは、添付した図１に示した一般
構造式をもつ。コバラミンは時々ビタミンＢ₁₂とも呼ば
れるが、実際には、図１の構造式に示すＲ置換基が互い
に異なるいくつかの種類のコバラミンがある：シアノコ
バラミン（Ｒ＝シアノ基）、ヒドロキシコバラミン（Ｒ
＝水酸基）、アクアコバラミン（Ｒ＝Ｈ₂Ｏ）、ニトロ
コバラミン（Ｒ＝ＮＯ₂）、５’−デオキシアデノシル
コバラミン（Ｒ＝５’−デオキシアデノシル基）、メチ
ルコバラミン（Ｒ＝メチル基）。これらのコバラミン
は、一般にすべてビタミンＢ₁₂であると考えられる：シ
アノコバラミン（ビタミンＢ₁₂）、ヒドロキシコバラミ
ン（ビタミンＢ₁₂ａ）、アクアコバラミン（ビタミンＢ
₁₂ｂ）、ニトロコバラミン（ビタミンＢ₁₂ｃ）、５’−
デオキシアデノシルコバラミン（補酵素Ｂ₁₂）、メチル
コバラミン（メチルＢ₁₂）。すべてのコバラミンは、類
似の代謝活性をもつ。しかし、シアノコバラミンは、他
に比べて安定である。コバラミンは、多数の代謝機能に
含まれており、正常な成長や栄養、造血、上皮細胞の産
生、神経系におけるミエリンの維持に必須である。

【００２５】ビタミンＢ₁₂が欠乏すると、造血が不完全
になり、ミエリンの合成が不充分になり、消化管の上皮
細胞の維持が不充分になり、貧血をおこす。しかし、ミ
エリン合成が不充分になることを除き、これらの症状
は、多数の代謝性貧血に共通したものであり、原因に関
係しない。

【００２６】このような貧血の原因を正確に示すため
に、ビタミンＢ₁₂欠乏試験をすることが必要である。ビ
タミンＢ₁₂のアッセイには、さまざまなものがある：比
色分析、分光分析、蛍光分析、放射活性アイソト−プ。
最も一般的な方法は、ビタミンＢ₁₂分子のコリン核のコ
バルトを置換したコバルト５７放射活性アイソト−プを
使用するものである。Ｂ₁₂を含むサンプルに、放射標識
された分子とＢ₁₂内因子を加えると、サンプル中の放射
標識されたＢ₁₂とＢ₁₂が、Ｂ₁₂内因子の結合部位で競合
する。Ｂ₁₂内因子は固相に結合しているため、固相の放
射活性あるいはサンプル中の放射活性は、もとのサンプ
ル中のＢ₁₂の量に比例する。最近の放射活性アッセイ
は、操作性、保存性、放射活性物質の廃棄性等におい
て、明らかな欠点がある。さらに、検出には、時間がか
かる。

【００２７】酵素を使用したビタミンＢ₁₂の競合結合ア
ッセイが提唱されている（Ｂａｃｈａｓ著、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｃｓ、４巻、１号、４２ペ−ジ、１９８６年を
見よ）。しかし、アッセイの感度は１３５５ｐｇ／ｍｌ
であると報告されており、ヒト血清中のビタミンＢ₁₂の
正常範囲は１５０−９００ｐｇ／ｍｌである。そのよう
なアッセイは、ヒト血清中の正常範囲にあるビタミンＢ
₁₂を検出することすらできないことが報告からわかるた
め、ビタミンＢ₁₂欠乏試験に使用できないことは明らか
である。

【００２８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、図２に示す
構造をもつ１８原子ホモバイファンクショナルリンカ−
であるジスクシニミジル化合物の発見に基づくものであ
り、ここでＲは図３の構造を持つ。本発明はさらに、ア
ッセイに上記の化合物を使用することにより、内因子の
コンジュゲ−トが微粒子と結合し、ビタミンＢ₁₂の免疫
アッセイの感度が予想外に上昇するという発見に基づく
ものである

【００２９】

【発明が解決しようとする手段】従って、本発明は式

【００３０】

【化５】

【００３１】（式中、Ｚ’はＨ ₂ ＮＨＮであるか、又は

【００３２】

【化６】

【００３３】である）の化合物からなる結合試薬を提供
する。

【００３４】本発明は、現在本発明から最良の方法であ
ると考えられる以下の実施例により、さらに充分に理解
されると思われる。しかし、これらの実施例は単に説明
のためのものであり、限定するものと解釈してはならな
いことを、理解しなければならない。

【００３５】本明細および添付の請求項に記載される用
語「パ−セント」および「割合」は、特に指摘がない限
り、重量に基づくパ−セントおよび割合である；ｇはグ
ラムを意味し；ｍｇはミリグラムを意味し；ｎｇはナノ
グラムを意味し；ｐｇはピコグラムを意味し；ｃｍはセ
ンチメ−トルを意味し、ｍｍはミリメ−トルを意味し；
Ｌはリットルを意味し；μＬはマイクロリットルを意味
し；ｍ／ｏはモルパ−セントを意味し、組成物中のその
成分のモル数を組成物中の総モル数で除した数の１００
倍に等しく；ｖ／ｖは容量パ−セントを意味し；ｗ／ｖ
は容量あたりの重量を意味し、ｇ／Ｌに換算され；Ｍは
モラ−を意味し、１リットルの溶液中の溶質のグラムモ
ル数と等しく；μＭはマイクロモラ−を意味し、１リッ
トルの溶液中のマイクログラムモル数と等しく；ｍＭは
ミリモラ−を意味し、１リットルの溶液中の溶質のミリ
グラムモル数と等しく；Ｎは規定度を意味し、１リット
ルの溶液中の溶質のグラム当量数と等しく；μＮは、マ
イクロ規定度を意味し、１リットルの溶液中の溶質のマ
イクログラム当量数と等しい。特に指摘のない限り、す
べての温度は℃である。

