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JP3415145B2 - 弱毒化細菌における組換えタンパク質の発現 - Google Patents

弱毒化細菌における組換えタンパク質の発現

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JP3415145B2
JP3415145B2 JP50556392A JP50556392A JP3415145B2 JP 3415145 B2 JP3415145 B2 JP 3415145B2 JP 50556392 A JP50556392 A JP 50556392A JP 50556392 A JP50556392 A JP 50556392A JP 3415145 B2 JP3415145 B2 JP 3415145B2
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bacterium
attenuated
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salmonella
protein
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Wellcome Foundation Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、異種タンパク質を発現することが可能な
弱毒化細菌、それらの調製およびそれらを含有するワク
チンに関する。
サルモネラの強毒株を、イン・ビボにおける生存およ
び増殖に必要な遺伝子に特定の変異を導入することによ
り弱毒化することができる。自己制限的な、臨床学的に
は重要ではない感染を起こす弱毒化変種は、サルモネラ
感染症に対する潜在的な経口生ワクチンであると考える
ことができる。Ty21aは、galEにおける変異および他の
未知の弱毒化領域を有するチフス菌（Salmonella typh
i）の弱毒化変種であり、多くの国で腸チフス経口生ワ
クチンとしての使用が許可されている。
最近では、異なる遺伝子に個別の特定の変異を有す
る、遺伝的に定義されたサルモネラ株が、幾つかの標的
種において実験的な経口ワクチンとして試験されてい
る。例えば、幾つかの芳香族化合物に対する栄養要求を
有するサルモネラ・アロ（Salmonella aro）変異体
が、マウス、ヒツジ、ウシ、ニワトリにおいて有効な経
口ワクチンであることが示されており、さらに最近で
は、それらが自発的に弱毒化し、かつ免疫原性を有する
ことが示されている。サルモネラ・ダブル・アロ変異体
がEP−Ａ−0322237に開示されている。また、サルモネ
ラcya crpダブル変異体も有効な経口ワクチンである。
弱毒化サルモネラは、それら自身の能力としてサルモ
ネラ感染症に対するワクチンであるほかに、経口免疫系
への異種抗原の担体と考えることもできる。これは、サ
ルモネラが、経口経路を介して送達することが可能であ
り、系統的および局所的な細胞性および抗体応答を刺激
することが可能な潜在的な免疫原であるためである。細
菌、ウイルスおよび寄生虫からの異種抗原を、サルモネ
ラワクチンを用いて宿主に送達することができる。
これらの生ワクチンを抗原送達に用いる上において、
潜在的に重大な欠点の１つは、イン・ビボでの外来抗原
発現の安定性に係る問題に関する。細菌における複数回
コピーされたプラスミドからの高レベルの外来タンパク
質の不規則な発現は、通常、細胞からのプラスミドまた
は発現遺伝子の急速な損失を招く結果となる。この問題
は、適当なバイオマスが達成された場合に遺伝子発現の
制御された誘発を可能にする、trpまたはlacのような誘
発可能なプロモーター系を用いて、発酵器内で制御する
ことができる。これらのプロモーターは、予防接種に続
く自己制限的な増殖の期間、宿主組織において細菌が増
