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JP3428027B2 - コルヒチノイド化合物を対応する３―グリコシル誘導体類にバイオトランスフォーメーションする方法 - Google Patents

コルヒチノイド化合物を対応する３―グリコシル誘導体類にバイオトランスフォーメーションする方法

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JP3428027B2
JP3428027B2 JP51715598A JP51715598A JP3428027B2 JP 3428027 B2 JP3428027 B2 JP 3428027B2 JP 51715598 A JP51715598 A JP 51715598A JP 51715598 A JP51715598 A JP 51715598A JP 3428027 B2 JP3428027 B2 JP 3428027B2
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culture
colchicine
biotransformation
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compounds
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Indena SpA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/248—Colchicine radicals, e.g. colchicosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • C12R2001/11—Bacillus megaterium

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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、選択した微生物菌により行う、コルヒチノ
イド化合物を対応の３−Ｏ−グリコシル誘導体類にする
バイオトランスフォーメーション（生物変換）に関す
る。本発明の方法は、コルヒチン、チオコルヒチン又は
それらの誘導体から出発して、もっぱら芳香族環ＡのＣ
−３でグリコシル化されたコルヒチノイド化合物を、高
収率に高純度で与える。
ベンゼン環のＣ−３でグリコシル化されたコルヒチノ
イド化合物は、それらの高い有効性のため、又は新しい
医薬の調製において、薬理学的に非常に重要である。
特に、チオコルヒコシド（３−Ｏ−グリコシルチオコ
ルヒチン）は、製薬分野、主に筋−骨格系の病気の治療
において、そして新規な抗腫瘍、免疫抑制、抗乾癬、及
び抗炎症薬剤の製造の出発物質として、著しく重要な用
途の活性成分である。
化学的反応又はバイオトランスフォーメーションのい
ずれかの手段によって、過去に数多くの努力が３−グリ
コシルコルヒチノイド化合物の製造のためになされてき
た。
化学的経路は、複雑で非特異的な反応の連続からな
り、それはグリコシル化された誘導体類の混合物を導
き、その誘導体のいくつかは不活性である。したがっ
て、その芳香族環のＣ−３で特異的にグリコシル化され
た有効な生成物への変換収率は非常に低い。
生物学的なアプローチは、チオコルヒチンを、Centel
la Asiaticaの培養により、芳香族環のＣ−２及びＣ−
３でモノグリコシル化された誘導体類にバイオトランス
フォーメーションすることに実質的に関し；そのような
トランスフォーメーションは、したがって、高選択的で
はなく、ほんのわずかな収率及び生産性を与える（Sole
t,J.M.et al.,Phytochemistry 33,4,817,820,1993）。
コルヒチノイド化合物をバイオトランスフォームする
ことについてのほかの努力は、芳香族環に結合したメト
キシ基（Ｃ−２及びＣ−３で）の単純な脱メチル化のみ
を与え、どちらにしても、制限された収率及び生産性、
並びに低い位置選択性（regioselectivity）により必ず
特徴づけられていた。
こうして、Streptomyces griseus及び／又はStreptom
yces spectabilisを用いるHufford C.D.ら（J.Pharm.S