【００３６】実施例１は、図２に示す構造をもつ１８原
子ホモバイファンクショナルリンカ−の製造を記載して
いる。実施例２は、１８原子ホモバイファンクショナル
リンカ−を使用してアルカリフォスファタ−ゼを「Ｂ₁₂
アミン」に結合させることを記載しており、この化合物
は添付の図４に示す構造をもち、ただしＣ環の１３番炭
素に結合した置換基が以下の構造をもつ。

【００３７】

【化１３】

【００３８】実施例１および実施例２の導入として、Ｂ
₁₂アミンの製造を以下に記載する

【００３９】〔Ｂ₁₂アミンの合成〕２．２ｇのシアノコ
バラミンを酸加水分解し、生成したモノカルボキシル酸
を単離し、酸のひとつを分離し、分離した酸を１，６−
ジアミノヘキサンに結合させることにより、上記のＢ₁₂
アミンを製造した。シアノコバラミンを３００ｍＬの
０．８Ｍリン酸に加え、窒素雰囲気下暗中で６時間７０
℃に加熱した。反応混合物を、カラムに詰めた洗浄した
イオン交換樹脂にアプライした；結合しない誘導体を溶
出した；そして結合したＢ₁₂酸をメタノ−ルで溶出し、
ロ−タリ−真空乾燥により濃縮した。使用したイオン交
換樹脂は、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥＸＡＤ−２という商標
で市販されているものである。その後、ＮａＯＨ、ＨＣ
ｌ、ＮａＯＡｃで洗浄して脱イオン水でｐＨ５．０に平
衡化したＤＥ−５２セルロ−スカラムを用いて、それぞ
れのＢ₁₂酸を分離した。サンプルを４ｘ７５ｃｍのカラ
ムに加え、ゆっくりと溶出した。２日後、無反応性のコ
リノイドを含む単一の赤色バンドを、蒸留水で除去し
た。Ｂ₁₂モノ酸を、０．０５パ−セント酢酸で溶出し
た。３６時間で、３つのピ−クが溶出された。それぞれ
のバンドを回収し、ロ−タリ−真空乾燥により濃縮し
た。赤色物質を含む分画を集め、橙黄色の分画を廃棄し
た。赤色分画の反応性を試験するために、放射アッセイ
を行った。赤色分画の性質を調べるため、マス分光、Ｃ
１３ＮＭＲ、ＨＰＬＣを使用した；赤色分画は、添付の
図４に示す構造（「モノカルボキシル化Ｂ₁₂」）をもつ
ことが明らかになった；赤色分画は、Ｃ環の１３番の位
置がカルボキシル化されていた。

【００４０】その後、Ｂ₁₂アミンを、６３ｍｇのモノカ
ルボキシル化Ｂ₁₂、０．２５５４ｇの１，６−ヘキシル
ジアミン、８８．８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド（「ＥＤＡ
Ｃ」）から製造した。モノカルボキシル化Ｂ₁₂と１，６
−ヘキシルジアミンを１３ｍＬの蒸留水に溶解し；溶液
のｐＨを１Ｎ塩酸で６．０に合わせ；ＥＤＡＣを加え；
反応混合物を窒素雰囲気下で約１６時間攪拌した（Ｔｅ
ｔｓｕｏＴｏｒａｙａ著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２５５巻、３５２０−３５２５ペ−ジ、１９８０
年）。反応混合物をロ−タリ−真空乾燥により濃縮し、
ＨＰＬＣで精製した（ＴｅｔｓｕｏＴｏｒａｙａ著、
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８巻、４１７−４２６ペ−ジ、１
９７９年）。２０ｖ／ｖのメタノ−ルと８０ｖ／ｖの１
パ−セント酢酸水溶液から成る溶媒系を使用し、初期流
速４ｍｌ／分で、Ｂ₁₂アミンをＣ−１８（Ｍａｇｎｕｍ
９）カラムで精製した；８０分後、流速を６ｍｌ／分に
上げた。産物を、Ｂ₁₂アミンと同定した。

【００４１】

【実施例】〔実施例１〕１８原子ホモバイファンクショナルリンカ−の合成（Ａ）エステル中間体の合成ジスクシニミジルエステル中間体を、２００ｍＬのジメ
チルホルムアミドに溶解した８．１６ｇのＮ−ヒドロキ
シスクシニミド、７．１７ｇのトリエチルアミン、５．
０ｇのスクシニルクロリドから製造した。トリエチルア
ミンを、窒素雰囲気下で、ジメチルホルムアミド溶液に
加えた。スクシニルクロリドをゆっくりと加えて攪拌を
開始し、加え終わってから８時間後まで攪拌し続けた。
生成した沈殿を濾過して反応混合液から分離し、高真空
下で乾燥し、得られたクル−ドな産物を５０ｍｌのクロ
ロホルムで粉砕し、アルゴンガス下で高真空乾燥し、Ｚ
が図３に示す構造である添付の図７に示す構造をもつ、
ジスクシニミジルエステル中間体と同定される８．５２
ｇの純粋な白色粉末を得た。