殖する場合に、PPまたはIPTGのような外部から適用され
たインデューサーによっては、明らかに誘発され得な
い。
実際、多くの研究者によって、生菌ベクターに関する
予防接種中のイン・ビボでのプラスミドの不安定性が報
告されている（Maskellら、Microb.Path ２、295−30
5、1987;Nakayamaら、Bio/technology ６、693−697、
1988;Titeら、Immunology 70、540−546、1990）。細
菌染色体からの異種抗原を発現させるための組込み系の
使用を含む問題を解決するための多くの試みがなされて
いる（Honeら、Microbiol.Path.５、407−418、1988;St
rugnellら、Gene 88、57−63、1990）。しかしなが
ら、この試みは、発現レベルがしばしば非常に低いため
（Maskellら、1987）、幾つかの抗原に関しての使用に
適するのみである。Nakamuraらは、イン・ビボでの発現
を安定化させるために、発現プラスミドへの必須遺伝子
の連結を用いることを記述している。これは非常に有効
な試みではあるものの、プラスミドを持たない変種の生
成を妨げるのではなく、単純にそれらが生き延びないこ
とを保証するだけである。サルモネラワクチン株におけ
る外来抗原の、より安定ではあるが本質的な高レベルの
発現は、増殖速度を低下させることが可能であり、それ
故、生ワクチンの免疫原性を潜在的に達成する。
この発明によると、異種タンパク質を発現することが
可能な弱毒化細菌が提供される。この異種タンパク質の
発現は、その活性が嫌気性条件によって誘発されるプロ
モーターの制御の下にある。
この異種タンパク質の安定な発現は、イン・ビボでも
得ることができる。したがって、この弱毒化細菌は、ワ
クチンとして用いることができる。例えばグラム陰性菌
のような、適切な細菌のどのようなものも使用すること
ができる。サルモネラのような幾つかのグラム陰性菌
は、真核細胞内に侵入して増殖し、かつ粘膜表面にコロ
ニーを形成する。
したがって、弱毒化細菌は、サルモネラ属、ボルデテ
ラ（Bordetella）属、ビブリオ（Vibrio）属、ヘモフィ
ラス（Haemophilus）属、ナイセリア（Neisseria）属お
よびエルシニア（Yersinia）属から選択することができ
る。代わRIに、弱毒化細菌は、腸管毒素原性大腸菌の弱
毒化株であってもよい。特に、以下の種に言及すること
ができる：チフス菌−ヒト腸チフスの原因；ネズミチフ
ス菌（S.typhimurium）−数種の動物のサルモネラ症の
原因；腸炎菌（S.enteritidis）−ヒトの食中毒の原
因；豚コレラ菌（S.choleraesuis）−豚のサルモネラ症
の原因；百日咳菌（Bordetella pertussis）−百日咳
の原因;Haemophilus influenzae−髄膜炎；淋菌（Neis
seria gonorrhoeae）−淋疾の原因；およびエルシニア
（Yersinia）−食中毒の原因。
細菌の弱毒化は、細菌の芳香族アミノ酸生合成経路の
遺伝子における非復帰変異に起因する可能性がある。芳
香族アミノ酸生合成経路の分岐点化合物であるコリスメ
ートの生合成には、少なくとも10種の遺伝子が関与す
る。これらの地図の幾つかは、aroA（５−エノールピル
ビルシキメート−３−ホスフェート・シンセターゼ）、
aroC（コリスメート・シンセターゼ）、aroD（３−ジヒ
ドロキネート・デヒドラターゼ）およびaroE（シキメー
ト・デヒドロゲナーゼ）のように、細菌ゲノム上で大き
く異なった位置をとる。したがって、変異は、aroA、ar
oC、aroDおよびaroE遺伝子に起こり得る。
しかしながら、好ましくは、弱毒化細菌は、その芳香
族アミノ酸生合成経路の２つの不連続遺伝子の各々に非
復帰変異を有する。そのような細菌は、EP−Ａ−032223
7に開示されている。適切なダブルaro変異体は、aroA
