JP3449961B2 - マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 - Google Patents
マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法Info
- Publication number
- JP3449961B2 JP3449961B2 JP2000049760A JP2000049760A JP3449961B2 JP 3449961 B2 JP3449961 B2 JP 3449961B2 JP 2000049760 A JP2000049760 A JP 2000049760A JP 2000049760 A JP2000049760 A JP 2000049760A JP 3449961 B2 JP3449961 B2 JP 3449961B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- primer
- sequence represented
- oligonucleotide containing
- microsporidia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 23
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title description 32
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 241000243190 Microsporidia Species 0.000 claims description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 52
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 29
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 23
- 241001126829 Nosema Species 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000149498 Sphaeriusidae Species 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 34
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 27
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 241001467064 Vairimorpha sp. Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 4
- 241001126828 Nosema bombycis Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001492487 Pleistophora sp. Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000243224 Vairimorpha necatrix Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241001302652 Bassiana Species 0.000 description 1
- 241000751139 Beauveria bassiana Species 0.000 description 1
- 241000255783 Bombycidae Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010053982 Microsporidia infection Diseases 0.000 description 1
- 201000000090 Microsporidiosis Diseases 0.000 description 1
- 241001295810 Microsporidium Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001492488 Pleistophora Species 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- -1 RNaseA Chemical compound 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物に感染した病
原生物の検出方法に関し、より詳細には、動物に感染し
た微胞子虫、又は昆虫に感染した昆虫病原生物のＰＣＲ
による検出方法に関する。
原生物の検出方法に関し、より詳細には、動物に感染し
た微胞子虫、又は昆虫に感染した昆虫病原生物のＰＣＲ
による検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、動物に対する病原生物としては、
ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原生動物など、様々な
ものが知られている。上記病原生物の一種である微胞子
虫類（Microsporida）は、Microspora（微胞子虫門）に
属する原虫であり、原生生物から哺乳動物まで広範な動
物細胞に寄生することが知られている。また、寄生した
微胞子虫は、その宿主において様々な病害を惹き起こす
ことが知られている。例えば、微胞子虫の一種であるノ
セマ・ボンビシス（Nosema bombycis）は主として蚕に
寄生し、微粒子病を惹き起こす。従って、蚕等の有用動
物に微胞子虫が感染しているかどうかをできるだけ迅速
に検定する必要がある。
ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原生動物など、様々な
ものが知られている。上記病原生物の一種である微胞子
虫類（Microsporida）は、Microspora（微胞子虫門）に
属する原虫であり、原生生物から哺乳動物まで広範な動
物細胞に寄生することが知られている。また、寄生した
微胞子虫は、その宿主において様々な病害を惹き起こす
ことが知られている。例えば、微胞子虫の一種であるノ
セマ・ボンビシス（Nosema bombycis）は主として蚕に
寄生し、微粒子病を惹き起こす。従って、蚕等の有用動
物に微胞子虫が感染しているかどうかをできるだけ迅速
に検定する必要がある。
【０００３】従来、一般に、病原が判定できない感染症
の場合に病原生物を検出するためには、その症状から病
原生物を予想し、それぞれを検出するための検査を個別
に行っていた。従って、一個体につき複数の検査を行う
必要があったが、このような検査の方法としては、検出
対象である病原に対する抗体を用いる方法、病原菌の菌
体を培養する方法等が主に用いられるため、大量の個体
を検査するためには多くの時間を必要とした。
の場合に病原生物を検出するためには、その症状から病
原生物を予想し、それぞれを検出するための検査を個別
に行っていた。従って、一個体につき複数の検査を行う
必要があったが、このような検査の方法としては、検出
対象である病原に対する抗体を用いる方法、病原菌の菌
体を培養する方法等が主に用いられるため、大量の個体
を検査するためには多くの時間を必要とした。
【０００４】特に、蚕に感染する微胞子虫の検定は、各
微胞子虫の胞子に反応する特異的な抗体を用いる方法に
よって行われるため、熟練の技師が検定を行う必要があ
った。また、胞子が未形成の場合には検出することがで
きず、さらに感染量の少ない卵の検定は非常に困難であ
った。そこで、熟練者でなくても簡便に微胞子虫を検出
できる方法が開発されれば便利である。
微胞子虫の胞子に反応する特異的な抗体を用いる方法に
よって行われるため、熟練の技師が検定を行う必要があ
った。また、胞子が未形成の場合には検出することがで
きず、さらに感染量の少ない卵の検定は非常に困難であ
った。そこで、熟練者でなくても簡便に微胞子虫を検出
できる方法が開発されれば便利である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、操作
が簡単で、視覚的に検出でき、さらに一回の操作で行う
ことができる微胞子虫の検出方法を提供することにあ
る。
が簡単で、視覚的に検出でき、さらに一回の操作で行う
ことができる微胞子虫の検出方法を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意検討を行った結果、マルチプラ
イマーＰＣＲ法において検出対象となる複数の病原生物
それぞれに特異的な複数のプライマーペアを用いること
により、これらの病原生物を同時に検出することができ
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
題を解決するために鋭意検討を行った結果、マルチプラ
イマーＰＣＲ法において検出対象となる複数の病原生物
それぞれに特異的な複数のプライマーペアを用いること
により、これらの病原生物を同時に検出することができ
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、被検動物体内に存在
する核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の微胞子
虫それぞれのゲノムＤＮＡの部分領域を増幅し得る少な
くとも２種のプライマーペアを含む混合プライマーを用
いて増幅処理を行うことを含む、該被検動物体内の該複
数種の微胞子虫を同時に検出し得る方法を提供する。こ
の本発明の方法を、以下「第１の本発明の方法」とい
う。
する核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の微胞子
虫それぞれのゲノムＤＮＡの部分領域を増幅し得る少な
くとも２種のプライマーペアを含む混合プライマーを用
いて増幅処理を行うことを含む、該被検動物体内の該複
数種の微胞子虫を同時に検出し得る方法を提供する。こ
の本発明の方法を、以下「第１の本発明の方法」とい
う。
【０００８】上記方法において、検出しようとする前記
複数種の微胞子虫は、好ましくは、ノセマ・ボンビシ
ス、バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、
バイリモルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラs
p. PSDからなる群より選択される少なくとも２種の微胞
子虫であり、より好ましくは、ノセマ・ボンビシス、バ
イリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、バイリ
モルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PSD
である。
複数種の微胞子虫は、好ましくは、ノセマ・ボンビシ
ス、バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、
バイリモルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラs
p. PSDからなる群より選択される少なくとも２種の微胞
子虫であり、より好ましくは、ノセマ・ボンビシス、バ
イリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、バイリ
モルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PSD
である。
【０００９】前記混合プライマーは、好ましくは、
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、（ii）配
列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーペア、（iii）配列番号
５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドからなるプライマーペア、並びに（iv）配列番号７
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーペアからなる群より選択される少
なくとも２種のプライマーペアを含み、より好ましく
は、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドを含む。また、前記被検動物は昆虫である
ことが好ましい。
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、（ii）配
列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーペア、（iii）配列番号
５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドからなるプライマーペア、並びに（iv）配列番号７
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーペアからなる群より選択される少
なくとも２種のプライマーペアを含み、より好ましく
は、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドを含む。また、前記被検動物は昆虫である
ことが好ましい。
【００１０】さらに、本発明は、被検昆虫体内に存在す
る核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の昆虫病原
生物それぞれのゲノムＤＮＡの部分領域を増幅し得る少
なくとも２種のプライマーペアを含む混合プライマーを
用いて増幅処理を行うことを含む、該被検昆虫体内の該
複数種の昆虫病原生物を同時に検出し得る方法を提供す
る。この本発明の方法を、以下「第２の本発明の方法」
という。
る核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の昆虫病原
生物それぞれのゲノムＤＮＡの部分領域を増幅し得る少
なくとも２種のプライマーペアを含む混合プライマーを
用いて増幅処理を行うことを含む、該被検昆虫体内の該
複数種の昆虫病原生物を同時に検出し得る方法を提供す
る。この本発明の方法を、以下「第２の本発明の方法」
という。
【００１１】上記方法において、前記昆虫病原生物が微
胞子虫であることが好ましい。この場合において、検出
しようとする前記複数種の微胞子虫は、好ましくは、ノ
セマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バイリモ
ルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス及びプ
レイストフォラsp. PSDからなる群より選択される少な
くとも２種の微胞子虫であり、より好ましくは、ノセマ
・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バイリモルフ
ァsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス及びプレイ
ストフォラsp. PSDである。
胞子虫であることが好ましい。この場合において、検出
しようとする前記複数種の微胞子虫は、好ましくは、ノ
セマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バイリモ
ルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス及びプ
レイストフォラsp. PSDからなる群より選択される少な
くとも２種の微胞子虫であり、より好ましくは、ノセマ
・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バイリモルフ
ァsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス及びプレイ
ストフォラsp. PSDである。
【００１２】前記混合プライマーは、好ましくは、
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、（ii）配
列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーペア、（iii）配列番号
５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドからなるプライマーペア、並びに（iv）配列番号７
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーペアからなる群より選択される少
なくとも２種のプライマーペアを含み、より好ましく
は、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドを含む。
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、（ii）配
列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーペア、（iii）配列番号
５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドからなるプライマーペア、並びに（iv）配列番号７
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーペアからなる群より選択される少
なくとも２種のプライマーペアを含み、より好ましく
は、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドを含む。
【００１３】さらに、本発明は、ノセマ・ボンビシス、
バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、バイ
リモルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PS
DのゲノムＤＮＡの部分領域を増幅し得るプライマーペ
アからなる群より選択される少なくとも２種のプライマ
ーペアを含む、微胞子虫検出用プライマーセットを提供
する。
バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、バイ
リモルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PS
DのゲノムＤＮＡの部分領域を増幅し得るプライマーペ
アからなる群より選択される少なくとも２種のプライマ
ーペアを含む、微胞子虫検出用プライマーセットを提供
する。
【００１４】上記プライマーセットは、好ましくは、
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、（ii）配
列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーペア、（iii）配列番号
５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドからなるプライマーペア、並びに（iv）配列番号７
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーペアからなる群より選択される少
なくとも２種のプライマーペアを含み、より好ましく
は、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドを含む。
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、（ii）配
列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなるプライマーペア、（iii）配列番号
５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドからなるプライマーペア、並びに（iv）配列番号７
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーペアからなる群より選択される少
なくとも２種のプライマーペアを含み、より好ましく
は、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドを含む。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
〔第１の本発明の方法〕本発明は、被検動物体内に存在
する複数種の微胞子虫を同時に検出し得る方法に関し、
この検出は、該被検動物体内に存在する核酸を鋳型と
し、検出しようとする複数種の微胞子虫それぞれのゲノ
ムＤＮＡの部分領域を増幅し得るプライマーペアを含む
混合プライマーを用いて増幅処理を行うことにより実施
することができる。ここで、該混合プライマーは少なく
とも２種のプライマーペアを含む。
する複数種の微胞子虫を同時に検出し得る方法に関し、
この検出は、該被検動物体内に存在する核酸を鋳型と
し、検出しようとする複数種の微胞子虫それぞれのゲノ
ムＤＮＡの部分領域を増幅し得るプライマーペアを含む
混合プライマーを用いて増幅処理を行うことにより実施
することができる。ここで、該混合プライマーは少なく
とも２種のプライマーペアを含む。
【００１６】第１の本発明の方法において、検出しよう
とする前記複数種の微胞子虫は、微胞子虫門（Microspo
ra）に属する原生生物であればよく、特に限定されない
が、好ましくは微胞子虫類（Microsporida）に属する原
生生物、より好ましくは、ノセマ・ボンビシス（Nosema
bombycis）、バイリモルファsp. M11（Vairimorphasp.