【００４２】（Ｂ）リンカ−の合成その後、１８原子ホモバイファンクショナルリンカ−
を、１５０ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した
５．０ｇのジスクシニミジルエステル中間体、４．２０
ｇの６−アミノカプロン酸、６．９３ｇのジシクロヘキ
シルカルボジイミドから合成した。６−アミノカプロン
酸をジメチルホルムアミド溶液に加え、得られた反応混
合液を、窒素雰囲気下約２２℃の室温で３時間攪拌し
た。その後、ジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、
反応混合液を、窒素雰囲気下室温で約１６時間攪拌し
た。その後、生成したジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾
過して反応混合物から分離し、減圧下で濾過物からジメ
チルホルムアミドを蒸発させた。エ−テルで粉砕した
後、高真空下で乾燥させ、７．９４ｇの１８原子ホモバ
イファンクショナルリンカ−を得た。

【００４３】〔実施例２〕Ｂ₁₂の製造：アルカリフォスファタ−ゼコンジュゲ−トコンジュゲ−トは、（１）０．８２ｍＭＢ₁₂アミンの５
０ｖ／ｖジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシド
溶液０．１７３ｍＬ、（２）１．８８ｍＭ１８原子ホモ
バイファンクショナルリンカ−の５０ｖ／ｖジメチルホ
ルムアミドとジメチルスルホキシド溶液０．１４２ｍ
Ｌ、（３）塩化亜鉛０．１ｍＭを含む５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析したアルカリ
フォスファタ−ゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍ；１０ｍｇ／ｍＬ）１．０ｍＬ、（４）５０ｖ／
ｖジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシド０．０
７４９ｍＬ、から調製した。

【００４４】Ｂ₁₂アミン溶液と、１８原子ホモバイファ
ンクショナルリンカ−溶液と、５０ｖ／ｖジメチルホル
ムアミドとジメチルスルホキシドとを、ガラスバイアル
中で混合し、約２２℃の室温で３０分間反応させた。そ
の後、反応混合物を透析したアルカリフォスファタ−ゼ
に加え、穏やかに攪拌し、４℃で約２０時間放置した。
１リットルあたり１．０ｍｇモルの塩化マグネシウムと
１リットルあたり０．１０ｍｇモルの塩化亜鉛を含む５
０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
（「ＴＲＩＳ」；ｐＨ７．４）の脱イオン水溶液を使用
し、反応混合物をセファデックスＧ５０−１００（１．
２ｘ４４ｃｍ）で分離した。適当な分画を集め、１リッ
トルあたり１．０ｍｇモルの塩化マグネシウムと１リッ
トルあたり０．１０ｍｇモルの塩化亜鉛を含む１０００
ｍｌのＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）の脱イオン水溶液に対し
て透析した。産物は、コンジュゲ−ト調製中に図２に示
すＺ基が置換し、添付の図８に示す構造の原子団を介し
てＢ₁₂分子がアルカリフォスファタ−ゼ分子と結合した
Ｂ₁₂／アルカリフォスファタ−ゼコンジュゲ−トであ
る。その後、アルカリフォスファタ−ゼコンジュゲ−ト
を希望の濃度に希釈し、「酵素−Ｂ₁₂コンジュゲ−ト反
応溶液」を調製した。

【００４５】以下の実施例３は、精製した内因子を処理
した微粒子に結合させるため、実施例１の方法で製造し
たリンカ−を使用することを記載する。精製した内因子
の調製、および内因子に結合した実施例１の１８原子ホ
モバイファンクショナルリンカ−が結合する処理した微
粒子の調製は、実施例３の導入として以下に記載する。

【００４６】〔精製した内因子の精製〕約４０ｇのブタ
十二指腸を洗浄し、小さな断片に切断した。小片を混合
し、過塩素酸でｐＨ１．０に酸性化し、１時間混合し
た。大きな断片を遠心して除去し、上清を５Ｎ水酸化カ
リウム脱イオン水溶液で中和した。４℃で約１６時間
後、沈殿が生成した。上清の上層９０パ−セントを吸引
除去し、セライトを通して濾過し、リピドを除去した。
透明な濾過物中の内因子を、ｅおよびｄＢ₁₂カルボキシ
ル誘導体の混合物を臭化シアンセファロ−ス４ｂに結合
させたアフィニティ−カラムを用い、親和性クロマトグ
ラフィ−精製した。

【００４７】非特異的に結合した蛋白質は、４Ｍ塩化ナ
トリウム脱イオン水溶液で、続いて５０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液の脱イオン水溶液でカラムを洗浄することに
より除去した。内因子は、３．８Ｍグアニジン塩酸で溶
出した。カラムから溶出した最初の内因子画分は、本発
明のアッセイに使用するために選択される内因子を含
む；後の画分はアッセイの性能が低い。コバラミンを含
むがコバラミンとは限らないさまざまなコリノイド環含
有化合物（すなわちコビナミド類）と結合するＲ蛋白
が、望ましい画分の内因子中に存在するかを試験した。
（Ｂ₁₂コバルト５７を使用した放射アッセイにより）試
験した内因子のコビナミド類との交差反応性が少なくと
も０．００４パ−セント未満を示したら、脱イオン水を
数回交換しながら内因子を完全に透析した。この方法で
アフィニティ−精製した最初の分画（「精製した内因
子」）は、少なくとも８５％がコバラミンと結合する蛋
白を含むことが示された。機能純度が約８５パ−セント
未満であると、アッセイの感度が悪くなることが示され
た。