aroC、aroA aroDおよびaroA aroE変異体である。しか
しながら、aroA、aroC、aroDおよびaroE遺伝子の他の組
み合わせに変異を有する他の細菌も有用である。サルモ
ネラ・ダブル・aro変異体、例えばチフス菌またはネズ
ミチフス菌のダブルaro変異体、特にはaroA aroC、aro
A aroDおよびaroA aroE変異体が特に好ましい。
代わりに、弱毒化細菌は、１種以上の他の遺伝子の調
節に関する遺伝子に非復帰変異を有していてもよい（EP
−Ａ−0400958）。変異は、ompR遺伝子または調節に関
与する他の遺伝子に起こることが好ましい。調節に関与
する他の遺伝子は多数存在し、環境の刺激に応答するこ
とが知られている（Ronsonら、Cell 49、579−581）。
このタイプの弱毒化細菌は、第２の遺伝子に第２の変
異を有していてもよい。この第２の遺伝子は、好ましく
は、本質的な生合成経路に関与する酵素をコードする遺
伝子、特に、芳香族化合物の生合成に関与するプレコリ
スメート（pre−chorismate）経路に関与する遺伝子で
ある。したがって、第２の変異は、aroA、aroCまたはar
oD遺伝子内にあることが好ましい。
他のタイプの弱毒化細菌は、弱毒化が、環境のストレ
スに応じて生成されるタンパク質をコードする細菌のDN
Aか、またはこのタンパク質をコードするDNAの発現を調
節する細菌のDNAにおける非復帰変異の存在によっても
たらされる細菌である。そのような細菌は、WO 91/1557
2に開示されている。この非復帰変異は、欠失、挿入、
逆位または置換であり得る。欠失変異は、トランスポゾ
ンを用いて生成させることができる。
環境のストレスに応じて生成するタンパク質の例に
は、熱ショックタンパク質（42℃を越える熱増加に応じ
て生成する）；栄養欠乏タンパク質（nutrient depriva
tion proteins）（微生物が生存するために必要なレベ
ルを下回る、リン酸もしくは窒素のような必須栄養のレ
ベルに応じて生成する）；毒性ストレスタンパク質（to
xic stress proteins）（染料、酸もしくは、ことによ
ると、植物分泌物のような毒性化合物に応じて生成す
る）；または代謝崩壊タンパク質（metabolic distrupt
ion proteins）（例えば、微生物の浸透圧調節能力に影
響を与えるイオン・レベル、または代謝を崩壊させるよ
うなビタミンもしくは補助因子レベルの変動に応じて生
成する）を含む。
熱ショックタンパク質は、好ましくは、htrA遺伝子
（degPとして特徴付けられることもある）によってコー
ドされるタンパク質である。他のタンパク質は、grpE、
groEL、（moPA）、dnaK、groES、lonおよびdnaJのよう
なストレス応答に関与することが知られている遺伝子に
よってコードされる。環境のストレスによって誘発され
ることが知られる遺伝子によってコードされる多くの他
のタンパク質が存在する（Ronsonら、Cell 49、579−5
81）。これらのうち、以下に言及することができる：窒
素欠乏に応じて誘発され、glnAおよびnifLAを積極的に
調節する大腸菌のntrB/ntrC系（Buckら、Nature 320、
374−378、1986;Hirschmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82、7525、1985;Nixonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
83、7850−7854、1986;ReitzerおよびMagansanik、Cel
l、45、785、1986）；リン酸塩欠乏に応じて誘発される
大腸菌のphoR/phoB系（Makinoら、J.Mol.Biol.192、549
−556、1986b）；染料および他の毒性化合物に応じて誘
発される大腸菌のcpxA/sfrA系（Albinら、J.Biol.Chem.