M11）、バイリモルファsp. M12（Vairimorpha sp. M1
2）、バイリモルファ・ネカトリクス（Vairimorpha nec
atrix）及びプレイストフォラsp. PSD（Pleistophora s
p. PSD）からなる群より選択される少なくとも２種の微
胞子虫、最も好ましくは、ノセマ・ボンビシス、バイリ
モルファsp. M11、バイリモルファsp.M12、バイリモル
ファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PSDであ
る。前記ノセマ・ボンビシスには、強毒系統及び弱毒系
統の両方が含まれる。
とする前記複数種の微胞子虫は、微胞子虫門（Microspo
ra）に属する原生生物であればよく、特に限定されない
が、好ましくは微胞子虫類（Microsporida）に属する原
生生物、より好ましくは、ノセマ・ボンビシス（Nosema
bombycis）、バイリモルファsp. M11（Vairimorphasp.
M11）、バイリモルファsp. M12（Vairimorpha sp. M1
2）、バイリモルファ・ネカトリクス（Vairimorpha nec
atrix）及びプレイストフォラsp. PSD（Pleistophora s
p. PSD）からなる群より選択される少なくとも２種の微
胞子虫、最も好ましくは、ノセマ・ボンビシス、バイリ
モルファsp. M11、バイリモルファsp.M12、バイリモル
ファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PSDであ
る。前記ノセマ・ボンビシスには、強毒系統及び弱毒系
統の両方が含まれる。
【００１７】第１の本発明の方法において使用する混合
プライマーに含まれるプライマーは、検出対象とする複
数の微胞子虫由来のＤＮＡを、相互に配列比較すること
によって設計することができる。配列比較に用いるＤＮ
Ａの領域は、いずれの遺伝子であってもよく、特に限定
されないが、例えば、ミトコンドリア熱ショックタンパ
ク質７０（ＨＳＰ７０）遺伝子、ペプチド延長因子１α
遺伝子、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子等が挙げられ
る。配列比較に用いるＤＮＡの塩基配列は公知のもので
あってもよく、例えば、GenBank等のデータベースから
取得することができる。当業者であれば、データベース
に登録された配列の中から、検出対象とする微胞子虫の
種類に応じて適切な配列を検索し、容易に取得すること
ができる。このようにして取得される塩基配列として
は、例えば、下記表１に示されるものを挙げることがで
きる。
プライマーに含まれるプライマーは、検出対象とする複
数の微胞子虫由来のＤＮＡを、相互に配列比較すること
によって設計することができる。配列比較に用いるＤＮ
Ａの領域は、いずれの遺伝子であってもよく、特に限定
されないが、例えば、ミトコンドリア熱ショックタンパ
ク質７０（ＨＳＰ７０）遺伝子、ペプチド延長因子１α
遺伝子、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子等が挙げられ
る。配列比較に用いるＤＮＡの塩基配列は公知のもので
あってもよく、例えば、GenBank等のデータベースから
取得することができる。当業者であれば、データベース
に登録された配列の中から、検出対象とする微胞子虫の
種類に応じて適切な配列を検索し、容易に取得すること
ができる。このようにして取得される塩基配列として
は、例えば、下記表１に示されるものを挙げることがで
きる。
【００１８】
【表１】
【００１９】上記のような配列比較に基いて、検出対象
とする各微胞子虫に対するプライマーを設計するには、
まず、取得した複数の塩基配列のアライメントをとる。
アライメントは、解析ソフトウェア、例えば、クラスタ
ルＸ（ClustalX、フリーウエア）を用いてとることがで
きる。その際のソフトウェアのパラメータは、全て初期
値のままであってもよく、また、必要に応じて変更して
もよい。このようなパラメータの変更は、当業者であれ
ば容易に行うことができる。次に、このようなアライメ
ント（配列比較の結果）に基き、以下の基準：（１）原
則として１種の微胞子虫につき１種類の増幅産物が形成
されるようにする；（２）プライマーを混合したとき
に、混在しているプライマーどうしが目的外の部位を増
幅しないように設計する（目的外の部位を増幅してしま
う場合にはプライマー配列を変更する）；（３）増幅す
る目的配列は必ずしも同じ遺伝子である必要はなく、生
物ごとに異なってもよい；（４）増幅される産物が電気
泳動で分離できるようにプライマーを設計する；に従っ
て、プライマーとして適切な配列を選択することができ
る。この際に、各プライマーの塩基数は特に限定されな
いが、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩
基以上とする。
とする各微胞子虫に対するプライマーを設計するには、
まず、取得した複数の塩基配列のアライメントをとる。
アライメントは、解析ソフトウェア、例えば、クラスタ
ルＸ（ClustalX、フリーウエア）を用いてとることがで
きる。その際のソフトウェアのパラメータは、全て初期
値のままであってもよく、また、必要に応じて変更して
もよい。このようなパラメータの変更は、当業者であれ
ば容易に行うことができる。次に、このようなアライメ
ント（配列比較の結果）に基き、以下の基準：（１）原
則として１種の微胞子虫につき１種類の増幅産物が形成
されるようにする；（２）プライマーを混合したとき
に、混在しているプライマーどうしが目的外の部位を増
幅しないように設計する（目的外の部位を増幅してしま
う場合にはプライマー配列を変更する）；（３）増幅す
る目的配列は必ずしも同じ遺伝子である必要はなく、生
物ごとに異なってもよい；（４）増幅される産物が電気
泳動で分離できるようにプライマーを設計する；に従っ
て、プライマーとして適切な配列を選択することができ
る。この際に、各プライマーの塩基数は特に限定されな
いが、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩
基以上とする。
【００２０】また、各プライマーペアにより増幅される
ＤＮＡ断片のサイズは、通常の電気泳動により検出され
得る範囲であればよく、特に限定されないが、好ましく
は１００塩基〜３０００塩基、より好ましくは１００塩
基〜２０００塩基とする。ここで、各プライマーペアに
より増幅されるＤＮＡ断片のサイズを、電気泳動により
各ＤＮＡ断片のバンドが相互に明確に分離される程度に
分散させておくと、上記方法により各微胞子虫の同時検
出だけでなく、同定をも行うことができる。ただし、こ
のような同定は、必ずしも検出対象とする微胞子虫の全
てを区別するものでなくてもよい。すなわち、区別する
必要のない微胞子虫の間では、それぞれに由来する増幅
断片のサイズが、電気泳動により明確に分離される程度
に異なっていなくてもよい。上述のようにして設計され
るプライマーの塩基配列は特定の配列に限定されるもの
ではないが、例えば、下記の表２に示される塩基配列を
含むものが挙げられる。
ＤＮＡ断片のサイズは、通常の電気泳動により検出され
得る範囲であればよく、特に限定されないが、好ましく
は１００塩基〜３０００塩基、より好ましくは１００塩
基〜２０００塩基とする。ここで、各プライマーペアに
より増幅されるＤＮＡ断片のサイズを、電気泳動により
各ＤＮＡ断片のバンドが相互に明確に分離される程度に
分散させておくと、上記方法により各微胞子虫の同時検
出だけでなく、同定をも行うことができる。ただし、こ
のような同定は、必ずしも検出対象とする微胞子虫の全
てを区別するものでなくてもよい。すなわち、区別する
必要のない微胞子虫の間では、それぞれに由来する増幅
断片のサイズが、電気泳動により明確に分離される程度
に異なっていなくてもよい。上述のようにして設計され
るプライマーの塩基配列は特定の配列に限定されるもの
ではないが、例えば、下記の表２に示される塩基配列を
含むものが挙げられる。
【００２１】
【表２】
【００２２】上記表２において、NBEF35F及びNBEF957R
は、ノセマ・ボンビシス延長因子１α遺伝子配列に基い
て設計したプライマーであり、ノセマ・ボンビシスの弱
毒系統及び強毒系統の両方を検出することができる。M1
1-96F及びM11-822Rは、バイリモルファsp. M11の小サブ
ユニットｒＲＮＡ遺伝子配列に基いて設計したプライマ
ーであり、バイリモルファsp. M11のみを検出すること
ができる。V70-176F及びV70-1898Rは、バイリモルファs
p. M12のＨＳＰ７０遺伝子配列に基いて設計したプライ
マーであり、バイリモルファsp. M12及びバイリモルフ