【００４８】〔微粒子の処理〕ＢＩＯＲＡＤＢＩＯＲ
ＥＸＭＳＸ５０１（Ｄ）という商品名で市販されてい
る樹脂０．５ｇを脱イオン水で数回洗浄した。その後、
アミノ微粒子（ＳＥＲＡＤＹＮＥ、平均直径０．２６μ
ｍ、平均面積アミノ基あたり３９０平方オングストロ−
ム）１ｍＬと脱イオン水１ｍＬを樹脂と混合し、混合物
を室温で１時間回転した。樹脂を沈殿させ、微粒子をデ
カントした。樹脂にさらに１ｍＬの脱イオン水を加えて
攪拌した後、もう一度微粒子をデカントした。すすぎ、
混合、デカントを２度繰り返し、デカントした微粒子に
脱イオン水を加えて微粒子固体濃度を７．５パ−セント
に合わせた（「処理した微粒子」）。

【００４９】〔実施例３〕微粒子の機能化微粒子／内因子コンジュゲ−トを、３００μＬの処理し
た微粒子と、３８μｇ／ｍＬの内因子と実施例１（Ｂ）
で製造した１８原子ホモバイファンクショナルリンカ−
を１．０ｍｇ／ｍＬ含有するジメチルホルムアミド３３
μＬを含む６００μＬの精製した内因子溶液とから製造
した。微粒子と１８原子ホモバイファンクショナルリン
カ−のジメチルホルムアミド溶液を小さなプラスチック
製バイアルに入れ、バイアルを３０分間回転させた；そ
の後内因子を加え、約２２℃の室温でバイアルを約１６
時間回転させ、内因子／微粒子コンジュゲ−トを製造し
た。使用前に、コンジュゲ−トをＴＷＥＥＮ２０という
商品名で市販されている界面活性剤の０．０５パ−セン
ト脱イオン水溶液で２回、０．０５ＭＴＲＩＳ（ｐＨ
７．４）の脱イオン水溶液で２回洗浄した。その後、内
因子／微粒子コンジュゲ−ト１容量に対して、ウシ血清
アルブミン１パ−セントとアジ化ナトリウム０．１パ−
セントとＴＷＥＥＮ２０という商品名で市販されている
界面活性剤０．０１パ−セントとショ糖０．４ｇモル／
リットルを含有する０．８ｍＴＲＩＳ溶液（ｐＨ７．
４）の脱イオン水溶液である粒子希釈液２５０容量で希
釈し、「内因子−微粒子コンジュゲ−ト、１８原子リン
カ−」を製造した。

【００５０】実施例４および実施例５は、酵素に使用し
たＢ₁₂アッセイを全自動の装置（ＡＢＢＯＴＴＩＭｘ
アナライザ−）で行ったときの、標準溶液中のシアノコ
バラミン濃度に相関するシグナルを示す標準曲線を誘導
する方法、および未知サンプルのコバラミンをアッセイ
するために標準曲線を使用する方法を記載する。実施例
４および実施例５を行うために、酵素−Ｂ₁₂コンジュゲ
−ト反応溶液、内因子−微粒子反応コンジュゲ−ト、１
８原子リンカ−、反応基質インディケ−タ−を使用し
た。反応基質インディケ−タ−は、１ｍｇモル／Ｌの塩
化マグネシウムと４ｍｇモル／Ｌのテトラミソ−ルと
１．２ｍｇモル／Ｌの４−メチルウンベリフェロン−リ
ン酸（「ＭＵＰ」）と０．１パ−セントのアジ化ナトリ
ウムを含有する１００ｍＭ２−アミノ−２−メチル−１
−プロパノ−ル（ｐＨ１０．３）溶液である。

【００５１】〔酵素を使用したＢ₁₂アッセイ法〕標準サ
ンプルあるいは血清サンプルに、標準液あるいはサンプ
ルに水酸化ナトリウムを１リットルあたり０．３ｇ等量
含むまで、コビナミドとｘ−モノチオグリセロ−ルのよ
うなチオ−ル剤と水酸化ナトリウムを加え、３４℃で８
分間変性させた（このステップの目的は、血清結合蛋白
質からＢ₁₂を解離させることにある）。その後、変性溶
液を内因子−微粒子反応コンジュゲ−トで中和し、中和
した組成物を室温で１５分間インキュベ−トした。その
後、インキュベ−トした組成物を、分離物質（Ａｂｂｏ
ｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮｏｒｔｈＣｈｉ
ｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓが販売するＩＭｘディスポ
−ザブル反応セル）の表面にのせた；微粒子とコンジュ
ゲ−トした内因子に結合したＢ₁₂は分離物質の表面に保
持されたが、結合していないＢ₁₂は洗浄除去された。そ
の後、分離物質の表面を５０ｍＭＴＲＩＳ（ｐＨ７．
４）の脱イオン水溶液で洗浄し、結合していないＢ₁₂を
除去した。分離物質の表面に酵素−Ｂ₁₂コンジュゲ−ト
反応溶液５０μＬを加え、フリ−の内因子部位に結合さ
せた。分離物質の表面を再び５０ｍＭＴＲＩＳ（ｐＨ
７．４）の脱イオン水溶液で洗浄した後、反応基質イン
ディケ−タ−５０μＬを加え、３６２ｎｍの波長の放射
で分離物質の表面を励起した。ＭＵＰはアルカリフォス
ファタ−ゼにより加水分解され、４−メチルウンベリフ
ェロンを遊離し、３６２ｎｍの波長の放射で励起したと
きに４４８ｎｍの波長の蛍光を発する。ＩＭｘ装置によ
る読み取り値は、アルカリフォスファタ−ゼ基質インデ
ィケ−タ−を分離物質表面に加えたときの、波長４４８
ｎｍにおける単位時間あたりの発光初期強度である。患
者の血清サンプルの読み取り値を曲線と比較し、Ｂ₁₂含
量を測定した。

