JP3338114B2

JP3338114B2 - ステロール又はステロールグルコシドで被覆したリポソーム

Info

Publication number: JP3338114B2
Application number: JP10001293A
Authority: JP
Inventors: 和則村松; 芳枝米谷; 幸三高山; 良冶町田; 恒司永井; 茂夫三竹; 宗和多田
Original assignee: Ryukakusan Co Ltd
Current assignee: Ryukakusan Co Ltd
Priority date: 1993-03-22
Filing date: 1993-03-22
Publication date: 2002-10-28
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: JPH06298638A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、脂質膜であるリポソー
ムを薬物のカプセルとして静脈投薬に使用するリポソー
ムの被覆組成物に関する。本発明はリポソームの被覆剤
としてステロール、ステロールグルコシドを用いること
により、血中滞留性や肝臓の実質細胞への取り込みがよ
く、また安定性も向上したリポソームを提供することに
関する。

【０００２】

【従来の技術】リポソームとは、内部に水相を含むリン
脂質二重層の微小ベシクルで、脂質を相転移温度以上
で、十分な量の水で水和することにより形成される。リ
ポソームは、その脂質二重層の数に基づいて分類した場
合、多重膜リポソーム（以下ＭＬＶという）と一枚膜リ
ポソームに分けられ、後者は、さらに大きさに基づい
て、小さな一枚膜リポソーム（以下ＳＵＶという）、大
きな一枚膜リポソーム（以下ＬＵＶという）および巨大
リポソーム（以下ＧＵＶという）に分けられる。

【０００３】ＳＵＶは直径数１０ｎｍ以下、ＬＵＶは１
００〜１０００ｎｍ、ＧＵＶは１０００ｎｍ以上のリポ
ソームを指す。ＭＬＶのサイズは不均一で、その分布は
数百から数千ｎｍにまで及ぶ。

【０００４】このように、種々のタイプのリポソームが
知られているが、水溶性薬物はその内水相へ、油溶性の
ものは二重膜部分へ取り込むことができる。リポソーム
に内包された薬物は、遊離の薬物とまったく異なった体
内分布を示すので、薬物による副作用の軽減、徐放化な
どの効果があり、さらにつぎのような利点がある。

【０００５】リポソームを構成するリン脂質は、生体
膜の主要構成成分であるため毒性が低い。投与の目
的、方法により粒子サイズをコントロールすることがで
きる。粒子表面に官能基を導入することにより抗原、
抗体、糖鎖などを導入することができ、標的部位へのタ
ーゲティングが可能である。

【０００６】肝臓へのターゲティングに際して最も広く
用いられているリガンドとして、ガラクトースおよびマ
ンノース残基がある。実質細胞はガラクトースに、マク
ロファージはマンノースに、それぞれ特異性を有するレ
セプターが存在することが知られており、それらの糖残
基で表面修飾したリポソームのそれぞれの細胞種に対す
るターゲティングがなされている。

【０００７】しかしながら、静脈投与されたリポソーム
は、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（以下ＲＥＳとい
う）に極めて取り込まれやすい性質を有している。ＲＥ
Ｓを標的部位とするときや、そこからの徐放性を期待す
る場合には有効である。しかし、標的部位がＲＥＳ以外
の場合には、リポソームにＲＥＳ回避能が必要となって
くる。

【０００８】従来のリポソームでは粒径を小さくすれ
ば、ある程度血中滞留時間を延長できるが、内包できる
薬物量が極めて少なくなり、一方、粒径を大きくすれば
内包薬物量は増えるが、ＲＥＳへ取り込まれ、血中での
徐放化やＲＥＳ以外の組織へのターゲティングは、非常
に困難であった。

【発明が解決しようとする課題】

【０００９】本発明は、上記従来技術に鑑み、ＲＥＳ回
避能、血中滞留時間を延長させ、安定性を向上させたリ
ポソームを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【００１０】上記課題を解決するために、本発明ではス
テロール配糖体であるステロールグルコシド（以下ＳＧ
という）及び／又はＳＧのグルコシド結合を加水分解し
て得られるアグリコンであるステロール（以下Ｓとい
う）でジパルミトイルホスファチジルコリンリポソーム
を被覆した。ＳあるいはＳＧの被覆によるリポソーム、
すなわち、ＳリポソームあるいはＳＧリポソームの安定
性及び体内における回避能を、リポソームに蛍光試薬で
あるカルセインを内包して、カルセインを指標にして調
べ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
のみで調製したリポソーム（以下ＤＰＰＣリポソームと
いう）と比較して有用性を認め本発明を完成した。