ァ・ネカトリクス（外国種）を検出することができる。
PSDF1は、微胞子虫小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の共
通配列に基いて設計したプライマーであり、PSDR450
は、プレイストフォラsp. PSDの小サブユニットｒＲＮ
Ａ遺伝子配列に基いて設計したプライマーである。PSDF
1及びPSDR450は、プレイストフォラsp. PSDのみを検出
することができる。なお、各プライマーの名称の最後の
数字は、そのプライマーの設計の基礎とした配列におけ
る、各プライマーの３’末端塩基の塩基番号を示してい
る。これらのプライマーは特異性が非常に高いため、そ
の検出対象として示したもの以外の微胞子虫及び他の病
原生物には反応しない。また、上記のようにして設計し
たオリゴヌクレオチド（プライマー）は、当業者に公知
の方法、例えば化学合成等により容易に作製することが
できる。
は、ノセマ・ボンビシス延長因子１α遺伝子配列に基い
て設計したプライマーであり、ノセマ・ボンビシスの弱
毒系統及び強毒系統の両方を検出することができる。M1
1-96F及びM11-822Rは、バイリモルファsp. M11の小サブ
ユニットｒＲＮＡ遺伝子配列に基いて設計したプライマ
ーであり、バイリモルファsp. M11のみを検出すること
ができる。V70-176F及びV70-1898Rは、バイリモルファs
p. M12のＨＳＰ７０遺伝子配列に基いて設計したプライ
マーであり、バイリモルファsp. M12及びバイリモルフ
ァ・ネカトリクス（外国種）を検出することができる。
PSDF1は、微胞子虫小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の共
通配列に基いて設計したプライマーであり、PSDR450
は、プレイストフォラsp. PSDの小サブユニットｒＲＮ
Ａ遺伝子配列に基いて設計したプライマーである。PSDF
1及びPSDR450は、プレイストフォラsp. PSDのみを検出
することができる。なお、各プライマーの名称の最後の
数字は、そのプライマーの設計の基礎とした配列におけ
る、各プライマーの３’末端塩基の塩基番号を示してい
る。これらのプライマーは特異性が非常に高いため、そ
の検出対象として示したもの以外の微胞子虫及び他の病
原生物には反応しない。また、上記のようにして設計し
たオリゴヌクレオチド（プライマー）は、当業者に公知
の方法、例えば化学合成等により容易に作製することが
できる。
【００２３】第１の本発明の方法において使用する混合
プライマーは、検出対象とする微胞子虫の種類に応じ
て、以上のようにして設計される２種以上のプライマー
ペアを含む。例えば、上記表２に記載したプライマーを
用いる場合には、検出対象とする微胞子虫の種類に応じ
て、全プライマーペアのうちの２種以上を混合して混合
プライマーとすることができるが、好ましくは、これら
のプライマーの全てを混合して混合プライマーとする。
プライマーは、検出対象とする微胞子虫の種類に応じ
て、以上のようにして設計される２種以上のプライマー
ペアを含む。例えば、上記表２に記載したプライマーを
用いる場合には、検出対象とする微胞子虫の種類に応じ
て、全プライマーペアのうちの２種以上を混合して混合
プライマーとすることができるが、好ましくは、これら
のプライマーの全てを混合して混合プライマーとする。
【００２４】第１の本発明の方法において用いる増幅処
理は特に限定されないが、好ましくはポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）である。ここで、該増幅処理に用いる鋳
型は被検動物体内に存在する核酸であり、好ましくはＤ
ＮＡである。このような核酸は、当業者に公知の方法に
より被検動物から抽出することができる。プライマーと
しては、上述の混合プライマーを用いる。鋳型及びプラ
イマーの他、増幅処理に必要な試薬、処理条件等は、当
業者であれば適切に設定することができる。例えば、Ｐ
ＣＲを行う場合には、鋳型及びプライマーの他に、Tris
-HCl、KCl、MgCl2、各ｄＮＴＰ、Taq DNAポリメラーゼ
等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とすることができ、
このような試薬類はＰＣＲ用キットとしても市販されて
いる。次いで、このようにして調製したＰＣＲ反応液
を、サーマルサイクラー等の装置に投入し、温度サイク
ル反応を行うことによって増幅処理を行うことができ
る。
理は特に限定されないが、好ましくはポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）である。ここで、該増幅処理に用いる鋳
型は被検動物体内に存在する核酸であり、好ましくはＤ
ＮＡである。このような核酸は、当業者に公知の方法に
より被検動物から抽出することができる。プライマーと
しては、上述の混合プライマーを用いる。鋳型及びプラ
イマーの他、増幅処理に必要な試薬、処理条件等は、当
業者であれば適切に設定することができる。例えば、Ｐ
ＣＲを行う場合には、鋳型及びプライマーの他に、Tris
-HCl、KCl、MgCl2、各ｄＮＴＰ、Taq DNAポリメラーゼ
等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とすることができ、
このような試薬類はＰＣＲ用キットとしても市販されて
いる。次いで、このようにして調製したＰＣＲ反応液
を、サーマルサイクラー等の装置に投入し、温度サイク
ル反応を行うことによって増幅処理を行うことができ
る。
【００２５】増幅処理により得られる増幅産物の検出
は、該産物のサイズ（塩基長）によって分離することの
できる公知の方法、好ましくはアガロースゲル電気泳動
等の電気泳動法により行うことができる。このような方
法により、増幅処理に使用した各プライマーペアから予
測されるサイズの増幅断片が検出されるか否かを調べる
ことができ、これにより、被検動物体内に存在する核酸
が上記混合プライマーによって増幅されるか否かを調べ
ることができる。ここで、プライマーペアからの増幅断
片のサイズの予測は、当業者であれば容易に行うことが
できる。上述のように、上記混合プライマーに含まれる
各プライマーペアが、相互に異なるサイズのＤＮＡ断片
を与えるものであれば、微胞子虫の検出のみならず、そ
の同定（各種微胞子虫の特異的検出）をも行うことがで
きる。例えば、表２に記載の各プライマーペアから予測
される増幅断片の塩基長は、NBEF35F及びNBEF957Rにつ
いては９４３塩基、M11-96F及びM11-822Rについては７
５２塩基、V70-176F及びV70-1898Rについては１７５０
塩基、PSDF1及びPSDR450については４５０塩基である。
は、該産物のサイズ（塩基長）によって分離することの
できる公知の方法、好ましくはアガロースゲル電気泳動
等の電気泳動法により行うことができる。このような方
法により、増幅処理に使用した各プライマーペアから予
測されるサイズの増幅断片が検出されるか否かを調べる
ことができ、これにより、被検動物体内に存在する核酸
が上記混合プライマーによって増幅されるか否かを調べ
ることができる。ここで、プライマーペアからの増幅断
片のサイズの予測は、当業者であれば容易に行うことが
できる。上述のように、上記混合プライマーに含まれる
各プライマーペアが、相互に異なるサイズのＤＮＡ断片
を与えるものであれば、微胞子虫の検出のみならず、そ
の同定（各種微胞子虫の特異的検出）をも行うことがで
きる。例えば、表２に記載の各プライマーペアから予測
される増幅断片の塩基長は、NBEF35F及びNBEF957Rにつ
いては９４３塩基、M11-96F及びM11-822Rについては７
５２塩基、V70-176F及びV70-1898Rについては１７５０
塩基、PSDF1及びPSDR450については４５０塩基である。
【００２６】第１の本発明の方法を適用することのでき
る動物、すなわち前記被験動物は、微胞子虫が感染しう
る動物であればよく、特に限定されないが、好ましくは
哺乳類、魚類又は昆虫類に属する動物、より好ましくは
カイコガ（Bombix mori）である。また、被検動物はい
かなる成長段階にあるものでもよく、卵であってもよい
が、好ましくは成虫又は卵、より好ましくは成虫の段階
である。本発明の方法においては、被検動物から核酸を
取得する必要があるが、上記のような被検動物からの核
酸抽出は、液体窒素を用いる摩砕及びフェノール法等の
当業者に公知の方法により行うことができ、また、市販
のキットを用いて行うこともできる。前記被検動物がヒ
トである場合には、被験者からの組織、細胞等から当業
者に公知の方法により核酸試料を得ることができる。
る動物、すなわち前記被験動物は、微胞子虫が感染しう