【００５２】〔実施例４〕ウシ血清アルブミン１パ−セ
ントとアジ化ナトリウム０．２パ−セントと塩化ナトリ
ウム１００ｍｇモル／Ｌと塩化マグネシウム１．０ｍｇ
モル／Ｌと塩化亜鉛０．１ｍｇモル／Ｌを含有するＵＳ
Ｐシアノコバラミンの５０ｍＭＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）
の脱イオン水溶液で希釈して調製した標準液中のシアノ
コバラミン濃度に相関したシグナルを測定するため、以
下の方法を使用した。標準液は、０、６２．５、１２
５、２５０、１０００、２０００ｐｇ／ｍＬのシアノコ
バラミンを含有する。標準サンプルのＩＭｘ装置による
読み取り値を、Ｂ₁₂含量に相関する曲線を書くためのデ
−タとした。

【００５３】〔実施例５〕以下の方法は、さまざまな患
者のサンプルからシグナルを測定するために使用した。
このアッセイは、３８ｐｇ／ｍＬのＢ₁₂を検出できるこ
とが見い出されている。患者の血清サンプル（ｎ＝１３
６）を上記の方法でおよびＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ（Ｏｒａｎｇｅｂｅｒｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ）から
ＳｉｍｕｌＴｒａｃという商品名で市販されている放射
アッセイ装置でアッセイした。ふたつの試験法のデ−タ
から相関曲線を計算した；曲線の傾きは１．０１であ
り、相関係数（Ｒ）は０．９９であった。

【００５４】以下の実施例６は、Ｎ−（カルボシクロヘ
キシルメチル）マレイミド、６−アミノカプロン酸、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ニミドからＮ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロア
ミドシクロヘキシルメチルマレイミドを合成する方法、
およびＮ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミド
シクロヘキシルメチルマレイミドから、Ｚ’が図１１に
示す構造をもちＣ₆Ｈ₁ ₀が１，４−シクロヘキシレンで
ある添付の図１３の構造式をもつ６８原子ホモバイファ
ンクショナルリンカ−を合成する方法について記載す
る。

【００５５】〔実施例６〕（Ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカプロアミドシク
ロヘキシルメチルマレイミドの調製Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカプロアミドシクロヘキ
シルメチルマレイミドは、Ｚが図３の構造をもち、Ｚ’
が図１１の構造をもち、ｎが１で、Ｃ₆Ｈ₁₀が１，４−
シクロヘキシルである添付の図１４の構造をもつ化合物
であり、１００ｍｇのＮ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドの乾燥ジメチルホルムアミド溶
液、３９．２３ｍｇの６−アミノカプロン酸、６７．８
ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド、３７．８ｍｇ
のＮ−ヒドロキシスクシニミドから製造した。Ｎ−（４
−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドは、Ｙ
ｏｓｈｉｔａｋｅらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１
０１巻、３９５−３９９ペ−ジ、１９７９年）により、
ｔｒａｎｓ−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカ
ルボキシル酸（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社）
から製造した。上記のＮ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミド溶液の入ったフラスコを窒素雰
囲気にして、６−アミノカプロン酸をフラスコに加え
た。その後、反応混合物を、窒素雰囲気下約２２℃の室
温で１６時間攪拌した後、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミドとＮ−ヒドロキシスクシニミドをフラスコに加え
た。さらに６時間室温で攪拌を続けた後、濾過して混合
物から沈殿したジシクロヘキシル尿素を除去し、減圧下
で濾過物からジメチルホルムアミドを蒸発させた。残存
した粘性の固体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフ
ィ−（クロロホルム中５ｖ／ｖメタノ−ル）により精製
し、示した構造式をもつ白色固体のＮ−ヒドロキシスク
シニミジルカプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミ
ド７１ｍｇを得た。

【００５６】（Ｂ）Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルジカ
プロアミドシクロヘキシルメチルマレイミドの調製Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルジカプロアミドシクロヘ
キシルメチルマレイミドは、Ｚが図３の構造で、Ｚ’が
図１１の構造で、ｎが２で、Ｃ₆Ｈ₁₀が１，４−シクロ
ヘキシルである添付の図１４の構造をもつ化合物であ
り、１００ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシニミジルカプロ
アミドシクロヘキシルメチルマレイミドの１ｍｌ乾燥ジ
メチルホルムアミド溶液、２９．３ｍｇの６−アミノカ
プロン酸、５０．７ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドから製造した。上記Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル
カプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミド溶液の入
ったフラスコを窒素雰囲気にして、６−アミノカプロン
酸をフラスコに加えた。その後、反応混合物を、窒素雰
囲気下約２２℃の室温で１６時間攪拌した後、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドをフラスコに加えた。さらに６
時間室温で攪拌を続けた後、濾過して混合物から沈殿し
たジシクロヘキシル尿素を除去し、減圧下で濾過物から
ジメチルホルムアミドを蒸発させた。残存した粘性の固
体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィ−（クロロ
ホルム中１０ｖ／ｖメタノ−ル）により精製し、示した
構造式をもつＮ−ヒドロキシスクシニミジルジカプロア
ミドシクロヘキシルメチルマレイミド６０ｍｇを得た。