【００１１】本発明で用いるステロール及び／又はＳＧ
のグルコシドとしては、例えば植物精製工程で生じるソ
ーダ油宰から得られるステロールグルコシド（ＳＧ）
で、その組成はシトステリル−Ｄ−グルコシド、カンペ
ステリル−Ｄ−グルコシド、スチグマステリル−Ｄ−グ
ルコシド、ブラシカステリル−Ｄ−グルコシドからなる
混合物、又は、このステロールグルコシド（ＳＧ）を加
水分解して得たステロール混合物（Ｓ）が使用でき、ま
た、それらの混合物を構成する単独成分を使用しても有
効である。

【００１２】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例１本発明で用いるステロールグルコシド（ＳＧ）及びステ
ロール（Ｓ）の製造方法。植物油精製工程で生じるソー
ダ油滓の乾燥粉末１００ｇにピリジン１，０００ｍｌを
加え加熱溶解する。この溶液に活性炭を加え攪判後に濾
過し、濾液を得る。濾液１，０００ｍｌに対しアセトン
１，５００ｍｌを添加し冷却すると結晶が析出する。得
られた粗ステロールグルコシドを再びピリジンに加熱溶
解し、上記と同様に活性炭を加えて脱色処理を行った
後、アセトンを加えて結晶を析出させる。得られた結晶
を減圧乾燥し、精製ＳＧ３０ｇを得た。このステロール
グルコシドの組成はβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシ
ド（４９．９％）、カンペステリルβ−Ｄ−グルコシド
（２９．１％）、スチグマステリルβ−Ｄ−グルコシド
（１３．４％）、ブラシカステリルβ−Ｄ−グルコシド
（７．２％）の混合物であった。本発明で用いたステロ
ール（Ｓ）は、ＳＧを酸で加水分解したもので、成分と
してＳＧのステリルグルコシドと同一のステロール成分
比を含んだものである。

【００１３】実施例２リポソームの調製法Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン［（日本
油脂（株）製）以下ＤＰＰＣという］の１０ｍＭのクロ
ロホルム溶液とＳ及びＳＧの１０ｍＭのメタノール：ク
ロロホルム＝２：１混液を調製する。この溶液をナス型
コルベンにＤＰＰＣ、ＳあるいはＳＧのモル比が７：
１：Ｘ（Ｘ＝０〜０．８，Ｘ＝Ｓ，ＳＧ）を量り取り、
室温でエバポレーターによって有機溶媒を減圧除去す
る。さらに、クロロホルムを完全に除くために減圧デシ
ケータ中で１６時間乾燥する。これに７０ｍＭのカルセ
インのＮａＣｌ含有リン酸緩衝溶液［（ｐＨ７．４）以
下ＰＢＳという］を加え、５０℃で１時間水和した後、
水浴型超音波器中で３０分間超音波を照射したのちに、
遠心分離して多重膜リポソーム（ＭＬＶ，１７．１ｍｇ
リン脂質／ｍｌＰＢＳ）を調製した。さらに、このリポ
ソーム懸濁液５００μｌをセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−５０カラム（１．９ｃｍ×３２ｃｍ，フラ
クションサイズ４．５ｍｌ）で展開溶媒にＰＢＳを用い
てカルセイン内包リポソーム（１．９ｍｇ×リン脂質／
ｍｌＰＢＳ）と遊離カルセインとを分離した。リポソー
ムの粒子径は、約０．１μｍであった。上記において、
ＰＢＳは次の組成の物である。塩化ナトリウム８．０００ｇ塩化カリウム０．１９４ｇリン酸二ナトリウム２．２９０ｇリン酸一カリウム０．１９６ｇ精製水１０００．０００ｍｌ

【００１４】実施例３Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの血漿中での安定性リポソームは体液中、特に血中で血液成分によってオプ
ソニ化され、内容物を漏出しやすいということが知られ
ている。そこで、各々のリポソームの体内での安定性に
及ぼすラット血漿の影響について試験した。図１ａ）
は、ＰＢＳ中に５０％ラット血漿を添加して、図１ｂ）
はＰＢＳのみに、それぞれリポソームを加え、３７．５
℃で１時間インキュベートしたときのカルセインの放出
プロファイルを示す。これより、ＤＰＰＣリポソーム、
ＳＧリポソームは、Ｓリポソームより漏出率が高く、１
時間後の漏出率は、ＤＰＰＣ＝ＳＧ＞Ｓの順に小さくな
った。また、ＰＢＳ中でのＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポ
ソーム、及びＳＧリポソームの漏出率は、すべて２０％
以下であった。また図１ａ）において５６℃、３０分で
血漿を熱処理したときの１時間での漏出率は、無処理に
比べて、Ｓリポソームでは３２．８％から１９．５％
へ、ＳＧリポソームは６０．８％から４４．５％へと低
くなった。

【００１５】実施例４Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの血中滞留性と臓器分
布静脈投与後の薬物の血中からの消失は、おもに各臓器で
の代謝と排泄に依存する。しかしながら、粒子性のリポ
ソーム自体及び添加薬物の体内動態は、主に、肝臓や脾
臓に存在するマクロファージ（細網内皮系組織：ＲＥ
Ｓ）による補足と血中での崩壊による。特に肝臓への分
布は、粒子径、表面の親水性や表面電位による。そこ
で、各々のリポソームをマウスに尾静脈投与したときの
血中滞留性の違いを測定し、図３に示した。投与５分後
の血中におけるリポソーム中のカルセインの蛍光強度を
１００％とすると、ＤＰＰＣリポソームの蛍光強度は６
時間後において０．８３（５．７％）、ＳＧリポソーム
は０．７％（２．６％）、Ｓリポソームは４．１（７．
７％）が血中に滞留した。これは、Ｓリポソームは、Ｄ
ＰＰＣリポソーム及びＳＧリポソームに比べ、リポソー
ム膜の流動性が低く、血漿成分によってオプソニン化が
されにくい。したがって、Ｓリポソームの血中滞留性が
長いのは、リポソーム膜が比較的固く、血漿中で安定な
ためにマクロファージによる補足から回避され、また血
中での崩壊も少ないためである。一方、ＤＰＰＣリポソ
ーム及びＳＧリポソームは、リポソーム膜の流動性がＳ
リポソームより高く、血漿成分によって１時間で５０〜
６０％の内包物を放出した。したがって、ＤＰＰＣリポ
ソーム及びＳＧリポソームの血中滞留性が短いのは、主
に血中でのリポソームの崩壊による。ＲＥＳの異物取り
込み能は、効率よく迅速で、たとえば１μｍ以下の粒子
は静脈投与して、約１分後には投与量の９０％以上は、
肝臓と脾臓に集まる。そこで、ＤＰＰＣリポソーム、Ｓ
リポソーム及びＳＧリポソームの静脈投与６時間後の肝
臓と脾臓の分布を調べた。その結果は、図４に示したよ
うに投与６時間後にリポソームは、投与量の約９０％以
上が肝臓に分布し、脾臓には投与量の１０％以下であっ
た。

【００１６】実施例５Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの肝細胞分布ネンブタール（０．０６ｍｌ／３０ｍｇ）及びヘパリン
（２００ＩＵ）を腹腔内投与したマウスに、カルセイン
内包リポソームを尾静脈より投与し、２時間後に開腹
し、カニュレーションをして、第一灌流液は５分、ＰＢ
Ｓは５分、コラゲナーゼ溶液（７５ＩＵ）は１５分の順
に灌流する。次に、肝臓を切り離し、シャーレ中の氷冷
したＨＡＮＫ′ｓ緩衝液（３ｍｌ）に移し、細胞を分散
させる。その後、ガーゼで濾過し、濾液をスピッツ管に
集め、５０×ｇ，７０×ｇ及び１４０×ｇでそれぞれ１
分間遠心分離し、実質細胞と非実質細胞を分離し、蛍光
強度を測定して、各リポソームの肝細胞分布を測定し
た。なお、１４０×ｇによって得た非実質細胞数分画の
各分画中の細胞数をＢｕｒｋｅｒ−ＴｕｒｋＣｈａｍ
ＢＥＲを用いて数えた結果、実質細胞数は２．４９×１
０^７個、非実質細胞数は２．７６×１０^７個となり、実
質細胞数と非実質細胞数は等しかった。また、実質細胞
数の生存率はトリパンブルーテストにより確認し、７０
％以上であった。

【００１７】肝臓では、栄養物質の処理、貯蔵、中毒性
物質（薬物）の解毒、分解、排泄などといった生体にと
って不可欠な機能が営まれており、実質細胞、毛細胆
管、毛細血管が放射状に集まった特有の構造をしてい
る。肝臓を構成する細胞には、実質細胞と非実質細胞で
ある内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞及び脂肪貯蔵細胞な
どがあり、それぞれ異なった構造と機能をもっている。
実質細胞は、肝臓の大部分（約７０％）を占め、代謝、
排泄など肝臓の主な機能を担っている。一方、非実質細
胞胞であるＫｕｐｆｆｅｒ細胞は、類洞の内側に定着し
た細網内皮系の細胞で、血液中に存在する微粒子性老廃
物の除去に中心的な役割を果たしている。

【００１８】図４に示したようにリポソームはＲＥＳの
中でも特に肝臓に取り込まれることから、肝臓内での実
質及び非実質細胞への取り込みの違いを測定し、その結
果を図５に示した。ＤＰＰＣリポソームの実質及び非実
質細胞への取り込み量は、極めて少なかった。これは、
血中において血漿成分によりＤＰＰＣリポソームは、非
常に崩壊されやすいために、肝細胞への取り込み量が低
くなったためである。一方、ＳＧリポソームは、血漿中
でＤＰＰＣリポソームと同様に不安定であったが、実質
細胞に多く取り込まれた。しかし、血漿中で安定である
Ｓリポソームの実質細胞への取り込み量は、ＳＧリポソ
ームの約１／３であった。また、非実質細胞への取り込
み量は、Ｓ及びＳＧリポソームともほぼ同様であった。
これらの結果より、膜の流動性が高いＤＰＰＣリポソー
ムは血中において崩壊し、また、ＳＧリポソームは、実
質細胞に取り込まれ易く、血中での滞留率も低くなっ
た。よって、ＳＧリポソームは、ＲＥＳ回避能を有する
ことが証明された。また、膜の流動性の低いＳリポソー
ムは、血漿中で安定であり、実質及び非実質細胞にも取
り込まれにくいために、血中での滞留率が高くなったこ
とが証明された。このことから、薬物担体としてのリポ
ソームは、薬物の徐放化にはＳリポソームが、肝臓への
ターゲティングにはＳＧリポソームが有効であることが
認められた。

【００１９】

【発明の効果】以上述べたように、ＤＰＰＣのみで調製
したリポソーム（ＤＰＰＣリポソーム）と比較して、ス
テロール（Ｓ）あるいはステロールグルコシド（ＳＧ）
でＤＰＰＣリポソームを被覆したものは安定性に優れ、
ＳリポソームとＳＧリポソームの血中滞留性は、Ｓリポ
ソームが最も良く、また、肝臓の実質細胞への取り込み
はＳＧリポソームが良いことが顕著に認められた。薬物
担体としてのリポソームは、薬物の徐放化にはＳリポソ
ームが、肝臓へのターゲティングにはＳＧリポソームが
有効であることが認められ、本発明の有用性が証明され
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ａ）はＰＢＳ中に５０％ラット血漿を添加
して、図１ｂ）はＰＢＳのみに、それぞれリポソームを
加え、３７．５℃で１時間インキュベートしたときのカ
ルセインの放出プロファイルを示す。

【図２】ＰＢＳ中の血漿添加量を０，２５，５０，９０
％と変化した場合の各々のリポソームからのカルセイン
の漏出変化を示す。

【図３】ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポソーム及びＳＧリ
ポソームをマウスに尾静脈投与したときの血中滞留性の
違い（蛍光強度）を示す。

【図４】ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポソーム及びＳＧリ
ポソームのマウスに尾静脈投与６時間後の肝臓と脾臓の
分布を示す。

【図５】リポソームをマウスに静脈投与したときの、２
時間後の肝臓内での実質及び非実質細胞の蛍光強度（各
リポソームの取り込みの違い）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者永井恒司東京都文京区本駒込１−23−10−103 (72)発明者三竹茂夫東京都千代田区東神田１−11−１株式会社龍角散研究開発部内 (72)発明者多田宗和東京都千代田区東神田１−11−１株式会社龍角散研究開発部内 (56)参考文献特開平２−273538（ＪＰ，Ａ) 特開平４−69332（ＪＰ，Ａ) 特開平２−200699（ＪＰ，Ａ) 特開平２−225495（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−74619（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 9/00 - 9/72 A61K 47/00 - 47/48

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ステロールグルコシドで被覆したリポソ
ーム及び薬物を含む、肝臓ターゲッティングのための医
薬組成物。
【請求項２】前記ステロールグルコシドは、シトステ
リル−Ｄ−グルコシド、カンペステリル−Ｄ−グルコシ
ド、スチグマステリル−Ｄ−グルコシド、ブラシカステ
リル−Ｄ−グルコシドから選ばれた１種以上であること
を特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。