る動物であればよく、特に限定されないが、好ましくは
哺乳類、魚類又は昆虫類に属する動物、より好ましくは
カイコガ（Bombix mori）である。また、被検動物はい
かなる成長段階にあるものでもよく、卵であってもよい
が、好ましくは成虫又は卵、より好ましくは成虫の段階
である。本発明の方法においては、被検動物から核酸を
取得する必要があるが、上記のような被検動物からの核
酸抽出は、液体窒素を用いる摩砕及びフェノール法等の
当業者に公知の方法により行うことができ、また、市販
のキットを用いて行うこともできる。前記被検動物がヒ
トである場合には、被験者からの組織、細胞等から当業
者に公知の方法により核酸試料を得ることができる。
【００２７】〔第２の本発明の方法〕本発明はまた、被
検昆虫体内に存在する複数種の昆虫病原生物を同時に検
出する方法に関し、この検出は、該被検昆虫体内に存在
する核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の昆虫病
原生物それぞれのゲノムの部分領域を増幅し得るプライ
マーペアを含む混合プライマーを用いて増幅処理を行う
ことによって実施することができる。ここで、該混合プ
ライマーは少なくとも２種のプライマーペアを含む。
検昆虫体内に存在する複数種の昆虫病原生物を同時に検
出する方法に関し、この検出は、該被検昆虫体内に存在
する核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の昆虫病
原生物それぞれのゲノムの部分領域を増幅し得るプライ
マーペアを含む混合プライマーを用いて増幅処理を行う
ことによって実施することができる。ここで、該混合プ
ライマーは少なくとも２種のプライマーペアを含む。
【００２８】第２の本発明の方法において、検出しよう
とする前記複数種の昆虫病原生物は、昆虫体内に入り込
んで何らかの疾患、障害等の病的状態を引き起こすもの
であればよく、特に限定されない。このような昆虫病原
生物としては、例えば、ウイルス、クラミジア、マイコ
プラスマ、細菌、真菌、リケッチア、原生動物（原
虫）、寄生虫等が挙げられるが、好ましくはカイコガ体
内に入り込む病原生物、より好ましくは微胞子虫であ
る。微胞子虫としては、微胞子虫門（Microspora）に属
する原生生物であればよく、特に限定されないが、好ま
しくは微胞子虫類（Microsporida）に属する原生生物、
より好ましくは、ノセマ・ボンビシス（Nosemabombyci
s）、バイリモルファsp. M11（Vairimorpha sp. M1
1）、バイリモルファsp. M12（Vairimorpha sp. M1
2）、バイリモルファ・ネカトリクス（Vairimorpha nec
atrix）、プレイストフォラsp. PSD（Pleistophora sp.
PSD）等が挙げられる。前記ノセマ・ボンビシスには、
強毒系統及び弱毒系統の両方が含まれる。
とする前記複数種の昆虫病原生物は、昆虫体内に入り込
んで何らかの疾患、障害等の病的状態を引き起こすもの
であればよく、特に限定されない。このような昆虫病原
生物としては、例えば、ウイルス、クラミジア、マイコ
プラスマ、細菌、真菌、リケッチア、原生動物（原
虫）、寄生虫等が挙げられるが、好ましくはカイコガ体
内に入り込む病原生物、より好ましくは微胞子虫であ
る。微胞子虫としては、微胞子虫門（Microspora）に属
する原生生物であればよく、特に限定されないが、好ま
しくは微胞子虫類（Microsporida）に属する原生生物、
より好ましくは、ノセマ・ボンビシス（Nosemabombyci
s）、バイリモルファsp. M11（Vairimorpha sp. M1
1）、バイリモルファsp. M12（Vairimorpha sp. M1
2）、バイリモルファ・ネカトリクス（Vairimorpha nec
atrix）、プレイストフォラsp. PSD（Pleistophora sp.
PSD）等が挙げられる。前記ノセマ・ボンビシスには、
強毒系統及び弱毒系統の両方が含まれる。
【００２９】第２の本発明の方法において使用する混合
プライマーに含まれるプライマーは、検出対象とする複
数の昆虫病原生物由来のＤＮＡ又はＲＮＡを、相互に配
列比較することによって設計することができる。配列比
較に用いるＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列は公知のもので
あってもよく、例えば、GenBank等のデータベースから
取得することができる。当業者であれば、データベース
に登録された配列の中から、検出対象とする昆虫病原生
物の種類に応じて適切な配列を検索し、容易に取得する
ことができる。検出対象が微胞子虫である場合には、こ
のようにして取得される塩基配列としては、例えば、上
記表１に示されるものを挙げることができる。
プライマーに含まれるプライマーは、検出対象とする複
数の昆虫病原生物由来のＤＮＡ又はＲＮＡを、相互に配
列比較することによって設計することができる。配列比
較に用いるＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列は公知のもので
あってもよく、例えば、GenBank等のデータベースから
取得することができる。当業者であれば、データベース
に登録された配列の中から、検出対象とする昆虫病原生
物の種類に応じて適切な配列を検索し、容易に取得する
ことができる。検出対象が微胞子虫である場合には、こ
のようにして取得される塩基配列としては、例えば、上
記表１に示されるものを挙げることができる。
【００３０】上記のような配列比較に基くプライマーの
設計は、第１の本発明の方法について述べた手法に従っ
て、同様に行うことができる。検出対象が微胞子虫であ
る場合には、このようにして設計されるプライマーとし
ては、例えば、上記表２に示されるものを挙げることが
できる。
設計は、第１の本発明の方法について述べた手法に従っ
て、同様に行うことができる。検出対象が微胞子虫であ
る場合には、このようにして設計されるプライマーとし
ては、例えば、上記表２に示されるものを挙げることが
できる。
【００３１】第２の本発明の方法において使用する混合
プライマーは、検出対象とする昆虫病原生物の種類に応
じて、以上のようにして設計される２種以上のプライマ
ーペアを含む。例えば、検出対象が微胞子虫である場合
において、上記表２に記載したプライマーを用いる場合
には、検出対象とする微胞子虫の種類に応じて、全プラ
イマーペアのうちの２種以上を混合して混合プライマー
とすることができるが、好ましくは、これらのプライマ
ーの全てを混合して混合プライマーとする。
プライマーは、検出対象とする昆虫病原生物の種類に応
じて、以上のようにして設計される２種以上のプライマ
ーペアを含む。例えば、検出対象が微胞子虫である場合
において、上記表２に記載したプライマーを用いる場合
には、検出対象とする微胞子虫の種類に応じて、全プラ
イマーペアのうちの２種以上を混合して混合プライマー
とすることができるが、好ましくは、これらのプライマ
ーの全てを混合して混合プライマーとする。
【００３２】第２の本発明の方法において用いる増幅処
理及び該増幅処理により得られる増幅産物の検出は、第
１の本発明の方法について述べた手法に従って、同様に
行うことができる。また、ゲノムＲＮＡを有する昆虫病
原生物を検出対象とする場合には、通常のＰＣＲに代え
てＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。このＲＴ−ＰＣＲ
は、鋳型であるＲＮＡからリバースプライマー及び逆転
写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを取得し、ＲＮアーゼを
用いてＲＮＡを分解した後に、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型
として通常のＰＣＲを行うことにより二本鎖ｃＤＮＡを
取得する手法である。ここで、逆転写酵素としては、モ
ロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素などの公
知のものを用いることができる。その他、ＲＴ−ＰＣＲ
において用いる試薬、反応条件等は、当業者であれば容
易に選択及び設定できる。
理及び該増幅処理により得られる増幅産物の検出は、第
１の本発明の方法について述べた手法に従って、同様に
行うことができる。また、ゲノムＲＮＡを有する昆虫病
原生物を検出対象とする場合には、通常のＰＣＲに代え
てＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。このＲＴ−ＰＣＲ
は、鋳型であるＲＮＡからリバースプライマー及び逆転