【００５７】（Ｃ）Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルトリ
カプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミドの調製Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミドシクロ
ヘキシルメチルマレイミドは、Ｚが図３の構造で、Ｚ’
が図１１の構造で、ｎが３で、Ｃ₆Ｈ₁₀が１，４−シク
ロヘキシルである添付の図１４の構造をもつ化合物であ
り、１００ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシニミジルジカプ
ロアミドシクロヘキシルメチルマレイミドの２ｍｌ乾燥
ジメチルホルムアミド溶液、２３．４ｍｇの６−アミノ
カプロン酸、４０．５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジ
イミドから製造した。上記Ｎ−ヒドロキシスクシニミジ
ルジカプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミド溶液
の入ったフラスコを窒素雰囲気にして、６−アミノカプ
ロン酸をフラスコに加えた。その後、反応混合物を、窒
素雰囲気下約２２℃の室温で１６時間攪拌した後、ジシ
クロヘキシルカルボジイミドをフラスコに加えた。さら
に６時間室温で攪拌を続けた後、濾過して混合物から沈
殿したジシクロヘキシル尿素を除去し、減圧下で濾過物
からジメチルホルムアミドを蒸発させた。残存した粘性
の固体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィ−（ク
ロロホルム中１０ｖ／ｖメタノ−ル）により精製し、示
した構造式をもつ白色固体のＮ−ヒドロキシスクシニミ
ジルトリカプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミド
６０ｍｇを得た。

【００５８】（Ｄ）６８原子ホモバイファンクショナル
リンカ−の調製６８原子ホモバイファンクショナルリンカ−は、Ｚ’が
図１１の構造で、Ｃ₆Ｈ₁₀が１，４−シクロヘキシルで
ある図１３の構造をもつ化合物であり、０．２３４２ｇ
の１，６−ヘキサンジアミンの３ｍＬ乾燥ジメチルホル
ムアミド溶液と２．６９５ｇのＮ−ヒドロキシスクシニ
ミジルトリカプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミ
ドの１０ｍＬ乾燥ジメチルホルムアミド溶液から、約２
２℃の室温で製造することができる。Ｎ−ヒドロキシス
クシニミジルトリカプロアミドシクロヘキシルメチルマ
レイミド溶液をヘキサンジアミン溶液に激しく攪拌しな
がらすばやく注ぐ。約２時間攪拌を続けた後、ジメチル
ホルムアミドを蒸発させ、残存物を５０ｖ／ｖアセトン
メタノ−ル溶媒１５ｍＬずつで３回洗浄し、減圧下で乾
燥して希望の産物を得る。

【００５９】実施例７は、実施例６（Ｂ）記載の２３原
子ヘテロバイファンクショナルリンカ−を、精製した内
因子と処理した微粒子とを結合させるために使用する方
法を記載する。内因子に結合した実施例６（Ｂ）記載の
２３原子ヘテロバイファンクショナルリンカ−が結合す
る精製した内因子および処理した微粒子の調製法は、実
施例３の導入として上に記載してある。

【００６０】〔実施例７〕微粒子の機能化処理した微粒子を、内因子３０μｇ／ｍＬと実施例３
（Ｂ）記載の２３原子ヘテロバイファンクショナルリン
カ−８０μｇの１７．５ｍＭトリエタノ−ルアミン緩衝
液（ｐＨ８．０）を含有する精製した内因子溶液７００
μＬと結合させて微粒子０．６パ−セントを含む溶液１
ｍＬを得、微粒子／内因子コンジュゲ−トを製造した。
得られた溶液を暗下約２２℃の室温で２時間攪拌した。
インキュベ−トした後、粒子を沈殿させ、弱い界面活性
剤／５０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液で数回洗浄し、粒子の大き
さの分布の均一性を確実にするためにホモゲナイズし、
希望の濃度に希釈した（「内因子−微粒子コンジュゲ−
ト、２３原子リンカ−」）。

【００６１】〔実施例８〕内因子−微粒子コンジュゲ−
トの１８原子リンカ−を２３原子リンカ−に置き換え、
実施例４に方法を繰り返した。添付の図６は、この方法
で測定した、Ｂ₁₂含量に相関した装置の読み取り値を示
す曲線である。精製した内因子を、２３原子リンカ−由
来の化学部分を介し、微粒子にコンジュゲ−トした；そ
の部分は添付の図１５の構造をもつ。

【００６２】〔実施例９〕内因子−微粒子コンジュゲ−
トを１８原子リンカ−から置き換え、実施例５に方法を
繰り返した。このアッセイは、ゼロ標準を複数測定した
標準偏差を２回使用した計算に基づき、６０ｐｇ／ｍＬ
未満のＢ₁₂を検出できることが明らかにされた。患者の
血清サンプル（ｎ＝７６）を上記の方法で、およびＢＩ
ＯＲＡＤＱｕａｎｔａｐｈａｓｅラジオアッセイという
商品名で市販されている放射アッセイ装置でアッセイし
た。添付の相関曲線は、ふたつの試験法のデ−タから計
算した；曲線の傾きは１．１０であり、相関係数（Ｒ）
は０．９９であった。本発明の他のさまざまなリンカ−
を、上記の方法およびその変法により製造した。それら
の調製法の代表例を、以下の実施例に記載する。

【００６３】〔実施例１０〕２２原子ビス（ヒドラジ
ド）ホモバイファンクショナルリンカ−を、５ｍｌの乾
燥メタノ−ルに溶解させた実施例１（Ｂ）記載の１８原
子バイファンクショナルリンカ−０．５０ｇと、２ｍｌ
のメタノ−ルに溶解させたヒドラジン水和物０．１４ｇ
とから製造した。ヒドラジン水和物の溶液をフラスコに
注ぎ込み、０℃に冷却した；磁気攪拌を開始し、リンカ
−溶液をゆっくり加える間攪拌を続け、加え終わってか
らも３０分間攪拌を続けた。リンカ−溶液を加える間フ
ラスコ内容物を０℃に保ち、その後３０分間で約２２℃
の室温にまで温めた。その後、反応混合物を焼結ガラス
製漏斗で濾過し、クロロホルム中０．５から２０ｖ／ｖ
メタノ−ルグラジエントを使用し、シリカゲルカラムで
クロマトグラフィ−を行った。ビス（ヒドラジド）ホモ
バイファンクショナルリンカ−を含む分画を集め、乾燥
し、ＺがＨ₂ＮＨＮである添付の図２の構造をもつ希望
の化合物０．２１ｇを得た。化合物をＮＭＲで同定し
た。