261、4698、1986;Druryら、J.Biol.Chem.260、4236−42
72、1985）。リゾビウム（Rhizobium）における類似の
系は、4C−ジカルボン酸に応答するdctB/dctDである（R
onsonら、J.Bacteriol.169、2424およびCell 49、579−
581、1987）。このタイプの強毒系がアグロバクテリウ
ム（agrobacterium）において記述されている。これ
は、植物分泌物に応じて誘発されるvirA/virG系である
（le Rouxら、EMBO J.６、849−856、1987;Stachelおよ
びZambryski、Am.J.Vet.Res 45、59−66、1986;Winans
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83、8278、1986）。同様
に、百日咳菌におけるbvgC−bvgA系（virとして従来よ
り公知）は、Mg2+の変動およびニコチン酸レベルに応じ
て強毒決定基の生成を調節する（Aricoら、1989、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 86、6671−6675）。
生ワクチンの形態で使用するためには、弱毒化細菌は
強毒状態に復帰するべきではない。一重鎖DNA配列にお
ける変異でこれが起こる可能性は小さいものと考えられ
る。しかしながら、２つの不連続DNA配列のいずれかに
おける変異の存在によって弱毒化された細菌に起こる復
帰の危険性は、無視できるものと考えられる。したがっ
て、好ましい弱毒化細菌は、その弱毒化が、環境のスト
レスに応じて生成するタンパク質をコードするDNA配列
か、もしくはこのタンパク質をコードするDNAの発現を
調節するDNA配列の存在および第２のDNA配列内の変異の
存在によってもたらされる細菌である。
第２のDNA配列は、好ましくは、本質的な栄養要求経
路に関与する酵素をコードするか、またはその生成物が
浸透圧反応性の遺伝子、すなわちompRの調節を制御する
配列である（Infect and Immun 1989、2136−2140）。
最も好ましくは、変異は、芳香族アミノ酸経路に関与す
るDNA配列中、特にはaroA、aroCまたはaroDをコードす
るDNA配列中に存在する。
弱毒化細菌は、当業者に公知の方法によるDNA配列へ
の変異の導入によって構築することができる（Maniati
s、Molecular Cloning and Laboratory Manual、198
2）。非復帰変異は、例えばネズミチフス菌株に、ハイ
ブリッド・トランスポゾンTnpho Aを導入することによ
り生成させることができる。Tnpho Aは、アルカリホス
ファターゼの周辺質もしくは膜タンパク質への酵素活性
タンパク融合を生起し得る。Tnpho Aトランスポゾン
は、カナマイシン耐性をコードする遺伝子を担持する。
適当な選別培地上でコロニーを成長させることにより、
カナマイシン耐性の形質導入体を選別する。
代わりの方法には、ベクター、例えばプラスミドまた
はコスミドへのDNA配列のクローニング、結果としてそ
の不活性化を招く、選択可能なマーカー遺伝子のクロー
ン化DNA配列への挿入が含まれる。不活性化DNA配列およ
び異なる選択可能なマーカーを担持するプラスミドを、
公知の技術により生物に導入することができる（Maniat
is、Molecular Cloning and Laboratory Manual、198
2）。次いで、適切な選別により、不活性化DNA配列が微
生物の染色体に再結合され、野生型DNA配列が対立交換
（allelic exchange）として知られるプロセスにおいて
非機能的になった変異体を同定することが可能になる。
特に、用いられるベクターは、微生物中ではむしろ不安
定であり、自然に失われる。プラスミドおよび野生型DN
A配列上の変異DNA配列は、遺伝学的交差により変換され
ることがある。さらなる方法は、ワクチン株の変異部位
への外来DNA配列の導入および株への抗生物質耐性マー
カーの導入を排除する。
弱毒化細菌が発現可能な異種抗原には、例えば、病原
微生物の抗原決定基が含まれ得る。この抗原は、ウイル
ス、細菌、真菌、酵母または寄生虫から得ることができ
る。したがって、異種タンパク質には、典型的には、ウ
イルス、細菌、真菌、酵母または寄生虫由来の抗原性配
列が含まれる。特には、この抗原配列は、HIV−１もし
くはHIV−２のようなヒト免疫不全症ウイルス（HIV）の
タイプ、Ａ型もしくはＢ型肝炎ウイルス、２型もしくは
14型のようなヒトライノウイルス、単純疱瘡ウイルス、
２型もしくは３型ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス、イ
ンフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、細胞表
面抗原CD4およびトラコーマクラミジア（Chlamydia tr
achomatis）から得ることができる。この抗原は、HIV、
例えばHIV−１もしくは−２由来のCD4受容体結合部位を
含んでいてもよい。他の有用な抗原には、大腸菌易熱性
毒素Ｂサブユニット（LT−Ｂ）、大腸菌K88抗原、百日
咳菌由来のP.69タンパク質、破傷風毒素フラグメントＣ
並びに吸虫、マイコプラズマ、回虫、条虫、狂犬病ウイ
ルスおよびロタウイルスが含まれる。
異種タンパク質の発現の制御に用いられる好ましいプ
ロモーターは、nirBプロモーターである。nirBプロモー
ターは大腸菌から単離されており、亜硝酸塩還元酵素遺
伝子nirB（Jayaramanら、J.Mol.Biol.196、781−788、1
987）、並びにnirD、nirCおよびcysG（Peakmanら、Eur.
J.Biochem.191、315−323、1990）を含むオペロンの発
現を指向する。これは、亜硝酸塩および環境の酸素分圧
の変化の両者によって調節され、酸素が欠乏したときに
活性化する（Cole、Biochem.Biophys.Acta、162、356−
368、1968）。嫌気的な生活に対する応答には、多くの
嫌気性呼吸遺伝子に共通の機構において転写活性化因子
として作用するタンパク質FNRが介在する。
欠失および変異解析により単独で嫌気的生活に応答す
るプロモーターの一部が単離され、他の嫌気的に調節さ
れたプロモーターと比較することによりコンセンサスFN
R結合部位が同定された（Bellら、Nucl.Acids Res.17、
3865−3874、1989;Jayaramanら、Nucl.Acids Res.17、1
35−145、1989）。推定FNR結合部位と−10相同領域との
距離が重要であることも示された（Bellら、Molec.Micr
obiol.４、1753−1763。1990）。したがって、単独で嫌
気的生活に応答するnirBプロモーターの一部のみを用い
ることが好ましい。ここでは、nirBプロモーターに対す
る言及は、プロモーターそれ自体、または嫌気性条件下
でコーディング配列の発現を促進することが可能なそれ
らの派生物の一部に向けられたものと解釈される。実際
に我々が用いた、nirBプロモーターを含む配列は、 である。
この発明による弱毒化細菌は、nirBプロモーターのよ
うに嫌気性条件によりその活性が誘発され、異種タンパ
ク質をコードするDNA配列に操作可能に結合されたプロ
モーターを含むDNA構成体で、弱毒化細菌を形質転換す
ることにより調製することができる。エレクトロポレー
ションのように、適切な形質導入技術であればどのよう
なものも用いることができる。このようにして、細菌に
対して異種のタンパクを発現することが可能な弱毒化細
菌を得ることができる。この弱毒化細菌の培養物は、好
気性条件下で増殖させることができる。その結果、異種
タンパク質の発現が最小限に止められた、ワクチンとし
て処方するに十分な量の細菌が調製される。
DNA構成体は、典型的には、異種タンパク質をコード
するDNA配列に操作可能に結合されたnirBプロモーター
を含む複製可能な発現ベクターである。nirBプロモータ
ーは、既に異種タンパク質をコードする遺伝子が組み込
まれた発現ベクターに、このタンパク質の発現を制御す
る既存プロモーターの代わりに挿入してもよい。もちろ
ん、発現ベクターは、そのベクターが挿入される弱毒化
細菌に適合可能であるべきである。
発現ベクターは、nirBプロモーターの他に、転写末端
部位並びに翻訳開始および停止コドンを含む、適当な転
写および翻訳制御要素を備えている。適当なリボソーム
結合部位も備えられている。このベクターは、典型的に
は、複製の起点および、所望であるならば、抗生物質耐
性遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子を有する。
ベクターはプラスミドであり得る。
この発明の弱毒化細菌は、ワクチンとして用いること
ができる。このワクチンは、薬剤学的に許容し得る担体
または希釈剤および、活性成分として弱毒化細菌を含
む。
ワクチンは、患者に経口投与するために、凍結乾燥形
態、例えばカプセル形態で有利に提供される。そのよう
なカプセルは、腸溶コーティング、例えばユードラゲー
ト（Eudragate）“S"、ユードラゲート“L"、セルロー
スアセテート、セルロースフタレートまたはヒドロキシ
プロピルメチルセルロースを備えて提供されてもよい。
これらのカプセルはそれ自体で、または代わりに、例え
ば懸濁液として投与前に戻すことができる凍結乾燥材料
として用いることができる。戻しは、微生物の生存度を
保証するに適したpHの緩衝液中において行なうことが都
合がよい。胃の酸性度から弱毒化細菌およびワクチンを
保護するために、ワクチンの各々の投与前に重炭酸ナト
リウム調製品を投与することが有利である。代わりに、
ワクチンを非経口投与、鼻孔内投与または乳房内投与用
に調製することができる。
この発明の弱毒化細菌は、宿主の予防処置に用いるこ
とができる。宿主は、特にはヒト宿主ではあるが動物宿
主であってもよい。これにより、微生物、特に病原体に
よって引き起こされる感染は、この発明による弱毒化細
菌の有効投与量を投与することにより防止することがで
きる。次いで、細菌は、微生物に対する抗体を増加させ
得る異種タンパク質を発現する。用いられる用量は、宿
主の大きさおよび重量、処方されたワクチンのタイプ並
びに異種タンパク質の性質を含む種々の因子に依存す
る。しかしながら、弱毒化チフス菌については、70kgの
成人宿主に対して、経口投与を含む、一回服用量当り10
9ないし1011チフス菌微生物の用量が一般に都合がよ
い。
以下の例はこの発明を説明するものである。
添付の図面において： 図１ないし４は、ネズミチフス菌単離株の、BALB/cマ
ウスの肝臓、脾臓、パイエル板および腸間膜リンパ節の
各々におけるイン・ビボでの増殖能力を示す。ｘ軸は感
染後の日数を示し、ｙ軸はlog10（臓器当りの視認可能
微生物）を示し、ΔはBRD509単離株を示し、□はBRD847
単離株を示し、○はBRD743単離株を示し、−はアンピシ
リン無を示し、かつ…はアンピシリン添加を示す。
図５は、マウス血清の抗破傷風毒素フラグメントＣ力
価を示す。ｘ軸はマウス血清に用いられる細菌のタイプ
を示す。ｘ軸はマウスの抗原投与に用いられる細菌のタ
イプを示す。投与回数は角括弧内に示す。ｙ軸は429nm
での吸光度読取値を示す。
例 pTETnir15の構築 発現プラスミドpTETnir15-を、pTETtac115（Makoff
ら、Nutl.Acids Res.17、10191−10202、1989）から、l
ac I遺伝子およびtacプロモーターを含むEcoR I−Apa I
領域（1354bp）をオリゴ１および２の下記ペアで置き換
えることにより構築した。
これらのオリゴヌクレオチドはファルマシア・ジーン
・アセンブラ（Pharmacia Gene Assembler）で合成し、
得られたプラスミドを配列決定法により確認した（Mako
ffら、Bio/Technology ７、1943−1046、1989）。
SL1334aroA aroD保持pTETnir15の構築 nirBプロモーターの制御下で破傷風毒素フラグメント
Ｃを発現するサルモネラワクチン株を構築するために、
中間株、ネズミチフス菌LB5010（r-m+）（Bullasおよび
Ryo、J.Bact.156、471−474、1983）をpTETnir15で形質
転換した。フラグメントＣを発現するコロニーを、抗生
物質選別および抗破傷風毒素フラグメントＣ血清を用い
るコロニー・イムノブロッティングにより検出した。コ
ロニーをニトロセルロース・フィルター上で一晩好気的
に増殖させた後、イムノブロッティングの前に嫌気性条
件下で４時間インキュベートすることにより誘発させ
た。フラグメントＣを安定に発現した株の１つをプラス
ミドDNAの調製に用いた。これを、エレクトロポレーシ
ョンによる、BRD509と命名されたネズミチフス菌SL1344
aroA aroDの分離株の形質転換に用いた。フラグメン
トＣを安定に発現する（上述のイムノブロッティングに
よって試験された）株をイン・ビボ研究のために選択
し、BRD847と命名した。
BALB/cマウスにおけるBRD743およびBRD847のイン・ビボ
動力学の比較 BALB/cマウスに経口投与した後の、BRD743（pTET85を
有するBRD509）とBRD847とのイン・ビボにおける増殖能
力を比較した。pTET85は、lac I遺伝子を保持する1.2kb
EcoR Iフラグメントを削除することにより、pTETtac1
15（Makoffら、Nucl.Acids Res.17,10191−10202、198
9）から構築した。これは、サルモネラ株において、フ
ラグメントＣを構成的に発現（constitutive expressio
n）する結果となった。肝臓、脾臓、パイエル板および
腸間膜リンパ節における細菌数を数え上げた。マウスか
ら単離された細菌についても、依然としてフラグメント
Ｃを発現するプラスミドを保有する微生物の割合の指標
としてのアンピシリンを含有するプレート上において、
増殖能力を評価した。結果を図１ないし４に示す。
同じ初期数の微生物（５×109）をマウスの感染に用
いた場合に、BRD743および847の両者とも、試験した全
てのネズミ組織内に侵入しかつ生存することが可能では
あるが、BRD509よりは低レベルであることが見出され
た。しかしながら、BRD743に感染したマウスから得られ
るアンピシリン耐性微生物は急速に減少し、14日目まで
に回収される全ての微生物がアンピシリン感受性である
ことは興味深い特徴である。これは、イン・ビボでの選
別では、急速に、サルモネラワクチン株からpTET85が失
われる結果となることを示している。対照的に、感染が
モニターされている期間は、アンピシリンを用いた場合
と用いない場合とのBRD847の計数は本質的に同じであっ
た。これは、免疫原性の点で明らかに有利な、イン・ビ
ボでより長期間フラグメントＣを発現する能力を有する
微生物に帰着する、ネズミチフス菌ワクチン株における
pTETnir15の付加された利点を示している。
pTET85（BRD743）またはpTETnir15（BRD847）を有する
サルモネラ株を用いたBALB/cマウスの免疫化 20匹のマウスの群に、BRD743、BRD847またはBRD509の
いずれかをマウス当り５×109細胞ずつ経口的に接種し
た。25日目に全てのマウスから血清を採取し、ELISAに
より好破傷風抗体の分析を行なった。BRD847をワクチン
接種した全てのマウスは、25日目に抗フラグメントＣ抗
体を検出することが可能であったが、BRD743またはBRD5
09をワクチン接種したマウスでは検出されなかった（図
５）。25日目に、各群10匹のマウスを、同量の同種微生
物を経口接種することにより追加免疫した。46日目にこ
れらのマウスから得た血清のELISA分析は、BRD743およ
びBRD847を接種された群よりも、抗フラグメントＣ応答
が増加していることを示した。BRD847で追加免疫したこ
れらのマウスに対する力価は、BRD743で追加免疫したマ
ウスに対するものよりも有意に高かった。BRD509で経口
的に追加免疫されたマウスは、フラグメントＣに応答す
る検出可能な抗体を生成することができなかった。
BRD847および743で経口的に免疫されたマウスの破傷風
毒素抗原投与 BRD743、847および509を経口的にワクチン接種したマ
ウスを、免疫用株（immunising strain）を１もしくは
２投与した後に、破傷風毒素抗原投与に対する免疫性に
ついて試験した。単一経口投与量５×109微生物を１回
投与されたマウス20匹の群およびマウス10匹の群に、50
0 50％致死量の破傷風毒素を25日目に抗原投与した（表
１参照）。BRD847をワクチン接種したマウスは、単一経
口投与の後の抗原投与に対して完全な防御を示したが、
BRD743をワクチン接種したマウスでは部分的な防御を示
すのみであった（2/10生存）。残りのマウス10匹の群
は、25日目に微生物（５×109）の第２の投与を受け、
（第１の投与の後）46日目に抗原投与された。BRD847で
免疫されたマウスは破傷風毒素を抗原投与された後再度