写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを取得し、ＲＮアーゼを
用いてＲＮＡを分解した後に、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型
として通常のＰＣＲを行うことにより二本鎖ｃＤＮＡを
取得する手法である。ここで、逆転写酵素としては、モ
ロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素などの公
知のものを用いることができる。その他、ＲＴ−ＰＣＲ
において用いる試薬、反応条件等は、当業者であれば容
易に選択及び設定できる。
【００３３】第２の本発明の方法を適用することのでき
る動物、すなわち前記被験昆虫は、特に限定されない
が、好ましくはカイコガ（Bombix mori）である。ま
た、前記被検昆虫はいかなる成長段階にあるものでもよ
く、卵であってもよいが、好ましくは成虫又は卵、より
好ましくは成虫の段階である。第２の本発明の方法にお
いては、被検昆虫から核酸を取得する必要があるが、上
記のような被検昆虫からの核酸抽出は、液体窒素を用い
る摩砕及びフェノール法等の当業者に公知の方法により
行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこと
もできる。
る動物、すなわち前記被験昆虫は、特に限定されない
が、好ましくはカイコガ（Bombix mori）である。ま
た、前記被検昆虫はいかなる成長段階にあるものでもよ
く、卵であってもよいが、好ましくは成虫又は卵、より
好ましくは成虫の段階である。第２の本発明の方法にお
いては、被検昆虫から核酸を取得する必要があるが、上
記のような被検昆虫からの核酸抽出は、液体窒素を用い
る摩砕及びフェノール法等の当業者に公知の方法により
行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこと
もできる。
【００３４】〔本発明のプライマーセット〕本発明はま
た、本発明の方法を使用するためのプライマーセット、
すなわち、ノセマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M1
1、バイリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリ
クス及びプレイストフォラsp. PSDのゲノムＤＮＡの部
分領域を増幅し得るプライマーペアからなる群より選択
される少なくとも２種のプライマーペアを含む、微胞子
虫検出用プライマーセットに関し、好ましくは、該プラ
イマーペアの全てを含む。
た、本発明の方法を使用するためのプライマーセット、
すなわち、ノセマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M1
1、バイリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリ
クス及びプレイストフォラsp. PSDのゲノムＤＮＡの部
分領域を増幅し得るプライマーペアからなる群より選択
される少なくとも２種のプライマーペアを含む、微胞子
虫検出用プライマーセットに関し、好ましくは、該プラ
イマーペアの全てを含む。
【００３５】本発明のプライマーセットに含まれる上記
プライマーペアは、上述のように設計し、調製すること
ができる。また、こうして調製されるプライマーペアの
具体例は、上記表２に示したとおりである。従って、本
発明のプライマーセットは、好ましくは、上記表２に記
載のプライマーセットのうちの少なくとも２種類を含
み、より好ましくは、その全て（配列番号１〜８で表わ
される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド）を含む。
プライマーペアは、上述のように設計し、調製すること
ができる。また、こうして調製されるプライマーペアの
具体例は、上記表２に示したとおりである。従って、本
発明のプライマーセットは、好ましくは、上記表２に記
載のプライマーセットのうちの少なくとも２種類を含
み、より好ましくは、その全て（配列番号１〜８で表わ
される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド）を含む。
【００３６】さらに、本発明の方法に使用するプライマ
ー以外の試薬類を本発明のプライマーセットに加えて、
微胞子虫検出用キットとすることもできる。このような
試薬類としては、Tris-HCl、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、プロテ
イナーゼＫ、RNaseA、フェノール、酢酸ナトリウム、エ
タノール等のＤＮＡ抽出用試薬、Tris-HCl、KCl、MgCl
2、各種ｄＮＴＰ、Taq DNAポリメラーゼ等のＰＣＲ用試
薬、ＴＥバッファー、４０％スクロースDye、アガロー
スゲル等の電気泳動用試薬などが挙げられるが、これら
に限定されない。
ー以外の試薬類を本発明のプライマーセットに加えて、
微胞子虫検出用キットとすることもできる。このような
試薬類としては、Tris-HCl、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、プロテ
イナーゼＫ、RNaseA、フェノール、酢酸ナトリウム、エ
タノール等のＤＮＡ抽出用試薬、Tris-HCl、KCl、MgCl
2、各種ｄＮＴＰ、Taq DNAポリメラーゼ等のＰＣＲ用試
薬、ＴＥバッファー、４０％スクロースDye、アガロー
スゲル等の電気泳動用試薬などが挙げられるが、これら
に限定されない。
【００３７】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕検出用プライマーの設計及び調製 データベースに登録されている、種々の微胞子虫由来の
ヌクレオチド配列を比較し、検出対象となる各微胞子虫
にのみ特異的な領域を数カ所ずつ選択した。ここで、配
列比較に使用したヌクレオチド配列は、下記の表３に記
載したとおりであり、これらの配列の比較は、解析ソフ
トウェアであるクラスタルＸ（ClustalX、フリーウエ
ア）を用いて行った。該ソフトウェアのパラメータは、
全て初期値のままとした。また、配列比較した比較図の
一部を図１に示した。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕検出用プライマーの設計及び調製 データベースに登録されている、種々の微胞子虫由来の
ヌクレオチド配列を比較し、検出対象となる各微胞子虫
にのみ特異的な領域を数カ所ずつ選択した。ここで、配
列比較に使用したヌクレオチド配列は、下記の表３に記
載したとおりであり、これらの配列の比較は、解析ソフ
トウェアであるクラスタルＸ（ClustalX、フリーウエ
ア）を用いて行った。該ソフトウェアのパラメータは、
全て初期値のままとした。また、配列比較した比較図の
一部を図１に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】次に、選択した各領域をプライマーにした
場合にＰＣＲによって増幅される産物の大きさを推定
し、これらの増幅産物が混在していても電気泳動によっ
て分離・識別が可能となるような大きさの産物を増幅す
る配列の組み合わせを選定し、下記表４に示すプライマ
ーを設計した。これらのプライマーは、常法に従って合
成した。
場合にＰＣＲによって増幅される産物の大きさを推定
し、これらの増幅産物が混在していても電気泳動によっ
て分離・識別が可能となるような大きさの産物を増幅す
る配列の組み合わせを選定し、下記表４に示すプライマ
ーを設計した。これらのプライマーは、常法に従って合
成した。
【００４０】
【表４】
【００４１】〔調製例１〕ＰＣＲ用の鋳型として使用す
るためのＤＮＡ試料の調製 （１）各微胞子虫の感染したカイコガ及び未感染カイコ
ガからのＤＮＡ抽出 微胞子虫の感染したカイコガ又は未感染カイコガ一個体
を乳鉢に取り、液体窒素を加えて摩砕した。得られた粉
末を50ml容遠心チューブに取り、32mM Tris-HCl(pH8.
0)、8mM EDTA (pH8.0)、3.2% SDS、32μg/ml Proteinas
e K、160μg/ml RNase Aの反応系において、３７℃で１
時間反応させた。反応後、フェノール抽出を行い、1/10
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、２倍量のエ
タノールを加えてＤＮＡを回収した。
るためのＤＮＡ試料の調製 （１）各微胞子虫の感染したカイコガ及び未感染カイコ
ガからのＤＮＡ抽出 微胞子虫の感染したカイコガ又は未感染カイコガ一個体
を乳鉢に取り、液体窒素を加えて摩砕した。得られた粉
末を50ml容遠心チューブに取り、32mM Tris-HCl(pH8.