【００６４】〔実施例１１〕ビス（ヨ−ドアセチル）２
６原子ホモバイファンクショナルリンカ−を、ビス（ヒ
ドラジド）ホモバイファンクショナルリンカ−（実施例
１０）０．１５ｇを含有する３ｍＬメタノ−ル溶液と、
ヨ−ド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル０．１
５ｇを含有する３ｍＬメタノ−ル溶液とから、約２２℃
の室温で製造した。ビス（ヒドラジド）ホモバイファン
クショナルリンカ−を含むフラスコを暗中に置き、溶液
の攪拌を開始した。ヨ−ド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニ
ミドエステル溶液をフラスコにゆっくりと加えた；加え
ている間攪拌を続け、加え終わってからも１時間攪拌を
続けた。その後、クロロホルム中０．５から１０ｖ／ｖ
メタノ−ルを使用し、溶液を短いシリカゲルカラムクロ
マトグラフィ−にかけた。その後、希望の産物を含む分
画から溶媒を蒸発させ、Ｚが図９の構造をもつ添付の図
２の構造をもつビス（ヨ−ドアセチル）２６原子ホモバ
イファンクショナルリンカ−０．０６ｇを得た。

【００６５】〔実施例１２〕ビス（マレイミド）２２原
子ホモバイファンクショナルリンカ−を、乾燥ジメチル
ホルムアミド５ｍＬに溶解したスクシニミジル４−（Ｎ
−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シレ−ト０．６６８ｇと新しいトリエチルアミン０．２
００ｇとエチレンジアミン０．０６０ｇとから、室温で
製造した。スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミジルメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ−ト溶液を、１
００ｍＬ丸底フラスコに入れた。攪拌を開始し、トリエ
チルアミンとエチレンジアミンを加えている間攪拌を続
け、加え終わってからも１時間攪拌を続けた（トリエチ
ルアミンとエチレンジアミンを加え終わって２分後に大
量の沈殿が生成した）。その後、濾過して沈殿を除去
し、水／メタノ−ルで洗浄し、乾燥した。産物は、Ｚ’
が図１１の構造をもちＣ₆Ｈ₁₀が１，４−シクロヘキシ
レンである添付の図１０の構造をもつビス（マレイミ
ド）２２原子ホモバイファンクショナルリンカ−である
ことが、ＮＭＲにより同定された。実施例１３は、２と
Ｚが図３の構造をもつ添付の図１２の構造をもつ本発明
のホモバイファンクショナルリンカ−の合成法を記載す
る。

【００６６】〔実施例１３〕図１２の構造をもつホモバ
イファンクショナルリンカ−は、乾燥ジメチルホルムア
ミド４１０ｍｌに溶解した１８原子ホモバイファンクシ
ョナルリンカ−〔実施例１（Ｂ）〕１３．６ｇと、６−
アミノカプロン酸６．６５ｇと、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド１０．４ｇとから合成することができる。６
−アミノカプロン酸をジメチルホルムアミド溶液に加
え、得られた反応混合物を窒素雰囲気下約２２℃の室温
で３時間攪拌する。その後、ジシクロヘキシルカルボジ
イミドを加え、反応混合物を窒素雰囲気下室温で約１６
時間攪拌する。その後、濾過して沈殿したジシクロヘキ
シル尿素を反応混合物から分離し、減圧下でジメチルホ
ルムアミドを濾過物から蒸発させた。エ−テルで粉砕し
た後、高真空下で乾燥し、示したホモバイファンクショ
ナルリンカ−を得る。本発明の範囲からはずれることな
く、以上の実施例に開示したような本発明の特定な詳細
にさまざまな変化や修飾ができることを、以上の実施例
から理解しなければならない。例えば、実施例１（Ｂ）
では１８原子ホモバイファンクショナルリンカ−をジス
クシニミジルエステル中間体と６−アミノカプロン酸と
から合成しているが、他の異なる原子数のリンカ−を製
造するため、６−アミノカプロン酸の代わりに当量の他
のさまざまなアミノ酸を使用することができる。そのよ
うに置換できるアミノ酸の例にはグリシン、３−アミノ
−ｎ−プロピオン酸、４−アミノ−ｎ−ブチル酸、５−
アミノ−ｎ−吉草酸、７−アミノ−ｎ−ヘプト酸、８−
アミノ−ｎ−カプリル酸、９−アミノ−ｎ−ノニル酸、
１０−アミノ−ｎ−カプリン酸を含む。同様に、ふたつ
の異なるアミノ酸をジスクシニミジルエステル中間体と
反応させ、ふたつの異なるアミノアルキル基をもつリン
カ−を製造することもできる。

【００６７】さらに、実施例６（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の部
分は、前段落に記載したすべてのアミノ酸を当量使用し
て他のＮ−ヒドロキシスクシニミジルトリアミドシクロ
ヘキシルメチルマレイミドを製造することができ、これ
は実施例６（Ｄ）の方法でホモバイファンクショナルリ
ンカ−に変換することかでき、実施例６（Ｂ）のＮ−ヒ
ドロキシスクシニミジルジアミドシクロヘキシルメチル
マレイミドも実施例６（Ｄ）の方法でホモバイファンク
ショナルリンカ−に変換することかできる。同様に、実
施例６（Ｄ）の１，６−ヘキサンジアミンの代わりに他
のジアミンを使用し、他のリンカ−を製造することもで
きる。そのように置換できるジアミンの例には、以下の
式に示す構造をもつものを含む、Ｈ₂Ｎ（−ＣＨ₂）_x−ＮＨ₂ ここでｘは２から１０までの整数である。

【００６８】したがって、簡便な本発明のひとつの側面
は、以下の構造式をもつ一群の化合物であることが理解
できる。

【００６９】

【化７】

【００７０】（式中、Ｚ’はＨ ₂ ＮＨＮであるか、又は

【００７１】

【化８】

【００７２】である。）

【００７３】

【００７４】

【００７５】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】他の変化や修飾は、当業者に明らかであ
り、添付の請求項に記載したように、本発明の精神と範
囲をはずれることなく、行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】コバラミンの一般構造式を示す。

【図２】本発明による他の好ましい一群の化合物の構造
式を示す。

【図３】図２の一群の化合物好ましい末端基の構造式を
示す。

【図４】本明細書にその調製法を記載し、「カルボキシ
ル化Ｂ₁₂」と命名された「赤色分画」の構造式を示す。

【図５】同一サンプルにおける、「Ｂｉｏ−ＲａｄＱ
ＵＡＮＴＩＰＨＡＳＥ」Ｂ₁₂測定値に対するＢ₁₂酵素ア
ッセイ測定値のプロットを示す。

【図６】本明細書に記載した方法で調製した標準溶液中
のシアノコバラミン濃度の関数としての装置の読みを示
す曲線を示す。

【図７】本明細書の実施例１に記載した方法で中間体と
して製造される一群の活性エステルのなかの１つの構造
式を示す。

【図８】本明細書の実施例２に記載される方法で製造さ
れるＢ₁₂／アルカリホスファタ−ゼコンジュゲ−トにお
いて、Ｂ₁₂分子をアルカリフォスファタ−ゼ分子に結合
させる基の構造式を示す。

【図９】本発明による化合物中の他の好ましい末端基の
構造式を示す。

【図１０】本発明による好ましい他の一群の化合物の構
造式を示す。

【図１１】本発明による化合物の好ましい末端基の他の
１つの構造式を示す。

【図１２】本発明によるの他の一群の好ましい化合物の
構造式を示す。

【図１３】本発明によるの好ましい一群の化合物の構造
式を示す。

【図１４】図１３の構造をもつ化合物が製造される中間
体の構造式を示す。

【図１５】図１４の構造をもつ化合物の中間体の構造を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クリストファーウエルチアメリカ合衆国イリノイ州 60801 ウルバナイーオレゴンストリート 910 (56)参考文献特開平１−201158（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式【化１】（式中、ｘは１〜１０の整数であり、ｙは２〜１０の整
数であり、ｎは０〜１０の整数であり、そしてＺ’はＨ
₂ ＮＨＮであるか、又は【化２】である）の化合物からなる結合試薬。
【請求項２】化合物が式【化３】（式中、Ｚ’は【化４】である）の構造をもつ請求項１記載の結合試薬。
【請求項３】微粒子を、請求項１記載の化合物からな
る結合試薬由来の部分を介して、コビナミドとの交叉反
応性が０．００４パーセント未満になるようにＲ蛋白を
分離して精製した内因子と結合させたことを特徴とする
コンジュゲート。
【請求項４】少なくとも９５パーセントの蛋白がコバ
ラミンと結合している請求項３記載の微粒子と内因子と
のコンジュゲート。
【請求項５】微粒子を、請求項１記載の化合物からな
る結合試薬由来の部分を介して、コビナミドとの交叉反
応性が０．００４パーセント未満になるようにＲ蛋白を
分離して精製した内因子と結合させたコンジュゲート
と、酵素と該精製内因子の特異的結合メンバーとを請求
項１記載の化合物からなる結合試薬由来の部分を介して
互いに結合させたコンジュゲートと、該酵素と反応して
シグナルを発生するか又はシグナルを発生する反応産物
を生成する基質インディケーターとからなることを特徴
とするコバラミンのアッセイ用キット。
【請求項６】酵素がアルカリホスファターゼであり、
インディケーターがＭＵＰ（４−メチルウンベリフェロ
ンホスフェート）である請求項５記載のキット。
【請求項７】特異的結合メンバーがＢ ₁₂ アミンである
請求項５記載のキット。
【請求項８】テストサンプルを変性し、該変性したテ
ストサンプルに、微粒子を請求項１記載の化合物からな
る結合試薬由来の部分を介してコビナミドとの交叉反応
性が０．００４パーセント未満になるようにＲ蛋白を分
離して精製した内因子と結合させたコンジュゲートを加
え、該コンジュゲートを含む変性したテストサンプルを
インキュベートし、内因子／微粒子コンジュゲートを保
持する分離物質の上に該インキュベートした組成物をの
せ、該分離物質を洗浄して未結合のビタミンＢ ₁₂ を除去
し、酵素と該精製内因子の特異的結合メンバーとのコン
ジュゲートを該分離物質に加えてフリーの内因子の部位
に結合させ、該分離物質を洗浄し、酵素と反応してシグ
ナルを発生するか又はシグナルを発生する反応産物を生
成する基質インディケーターを加え、該酵素と該インデ
ィケーターとが反応して発生するシグナルを測定する
か、又は該酵素と該インディケーターとの反応産物が発
生するシグナルを測定することからなることを特徴とす
るコバラミンのアッセイ法。