c.,68,10,1239−1242,1959）、並びに異なる系統のStre
ptomyces及びほかの種類の細菌や真菌を用いるBellet
P.ら（GB−923421,1959）は、コルヒチン及びその誘導
体類を対応する３−脱メチル化誘導体類にトランスフォ
ームすることを試みた。これらの既知の方法の結果は、
係わっている微生物酵素の非選択性（例えばアルカロイ
ド分子のＣ−２、Ｃ−３又はＣ−10における）との関連
において、先に記載したことを確認している。更に、前
記の触媒系の生産性レベルはどちらかといえば低く、そ
れは変換収率の低さ、減少した使用可能な基質濃度、そ
して頻繁なトロポロン環の分解に起因している。
更に最近では、Poulev et al.（J.Ferment.Bioeng.7
9,1,33−38,1995）が、細菌微生物の特異的なバイオト
ランスフォーメーションを得ているが、まだどちらかと
いえば低い収率及び生産性である。
上記のものと同様な微生物（Streptomyces、Bacillus
など）からの酵素活性を、マイタンシノイド類（maytan
sinoids）のようなほかの化合物のバイオトランスフォ
ーメーションに適用している（米国特許第4361650号:Iz
awa,M.,et al.,J.Antibiotics,34,12,1587−1590,198
1）。この場合、その触媒反応はもっぱら脱メチル化か
らなり、低い変換収率及び低い生産性により特徴づけら
れる。
Bacillus megateriumからのα−アミラーゼのグリコ
シルトランスフェラーゼの活性が、記載されており（Br
umm,P.J.,et al.,Starch,43,8,319−323,1991）；転移
酵素反応の受容体特異性は（グルコース又はグリコシド
類に限定的）、特に高い。同一の微生物源により製造さ
れたシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラー
ゼは、デンプンから出発するルブソシド（rubusoside）
（13−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル−ステビオール（stevio
l） β−Ｄ−グルコシルエステル）のα−1,4−トラン
スグルコシル化を促進する。このバイオコンバージョン
においては、また、転移酵素反応の受容体は基質グルコ
シド画分である（Darise,M.,et al.,Agric.Bioel.Che
m.,48,10,2483−2488,1984）。シクロデキストリン−グ
リコシルトランスフェラーゼは、デンプンからのシクロ
デキストリン類G6、G7及びG8の製造に以前は用いられて
いた（Kitahata,S.,Okada,S.,Agric.Biol.Chem.,38,12,
2413−2417,1974）。
これらの例は、Bacillus megateriumにより発現され
るグリコシルトランスフェラーゼ活性の基質特異性の高
さを裏付けており、それはグルコシド受容体類のみを伴
い、したがって、コルヒチノイドのような、異なる複雑
な分子構造を有する二次代謝物とのいかなる反応も伴わ
ない。事実、コルヒチノイド類を３−グリコシル誘導体
類に酵素変換する前記の微生物の用途の例は全く知られ
ていない。
高濃度コルヒチン及びチオコルヒチンの存在下で増殖
できるBacillus megaterium菌株は、コルヒチノイド基
質をもっぱら芳香族環のＣ−３でグリコシル化された誘
導体類にする、顕著に高く、かつ非常に特異的なバイオ
トランスフォーメーション活性を有することが今見い出
された。そのようなバイオトランスフォーメーションは
非常に短い時間で起こり、驚くほど高い収率により特徴
づけられている。
したがって、本発明は、式（Ｉ）： （式中、R1は、Ｏ−グリコシド基であり、R2は、水素又
はC1−C7アシルであり、R3は、C1−C6アルコキシ又はC1
−C6チオアルキルである） で示される３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド化合物の
製造方法であって、Bacillus megateriumによりR1がOH
又はメトキシである化合物のバイオトランスフォーメー
ションを含む方法に関する。
Bacillus megateriumは、細胞直径1.0μｍ以上の細菌
を発生するグラム陽性芽胞であり；数多くの培養液にお
いて好気的に増殖し；カタラーゼ陽性；ゼラチンを加水
分解する。
本発明で用いることができるBacillus megaterium菌
株は、増殖試験及び顕微鏡分析により裏付けられたよう
に、充分に増殖し、また、高濃度コルヒチン及び／又は
チオコルヒチン（3g/l以上）で生存し続けることを示し
た。
Bacillus cereusのような同属の種は、基質濃度1.5g/
lで既に増殖困難性を示し（吸光度は、対照の15〜25
％）、それは著しい自己消化が生起する場合に濃度3g/l
で更により顕著になる。Bacillus megateriumの選択培
養液は、対照的に、Bacillus cereusと比較して、より
高い増殖レベルに（２倍から３倍）上記の濃度で到達す
ることができる。
バイオトランスフォーメーションの高い選択性及び高
い有効性は、その収率レベルが80〜100％の範囲であ
り、通常、約90〜95％の範囲であるので、驚くべきこと
であり、普通ではない。
更に、バイオコンバージョンに用いられた微生物は、
発酵工程の繰り返しにおいてさえも、その触媒活性を恒
久的に維持することができ、したがって、半回分（fed
−batch）及び連続法において特異的なバイオコンバー
ジョンを与える。したがって、この方法は、高い生産性
レベル及び高い再現性（reproducibility）レベルを与
える。
顕著な反応位置選択性は、著しく高い生産収率に加え
て、得られる生成物の高い品質及び高い純度を保証し、
つまり、簡単な下流処理により生成物を純度100％で与
える。
更に、重要な利点は、生成物の精製及び回収工程のト
ラブルが減少すること、本方法の経済性、並びに使用す
ることのアフィダビリティ（affidability）、及び安全
性である。
本発明の方法において用いることができる細菌株の選
択のための操作順列は、以下を含んでいる。
Ａ） 高濃度のコルヒチン基質の存在下で増殖すること
ができる、天然源又は採取株から出発するBacillus meg
ateriumの培養液を選択すること。
Ｂ） 特異的な基質上でのバイオコンバージョンアッセ
イの手段により、徐々に増加する濃度で投与して、コル
ヒチンを対応する３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド誘
導体類にするトランスフォーメーション活性を調査し
て、確認するため、Ａ）からの単離物を選択すること。
Ｃ） Ｂ）において選択した菌株の微生物特性試験する
こと（microbiological characterization）。
Ｄ） Ｂ）からの細菌集団をターゲット−特異的に選択
する手段により、バイオトランスフォーメーション収率
を段階的に増加させること。
Ｅ） バイオトランスフォーメーションを最適化するた
め、発酵の臨界パラメーターを研究し、かつ最適化する
こと。
Ｆ） 工業的規模での生産適用（productive applicati
on）のために安定で均一な接種物を保証するため、高生
産性の培養液を保存する方法を研究し、かつ最適化する
こと。
Ｇ） 回分、半回分、及び連続法において発酵器をスケ
ールアップすること。
Ｈ） 下流処理法及び生成物の回収法を行ない、最適化
すること。
特別には、本発明において利用可能な微生物は、菌株
の寄託所（strain depositcenter）から得られた収集培
養液から、又は種々の源の土壌試料から出発し、有機窒
素源（ペプトン類、イースト抽出物類、肉抽出物類、ア
スパラギンなど）、炭素源（グリセリン、デンプン、マ
ルトース、グルコースなど）を含有している別個の寒天
培地においてpH5〜８、好ましくは６〜７での選択的な
回収により選ぶことができる。インキューベーション温
度は20〜45℃、好ましくは28〜40℃の範囲である。
有毒な濃度のコルヒチン系基質の存在下で増殖するト
ランスフォームさせる培養体の性能は、その一部にコル
ヒチン又はチオコルヒチンが0.1〜3g/lの濃度で（微生
物の主要部分の増殖を阻害するため）予め添加されてい
る別個の寒天化基質上での段階希釈及び重複培養の手法
により評価する。
上記の条件下で増殖することができるコロニーを無菌
の状態でとりだし、異なる寒天培地において、それらの
純度及び増殖の均一度（homogeneity）を調査して、確
認する。
培養体を保存するために用いた培養基は、典型的な微
生物基質であり、有機窒素源（ペプトン類、イースト抽