0)、8mM EDTA (pH8.0)、3.2% SDS、32μg/ml Proteinas
e K、160μg/ml RNase Aの反応系において、３７℃で１
時間反応させた。反応後、フェノール抽出を行い、1/10
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、２倍量のエ
タノールを加えてＤＮＡを回収した。
【００４２】（２）各微胞子虫の胞子からのＤＮＡ抽出
1.5ml容チューブに胞子10mgを取り、STEバッファー（10
mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH8.0,10mM NaCl）で洗
浄した。その後、胞子に50mgのグラスビーズ（SIGMA
社、G-8772）及び200μlのSTEバッファーを加え、ボル
テックスを用いて30秒間破砕処理した。処理後、95℃で
５分間の熱処理を行い、150μlの上清を回収した。回収
した上清に1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.2）及び
2.5倍量の99.5％エタノールを加え、エタノール沈澱を
行った。遠心（10000×ｇ、４℃、１０分間）した後、7
0%エタノールを用いてリンスし、回収した沈澱を20μl
のTEバッファー中に懸濁した。
mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH8.0,10mM NaCl）で洗
浄した。その後、胞子に50mgのグラスビーズ（SIGMA
社、G-8772）及び200μlのSTEバッファーを加え、ボル
テックスを用いて30秒間破砕処理した。処理後、95℃で
５分間の熱処理を行い、150μlの上清を回収した。回収
した上清に1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.2）及び
2.5倍量の99.5％エタノールを加え、エタノール沈澱を
行った。遠心（10000×ｇ、４℃、１０分間）した後、7
0%エタノールを用いてリンスし、回収した沈澱を20μl
のTEバッファー中に懸濁した。
【００４３】〔実施例２〕各微胞子虫検出用プライマー
の特異性実験 実施例１で調製した各プライマ−を用い、各プライマー
が増幅対象とする微胞子虫胞子からのＤＮＡ試料を鋳型
としてＰＣＲを行い、目的産物の増幅を確認した。ま
た、これらのプライマーが目的とする微胞子虫以外の微
胞子虫のゲノムを鋳型にした場合に増幅産物を形成する
か否かを確かめるために、それぞれのプライマーをその
検出対象以外の微胞子虫からのＤＮＡ試料と混合し、Ｐ
ＣＲを行った。さらに、これらのプライマーが、カイコ
ガゲノム由来のＤＮＡ断片を増幅するか否かを調べた。
の特異性実験 実施例１で調製した各プライマ−を用い、各プライマー
が増幅対象とする微胞子虫胞子からのＤＮＡ試料を鋳型
としてＰＣＲを行い、目的産物の増幅を確認した。ま
た、これらのプライマーが目的とする微胞子虫以外の微
胞子虫のゲノムを鋳型にした場合に増幅産物を形成する
か否かを確かめるために、それぞれのプライマーをその
検出対象以外の微胞子虫からのＤＮＡ試料と混合し、Ｐ
ＣＲを行った。さらに、これらのプライマーが、カイコ
ガゲノム由来のＤＮＡ断片を増幅するか否かを調べた。
【００４４】すなわち、ノセマ・ボンビシス強毒系統
（微粒子病病原）及び弱毒系統、バイリモルファsp. M1
1、バイリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリ
クス（外国種）、プレイストフォラsp. PSD、並びにノ
セマ・フルナカリス（外国種）からの各ＤＮＡ試料並び
にカイコガからのＤＮＡ試料と、上記表４に記載の４種
の各プライマーペアとの全ての組み合わせにおいてＰＣ
Ｒを行った。
（微粒子病病原）及び弱毒系統、バイリモルファsp. M1
1、バイリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリ
クス（外国種）、プレイストフォラsp. PSD、並びにノ
セマ・フルナカリス（外国種）からの各ＤＮＡ試料並び
にカイコガからのＤＮＡ試料と、上記表４に記載の４種
の各プライマーペアとの全ての組み合わせにおいてＰＣ
Ｒを行った。
【００４５】ＰＣＲ反応液は、終濃度で10mM Tris-HCl
(pH8.9)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM 各dNTP、2.5U
nit Taq DNAポリメラーゼ (Sawady テクノロジー社
製)、各0.5μMの相同プライマー及び相補プライマーを
含み、さらに10ngの鋳型ＤＮＡを含む計100μlの溶液と
した。ＰＣＲは、アステックPC800サーマルサイクラー
を用い、94℃で２分の熱処理後、94℃で30秒−55℃で30
秒−72℃で30秒の反応を35サイクルという条件で行っ
た。
(pH8.9)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM 各dNTP、2.5U
nit Taq DNAポリメラーゼ (Sawady テクノロジー社
製)、各0.5μMの相同プライマー及び相補プライマーを
含み、さらに10ngの鋳型ＤＮＡを含む計100μlの溶液と
した。ＰＣＲは、アステックPC800サーマルサイクラー
を用い、94℃で２分の熱処理後、94℃で30秒−55℃で30
秒−72℃で30秒の反応を35サイクルという条件で行っ
た。
【００４６】ＰＣＲ後の反応液2.5μlを採取し、等量の
TEバッファー及び1μlの40%スクロースDye（0.03％ＢＰ
Ｂ、50mM ＥＤＴＡ、pH8.0、40％スクロース）を加えて
電気泳動用試料とした。電気泳動は２％アガロースゲル
（Sigma社、Type-II medium EEO A-6877）及び電気泳動
装置Mupid 21（コスモバイオ社）を用い、100Vで30分間
行った。
TEバッファー及び1μlの40%スクロースDye（0.03％ＢＰ
Ｂ、50mM ＥＤＴＡ、pH8.0、40％スクロース）を加えて
電気泳動用試料とした。電気泳動は２％アガロースゲル
（Sigma社、Type-II medium EEO A-6877）及び電気泳動
装置Mupid 21（コスモバイオ社）を用い、100Vで30分間
行った。
【００４７】電気泳動の結果を図２に示す。図２におい
て、パネルＡは、ノセマ・ボンビシス強毒系統及び弱毒
系統を検出対象とするプライマーNBEF35F及びNBEF957R
を用いたＰＣＲの結果を示し、パネルＢは、バイリモル
ファsp. M11を検出対象とするプライマーM11-96F及びM1
1-822Rを用いたＰＣＲの結果を示し、パネルＣは、バイ
リモルファsp. M12及びバイリモルファ・ネカトリクス
を検出対象とするプライマーV70-176F及びV70-1898Rを
用いたＰＣＲの結果を示し、パネルＤは、プレイストフ
ォラsp. PSDを検出対象とするプライマーPSDF1及びPSDR
450を用いたＰＣＲの結果を示す。
て、パネルＡは、ノセマ・ボンビシス強毒系統及び弱毒
系統を検出対象とするプライマーNBEF35F及びNBEF957R
を用いたＰＣＲの結果を示し、パネルＢは、バイリモル
ファsp. M11を検出対象とするプライマーM11-96F及びM1
1-822Rを用いたＰＣＲの結果を示し、パネルＣは、バイ
リモルファsp. M12及びバイリモルファ・ネカトリクス
を検出対象とするプライマーV70-176F及びV70-1898Rを
用いたＰＣＲの結果を示し、パネルＤは、プレイストフ
ォラsp. PSDを検出対象とするプライマーPSDF1及びPSDR
450を用いたＰＣＲの結果を示す。
【００４８】これらの結果によれば、各プライマーは目
的とする微胞子虫からのＤＮＡ試料を鋳型にした場合に
のみ特異的な産物を増幅し、他の微胞子虫からのＤＮＡ
試料を鋳型にした場合には産物の増幅が認められなかっ
た。さらに、いずれのプライマーを用いた場合にも、カ
イコガゲノム由来の増幅産物は検出されなかった。
的とする微胞子虫からのＤＮＡ試料を鋳型にした場合に
のみ特異的な産物を増幅し、他の微胞子虫からのＤＮＡ
試料を鋳型にした場合には産物の増幅が認められなかっ
た。さらに、いずれのプライマーを用いた場合にも、カ
イコガゲノム由来の増幅産物は検出されなかった。
【００４９】〔実施例３〕混合プライマーによる微胞子
虫の検出 各微胞子虫に特異的なプライマーを複数種混合させ、目
的の遺伝子以外の部位を増幅するか否かを調べた。ま
た、このような混合プライマーが、宿主であるカイコガ
ゲノム由来のＤＮＡ断片を増幅するか否かを調べた。す
なわち、ノセマ・ボンビシス強毒系統（微粒子病病原）
及び弱毒系統、バイリモルファsp. M11、バイリモルフ
ァsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス（外国
種）、並びにプレイストフォラsp. PSDからの各ＤＮＡ
試料並びにカイコガからのＤＮＡ試料を鋳型とし、上記
表４に記載の４種のプライマーペアを混合した混合プラ
イマーを用いてＰＣＲを行った。
虫の検出 各微胞子虫に特異的なプライマーを複数種混合させ、目
的の遺伝子以外の部位を増幅するか否かを調べた。ま
た、このような混合プライマーが、宿主であるカイコガ
ゲノム由来のＤＮＡ断片を増幅するか否かを調べた。す
なわち、ノセマ・ボンビシス強毒系統（微粒子病病原）
及び弱毒系統、バイリモルファsp. M11、バイリモルフ
ァsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス（外国
種）、並びにプレイストフォラsp. PSDからの各ＤＮＡ
試料並びにカイコガからのＤＮＡ試料を鋳型とし、上記
表４に記載の４種のプライマーペアを混合した混合プラ
イマーを用いてＰＣＲを行った。
