JP3427984B2

JP3427984B2 - 新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素およびその用途

Info

Publication number: JP3427984B2
Application number: JP07314392A
Authority: JP
Inventors: 正宏中尾; 亨中山; 雅己原田; 裕次柴野
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1992-02-25
Filing date: 1992-02-25
Publication date: 2003-07-22
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: JPH05227955A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シュクロオリゴ糖の効
率的かつ安定的な大量生産を可能とする、新規な耐熱性
シュクロオリゴ糖生成酵素、その遺伝子、およびその遺
伝子を含有する組換えベクターを用いた該酵素の製造法
ならびに該酵素の利用法に関する。

【０００２】

【従来の技術】スクロースのグルコース部分にグルコー
スがα−１,６結合したテアンデロース（別名イソマル
トシルフラクトシド, Ｇ１６ＧＦ）およびスクロースの
フルクトース部分にグルコースがα−１,６結合したイ
ソメレチトース（ＧＦ６１Ｇ）は、蜂蜜中に含まれる微
量オリゴ糖類であり、蜂蜜の風味と密接な関係があると
考えられている。

【０００３】これらのオリゴ糖は、有用腸内細菌である
ビフィズス菌の増殖を選択的に促進するので、整腸作用
が期待される他、虫歯菌であるストレプトコッカス・ミ
ュータンス菌およびソブリヌス菌の生成するグルコシル
トランスフェラーゼ（不溶性グルカン合成酵素）を阻害
し、これらの虫歯菌による酸生成が弱いため、虫歯予防
作用が期待されている。

【０００４】また、スクロースの構成単糖であるフルク
トースは、高甘味で味質も優れ、グルコシルトランスフ
ェラーゼによる不溶性グルカン合成の基質とならず、テ
アンデロースやイソメレチトースと同様に不溶性グルカ
ン合成を阻害することも知られている。

【０００５】したがって、虫歯発生の原因となるグルコ
ース部分を他のスクロース分子に転移させることによ
り、上述のような好ましい機能を有するテアンデロース
やイソメレチトースを生成させ、その結果得られる糖類
の混合物（シュクロオリゴ糖）は、テアンデロース、イ
ソメレチトース、および転移反応の結果遊離してくるフ
ラクトースを含有する極めて優れた糖製品となる。

【０００６】このシュクロオリゴ糖生成反応は、スクロ
ースをグルコシル供与体ならびに受容体とする、スクロ
ース分子間のグルコシル基転移酵素反応によるのが最も
効率的であり、この目的のために、種々のグルコシル基
転移酵素が用いられてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この酵素反応は、基質
スクロース濃度を上げれば上げるほど効率良く進行する
が、高濃度のスクロース溶液は常温では粘性が高く、撹
拌による反応液の均一性の保持、送液時の流速の低下や
配管の目詰まり等、製造工程上の取扱いに問題点があっ
た。

【０００８】この酵素反応を高温で行えば、これらの問
題点が解決する上に、反応速度の増大による反応工程時
間の短縮化や、製造工程の雑菌汚染防止も可能となると
考えられるが、そのためには耐熱性の高い酵素が必要と
される。また、工業的スケールでこれらの酵素を固定化
して高温で長期間にわたり繰り返し使用しようとすれ
ば、さらに高度な耐熱性を持った酵素が要求される。

【０００９】本発明者等の研究グループは、先にこのよ
うな耐熱性グルコシル基転移酵素を生産する微生物を見
いだし、これらの微生物を用いるスクロース転移ならび
に該スクロース転移糖として、イソマルトシルフラクト
シドおよび／またはイソメレチトースを含有する新規食
品素材に関する特許出願をそれぞれ行なった（特開平４
−３０７８８号、同４−３０７９６号、同４−３０７
７１号）。

【００１０】しかしながら、それらの微生物の該酵素生
産性は低く、しかも培養のたびに活性が変動する不安定
なものであるため、シュクロオリゴ糖の工業的な製造に
は実用的には困難が伴い、該酵素の完全精製までには至
らなかった。

【００１１】そこで本発明者等は、該微生物の酵素生産
性の向上・安定化に鋭意取り組んだが、次の理由で目的
を達成するには至らなかった。すなわち、研究の過程
で、上記出願に関して工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィラスＡ
ＩＫ９０−３０株は、少なくとも２種以上の微生物から
なることを見出したので、それらの微生物を互いに分離
し、シュクロオリゴ糖生成酵素生産菌のみを単離するこ
とを試みた。しかし、本シュクロオリゴ糖生成酵素生
産菌はそれ単独では非常に死滅しやすく、これ以外の微
生物と寄生あるいは共生関係にあるためか、シュクロオ
リゴ糖生成酵素生産菌自体の純粋単離ができなかった。

【００１２】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、該
シュクロオリゴ糖生成酵素の生産性の安定的な向上を目
指し、遺伝子操作の技法によって、共生状態にある微生
物群から該シュクロオリゴ糖生成酵素をコードする遺伝
子のみを単離し、これで大腸菌を形質転換することによ
り、親株に較べて数百倍から２千倍のシュクロオリゴ糖
生成酵素生産能を有する該形質転換体を得、更にシュク
ロオリゴ糖生成酵素自体も明らかにして本発明を完成し
た。

【００１３】すなわち、本発明の第一の目的は、遺伝子
工学の手法を応用することにより大量かつ安定的に得ら
れる、工業的に利用可能なシュクロオリゴ糖生成酵素を
提供するものである。また、本発明の第二の目的は、シ
ュクロオリゴ糖生成酵素をコードする新規な遺伝子、そ
の遺伝子を組み込んだベクターならびに当該酵素を産生
する形質転換体を提供することを目的とするものであ
る。更に、本発明の第三の目的は、前記形質転換体を培
養し、その培養物より当該酵素を抽出、精製するシュク
ロオリゴ糖生成酵素の製造方法を提供するものである。
更にまた、本発明の別の目的は、前記酵素を利用したシ
ュクロオリゴ糖製造法を提供するものである。

【００１４】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素は、耐
熱性グルコシル基転移酵素を生産する微生物、例えばバ
チルスステアロサーモフィラスＡＩＫ９０−３０株よ
り当該酵素をコードする遺伝子を単離し、これを適当な
ベクターに組み込んだ後、これで適当な宿主微生物を形
質転換し、当該微生物の培養液中から分離取得すること
により得られる。上記ＡＩＫ９０−３０株から細菌ＤＮ
Ａを単離するには、例えばサイトウ・ミウラ法（Saito,
H. and Miura, K., Biochem. Biophys. Acta,72巻,619
頁,1963年）等の公知の方法を用いることができる。ま
た、遺伝子ライブラリーの作成は、制限酵素を用いる公
知の方法を用いることができる。

【００１５】こうして得られたＤＮＡ断片は、常法によ
りプラスミドに組み込み、宿主に導入して該形質転換体
を得ることができる。宿主細胞としては、大腸菌（エシ
ェリヒア・コリ、Escherichia coli）やバチルス・ズブ
チリス（Bacillus subtilis）を用いることができ、ベ
クターとしては、大腸菌内で複製できるｐＵＣ１８、ｐ
ＢＲ３２２等、バチルス・ズブチリス内で複製できるｐ
ＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４等の公知のプラス
ミドが使用できる。

【００１６】このようにして得られた形質転換体につい
て、そのα−グルコシダーゼ活性を測定し、高い該酵素
活性を有する菌株を選択すれば、目的とする形質転換体
を得ることができる。なお、得られた形質転換体の一つ
である、大腸菌（pUSU334/W3110）株は、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）ＳＡＭ１９５４と命名さ
れ、１９９２年２月１４日付で工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄３７４９号（ＦＥＲＭＢＰ−３
７４９）として寄託されている。

【００１７】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素をコー
ドする遺伝子の塩基配列は、α−グルコシダーゼ活性を
示す形質転換体のプラスミドを用いて、常法により決定
できる。また、これらの塩基配列より、該酵素のアミ
ノ酸配列を推定することができる。かくして得られたシ
ュクロオリゴ糖生成酵素をコードする遺伝子の塩基配列
およびこれより推定されるシュクロオリゴ糖生成酵素の
アミノ酸配列は後記の配列表に示す通りである。な
お、本明細書において相同性を有するアミノ酸配列と
は、配列の１部にアミノ酸の置換、欠失、付加等がある
が、機能は元のアミノ酸配列で表されるペプチドと同一
であるものをいう。

【００１８】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素を製造
するには、上記のようにして得られた、シュクロオリゴ
糖生成酵素遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た宿主細胞を適当な炭素源、窒素源および微量の金属元
素を含む培地を用いて培養し、次いで、得られた菌体か
ら公知の方法で菌体成分を抽出し、更に硫安分画法、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー等の通常の蛋白質精製法を用いて精製すれば良い。
また、本酵素は耐熱性であるので、該菌株中で大量に
発現させた後、得られた培養物を熱処理することによ
り、該酵素を含む粗酵素液を容易に大量に調製すること
ができる。

【００１９】かくして得られるシュクロオリゴ糖生成酵
素は次のような物理化学的性質を有していた。（１）作用転移反応： α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ−Ｘ）
１モルとグルコシル基受容体（Ｙ）１モルとから、新た
なα−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ−Ｙ）１モルと
（Ｘ）１モルを生成する。加水分解：１モルのα−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌ
ｃ−Ｘ）を加水分解し、１モルの（Ｘ）と１モルのグル
コースを生成する。（ここでＸ、Ｙはいずれも糖あるい
はアグリコンを示す）（２）基質特異性転移反応： α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ−Ｘ）
とグルコシル基受容体（Ｙ）がいずれもスクロースであ
る場合の転移反応の主生成物が、テアンデロースおよび
／またはイソメレチトースである。加水分解：スクロースおよびｐ−ニトロフェニル−α
−Ｄ−グルコピラノシドを加水分解するが、ｐ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドは加水分解しな
い。（ここでＸ、Ｙは前記と同じ）（３）反応最適ｐＨ：ｐＨ５.０〜６.０反応最適温度：７５℃（ｐＨ６.０）（４）ｐＨ安定性：ｐＨ５.０〜１２.０（５５℃，１
０分間）で安定熱安定性：６５℃（ｐＨ７.２，１０分間）で安定（５）等電点：ｐＩ４.６（等電点電気泳動）（６）分子量：約６５,０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）約２４０,０００（ゲル濾過）

【００２０】上記の本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素
を用いてシュクロオリゴ糖を製造するには、精製酵素を
用いてもよいが、酵素反応に支障がない限り、例えば上
記のようにして得られた粗酵素液や硫安分画、ゲル濾過
クロマトグラフィー等で精製した部分精製酵素を用いる
ことも出来る。また、セファローズ等の不溶性担体に
固定化された酵素を用いることも出来る。

【００２１】シュクロオリゴ糖を製造する酵素反応につ
いては、スクロース濃度は出来る限り高い方が望ましい
が、糖溶液の粘度を勘案すれば、１〜２ｇ／ｍｌ程度が
好ましい。酵素反応は、ｐＨ５.０〜ｐＨ１２.０の範
囲で進行するが、酵素の至適ｐＨを勘案し、ｐＨ５.０
〜６.０の間に保つのが好ましい。また酵素反応は、室
温〜８５℃で進行するが、酵素の安定性および至適温度
を勘案して、反応温度を６５〜７５℃程度に保つのが好
ましい。また、添加酵素量は、スクロース１ｇあたり１
〜１０ＰＮＰ単位（１ＰＮＰ単位とは１分間に１μmol
のｐ−ニトロフェノール（以下ＰＮＰと略す）を遊離す
る酵素力価を示す）とするのが望ましい。酵素は、一
度に添加しても良いが、高速液体クロマトグラフィー等
で反応をモニターしながら、数回に分けて添加すること
も出来る。反応時間は１〜４日間程度で充分である
が、反応をモニターしながら反応終了時点を決定するこ
ともできる。

【００２２】反応終了後、必要に応じて酵素を除去また
は加熱失活させ、反応終了液をイオン交換樹脂カラム、
活性炭等で処理した後、濃縮すれば、所望のシュクロオ
リゴ糖を製造することができる。

【００２３】

【作用】本発明によれば、シュクロオリゴ糖を生成する
耐熱性酵素を大量に安定的に得ることが可能となり、該
酵素を用いたテアンデロースおよび／またはイソメレチ
トースを主成分とするシュクロオリゴ糖の工業的生産を
可能ならしめるものである。

【００２４】

【実施例】次いで、実施例を掲げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約され
るものではない。

【００２５】実施例１バチルスＡＩＫ９０−３０株より、シュクロオリゴ糖生
成酵素（α−グルコシダーゼ）遺伝子の取得：ステップ１：染色体ＤＮＡの単離染色体ＤＮＡの単離は、サイトウおよびミウラ（Saito,
H. and Miura, K., Biochem. Biophys. Acta,72巻,619
頁,1963年）によって報告されている方法を用いた。即
ち、スクロース５％、酵母エキス０.１％、ポリペプト
ン０.５％を含む液体培地（ｐＨ７.０）１.７ｌを用
い、６０℃で振盪培養したバチルスＡＩＫ９０−３０株
の菌体を遠心分離により集め、２５％スクロース溶液に
懸濁した後、ＥＤＴＡおよびリゾチームを加え、３７℃
で３０分間インキュベートし、次いで、プロナーゼＥ
２００μｇ／ｍｌおよびＮａＣｌ０.２Ｍを含む１％Ｓ
ＤＳ溶液を加え、軽く攪拌して３７℃で一晩インキュベ
ートした。

【００２６】次に等量のフェノールを加えゆっくりと攪
拌し、遠心分離を行った後、上層を駒込ピペットで回収
し、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出
を行った。２倍量の冷エタノールを加え、生じたＤＮＡ
の沈殿をガラス棒に巻き取って回収した。得られたＤ
ＮＡを、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、最終濃度がＮａＣｌ２
００ｍＭ、ＲＮａｓｅ１００μｇ／ｍｌとなるように加
え、３７℃で１時間インキュベートした後、上記と同様
にフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
い、得られたＤＮＡ沈澱を上記のトリス−塩酸緩衝液に
溶解し、ＤＮＡ濃度２ｍｇ／ｍｌの標品１ｍｌを調製し
た。

【００２７】ステップ２：ライブラリーの作成このようにして調製したＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分分
解し、０.７％アガロースで電気泳動後、６〜９ｋｂの
ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ断片を回収し
た。この６〜９ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩで完
全消化後アルカリフォスファターゼ（ＣＡＰ）処理した
ベクターｐＵＣ１８とライゲーションし、マンデル・ヒ
ガの方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol.,
53巻, 154頁, 1970年）を用いて大腸菌ＪＭ１０９に形
質転換した。

【００２８】得られた形質転換体は、ｐＵＣ１８中にア
ンピシリン耐性遺伝子を保有しているので、バクトペプ
トン１.６％、バクト−イーストエクストラクト１.０
％、ＮａＣｌ０.５％、ｐＨ７.４、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌ, ０.３ｍＭイソプロピル−１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）および０.０３％５−クロ
ロ−４−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（X-gal）を含む２ｘＹＴ寒天培地上に白いコロニー
として生育する。

【００２９】ステップ３：形質転換体の選択このようにして得た形質転換体の白色コロニーを、同じ
２ｘＹＴ寒天培地にレプリカし、１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７.２）に溶解した２０ｍＭｐ−
ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（PNP-Gl
c）溶液を含む０.７％寒天を重層し、６０℃でインキュ
ベーションした。この方法によれば、シュクロオリゴ糖
生成酵素を発現している形質転換体はＰＮＰ−Ｇｌｃを
分解してｐ−ニトロフェノールを生成するので、培地上
に黄色く発色したコロニーとして分離できる。上記選択
の結果、Ｎｏ. ３１、５１、６４および７１の４株が分
離された。これらの培養菌体の菌体破砕液を６５℃で
１.５時間加熱処理した後、ＰＮＰ−Ｇｌｃ分解活性と
シュクロオリゴ糖合成活性を測定することにより、目的
の酵素遺伝子が発現していることを確認した。

【００３０】ステップ４：サブクローニング陽性クローンＮｏ. ３１、５１、６４および７１株が含
有する組換えプラスミド、各々ｐＵＳＵ３１、ｐＵＳＵ
５１、ｐＵＳＵ６４およびｐＵＳＵ７１について制限酵
素地図を作成した（図１）。制限酵素地図を比較する
ことにより、これら各プラスミドは互いに共通部分を有
する、長さの異なった挿入ＤＮＡ断片をもつことがわか
った。挿入ＤＮＡ断片が最も短いｐＵＳＵ７１につい
て、さらに詳しい制限酵素地図を作成した。この制限
酵素地図をもとに、制限酵素サイトを利用して挿入ＤＮ
Ａ断片の縮小化を行った。ｐＵＳＵ７１中、挿入ＤＮ
Ａ断片の中程にあるＨｉｎｄIIIサイトとマルチクロー
ニングサイトにあるＸｂａＩサイトで切断して得られる
ＤＮＡ断片（約２.９ｋｂ）をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII
／ＸｂａＩサイトに挿入してｐＵＳＵ２６７を得た。ま
た、ｐＵＳＵ７１のマルチクローニングサイトにあるＳ
ｍａＩサイトと挿入ＤＮＡ断片中のＳｍａＩサイトの間
を欠失した約２.３ｋｂのバチルスＡＩＫ９０−３０株
由来挿入ＤＮＡ断片を有するｐＵＳＵ３３４を得た
（図１）。ｐＵＳＵ２６７およびｐＵＳＵ３３４を含
む大腸菌はシュクロオリゴ糖生成酵素の活性を有してい
た。

【００３１】実施例２シュクロオリゴ糖生成酵素（α−グルコシダーゼ）遺伝
子の塩基配列の決定：実施例１で得られたｐＵＳＵ３３
４の２.３ｋｂ挿入ＤＮＡ断片をファージＭ１３に両方
向にクローニングし、２本鎖ＤＮＡ（ＲＦ）をおのおの
調製した。これを「続生化学実験講座、第１巻、遺伝子
研究法II」（東京化学同人１９８６年発行）の２８９〜
３０５頁に記載されている方法により、大腸菌エキソヌ
クレアーゼIII と反応させ、一方向に欠失が導入された
二本鎖ＤＮＡを調製した。このようして得られた二本鎖
ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、一方向に
欠失が挿入されたファージクローンを作成した。

【００３２】各ファージクローンから二本鎖ＤＮＡを調
製して、制限酵素による切断パターンから欠失の程度を
調べ、適当なクローンから一本鎖ファージＤＮＡを調製
した。これら一本鎖ファージＤＮＡを鋳型として、ジデ
オキシ法（Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 74巻, 5463頁, 1977年）によって塩基配列を決
定した。各クローンの塩基配列をつなぎ合わせることに
より、２.３ｋｂＤＮＡ挿入断片（3.1kb）の全塩基配列
を決定した。

【００３３】決定された塩基配列は２３２０塩基からな
り、当該α−グルコシダーゼ遺伝子の全領域を含んでい
る。塩基配列中には３９３〜３９５番目のＴＴＧで始
まり、２１５４〜２１５６番目のＴＧＡで終わる１７６
１塩基対からなる当該α−グルコシダーゼ遺伝子に対応
するオープンリーディングフレームが存在する（配列表
参照）。翻訳開始コドンは通常ＡＴＧであるが、ＴＴ
Ｇで開始される例も知られている。３９３〜３９５番
目のＴＴＧを開始コドンとした理由は、９塩基対前にＡ
ＧＧＡＧＧからなるリボソームバインディングサイトが
存在すること、及び実施例６で示す当該α−グルコシダ
ーゼのＮ末端アミノ酸配列が、２９アミノ酸残基にわた
ってＤＮＡ塩基配列から推定したアミノ酸配列に一致す
ることによる。

【００３４】以上の結果から当該α−グルコシダーゼ遺
伝子は、５８６アミノ酸からなる分子量約６９,０００
のタンパク質をコードしていることが明らかになった。

【００３５】実施例３シュクロオリゴ糖生成酵素（α−グルコシダーゼ）の発
現：実施例２で得られた当該α−グルコシダーゼ遺伝子
を含む大腸菌組換え体中のα−グルコシダーゼ活性を測
定した。活性測定は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７.２）に溶解した１０ｍＭＰＮＰ−Ｇｌｃ溶
液０.６ｍｌに酵素液０.１ｍｌを添加し、５５℃にて反
応させながら分光光度計にて１分間当たりに遊離してく
るＰＮＰ量を４０５ｎｍの吸光度として経時的に測定し
た。なお、酵素活性は上記測定条件下、１分間に１μm
olのＰＮＰを遊離する酵素力価を１ＰＮＰＵｎｉｔと
した。

【００３６】まず、各大腸菌組換え体を、グルコース
０.１％、酵母エキス０.５％、ポリペプトン１％、Ｎ
ａＣｌ０.５％（ｐＨ７.２）よりなる液体培地にて、
３７℃で振盪培養を行った後、その培養液１０ｍｌを２
ｌ容三角フラスコに入れた同上培地４００ｍｌに植菌
し、３７℃で３時間振盪培養した。この時点で、１０
０ｍＭＩＰＴＧ溶液を１ｍｌ添加し、さらに１日間振
盪培養を行った後、集菌して１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７.２）で洗浄した。次に、この洗浄
菌体を適量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７.２）に懸濁し、３分間ガラスビーズにて菌体破砕を
行った後、遠心分離により酵素液を調製した。

【００３７】各種大腸菌組換え体での培養菌体量と酵素
活性について、表１にまとめた。

【００３８】この結果から明らかなように、挿入ＤＮＡ
断片をｐＵＳＵ７１、ｐＵＳＵ２６７、ｐＵＳＵ３３４
と短くすることにより、その酵素生産量は向上した。
また、宿主大腸菌をＪＭ１０９からＷ３１１０とする
ことにより培養液１ｍｌ当たり４.２ＰＮＰＵｎｉｔ
生産され、酵素生産量はＪＭ１０９（ｐＵＳＵ７１）と
比較して約２００倍、親株（バチルス）と比較して約２
０００倍と著しく向上させることに成功した。

【００３９】実施例４形質転換体の生産するシュクロオリゴ糖生成酵素を用い
たシュクロオリゴ糖の製造：ステップ１：形質転換体からの酵素液の調製種培養として、シュクロオリゴ糖生産菌である大腸菌
（ｐＵＳＵ３３４／Ｗ３１１０）をグルコース０.１
％、酵母エキス０.５％、ポリペプトン１％、ＮａＣ
ｌ０.５％よりなる液体培地に植菌した後、３７℃で１
日間振とう培養した。ついで、この培養液１.６ｌを３
０ｌの酵母エキス０.１％、ポリペプトン１％、ＮＨ₄
Ｃｌ０.１％、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １.５２％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０.３％、Ｎａ₂ ＳＯ₄ ０.０１％、ＮａＣｌ０.３％、
ＭｇＣｌ₂ ０.００８％よりなる液体培地を入れた５０
ｌ容ジャーファーメンターに植菌して３７℃で２００ｒ
ｐｍ、０.５ｖｖｍにて１９時間通気撹拌培養を行っ
た。培養終了後、遠心分離により集菌し、脱イオン水
にて洗浄して、湿重量１１８ｇの菌体を得た。

【００４０】得られた菌体を１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液 (ｐＨ７.２) １ｌに懸濁し、低温下ビーズ破
砕にて菌体破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去
し粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を、６０℃
で３０分間熱処理を行い、遠心分離して上清１,５２０
ｍｌを得た。これに硫酸アンモニウム１１.５５ｇを添
加後、３％ポリエチレンイミン溶液を６０.８ｍｌを加
え、室温にて３０分間放置後、遠心分離して上清１,５
６０ｍｌを得た。ついで、これに硫酸アンモニウム４
７４.２４ｇを添加し、沈殿を遠心分離により回収し
た。

【００４１】得られた沈殿物を１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液 (ｐＨ７.２) ８０ｍｌに溶解し、セファデ
ックス（Sephadex）Ｇ−２５を用いたゲル濾過にて脱塩
を行い、活性８１２ＰＮＰＵｎｉｔ／ｍｌの酵素溶
液２２０ｍｌを調製し、−２０℃にて凍結保存した。

【００４２】ステップ２：シュクロオリゴ糖液の調製スクロース１０ｋｇを２０ｍＭ酢酸緩衝液 (ｐＨ５.
５) １０ｌに溶解し、上記酵素液をスクロース１ｇ当
たり２ＰＮＰＵｎｉｔ加え６５℃にて１日間反応さ
せて、糖組成として、テアンデロース７.５％、イソメ
レチトース７％、スクロース７１％、イソマルトー
ス０.７％、フラクトース１０.３％およびグルコー
ス３.５％の糖組成を有するシュクロオリゴ糖液が生
成された。

【００４３】さらに、スクロース１ｇ当たり２ＰＮＰ
Ｕｎｉｔの酵素液を追加し、６５℃にて２日間反応させ
た後、９５℃で１０分間加熱した。こうして調製した
加熱処理反応液１６ｌをカチオン交換樹脂（ダイヤイ
オンＳＫ−１Ｂ；三菱化成株式会社製）０.８ｌ、アニ
オン交換樹脂（ダイヤイオンＷＡ−３０；三菱化成株
式会社製）１.２ｌおよび活性炭（タケコール；武田薬
品株式会社製）１５０ｇにて脱色脱塩を行った。ケイ
ソウ土（ラジオライト＃１００；昭和化学工業株式会
社製）濾過にて活性炭を除去することにより４糖オリゴ
糖５.４％、テアンデロース１３.６％、イソメレチト
ース１２.６％、スクロース３２.８％、イソマルトー
ス３.５％、フラクトース２３.４％およびグルコース
８.７％の糖組成を有するシュクロオリゴ糖液を調製し
た。これを糖濃度７５％（W/W）に濃縮して、シュク
ロオリゴ糖液１２.５ｋｇを取得した。

【００４４】この酵素反応中、下記条件で高速液体クロ
マトグラフィーで反応生成物の分析を行った。カラム：アサヒパックＮＨ２Ｐ−５０（Asahipak NH2
P-50 ; 4.6 mmID ×250 mmL) 溶出溶媒：アセトニトリル−水（70:30）溶出速度：１.０ｍｌ／ｍｉｎ検出手段：示差屈折計(Shodex SE-61)

【００４５】実施例５シュクロオリゴ糖液を生成するシュクロオリゴ糖生成酵
素（α−グルコシダーゼ）の完全精製：実施例４で得ら
れた酵素液を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７.２）にて平衡化したセパビーズＦＰ−ＤＡ１３（三
菱化成株式会社製）カラムクロマトグラフィーに供し、
素通り画分を溶出させた後、塩化ナトリウムにて溶出を
行った。活性画分について硫安分画、透析、膜濃縮を
行った後、高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過
クロマトグラフィー（TSKgel G3000 SW ;東ソー株式会
社製）、イオン交換クロマトグラフィー（DEAE-Toyopea
rl 650S ;東ソー株式会社製）、疎水クロマトグラフィ
ー（Butyl-Toyopearl 650S;東ソー株式会社製）および
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（HCA P-20
05;三井東圧株式会社製）を行い、電気泳動的に単一な
精製酵素標品（比活性２７.６ＰＮＰＵｎｉｔ／Ａ２
８０、総活性４,５７６ＰＮＰＵｎｉｔ）を得た。

【００４６】実施例６シュクロオリゴ糖液を生成するシュクロオリゴ糖生成酵
素（α−グルコシダーゼ）の理化学的諸性質の検討：実
施例５で得られた単一な精製酵素標品について、以下の
ように理化学的諸性質を検討した。

【００４７】（１）分子量Ｐｈａｓｔ−Ｇｅｌ電気泳動装置（ファルマシアＬＫＢ
バイオテクノロジー社製）を用いたＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動法による分子量は、約６５,０００であ
った。また、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷカラム（東
ソー株式会社製）を用いた高速液体ゲルクロマトグラフ
ィーによるゲル濾過では、分子量は約２４０,０００で
あった。

【００４８】（２）等電点Ｐｈａｓｔ−Ｇｅｌ電気泳動装置（ファルマシアＬＫＢ
バイオテクノロジー社製）を用いる等電点電気泳動法に
よる等電点は、ｐＩ４.６であった。

【００４９】（３）至適ｐＨ１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.５〜５.５）
および１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５
〜８.５）に溶解した５０ｍＭスクロース溶液０.９５
ｍｌに酵素液０.０５ｍｌを添加し、５５℃で１０分間
作用させ生成するグルコース量をグルコースオキシダー
ゼ法で測定することにより求め、ｐＨ５.５の場合の活
性を１００として相対的に示した至適ｐＨは、図２に示
す通りｐＨ５〜６付近であった。

【００５０】また、同様の緩衝液に溶解した１０ｍＭ
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド溶液
０.６５ｍｌに酵素液０.０５ｍｌを添加し、５５℃で１
０分間作用させた後、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液０.３
ｍｌを添加して反応を止め遊離したＰＮＰ量を測定する
エンドポイント測定法でも、至適ｐＨは、図３に示す通
りｐＨ５〜６付近であった。

【００５１】（４）ｐＨ安定範囲各種ｐＨの緩衝液中に５５℃で１０分間放置後、直ちに
氷冷しその残存活性を以下に示す初速度法にて測定し
た。図４に示す通りｐＨ５.０〜１２.０の範囲におい
て安定であった。なお、緩衝液は酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ３.５〜６.０）、リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５.５〜８.５）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ８.５〜１１.５）を使用した。残存活性は１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）に溶解し
た１０ｍＭｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド溶液０.６ｍｌに酵素液０.１ｍｌを添加し、５
５℃にて反応させながら分光光度計で１分間当たりに遊
離してくるＰＮＰ量を経時的に測定した。

【００５２】（５）至適温度および温度安定範囲至適温度は実施例６（３）のスクロースを用いる測定方
法で検討した。ｐＨ６.０、１０分間の反応条件で活性
は図５に示すように、７５℃で最高となり、至適温度は
７５℃と推定された。また、温度安定範囲は、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）中で酵素を
各種温度で１０分間保った後、氷冷しその残存活性を上
記の方法で測定した。結果は図６に示す通り、６５℃
まで安定であった。

【００５３】（６）各種阻害剤の酵素活性への影響金属イオンおよび化学試薬・糖類の酵素活性への影響
を、実施例６（４）に示した測定系を用いて、０.１ｍ
Ｍ濃度の各種金属イオンおよび１ｍＭ濃度の化学試薬・
糖類を添加して酵素活性を測定した。その結果、表２
に示すように、銅イオン、鉛イオンおよび銀イオンによ
り、相対活性として各々６８％、６７％、および１９％
と活性の低下が認められたが、化合物添加による顕著な
活性化という現象は認められなかった。

【００５４】 * 化合物中の略号は次のものを示す。ＡｃＯ：アセチルオキシ基ＩＡＡ：モノヨード酢酸ＤＴＮＢ：５,５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）ＤＴＴ：ジチオスレイトールＥＤＴＡ：エチレンジアミン４酢酸ＥＧＴＡ：エチレングリコールビス（β−アミノエチ
ルエーテル）４酢酸

【００５５】（７）Ｎ末端アミノ酸配列シュクロオリゴ糖生成酵素のＮ末端アミノ酸配列を島津
製作所社製の気相シーケンサーＰＳＱ−１を用いて、
以下のように決定した。 Ser - Thr - Ala - Leu - Thr - Gln - Thr - Ser - Thr - Asn -Ser - Gln - Gln - Ser - Pro - Ile - Arg - Arg - Ala - Trp -Trp - Lys - Glu - Ala - Val - Val - Tyr - Gln - Ile - このアミノ酸配列は、配列表に示す１〜２９番目のアミ
ノ酸配列と一致した。

【００５６】（８）Ｃ末端アミノ酸シュクロオリゴ糖生成酵素のＣ末端アミノ酸は、ヒドラ
ジン分解法（「生化学実験講座第１巻タンパク質の
化学II」（１９７６年東京化学同人）１８６〜１９３
頁）により、ヒスチジンと決定した。

【００５７】（９）作用および基質特異性シュクロオリゴ糖生成酵素の加水分解活性を、基質とし
てｐ−ニトログリコシド類を使用する場合は、実施例６
（４）に記載の方法に準じ、２糖類を使用する場合は、
実施例６（３）に記載の方法に準じて測定し、測定結果
をｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドの分
解速度を１００％とした時の相対活性として表３に示し
た。

【００５８】

【００５９】表３に示すように、本酵素は、スクロース
（７３.５％）の他に、マルトース（３９.０％）、トレ
ハロース（２５.５％）およびｐ−ニトロフェニル−α
−Ｄ−マルトピラノシド（３.４％）を分解した。

【００６０】

【発明の効果】本発明によれば、シュクロオリゴ糖を生
成する耐熱性酵素を大量に安定的に製造することがで
き、また、当該シュクロオリゴ糖生成酵素を用いること
によりテアンデロースおよび／またはイソメレチトース
を主成分とするシュクロオリゴ糖の工業的製造が可能と
なった。

【配列表】配列番号：１配列の長さ：2320 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直線状配列の種類：Genomic DNA 起源：生物名：バチルスステアロサーモフィラス株名：ＡＩＫ９０−３０株配列の特徴：特徴を表す記号：ＲＢＳ存在位置： 379..384 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置： 396..2153 特徴を決定した方法：Ｅ配列 1 CC CGG GCT GTT CAC GGC GGC CGT ATT CAC GTT TGT CGC GAG CTG GAC 48 CGA GTT TTT CAT GGC GTT GGT GTT TAA CTC GTC GAG TGC GAT GCG AAC 96 CAT CCC GGT CGG GAT TGC ACT GTT CAG CAG CGA ATA CAA CGT GCC ATA 144 CGG GGA CAT CTT CGC CGG TTC CGT GGT CTC CAT CCT GCC CAT TGT CGT 192 GTT GGT CAT CCT GTT CCG CAA GTG GAT TGT CTC TGG CCT CAC GGC GGG 240 CGC GGT GAA AGG CTG ACC GCT GGG CCG CCC CAA GCC GCT TGT CCG TGC 288 GCG GGG ATG AAG CCA GTT TCG CCC GTC CCG CGG CTG TGC ACC GGT GAG 336 CGG CAG ACA AAG ACG CCG ACG ACT GGA AAC AGG TTG AGC AAA AAG GAG 384 GCA TCG ACA TTG TCC ACC GCC TTG ACG CAG ACC TCA ACG AAC TCG CAG 1 Ser Thr Ala Leu Thr Gln Thr Ser Thr Asn Ser Gln 432 CAA TCG CCC ATT CGC CGG GCG TGG TGG AAG GAA GCG GTC GTA TAC CAG 13 Gln Ser Pro Ile Arg Arg Ala Trp Trp Lys Glu Ala Val Val Tyr Gln 480 ATT TAT CCG AGA TCC TTC ATG GAC TCG AAT GGC GAC GGT ATC GGC GAT 29 Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Met Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp 528 TTG CGC GGC ATC CTC TCG AAG CTG GAC TAC CTC AAA CTG CTC GGC GTG 45 Leu Arg Gly Ile Leu Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Val 576 GAT GTG TTG TGG CTG AAT CCC ATC TAC GAC TCG CCG AAT GAC GAC ATG 61 Asp Val Leu Trp Leu Asn Pro Ile Tyr Asp Ser Pro Asn Asp Asp Met 624 GGC TAT GAC ATC CGC GAC TAC TAC AAG ATT ATG GAA GAG TTC GGG ACG 77 Gly Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Tyr Lys Ile Met Glu Glu Phe Gly Thr 672 ATG GAG GAC TTT GAG GAG CTG CTG CGC GAG GTG CAC GCC CGC GGC ATG 93 Met Glu Asp Phe Glu Glu Leu Leu Arg Glu Val His Ala Arg Gly Met 720 AAG CTG GTC ATG GAC CTG GTG GCC AAC CAT ACC TCA GAC GAG CAC CCG 109 Lys Leu Val Met Asp Leu Val Ala Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro 768 TGG TTC ATC GAG TCA CGC TCC TCG CGC GAC AAC CCG TAC CGC GAC TGG 125 Trp Phe Ile Glu Ser Arg Ser Ser Arg Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Trp 816 TAC ATT TGG CGC GAT CCG AAA GAC GGC CGC GAG CCG AAC AAC TGG TTG 141 Tyr Ile Trp Arg Asp Pro Lys Asp Gly Arg Glu Pro Asn Asn Trp Leu 864 TCG TAT TTC AGC GGA TCG GCC TGG GAA TAC GAC GAG CGC ACG GGG CAG 157 Ser Tyr Phe Ser Gly Ser Ala Trp Glu Tyr Asp Glu Arg Thr Gly Gln 912 TAC TAC CTG CAC TTG TTC AGC CGC AGG CAG CCG GAC TTG AAC TGG GAA 173 Tyr Tyr Leu His Leu Phe Ser Arg Arg Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu 960 AAC CCA AAG GTT CGC GAG GCC ATC TTC GAG ATG ATG CGG TTC TGG CTC 189 Asn Pro Lys Val Arg Glu Ala Ile Phe Glu Met Met Arg Phe Trp Leu 1008 GAC AAA GGG ATA GAT GGC TTC CGC ATG GAT GTC ATC AAC GCC ATC GCC 205 Asp Lys Gly Ile Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ile Asn Ala Ile Ala 1056 AAG GCC GAG GGT CTG CCG GAC GCG CCG GCG CGT CCC GGA GAG CGT TAC 221 Lys Ala Glu Gly Leu Pro Asp Ala Pro Ala Arg Pro Gly Glu Arg Tyr 1104 GCT TGG GGC GGC CAG TAC TTT CTC AAT CAG CCG AAG GTC CAC GAG TAC 237 Ala Trp Gly Gly Gln Tyr Phe Leu Asn Gln Pro Lys Val His Glu Tyr 1152 CTG CGC GAG ATG TAT GAT AAG GTG CTC TCT CAT TAC GAC ATC ATG ACC 253 Leu Arg Glu Met Tyr Asp Lys Val Leu Ser His Tyr Asp Ile Met Thr 1200 GTC GGC GAG ACC GGC GGT GTG ACG ACA AAG GAT GCA CTC TTG TTT GCC 269 Val Gly Glu Thr Gly Gly Val Thr Thr Lys Asp Ala Leu Leu Phe Ala 1248 GGT GAA GAC CGG CGC GAG CTG AAC ATG GTC TTC CAG TTT GAA CAC ATG 285 Gly Glu Asp Arg Arg Glu Leu Asn Met Val Phe Gln Phe Glu His Met 1296 GAC ATC GAT GCG ACC GAC GGC GAC AAG TGG CGG CCG CGG CCG TGG CGA 301 Asp Ile Asp Ala Thr Asp Gly Asp Lys Trp Arg Pro Arg Pro Trp Arg 1344 TTG ACC GAG TTG AAA ACC ATC ATG ACG CGG TGG CAA AAT GAT TTG TAC 317 Leu Thr Glu Leu Lys Thr Ile Met Thr Arg Trp Gln Asn Asp Leu Tyr 1392 GGC AAG GCC TGG AAC AGC CTG TAC TGG ACC AAC CAT GAC CAG CCC CGC 333 Gly Lys Ala Trp Asn Ser Leu Tyr Trp Thr Asn His Asp Gln Pro Arg 1440 GCG GTG TCG CGG TTT GGC AAC GAC GGT CCC TAC CGC GTG GAG TCA GCC 349 Ala Val Ser Arg Phe Gly Asn Asp Gly Pro Tyr Arg Val Glu Ser Ala 1488 AAG ATG CTT GCC ACC GTC CTG CAC ATG ATG CAG GGG ACC CCC TAC ATC 365 Lys Met Leu Ala Thr Val Leu His Met Met Gln Gly Thr Pro Tyr Ile 1536 TAC CAG GGC GAG GAA ATC GGC ATG ACG AAC TGT CCG TTT GAC TCT ATT 381 Tyr Gln Gly Glu Glu Ile Gly Met Thr Asn Cys Pro Phe Asp Ser Ile 1584 GAC GAG TAC CGG GAC GTC GAG ATC CAC AAC CTG TGG CGG CAC CGT GTG 397 Asp Glu Tyr Arg Asp Val Glu Ile His Asn Leu Trp Arg His Arg Val 1632 ATG GAA GGC GGC CAG GAC CCT GCC GAG GTG CTG CGC GTC ATC CAG CTC 413 Met Glu Gly Gly Gln Asp Pro Ala Glu Val Leu Arg Val Ile Gln Leu 1680 AAA GGG CGG GAC AAC GCG CGC ACG CCC ATG CAG TGG GAC GAT TCA CCG 429 Lys Gly Arg Asp Asn Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp Asp Ser Pro 1728 AAC GCC GGG TTC ACC ACC GGT ACG CCG TGG ATC AAG GTG AAC CCA AAC 445 Asn Ala Gly Phe Thr Thr Gly Thr Pro Trp Ile Lys Val Asn Pro Asn 1776 TAT CGC GAG ATT AAC GTC AAG CAG GCC CTG GCG GAC CCG AAC TCG ATT 461 Tyr Arg Glu Ile Asn Val Lys Gln Ala Leu Ala Asp Pro Asn Ser Ile 1824 TTC CAT TAC TAC CGC CGC CTG ATT CAG TTG CGC AAA CAG CAT CCC ATC 477 Phe His Tyr Tyr Arg Arg Leu Ile Gln Leu Arg Lys Gln His Pro Ile 1872 GTG GTG TAC GGC AAG TAT GAC CTG ATT CTG CCG GAT CAC GAG GAG ATT 493 Val Val Tyr Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Leu Pro Asp His Glu Glu Ile 1920 TGG GCT TAC ACG CGC ACG CTG GGA GAC GAG CGC TGG CTG ATT GTG GCC 509 Trp Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Gly Asp Glu Arg Trp Leu Ile Val Ala 1968 AAC TTC TTT GGC GGC ACT CCG GAG TTC GAG CTG CCG CCG GAA GTC CGG 525 Asn Phe Phe Gly Gly Thr Pro Glu Phe Glu Leu Pro Pro Glu Val Arg 2016 TGC GAG GGC GCA GAG CTG GTG ATT GCC AAC TAC CCG GTG GAC GAT TCG 541 Cys Glu Gly Ala Glu Leu Val Ile Ala Asn Tyr Pro Val Asp Asp Ser 2064 GAA GCG GGC GGT CCA GCG GCC GCT GGG GCA CCT CAC CGC TTC CGT CTG 557 Glu Ala Gly Gly Pro Ala Ala Ala Gly Ala Pro His Arg Phe Arg Leu 2112 CGC CCG TAC GAA TGC CGC GTC TAC CGG CTG CTC GGC TGG CAC TGA CAG 573 Arg Pro Tyr Glu Cys Arg Val Tyr Arg Leu Leu Gly Trp His 2160 GCG ATT GGG CGG GTG CGC GCA CGG GCC TGC GCA AGA GGG AGG TCG GTA 2208 CGA TGA AGG CGG TCT ACA TTG AGG CCT ATG GTG GCA GGG AAC AGC TCA 2256 AGT ACG GTG ATC TCC CGA AGC CTG AGC TTC GTC CCC GCG ACG TGC TCA 2304 TCG AGG TGC ACG CCG CC

【図面の簡単な説明】

【図１】シュクロオリゴ糖生成酵素遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片が挿入された、各種挿入ＤＮＡ断片の長さ
の異なるプラスミドの制限酵素地図を示す図面。

【図２】スクロースを基質とした場合の本発明のシュ
クロオリゴ糖生成酵素の反応最適ｐＨを示す図面。図
中、○は酢酸ナトリウム緩衝液、●はリン酸ナトリウム
緩衝液を示す。

【図３】ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノ
シドを基質としてエンドポイント法で測定した場合の本
発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の反応最適ｐＨを示す
図面。図中、○および●は図２と同じである。

【図４】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素のｐＨ
安定範囲を示す図面。図中、○は酢酸ナトリウム緩衝
液、●はリン酸ナトリウム緩衝液、□はグリシン−Ｎａ
ＯＨ緩衝液を示す。

【図５】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の反応最
適温度を示す図面。

【図６】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の温度安
定範囲を示す図面。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者柴野裕次大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社基礎研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/10 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の式（I） STATTSTNSSRRAWWKAVVYYRSMDSNGDGGDRGSKDYKGVDVWNYDSNDDMGYDRDYY KMGTMDRVHARGMKVMDVANHTSDHWSRSSRDNYRDWYWRDKDGRNNWSYSGSAWYDRTG YYHSRRDNWNKVRAMMRWDKGDGRMDVNAAKAGDAARGRYAWGGYNKVHYRMYDKVSHYD MTVGTGGVTTKDAAGDRRNMVHMDDATDGDKWRRWRTKTMTRWNDYGKAWNSYWTNHDRA VSRGNDGYRVSAKMATVHMMGTYYGGMTNCDSDYRDVHNWRHRVMGGDAVRVKGRDNART MWDDSNAGTTGTWKVNNYRNVKAADNSHYYRRRKHVVYGKYDDHWAYTRTGDRWVANGGT VRCGAVANYVDDSAGGAAAGAHRRRYCRVYRGWH （I）（式中のアルファベットは、以下のアミノ酸を示す。
Ａ; アラニン、Ｃ; システイン、Ｄ; アスパラギン酸、
Ｅ; グルタミン酸、Ｆ; フェニルアラニン、Ｇ;グリシ
ン、Ｈ; ヒスチジン、Ｉ; イソロイシン、Ｋ; リシン、
Ｌ; ロイシン、Ｍ; メチオニン、Ｎ; アスパラギン、
Ｐ; プロリン、Ｑ; グルタミン、Ｒ; アルギニン、Ｓ;
セリン、Ｔ; スレオニン、Ｖ; バリン、Ｗ; トリプトフ
ァン、Ｙ; チロシン）で表されるアミノ酸配列または当
該配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列で示され、下記の作用
を有する新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素。転移反応：α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ−Ｘ）１
モルとグルコシル基受容体（Ｙ）１モルとから、新たな
α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ−Ｙ）１モルと
（Ｘ）１モルを生成する。加水分解：１モルのα−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ
−Ｘ）を加水分解し、１モルの（Ｘ）と１モルのグルコ
ースを生成する。（ここでＸ、Ｙはいずれも糖あるいは
アグリコンを示す）
【請求項２】下記の理化学的性質を有する請求項１記
載の新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素。（１）基質特異性転移反応：α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｃ−Ｘ）と
グルコシル基受容体（Ｙ）がいずれもスクロースである
場合の転移反応の主生成物が、テアンデロースおよび／
またはイソメレチトースである。加水分解：スクロースおよびｐ−ニトロフェニル−α−
Ｄ−グルコピラノシドを加水分解するが、ｐ−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドは加水分解しない。
（ここでＸ、Ｙはいずれも糖あるいはアグリコンを示
す）（２）反応最適ｐＨ：ｐＨ５.０〜６.０反応最適温度：７５℃（ｐＨ６.０）（３）ｐＨ安定性：ｐＨ５.０〜１２.０（５５℃，１
０分間）で安定熱安定性：６５℃（ｐＨ７.２，１０分間）で安定（４）等電点：ｐＩ４.６（等電点電気泳動）（５）分子量：約６５,０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）約２４０,０００（ゲル濾過）
【請求項３】前記式（I）で表されるアミノ酸配列ま
たは当該配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる請求
項１のポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項４】次の式（II） TCCACCG CCTTGACGCA GACCTCAACG AACTCGCAGC AATCGCCCAT TCGCCGGGCG TGGTGGAAGG AAGCGGTCGT ATACCAGATT TATCCGAGAT CCTTCATGGA CTCGAATGGC GACGGTATCG GCGATTTGCG CGGCATCCTC TCGAAGCTGG ACTACCTCAA ACTGCTCGGC GTGGATGTGT TGTGGCTGAA TCCCATCTAC GACTCGCCGA ATGACGACAT GGGCTATGAC ATCCGCGACT ACTACAAGAT TATGGAAGAG TTCGGGACGA TGGAGGACTT TGAGGAGCTG CTGCGCGAGG TGCACGCCCG CGGCATGAAG CTGGTCATGG ACCTGGTGGC CAACCATACC TCAGACGAGC ACCCGTGGTT CATCGAGTCA CGCTCCTCGC GCGACAACCC GTACCGCGAC TGGTACATTT GGCGCGATCC GAAAGACGGC CGCGAGCCGA ACAACTGGTT GTCGTATTTC AGCGGATCGG CCTGGGAATA CGACGAGCGC ACGGGGCAGT ACTACCTGCA CTTGTTCAGC CGCAGGCAGC CGGACTTGAA CTGGGAAAAC CCAAAGGTTC GCGAGGCCAT CTTCGAGATG ATGCGGTTCT GGCTCGACAA AGGGATAGAT GGCTTCCGCA TGGATGTCAT CAACGCCATC GCCAAGGCCG AGGGTCTGCC GGACGCGCCG GCGCGTCCCG GAGAGCGTTA CGCTTGGGGC GGCCAGTACT TTCTCAATCA GCCGAAGGTC CACGAGTACC TGCGCGAGAT GTATGATAAG GTGCTCTCTC ATTACGACAT CATGACCGTC GGCGAGACCG GCGGTGTGAC GACAAAGGAT GCACTCTTGT TTGCCGGTGA AGACCGGCGC GAGCTGAACA TGGTCTTCCA GTTTGAACAC ATGGACATCG ATGCGACCGA CGGCGACAAG TGGCGGCCGC GGCCGTGGCG ATTGACCGAG TTGAAAACCA TCATGACGCG GTGGCAAAAT GATTTGTACG GCAAGGCCTG GAACAGCCTG TACTGGACCA ACCATGACCA GCCCCGCGCG GTGTCGCGGT TTGGCAACGA CGGTCCCTAC CGCGTGGAGT CAGCCAAGAT GCTTGCCACC GTCCTGCACA TGATGCAGGG GACCCCCTAC ATCTACCAGG GCGAGGAAAT CGGCATGACG AACTGTCCGT TTGACTCTAT TGACGAGTAC CGGGACGTCG AGATCCACAA CCTGTGGCGG CACCGTGTGA TGGAAGGCGG CCAGGACCCT GCCGAGGTGC TGCGCGTCAT CCAGCTCAAA GGGCGGGACA ACGCGCGCAC GCCCATGCAG TGGGACGATT CACCGAACGC CGGGTTCACC ACCGGTACGC CGTGGATCAA GGTGAACCCA AACTATCGCG AGATTAACGT CAAGCAGGCC CTGGCGGACC CGAACTCGAT TTTCCATTAC TACCGCCGCC TGATTCAGTT GCGCAAACAG CATCCCATCG TGGTGTACGG CAAGTATGAC CTGATTCTGC CGGATCACGA GGAGATTTGG GCTTACACGC GCACGCTGGG AGACGAGCGC TGGCTGATTG TGGCCAACTT CTTTGGCGGC ACTCCGGAGT TCGAGCTGCC GCCGGAAGTC CGGTGCGAGG GCGCAGAGCT GGTGATTGCC AACTACCCGG TGGACGATTC GGAAGCGGGC GGTCCAGCGG CCGCTGGGGC ACCTCACCGC TTCCGTCTGC GCCCGTACGA ATGCCGCGTC TACCGGCTGC TCGGCTGGCA C （II）で表される塩基配列からなる請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】請求項３に記載の遺伝子を含有する組換
えベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、該
培養物より耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素を採取する
ことを特徴とする請求項１に記載の新規耐熱性シュクロ
オリゴ糖生成酵素の製造法。
【請求項６】請求項１に記載の新規耐熱性シュクロオ
リゴ糖生成酵素を用いることを特徴とする、テアンデロ
ースおよび／またはイソメレチトースを主成分とするシ
ュクロオリゴ糖の製造法。
【請求項７】スクロース、マルトースおよびトレハロ
ースのいずれも加水分解するα−グルコシダーゼ活性を
有する請求項１に記載の新規耐熱性シュクロオリゴ糖生
成酵素。