出物類、トリプトン、肉抽出物類など）、炭素源１種
（グルコース、マルトース、グリセリンなど）を含有
し、pH5〜８、好ましくは６〜７である。インキューベ
ーション濃度は20〜45℃、好ましくは28〜40℃の範囲で
ある。
選択した微生物を、その後、深部培養における増殖
能、コルヒチノイド化合物の存在下での増殖能、及び後
者を対応する３−グリコシル誘導体類にトランスフォー
ムする性能について分析する。
前記の分析を、異なる培地処方を含有し、１種以上の
有機窒素源（イースト抽出物類、ペプトン類、トリプト
ン、カゼイン水解物類、肉抽出物、コーンスチープリカ
ーなど）、１種以上の炭素源（グルコース、グリセリ
ン、デンプン、サッカロースなど）、無機リン源及び無
機窒素源、並びに様々なイオン（K+、Na+、Mg++、C
a++、Fe++、Mn++など）の無機塩を含む液体培地20mlを
含有する100ml容のフラスコ内で行った。
培養試料は、場合により、慣用の突然変異誘発手法
（UV線での放射など）の手段により突然変異誘発処理に
付して、上記と同一の手法で評価することができる特異
なバイオコンバージョン活性を有する突然変異体を誘発
することができる。
それぞれのバイオコンバージョンアッセイからの培養
試料は、３−グリコシル誘導体類の生成を評価するため
に、TLC及びHPLCのようなクロマトグラフィーの手段に
より分析した。
選択した微生物のコルヒチン基質を対応する３−グリ
コシル誘導体類にトランスフォームする能力を、選択操
作で用いたのと同一の培養ブロスでのフラスコ内バイオ
コンバージョンアッセイの手段により、300ml規模（sca
le）において確認した。
陽性の応答を与えた微生物を、300ml規模での異なる
培養ブロス中のバイオコンバージョンの最適化試験に用
いた。研究した主要な培養及び発酵パラメーターは、有
機窒素源、炭素源、無機塩（mineral salt）、温度、撹
拌−通気、pH、インキュベーション時間、接種物比、継
代手段、トランスフォームされる基質の添加時間であ
る。
本発明のバイオトランスフォーメーションを行うこと
が可能な選択した細菌微生物は、１種以上の有機窒素
源、好ましくはイースト抽出物、肉抽出物、ペプトン、
トリプトン、カゼイン水解物類、トウモロコシ精製リキ
ュールなどを含有する固体及び液体培養基質の両方に増
殖することができる。増殖及びバイオトランスフォーメ
ーションに有用な炭素源数種は、グルコース、フルクト
ース、サッカロース、コーンスチープリカーなどであ
り、好ましくはグルコース、フルクトース及びグリセリ
ンである。培養基は、更に、無機リン源及びK+、Na+、M
g++、NH4 +の塩を含有する。
選択した微生物を、温度20〜45℃、好ましくは28〜40
℃で、pH5〜８、好ましくは６〜７で増殖させることが
できる。同一の条件下で、考慮した微生物はコルヒチノ
イド化合物を対応する３−グリコシル誘導体類にトラン
スフォームすることができる。前記のトランスフォーメ
ーションは、回転する振動基でのインキュベーションさ
れたフラスコ内に150〜250rpmで撹拌しながら深部培養
中に起こる。
バイオトランスフォーメーションに関する微生物の増
殖に関する特殊なカイネティックスのため、バイオトラ
ンスフォーメーション目的用の最適な条件は、増殖に最
適なものと同一条件である。したがって、上記の有機及
び無機成分をベースとしたもののような、良好な微生物
増殖を促進するのに有用な培養基は、また、関係基質の
バイオトランスフォーメーションの良好な活性にも有用
である。後者を、始まりの発酵操作において培地に添加
する。
本発明のバイオトランスフォーメーションは、酵素コ
ンバージョンに基づいており、それは指数的増殖期（gr
owth exponential phase）の間に始まり、その増殖と平
行プログレッションを続け:3−グリコシル誘導体類への
変換の最大レベルは（非常に高い:95〜100％まで）最初
の24〜30時間以内に到達される。バイオトランスフォー
メーションの位置選択性は絶対的であり:2−グリコシル
誘導体類の存在は全く裏付けられていない。得られる生
成物は、もっぱら細胞外である。
本発明のバイオトランスフォーメーションは、特に培
養基、温度及び工程時間に関する限り、培地条件を変化
させずに、発酵器レベルまでスケールアップすることが
できる。良好な増殖を得るためには、適切な撹拌−通気
レベルが重要であり、特に毎分培地1L当たり空気１〜2L
（vvm）の通気レベル、好ましくは1.5〜2vvmが必要であ
る。
バイオコンバージョンから得られる生成物を遠心分離
及び上澄み液の回収によるか、又はマイクロろ過及び透
過液の回収により液体画分からのバイオマスの分離の後
に、培養ブロスから抽出する。生成物の最適な回収のた
めに、培養液をアルコール処理してもよい。
バイオトランスフォーメーション生成物の精製及び回
収は、吸着樹脂での分離、及びアルコール類、好ましく
はメタノールでの溶離にクロマトグラム手法を用いて行
ってもよい。生成物を含有しているメタノール水性溶液
を、更に、親油性有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで
の抽出により精製することができる。アルコール類及び
有機溶媒類の混合物での更なる処理の後、得られるアル
コール溶液からの結晶化により、生成物を純粋な状態で
得ることができる。
そのバイオトランスフォーメーション方法は、トロポ
ロン基を含有している基質に特異的であり、コルヒチ
ン、チオコルヒチン、３−脱メチルコルヒチン、３−脱
メチルチオコルヒチン、Ｎ−脱アセチルチオコルヒチン
及び他の各種の置換コルヒチン類のような多数のコルヒ
チノイド化合物に適用することができる。
トロポロンを有さないほかの天然化合物は、Bacillus
megateriumによりグリコシル化されない。
グルコールは、グリコシルトランスフェラーゼの活性
低下を起こさないで、フルクトース又はガラクトースの
ようなほかの糖類により置換することができる。
以下の例は、本発明を更に詳細に記載している。
例１ 耕作土壌（agriculture soil）から単離したBacillus
megateriumの培養アリコートを、無菌生理食塩水20ml
に再懸濁し、次いで希釈因子1:10,000,000まで段階希釈
（scalar dilution）に付す。様々な希釈度の懸濁液
を、LB−寒天培地に、及び順にコルヒチン又はチオコル
ヒチンを添加したLB−寒天に、最終濃度2g/l（表を参
照）まで載せる。培養体を＋28℃で暗所内に３日間イン
キュベーションする。コルヒチノイドを添加した選択培
地上に増殖したコロニーを単離し、非選択培地上に載せ
る手段により精製する；前記の試料を上記のようにイン
キュベーションするが、より短時間（24時間）である。
続けて、培養体を試験管内の同一の寒天培地に移動し、
次いで上記のように24時間インキュベーションする。
上記のように選択した培養のアリコートは、最終濃度
0.4mg/mlまでコルヒチン又はチオコルヒチンを添加した
培基ST（表）20mlを含有する100ml容エーレンマイヤー
フラスコを接種するのに用いる。前記の培養を、200rpm
のロータリーシェーカー上、28℃で一晩インキュベーシ
ョンする。
コルヒチン基質のトランスフォーメーションは、アセ
トン：酢酸エチル：水＝5:4:1溶離システムでシリカゲ
ルでのTLCによる、３〜４時間毎にとる培養ブロスのア
リコート分析により検査する。
４日間のインキュベーション後、３−グリコシル誘導
体に対して確固とした触媒活性を示した培養類のアリコ
ートを、試験管内に新規な接種物の調製のために、上記
のスカラ希釈の手法によりプレート上に回収する。顕著
により高いコルヒチン及びチオコルヒチン最終濃度（1m
g/ml）を用いる以外は、上記と同一の条件で、フラスコ
内のバイオトランスフォーメーションアッセイを繰り返
す。最も活性な単一の培地を（基質変換率は、80％、又
はそれ以上）、例３に記載したように凍結氷管（cryotu
be）内での接種の準備のために用いる。
表 培養基の処方 １） LB−寒天（滅菌:121℃×20'）−pH7 トリプトン 10g/l イースト抽出物 5g/l NaCl 10g/l 寒天−寒天 15g/l ２） ブロスST（滅菌:121℃×20'）−pH7 グルコース 20g/l グリセリン 10g/l ペプトン 15g/l イースト抽出物 5g/l NaCl 3g/l NH4Cl 3g/l K2HPO4 8g/l KH2PO4 3g/l MgSO4・7H2O 0.5g/l 例２ 例１に記載の手順を繰り返し、Bacillus megaterium
培養体から出発して、下記の収集菌株から誘導する〔De
utsche Sammlung von Mikroorganismen,Braunschweig,G
ermany（ドイツ国ブラウンシュバイグ、ドイツ微生物寄
託所）〕:DSM90、509、322、333、1667、1670、1671。
DSM 90 DSM 509 DSM 322 DSM 333 DSM 1667 DSM 1670 DSM 1671 例１のように選択され、チオコルヒチン（1mg/ml）を
添加した培地を、液体培養中に４日間インキュベーショ
ンする：そのTLC分析は、50％（株DSM1671）〜70％（株
DSM90）、80％まで及びそれ以上（株DSM333、DSM509、D
SM1667、DSM1670）に広がる変換収率で基質のチオコル
ヒコシドへのトランスフォーメーションが起こったこと
を検出する。
例３ 上記の例に記載したように選択した試験管内の培養試
料のアリコートを、ブロスST20mlを含有する100ml容エ
ーレンマイヤーフラスコを接種するのに用いる。
その培養ブロスを、200rpmのロータリーシェーカー
上、＋30℃で一晩インキュベーションする。インキュベ
ーションの後、培養液にグリセリド無菌溶液を、最終濃
度20％まで添加する。培養液を、その後、2ml容氷管に
分配し、次いで直ちに液体窒素に浸す。
数日後、培養液の10％を37℃で急速に解かす。それぞ
れの氷管のアリコートは、続けて＋28℃、200rpmで一晩
インキュベーションしてある培地ST（前培養）の20mlを
含有している100ml容エーレンマイヤーフラスコを接種
するのに用いる。インキュベーション後に、それぞれの
前培養2mlを、新鮮な培地ST20mlに無菌で移動させ、今
回はコルヒチン又はチオコルヒチンを最終濃度1g/lまで
添加する。バイオトランスフォーメーションを、例１に
記載した条件で、行ない、かつ検査した。分析は、基質
の３−グリコシル誘導体へのトランスフォーメーション
は上記に記載した定量的な形態で起こる（80％及びそれ
以上）ことを確認し、そうして凍結培養液の触媒安定性
を証明している。
融かした直後にLB寒天に置かれた培養ブロスの平行対
照は、凍結培養液のバイアビリティ、均一性及び純度を
確認する。
例４ 氷管内の培養のアリコートを、融かした後、培地ST
（前培養）50mlを含有している300ml容エーレンマイヤ
ーフラスコを接種するのに用いる。30℃、250rpmで一晩
インキュベーションした後、コルヒチンを最終濃度1g/l
まで添加された同一の培地50mlに前培養5mlを移動させ
る。培養液を上記と同一の条件下、２日間インキュベー
ションする。４時間毎に、試料は増殖レベル（600nmで
の吸光度を測定する）、コルヒコシド生成（TLC及びHPL
C）、無菌性（LB寒天上）を評価するため、そして顕微
鏡形態調査用にとる。
HPLC分析用に、培養ブロス1ml画分に、メタノール9ml
を添加し、13,000rpmで２分間遠心分離する。コルヒコ
シド上澄み液中の成分を、水：アセトニトリル80:20系
の溶離剤の手法によるイソクラクティック溶離で逆相HP
LCにより分析する。
そのHPLC分析は、コルヒチンのコルヒコシドへの変換
の進行は成長のそれに平行であることを証明する。約26
時間のインキュベーション後に、バイオコンバージョン
は完了する。
コルヒコシドの最終収率は、80〜85％の範囲である。
例５ 培養液にコルヒチンの代わりに、チオコルヒチンを同
一の最終濃度（1g/l）で添加した以外は、例４に記載し
た手法を繰り返す。
その培養体の増殖及び生成応答は、コルヒチンで得ら
れたものに類似しており、チオコルヒコシド収率は約90
％である。
例６ 培養体にコルヒチンの代わりに、３−脱メチルチオコ
ルヒチンを同一の最終濃度（1g/l）で添加する以外は、
例４に記載した手法を繰り返す。その培養体の増殖及び
生成応答は、コルヒチンで得られたものに類似してお
り、チオコルヒコシド収率は約90％である。
例７ 培養体にコルヒチンの代わりに、Ｎ−ホルミルチオコ
ルヒチンを同一の最終濃度（1g/l）で添加する以外は、
例４に記載した手法を繰り返す。その培養体の増殖及び
生成応答は、コルヒチンで得られたものに類似してお
り、チオコルヒコシド収率は約90％である。
例８ エーレンマイヤーフラスコ内のSTブロス1Lを、細胞株
DSM1670の氷管培養で接種する。そのフラスコを＋30
℃、250rpmで一晩インキュベーションする。接種物を、
最終濃度1g/lまでチオコルヒチンを添加した無菌ブロス
ST9Lを含有する14L容の発酵槽に無菌状態で移動させ
る。適切な撹拌−通気レベル（撹拌900rpmまで、通気１
〜1.5vvm、培養体の増殖に依存して）を保持しながら、
発酵を行う。２時間毎に、試料を培養ブロスからとり、
下記の分析に付す： −600nmでの光学的密度（OD）； −LB寒天上の細菌株の無菌度及び純度分析； −顕微鏡形態学（グラム染色）； −TLC及びHPLCによるチオコルヒコシド含量分析。
28時間の発酵後、チオコルヒコシドへのトランスフォ
ーメーションはほぼ終了している。最終収率は約90％で
ある。
例９ 28時間の発酵後、培養ブロス90％のみを回収して、生
成物（画分１）を抽出する以外は、例８に記載した手法
を繰り返す。残る10％を、チオコルヒチン10gを含有す
る新鮮な無菌培地ST9Lを有する発酵槽中に無菌で添加す
る。例８に記載したように、発酵を行う。26時間後、培
養ブロス9Lを回収し、抽出する（画分２）。残る容積分
の培養ブロスに、チオコルヒチン（10g）を含有する新
鮮な無菌培地STを更に9Lと無菌で添加する。上記のよう
に発酵を行う。26時間後、培養ブロスを完全に回収し、
抽出する（画分３）。その細胞株のバイオトランスフォ
ーメーション活性は、変換収率約90％、かつ単一バッチ
法で得られるものと比較して、ほぼ３倍の全チオコルヒ
コシド生成で、３回の運転中すべてにおいて安定を保っ
た。
例10 発酵（全量：約27L）からの最終培養ブロスを、0.22
μｍセラミックカートリッジでの向流式マイクロろ過
（cross−flow microfiltration）に付して、ブロスか
ら細胞を分離する。浸透液を、三菱吸収樹脂、HP21で充
填したカラムで吸収する。水洗の後、生成物をメタノー
ルで溶離する。メタノール溶離液を真空下に蒸発乾固
し、その後、メタノールに再溶解する。塩化メチレンで
の抽出を繰り返した後、そのアルコール画分を濃縮乾固
し、次いでエタノール−塩化メチレン、1:1混合物中に
再溶解する。シリカゲルでの精製（clarification）
後、その溶液を真空下に濃縮し；塩化メチレンを、その
後、エタノール置換する。得られる懸濁液を濃縮し、放
置して結晶化させる。エタノール−クロロホルム混合物
中の固体の更なる再溶解操作及びシリカゲルでの精製の
後、エタノールでの２回目の結晶化を行う。
得られる生成物は、HPLC、Ｃ−NMR、Ｈ−NMR及び質量
スペクトルにより分析して、チオコルヒコシドの標準物
と同一であることが分かった。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式（Ｉ）： （式中、R1は、Ｏ−グルコシド基、Ｏ−フルクトシド基
    又はＯ−ガラクトシド基であり、R2は、水素又はC1−C7
    アシルであり、R3は、C1−C6アルコキシ又はC1−C6チオ
    アルキルである） で示される３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド化合物の
    製造方法であって、 R1がOH又はメトキシである化合物を添加した培地で、バ
    シラスメガテリウム（Bacillus megaterium）を培養す
    ることを含む方法。
  2. 【請求項２】３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド化合物
    が、R1がＯ−グルコシド基である化合物（Ｉ）である請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド化合物
    が３−Ｏ−グルコシルコルヒコシド又はチオコルヒコシ
    ドである請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】培養を、深部培養において、pH6〜７、温
    度28〜40℃で、グルコース、フルクトース、又はグリセ
    リンを炭素源として含む培地を用いて行う、請求項１〜
    ３のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】用いる培地が、R1がヒドロキシ又はメトキ
    シである化合物（Ｉ）を0.1〜3g/l含有する、請求項１
    〜４のいずれか１項記載の方法。
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