【００５０】ＰＣＲ反応液は、終濃度で10mM Tris-HCl
(pH8.9)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM 各dNTP、2.5U
nit Taq DNAポリメラーゼ (Sawady テクノロジー社
製)、各0.5μMのプライマーを含み、さらに10ngの鋳型
ＤＮＡを含む計100μlの溶液とした。ＰＣＲは、アステ
ックPC800サーマルサイクラーを用い、94℃で２分の熱
処理後、94℃で30秒−55℃で30秒−72℃で30秒の反応を
35サイクルという条件で行った。
(pH8.9)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM 各dNTP、2.5U
nit Taq DNAポリメラーゼ (Sawady テクノロジー社
製)、各0.5μMのプライマーを含み、さらに10ngの鋳型
ＤＮＡを含む計100μlの溶液とした。ＰＣＲは、アステ
ックPC800サーマルサイクラーを用い、94℃で２分の熱
処理後、94℃で30秒−55℃で30秒−72℃で30秒の反応を
35サイクルという条件で行った。
【００５１】ＰＣＲ後の反応液2.5μlを採取し、等量の
TEバッファー及び1μlの40%スクロースDye（0.03％ＢＰ
Ｂ、50mM ＥＤＴＡ、pH8.0、40％スクロース）を加えて
電気泳動用試料とした。電気泳動は２％アガロースゲル
（Sigma社、Type-II medium EEO A-6877）及び電気泳動
装置Mupid 21（コスモバイオ社）を用い、100Vで30分間
行った。
TEバッファー及び1μlの40%スクロースDye（0.03％ＢＰ
Ｂ、50mM ＥＤＴＡ、pH8.0、40％スクロース）を加えて
電気泳動用試料とした。電気泳動は２％アガロースゲル
（Sigma社、Type-II medium EEO A-6877）及び電気泳動
装置Mupid 21（コスモバイオ社）を用い、100Vで30分間
行った。
【００５２】電気泳動の結果を図３に示す。図３におい
て、左側の４つの矢印は、そこに示されているとおり、
それぞれNB（Nosema bombycis）を検出するプライマー
（NBEF35F及びNBEF957R）、M11（Vairimorpha sp. M1
1）を検出するプライマー（M11-96F及びM11-822R）、M1
2（Vairimorpha sp. M12）を検出するプライマー（V70-
176F及びV70-1898R）、及びPSD（Pleistophora sp. PS
D）を検出するプライマー（PSDF1及びPSDR450）により
増幅されるＰＣＲ産物の推定泳動度を示す。図３によれ
ば、各プライマーは予想される大きさの産物を増幅し、
それ以外の産物の増幅は確認されなかった。また、上記
混合プライマーは、カイコガゲノム由来のＤＮＡ断片を
増幅しなかった。
て、左側の４つの矢印は、そこに示されているとおり、
それぞれNB（Nosema bombycis）を検出するプライマー
（NBEF35F及びNBEF957R）、M11（Vairimorpha sp. M1
1）を検出するプライマー（M11-96F及びM11-822R）、M1
2（Vairimorpha sp. M12）を検出するプライマー（V70-
176F及びV70-1898R）、及びPSD（Pleistophora sp. PS
D）を検出するプライマー（PSDF1及びPSDR450）により
増幅されるＰＣＲ産物の推定泳動度を示す。図３によれ
ば、各プライマーは予想される大きさの産物を増幅し、
それ以外の産物の増幅は確認されなかった。また、上記
混合プライマーは、カイコガゲノム由来のＤＮＡ断片を
増幅しなかった。
【００５３】〔実施例４〕宿主に感染した状態での各微
胞子虫の検出・判別実験 宿主に感染した状態でも微胞子虫が検出できるか否かを
調べるために、微胞子虫に感染したカイコガ成虫からの
ＤＮＡ試料を鋳型として、ＰＣＲを行った。すなわち、
ノセマ・ボンビシス強毒系統（微粒子病病原）及び弱毒
系統、バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M1
2、バイリモルファ・ネカトリクス（外国種）、並びに
プレイストフォラsp. PSDをそれぞれ感染させた各カイ
コガ成虫からの各ＤＮＡ試料を鋳型とする以外は、実施
例３と同様にＰＣＲを行った。
胞子虫の検出・判別実験 宿主に感染した状態でも微胞子虫が検出できるか否かを
調べるために、微胞子虫に感染したカイコガ成虫からの
ＤＮＡ試料を鋳型として、ＰＣＲを行った。すなわち、
ノセマ・ボンビシス強毒系統（微粒子病病原）及び弱毒
系統、バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M1
2、バイリモルファ・ネカトリクス（外国種）、並びに
プレイストフォラsp. PSDをそれぞれ感染させた各カイ
コガ成虫からの各ＤＮＡ試料を鋳型とする以外は、実施
例３と同様にＰＣＲを行った。
【００５４】電気泳動の結果を図４に示す。図４によれ
ば、上記のＰＣＲの結果は、各微胞子虫の胞子からのＤ
ＮＡ試料を鋳型として用いた場合との差を示さなかっ
た。従って、上記のような混合プライマーを用いるマル
チプライマーＰＣＲにより、微胞子虫に感染したカイコ
ガからのＤＮＡ試料から、各微胞子虫を判別可能な形で
検出することができることが分かった。
ば、上記のＰＣＲの結果は、各微胞子虫の胞子からのＤ
ＮＡ試料を鋳型として用いた場合との差を示さなかっ
た。従って、上記のような混合プライマーを用いるマル
チプライマーＰＣＲにより、微胞子虫に感染したカイコ
ガからのＤＮＡ試料から、各微胞子虫を判別可能な形で
検出することができることが分かった。
【００５５】〔実施例５〕微胞子虫感染時期による影響
カイコガの成長段階によって検出精度に影響がでるか否
かを検討した。すなわち、ノセマ・ボンビシス強毒系統
（微粒子病病原）及び弱毒系統、バイリモルファsp. M1
1、バイリモルファsp. M12、並びにプレイストフォラs
p. PSDをそれぞれ感染させたカイコガ（１齢、２齢、３
齢、４齢及び５齢サナギ、並びに成虫）からの各ＤＮＡ
試料を鋳型とする以外は、実施例３と同様にＰＣＲを行
った。その結果、カイコガの成長は検出結果には直接影
響しないことが明らかとなった。
かを検討した。すなわち、ノセマ・ボンビシス強毒系統
（微粒子病病原）及び弱毒系統、バイリモルファsp. M1
1、バイリモルファsp. M12、並びにプレイストフォラs
p. PSDをそれぞれ感染させたカイコガ（１齢、２齢、３
齢、４齢及び５齢サナギ、並びに成虫）からの各ＤＮＡ
試料を鋳型とする以外は、実施例３と同様にＰＣＲを行
った。その結果、カイコガの成長は検出結果には直接影
響しないことが明らかとなった。
【００５６】〔実施例６〕混合プライマーの目的外生物
に対する反応 表４に記載の全プライマーを含む混合プライマーが微胞
子虫以外の生物であって、微胞子虫と同じ環境で生育し
うるもののゲノム由来のＤＮＡ断片を増幅するか否かを
調べるため、カイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰ
Ｖ）、白きょう病菌ボーベリア・バシアナ（B. bassian
a）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensi
s）、及び大腸菌（E. coli）から調製したＤＮＡ試料を
鋳型とする以外は実施例３と同様にＰＣＲを行った。
に対する反応 表４に記載の全プライマーを含む混合プライマーが微胞
子虫以外の生物であって、微胞子虫と同じ環境で生育し
うるもののゲノム由来のＤＮＡ断片を増幅するか否かを
調べるため、カイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰ
Ｖ）、白きょう病菌ボーベリア・バシアナ（B. bassian
a）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensi
s）、及び大腸菌（E. coli）から調製したＤＮＡ試料を
鋳型とする以外は実施例３と同様にＰＣＲを行った。
【００５７】これらの結果のうち、ボーベリア・バシア
ナ及びバチルス・チューリンゲンシスについての結果を
図５に示す。図５からわかるように、上記混合プライマ
ーはこれら２種の生物由来のＤＮＡ断片を増幅しなかっ
た。また、ＢｍＮＰＶ及び大腸菌に由来するＤＮＡ断片
も増幅されなかった。
ナ及びバチルス・チューリンゲンシスについての結果を
図５に示す。図５からわかるように、上記混合プライマ
ーはこれら２種の生物由来のＤＮＡ断片を増幅しなかっ
た。また、ＢｍＮＰＶ及び大腸菌に由来するＤＮＡ断片
も増幅されなかった。
【００５８】〔実施例７〕微胞子虫が共感染していた場
合の微胞子虫の検出及び識別 検出対象となっている微胞子虫が２種類感染していた場
合でも、カイコガ成虫からこれらの微胞子虫を識別でき
る形で検出できるか否かを調べた。すなわち、ノセマ・
ボンビシスからのＤＮＡ試料及びプレイストフォラsp.
PSDからのＤＮＡ試料を混合して鋳型とする以外は実施
例３と同様にＰＣＲを行った。この際に、これらのＤＮ
Ａ試料のそれぞれを鋳型とする別々のＰＣＲを行った後
にＰＣＲ産物を混合して電気泳動を行う実験と、これら
のＤＮＡ試料の混合物にさらにカイコガからのＤＮＡ試
料を添加したものを鋳型とする実験を同時に行った。そ
の結果を図６に示す。図６からわかるように、感染して
いる二種類の微胞子虫に特異的な産物がそれぞれ増幅さ
れ、電気泳動によって二種類の微胞子虫の感染が確認さ
れた。
合の微胞子虫の検出及び識別 検出対象となっている微胞子虫が２種類感染していた場
合でも、カイコガ成虫からこれらの微胞子虫を識別でき
る形で検出できるか否かを調べた。すなわち、ノセマ・
ボンビシスからのＤＮＡ試料及びプレイストフォラsp.