完全な防御を示したが、BRD743で免疫されたマウスは部
分的な防除を示すのみであった（5/10）。BRD509の１も
しくは２投与量で免疫され、破傷風毒素を抗原投与され
たマウスは全て死亡した。BRD847はマウスにおける破傷
風毒素抗原投与に対する有効な単一投与量経口ワクチン
である。また、マウスの群に、BRD847およびBRD743 105
微生物の静脈内投与量を１および２回投与した後、破傷
風毒素を抗原投与した。ワクチン株の１もしくは２回投
与の後には、全てのマウスが、破傷風毒素の抗原投与に
対して完全な防御を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:42） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 チャトフィールド、スティーブン・ネビ ル イギリス国、ビーアール３・３ビーエ ス、ケント、ベッケンハム、ラングレ イ・コート（番地なし) (72)発明者 フェアウエザー、ネイル・フレイザー イギリス国、ビーアール３・３ビーエ ス、ケント、ベッケンハム、ラングレ イ・コート（番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/74 A61K 39/00 - 39/112 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】薬学的に許容し得る担体または希釈剤と、
    活性成分として、病原菌の抗原決定基を含む異種タンパ
    ク質をコードするDNA配列に機能的に連結したnirBプロ
    モーターを含有する弱毒化細菌とを含むワクチン。
  2. 【請求項２】前記弱毒化細菌がサルモネラ属の弱毒化株
    である請求項１記載のワクチン。
  3. 【請求項３】前記弱毒化細菌がチフス菌またはネズミチ
    フス菌の弱毒化株である請求項２記載のワクチン。
  4. 【請求項４】前記細菌の弱毒化が、芳香族アミノ酸生合
    成経路における遺伝子内の非復帰変異に起因するもので
    ある請求項１〜３のいずれか１項記載のワクチン。
  5. 【請求項５】前記細菌の弱毒化が、環境ストレスに応じ
    て生成されるタンパク質をコードする細菌のDNA、また
    は環境ストレスに応じて生成されるタンパク質をコード
    するDNAの発現を調節するタンパク質をコードする細菌
    のDNAにおける非復帰変異に起因するものである請求項
    １〜４のいずれか１項記載のワクチン。
  6. 【請求項６】前記弱毒化細菌が、芳香族アミノ酸生合成
    経路における二つの別々の遺伝子の各々に非復帰変異を
    有する請求項４記載のワクチン。
  7. 【請求項７】前記弱毒化細菌がaroA aroC、aroA aroD
    またはaroA aroE変異体である請求項６記載のワクチ
    ン。
  8. 【請求項８】前記細菌の含有する前記異種タンパク質コ
    ード配列が、ウイルス、細菌、真菌、酵母または寄生虫
    由来の抗原性配列をコードする請求項１〜７のいずれか
    １項記載のワクチン。
  9. 【請求項９】前記異種タンパク質コード配列が、百日咳
    菌由来のP69タンパク質または破傷風毒素フラグメント
    Ｃをコードする請求項８記載のワクチン。
  10. 【請求項１０】微生物による感染に対してヒトまたは動
    物宿主を予防治療するための方法に使用する請求項１〜
    ９のいずれか１項において定義した弱毒化細菌。
  11. 【請求項１１】請求項２〜９のいずれか１項において定
    義した弱毒化サルモネラ属細菌。
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