PSDからのＤＮＡ試料を混合して鋳型とする以外は実施
例３と同様にＰＣＲを行った。この際に、これらのＤＮ
Ａ試料のそれぞれを鋳型とする別々のＰＣＲを行った後
にＰＣＲ産物を混合して電気泳動を行う実験と、これら
のＤＮＡ試料の混合物にさらにカイコガからのＤＮＡ試
料を添加したものを鋳型とする実験を同時に行った。そ
の結果を図６に示す。図６からわかるように、感染して
いる二種類の微胞子虫に特異的な産物がそれぞれ増幅さ
れ、電気泳動によって二種類の微胞子虫の感染が確認さ
れた。
【００５９】
【発明の効果】本発明により、一個体につき一本のチュ
ーブを使用した一回の検査のみで複数の病原を検出する
ことができる。また、各病原生物ごとに異なる大きさの
ＤＮＡ断片が増幅されるように設定することにより、病
原の同定も容易に行うことができる。さらに、本発明
は、農業分野以外に、医療現場で緊急診断に用いること
も可能である。さらに、この検出方法では、病原体の種
類を一種類に限定する必要がないため、ウイルスとバク
テリアなど異生物集団の比較も可能である。
ーブを使用した一回の検査のみで複数の病原を検出する
ことができる。また、各病原生物ごとに異なる大きさの
ＤＮＡ断片が増幅されるように設定することにより、病
原の同定も容易に行うことができる。さらに、本発明
は、農業分野以外に、医療現場で緊急診断に用いること
も可能である。さらに、この検出方法では、病原体の種
類を一種類に限定する必要がないため、ウイルスとバク
テリアなど異生物集団の比較も可能である。
【００６０】蚕微粒子病の検定の場合には、増殖状態や
感染量に依存せずに微胞子虫を検出できるため、従来困
難であった胞子を形成していない状態での検出も行うこ
とができ、さらに卵の検定も容易に行える。また、検定
が形質に依存しないため、微胞子虫と他の病原菌を見誤
ることがない。
感染量に依存せずに微胞子虫を検出できるため、従来困
難であった胞子を形成していない状態での検出も行うこ
とができ、さらに卵の検定も容易に行える。また、検定
が形質に依存しないため、微胞子虫と他の病原菌を見誤
ることがない。
【００６１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Director-General of National Institute of Sericultural
and Entomological Science
Japan Science and Technology Corporation
<120> Method for Identifying Pathogenic organisms using
multi-primer PCR
<130> P99-0623
<160> 8
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 1
tggcgctgtt gataagagat t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 2
aatttagcaa cacaagcctt at 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 3
tactttattt aatgtacatt tgaaaa 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 4
ctcgaattag aaaattctct caa 23
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 5
caaatgacag ggaaagaaat aagttcca 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 6
ttaaatattt tgtgctatag cttactc 27
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 7
caccaggttg attctgcctg acg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer
<400> 8
gctccgcctc tctttccgtc tcc 23
【００６２】
【配列表フリーテキスト】配列番号１〜８：プライマー
【図１】６種類の微胞子虫及び大腸菌（E. coli）由来
のＤＮＡ部分配列のアライメントを示す図である。
のＤＮＡ部分配列のアライメントを示す図である。
【図２】４種のプライマーペアをそれぞれ単独で用いた
場合における、各種微胞子虫の検出結果を示す電気泳動
写真である。
場合における、各種微胞子虫の検出結果を示す電気泳動
写真である。
【図３】４種のプライマーペアからなる混合プライマー
を用いた場合における、各種微胞子虫の検出結果を示す
電気泳動写真である。
を用いた場合における、各種微胞子虫の検出結果を示す
電気泳動写真である。
【図４】各種微胞子虫を感染させたカイコガから取得し
たＤＮＡ試料からの微胞子虫の検出結果を示す電気泳動
写真である。
たＤＮＡ試料からの微胞子虫の検出結果を示す電気泳動
写真である。
【図５】微胞子虫以外の生物（ボーベリア・バシアナ及
びバチルス・チューリンゲンシス）から取得したＤＮＡ
試料を鋳型とし、微胞子虫検出用混合プライマーを用い
るＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
びバチルス・チューリンゲンシス）から取得したＤＮＡ
試料を鋳型とし、微胞子虫検出用混合プライマーを用い
るＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図６】２種類の微胞子虫を同時感染させたカイコガか
ら取得したＤＮＡ試料からの、微胞子虫の検出結果を示
す電気泳動写真である。
ら取得したＤＮＡ試料からの、微胞子虫の検出結果を示
す電気泳動写真である。
フロントページの続き
(72)発明者 米村 真之
茨城県つくば市吾妻２−３−２−708−
607
(56)参考文献 特開 平８−252099（ＪＰ，Ａ)
日本蚕糸学雑誌，Ｖｏｌ．66，Ｎｏ.
４（1997），ｐ．242−252
Ａｄｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉ
ｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．94ｔｈ（1994），ｐ.
529
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/00 - 1/70
ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (8)
- 【請求項１】 被検動物体内に存在する核酸を鋳型と
し、検出しようとする複数種の微胞子虫それぞれのゲノ
ムＤＮＡの部分領域を増幅し得る少なくとも２種のプラ
イマーペアを含む混合プライマーを用いて増幅処理を行
うことを含む、該被検動物体内の該複数種の微胞子虫を
同時に検出し得る方法であって、該混合プライマーが、
下記(i)〜(iv): （i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、 （ii）配列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号４で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、 （iii）配列番号５で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号６で表わされる塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、並びに （iv）配列番号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号８で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、からなる
群より選択される少なくとも２種のプライマーペアを含
む、前記方法。 - 【請求項２】 検出しようとする前記複数種の微胞子虫
が、ノセマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バ
イリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス
及びプレイストフォラsp. PSDからなる群より選択され
る少なくとも２種の微胞子虫である請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 検出しようとする前記複数種の微胞子虫
が、ノセマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バ
イリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス
及びプレイストフォラsp. PSDである請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】 被検動物体内に存在する核酸を鋳型と
し、配列番号１〜８で表わされる塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを含む混合プライマーを用いて増幅処理
を行うことを含む、該被検動物体内の該複数種の微胞子
虫を同時に検出し得る方法。 - 【請求項５】 前記被検動物が昆虫である請求項１記載
の方法。 - 【請求項６】 昆虫がカイコガ（Bombix mori）である
請求項５記載の方法 。 - 【請求項７】 （i）配列番号１で表わされる塩基配列
を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマー
ペア、（ii）配列番号３で表わされる塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチド及び配列番号４で表わされる塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
（iii）配列番号５で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号６で表わされる塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、並びに
（iv）配列番号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチド及び配列番号８で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドからなるプライマーペアからなる群
より選択される少なくとも２種のプライマーペアを含
む、微胞子虫検出用プライマーセット。 - 【請求項８】 配列番号１〜８で表わされる塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドを含む請求項７記載の微胞子虫
検出用プライマーセット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000049760A JP3449961B2 (ja) | 2000-02-25 | 2000-02-25 | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000049760A JP3449961B2 (ja) | 2000-02-25 | 2000-02-25 | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001231575A JP2001231575A (ja) | 2001-08-28 |
| JP3449961B2 true JP3449961B2 (ja) | 2003-09-22 |
Family
ID=18571646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000049760A Expired - Lifetime JP3449961B2 (ja) | 2000-02-25 | 2000-02-25 | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3449961B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498509A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-04-08 | 华南农业大学 | Hmg1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用 |
| CN105671144A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-06-15 | 华南农业大学 | 适用于家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及快速检测方法 |
| WO2016115903A1 (zh) * | 2015-01-21 | 2016-07-28 | 华南农业大学 | 家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其应用 |
| CN107245492A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-10-13 | 华南农业大学 | 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2539449B9 (en) * | 2010-02-26 | 2018-09-05 | Qiagen GmbH | Process for parallel isolation and/or purification of rna and dna |
| CN104017890B (zh) * | 2014-06-20 | 2016-06-15 | 华南农业大学 | Eb1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用 |
| CN107400719B (zh) * | 2017-09-07 | 2021-02-12 | 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 | 一组柞蚕微孢子虫检测引物及其应用 |
-
2000
- 2000-02-25 JP JP2000049760A patent/JP3449961B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｄｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９４ｔｈ（１９９４），ｐ．５２９ |
| 日本蚕糸学雑誌，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．４（１９９７），ｐ．２４２−２５２ |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498509A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-04-08 | 华南农业大学 | Hmg1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用 |
| CN104498509B (zh) * | 2014-12-11 | 2017-04-12 | 华南农业大学 | Hmg1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用 |
| WO2016115903A1 (zh) * | 2015-01-21 | 2016-07-28 | 华南农业大学 | 家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其应用 |
| CN105671144A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-06-15 | 华南农业大学 | 适用于家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及快速检测方法 |
| CN107245492A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-10-13 | 华南农业大学 | 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 |
| CN107245492B (zh) * | 2017-05-02 | 2019-10-22 | 华南农业大学 | 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001231575A (ja) | 2001-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8785130B2 (en) | Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material | |
| JP2010521156A (ja) | Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 | |
| CN102066573A (zh) | 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 | |
| JP2013528049A (ja) | 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物 | |
| KR20070103417A (ko) | 핵산의 추출 및 확인방법 | |
| KR102338861B1 (ko) | RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 | |
| Mota et al. | Recombinase polymerase amplification in the molecular diagnosis of microbiological targets and its applications | |
| WO2017123921A1 (en) | Multiple stage isothermal enzymatic amplification | |
| KR20070090230A (ko) | 시토신의 화학적 변형에 의한 미생물 핵산의 단순화 방법 | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| JP3449961B2 (ja) | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 | |
| EP2753629B1 (en) | Methods for detecting lyme disease | |
| Esvaran et al. | Targeting essential genes of Nosema for the diagnosis of pebrine disease in silkworms | |
| JP2022546443A (ja) | ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含む、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅および検出のための組成物および方法 | |
| Galetto et al. | Real-time PCR diagnosis and quantification of phytoplasmas | |
| JP2023184756A (ja) | Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓを標的とするためのシステムおよび方法 | |
| KR101912488B1 (ko) | 분자 검출 분석법 | |
| US20230332216A1 (en) | Methods and reagents for rapid detection of pathogens in biological samples | |
| JP5315519B2 (ja) | コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法 | |
| KR101395938B1 (ko) | 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법 | |
| KR102076341B1 (ko) | Lamp를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| CN111004855A (zh) | 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒 | |
| CN106939356B (zh) | 一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| RU2822037C1 (ru) | Способ дифференциации генома вакцинного штамма "ВНИИЗЖ" от полевых изолятов вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков температур плавления ампликонов и применением асимметричного красителя SYBR Green | |
| JP3103882B2 (ja) | バベシア・オバタに特異的な塩基配列とそれを利用したバベシア・オバタの検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3449961 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080711 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090711 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100711 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110711 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110711 Year of fee payment: 8 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110711 Year of fee payment: 8 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110711 Year of fee payment: 8 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |