JP3316199B2 - Ｐｉｖｋａ−ｉｉの免疫学的測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトフイブリン様
関連物質に反応する抗体及び／又はトロンビンを試薬に
加えて、血清又は血漿中のPIVKA-II（Protein Induced
by Vitamin ＫAbsence or Antagonist-II）を特異的に
しかも高感度に測定する抗原抗体反応の免疫学的測定法
に関する。

【０００２】

【関連技術】PIVKA-II（Protein Induced by Vitamin
Ｋ Absence or Antagonist-II）は、肝細胞癌患者にお
いて特異的に上昇する、AFPと並んで肝細胞腫瘍を検出
するマーカーとして広く臨床検査室で測定されている。
一般的には、PIVKA-IIの特異的なモノクローナール抗体
やもしくはポリクローナール抗体を吸着させた磁気ビ−
ズやガラスビーズ、プラスチックプレート、ラテックス
等に血清や血漿と第1 反応させたのち、BF洗浄を行い、
酵素、蛍光物質、放射性同位元素やRu錯体等を標識し
た、ヒトプロトロンビンに特異的なポリクローナール抗
体又はモノクローナール抗体を加える第２反応をさせ
て、BF洗浄後、抗原抗体反応によって形成された免疫複
合体に結合している酵素、蛍光物質、放射性同位元素、
Ruを吸光度又は発光量を測定することによって、PIVKA-
IIを測定する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来は、酵素標識免疫
法（EIA）でPIVKA-IIを測定してきたが、比較的小さい
肝癌の例では陽性率が低く感度が不十分であったため、
より高感度に測定するため、最近に至ってRu錯体を抗原
又は抗体に標識する電気化学発光免疫測定法（ECLIA）
が開発された。電気化学発光免疫測定法によってPIVKA-
II測定の高感度化に成功した。ECLIAに限らず酵素免疫
測定法、化学発光法や放射性同位元素法、ラテックス比
濁法等で高感度化を実現するにあたって、検体中の非特
異反応の影響を考慮しなければならない。

【０００４】PIVKA-II測定において検体中の非特異反応
の影響を回避する研究を進めている過程で、高感度に試
薬中にヒトフイブリン様関連物質に反応する抗体及び／
又はトロンビンを加えることで、さらに感度を増し、特
異性が上がることを見い出した。検体中の非特異反応物
質として一つは検体中のフイブリン又はその関連物質を
考え、もう一つに、フイブリン又はその関連物質に結合
したトロンビンに着目した。特に、標識抗体又は２次抗
体に用いる抗ヒトプロトロンビンとしてポリクローナー
ル抗体を用いた場合に、これら非特異反応物質の干渉を
受け、PIVKA-II測定の正誤差を招きやすい可能性がな
る。プロトロンビンの蛋白構造は、Ｆ₁フラグメントと
Ｆ₂フラグメントにトロンビンから構成されていること
が報告されている。PIVKA-II測定に用いる標識抗体には
抗プロトンビン抗体に限らず、抗Ｆ ₁や抗Ｆ₂、抗（Ｆ₁
＋Ｆ₂）を用いることができるが、抗体の純度やトロン
ビンとの抗原の類似性を考えると検体中の結合型又は遊
離型のトロンビンと反応してしまう可能性がある。ま
た、PIVKA-II測定において検体中のフイブリン又はその
関連物質の不溶性のものが磁気ビーズ、ガラスビーズ、
ラテックス、プラスチックプレート等の担体に物理吸着
を起こし、正の測定誤差を招く現象が見られた。

【０００５】フイブリン様関連物質由来の干渉とトロン
ビン由来の干渉を防ぐために、ヒトフイブリン様関連物
質に反応する抗体、例えば抗フイブリノーゲンや抗フイ
ブリン及び／又はトロンビンを試薬中に加えることで、
非特異的反応を効果的に抑制し、微量のPIVKA-IIを正確
に測定することに成功し、本発明を完成した。

【０００６】本発明は、ヒトフイブリン様関連物質に反
応する抗体及び／又はトロンビンを試薬に加えて、血清
又は血漿中のPIVKA-IIを特異的にしかも高感度に測定す
る抗原抗体反応の免疫学的測定法を提供することを目的
とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明のPIVKA-IIの免疫学的測定法は、ヒトフイブ
リン様関連物質に反応する抗体及び／又はトロンビンを
試薬に添加し、血清又は血漿中のPIVKA-IIを測定するも
のである。

【０００８】前記トロンビンとしてトロンビンを含む動
物血清及び／又は精製トロンビンを用いるのが好適であ
り、これらは加熱しないものも加熱したものも用いるこ
とができる。

【０００９】前記ヒトフイブリン様関連物質に反応する
抗体として抗フイブリノーゲン又は抗フイブリンを用い
るのが好適である。

【００１０】本発明の用いるヒトフイブリン様関連物質
に反応する抗体の一例に抗フイブリノーゲンや抗フイブ
リンがあるが、これらはポリクローナール抗体が好まし
く、フイブリノーゲンやフイブリンのみならずFDP、フ
イブリノペプタイドＡ、フイブリノペプタイドＢなどの
フイブリン様関連物質に反応性の高い抗体が望ましい。
またトロンビンとしてヒト由来精製品や牛由来、豚由
来、羊由来、馬由来、ウサギ由来、ニワトリ由来精製品
等の動物由来精製品が用いられる。さらにまた、標識抗
体用又は２次抗体の抗体を得る免疫動物とは異なる種の
動物の、トロンビンを含む牛血清や羊血清、豚血清、馬
血清、ニワトリ血清、ウサギ血清等の各種動物血清が用
いることによって、標識抗体中に不純物として存在する
抗トロンビンの反応を抑制することができる。

【００１１】本発明に用いる標識抗体又は２次抗体とし
ては、ヒトのプロトロンビン、Ｆ₁、Ｆ₂、Ｆ₁＋Ｆ₂のポ
リクロナール抗体を用いることができるが、ポリクロナ
ール抗体に限らず、ヒトのプロトロンビン、Ｆ₁、Ｆ₂、
Ｆ₁＋Ｆ₂のモノクロナール抗体を用いることができる。
なお、Ｆ₁、Ｆ₂はプロトロンビン構成ぺブタイドであ
る。また、プロトロンビンの抗原性を持つ合成ペプタイ
ドから免疫して作製したポリクロナール抗体やモノクロ
ナール抗体をも使用可能である。

【００１２】また、本発明の実施例は電気化学発光免疫
測定法の実施例で示したが、化学発光法や放射性同位元
素法等の高感度化を試みる方法において有用である。本
発明に用いる抗フイブリノーゲンや抗フイブリン等のフ
イブリノーゲン、フイブリン、FDP、フイブリノペプタ
イドＡ、フイブリノペプタイドＢ等のフイブリン様関連
物質に反応する抗体は、ヒト由来フイブリン様関連物質
で免疫されたものが好ましいが、ヒト由来フイブリン様
関連物質と交差性のある、動物由来フイブリノーゲンや
フイブリン等のフイブリン様関連物質で免疫した抗体を
も用いることができる。これらの抗フイブリノーゲンや
抗フイブリン等のフイブリン様関連物質に特異的な抗体
は、２ステップサンドイッチ法における第１反応の反応
液に加えることが好ましい。一方、トロンビンは第２反
応の標識抗体液又は２次抗体液に加えることが好まし
く、添加量は１〜50NIH/mLが適当である。抗フイブリノ
ーゲンや抗フイブリン等のフイブリン様関連物質特異抗
体、精製トロンビン及びトロンビンを含む動物血清は必
要に応じて単独もしくは併用して用いる。

【００１３】標識抗体用又は２次抗体用の抗体を得る免
疫動物とは異なる種の動物のトロンビンを含む牛血清や
羊血清、豚血清、馬血清、ニワトリ血清、ウサギ血清等
の動物血清の添加量は１〜２０％が適当である。これら
の異種の動物血清は、標識抗体用又は２次抗体用の抗体
を免疫した動物と同種の動物血清を適宜配合できる。

【００１４】トロンビンを試薬に加える際、トロンビン
の酵素活性が強いと免疫反応中に悪い影響を与えること
が考えられ、標識抗体又は２次抗体を含む試薬に動物血
清を添加した場合、試薬の安定性に影響を与えるから、
トロンビン又は動物血清を添加する試薬にトロンビンの
酵素活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤を配合する
ことが好ましい。

【００１５】プロテアーゼ活性阻害剤として、臨床酵素
ハンドブック（北村、馬場他編、１９８２年９月１０日
第１刷発行、講談社サイエンテイフイク）のp452にあげ
られている阻害物質, 即ち、血漿蛋白性阻害剤、ヒルジ
ン、ベンザミジンやPMSF（フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド）、NPGB等の合成阻害剤を用いることができ
る。しかし、これら阻害物質だけでは酵素活性を十分に
阻害をかけることができないので、トロンビン精製品を
熱処理、例えば、およそ40℃〜65℃で加熱しても、抗原
性を失わずに、酵素活性を著しく減じることを見出し
た。

【００１６】市販のトロンビン精製品は本来冷蔵か冷凍
で保存されるべきものであり、高温にさらしてはいけな
いものである。本発明に用いるトロンビンの加熱温度は
30℃〜70℃であり、特に40℃〜60℃が好ましく、15分〜
60分と加熱時間を短くすることができる。勿論加熱温度
や加熱時間は、トロンビンの酵素活性の失活を目的とす
るもので、抗原性を失わずに酵素活性失活の目的を達成
できれば、この限りではない。

【００１７】トロンビンとして、標識抗体の免疫動物と
は異なる種の動物血清を予め加熱して用いる場合には、
加熱温度が50℃〜65℃、加熱時間15分〜60分が適当であ
る。この場合においてもこの限りではなく適宜、加熱時
間と加熱温度は調節できることは言うまでもない。ま
た、必要に応じて加熱せずに用いることができる。

【００１８】

【実施例】以下に本発明を実施例によって説明するが、
これらの実施例は例示的にしめされるもので、限定的に
解釈されるべきものではない。

【００１９】実施例１（電気化学発光免疫測定法を用い
て自動分析装置ピコルミ8220で測定した例） 反応溶液150μLに検体を50μＬを加えたのち、抗PIVKA-
IIモノクロナール抗体を固相した磁気ビーズを25μLを
加える。30℃で９分間反応させたのち、ピコルミBF洗浄
液（10mMトリス緩衝液）を350μLを加え、磁気ビーズを
磁石でトラップしながら3 回洗浄する。第1 反応をすま
せた磁気ビーズに１μg/mLのRu標識抗ヒトプロトロンビ
ン抗体（ウサギ由来）を含むRu標識抗体液200μLを加
え、30℃で９分間反応させる。同様に磁気ビーズを磁石
でトラップしながらピコルミBF洗浄液で３回洗浄する。
0.1Mトリプロピルアミンを含むピコルミ発光電解液を30
0μLを加えて、電極表面に送り、磁気ビーズに結合した
Ruの発光量を測定し、検体中のPIVKA-II量を求める。

【００２０】試薬組成 反応溶液：50mMトリス緩衝液（pH7.8）、0.150M NaCl、
0.01％Tween 20、0.1 ％NaN3、5 ％ウサギ血清（加熱） Ru標識抗体液：50mMトリス緩衝液(pH7.8）、0.150M NaC
l、0.01 ％Tween20,0.1%NaN3、1mM PMSF、１μg/mL Ru
標識抗ヒトプロトロンビン抗体（ウサギ由来）、5％ウ
サギ血清（加熱）

【００２１】（抗PIVKA-IIモノクロナール抗体固相磁気
ビーズの調製）磁気ビーズ（4.5ミクロン）30mg/mLの１mLを
試験管にとり、磁石でトラップし、上清液を捨てたあ
と、磁気ビーズに抗PIVKA-IIモノクロナール抗体0.5mg/
mL（150mMリン酸緩衝液、pH7.8）を１mL加え、室温で一
昼夜撹拌しながら反応させる。磁気ビーズを洗浄したあ
と、１％BSA・リン酸緩衝液を2mL加え、室温で１昼夜撹
拌しながらブロッキングする。使用時、１％BSA・リン
酸緩衝液で磁気ビーズ量１mg/mLに希釈して用いる。

【００２２】（Ru標識抗ヒトプロトロンビン抗体の調
製）ウサギで免疫した抗ヒトプロトロンビン１mg/mLに
調製した１mLに、サクシニミド基修飾ルテニウム・トリ
・ジピリジルのRu錯体化合物を68μLを加え、室温で30
分撹拌しながら反応させたのち、２Mグリシンを50μL加
え、反応を停止し、さらに室温で10分間撹拌しながら反
応させる。最後に試料をセファデックスＧ-25（10mMリ
ン酸緩衝液で平衡化）に流し、Ru結合の蛋白分画を集め
る。このようにして得られたRu標識抗ヒトプロトロンビ
ンは、使用時、１μg/mLに希釈して用いる。

【００２３】反応溶液に抗ヒトフイブリノーゲン（ウサ
ギ由来）を180μg/mLを加え、抗ヒトフイブリノーゲン
（ウサギ由来）無添加の対照と８例のヒト血清を用いて
特異性を比較した。各血清ともn=3で測定し、その結果
を表１に示した。抗ヒトフイブリノーゲン（ウサギ由
来）を添加した試薬では、測定値のバラツキが少なく、
非特異反応のないことが示された。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例２ 実施例１の試薬組成において反応溶液はそのまま、Ru標
識抗体液に牛トロンビン精製品又はヒトトロンビン精製
品を10NIH/mLを加えて、特に非特異反応の大きい検体を
選んでn=10のPIVKA-IIの同時測定を行い、牛トロンビン
又はヒトトロンビン無添加の対照と比較し、その結果を
表２に示した。牛トロンビン精製品又はヒトトロンビン
精製品を添加した場合、対照と比較して、特異性が改善
された。なお、この血清を3000rpm、10分遠心後の上清
液で測定した結果、80mAU/mLであった。

【００２６】実施例３ 実施例１の試薬組成において反応溶液に抗ヒトフイブリ
ノーゲン（ウサギ由来）180μg/mLを添加し、かつRu標
識抗体に牛トロンビンを10 NIH/mLを加えて、同様に非
特異反応の大きい検体についてn=10のPIVKA-IIの同時測
定を行い、抗ヒトフイブリノーゲン（ウサギ由来）も牛
トロンビンも添加していない対照と比較し、実施例２の
結果とともに表２に示した。抗ヒトフイブリノーゲン
（ウサギ由来）添加と牛トロンビン添加を併用した場
合、牛トロンビン添加単独よりさらに特異性を増し、正
確に検体中のPIVKA-IIを測定できるようになった。

【００２７】

【表２】

【００２８】実施例４ 牛トロンビン精製品500NIHを１mLの50mMトリス緩衝液
（0.15MNaCl,pH7.8）に加え、恒温水槽中にて50℃で30
分加熱した。実施例１の試薬組成において、反応溶液に
抗ヒトフイブリノーゲン（ウサギ由来）180μg/mL、Ru
標識抗体液にこの加熱処理した牛トロンビン精製品を5N
IH/mLになるように加えた。非特異反応の大きい検体を
用いてPIVKA-IIを測定した結果を抗ヒトフイブリノーゲ
ン（ウサギ由来）も加熱牛トロンビンも加えない対照と
ともに表３に示した。表３の結果から明らかなごとく、
本実施例の場合も実施例３の場合と同様の非特異反応を
抑制する効果を示した。なお、この加熱後のトロンビン
の酵素活性を、クロモザイムTH（ベーリンガー社製）で
測定すると、加熱しないときに比べて1/5に減少した。

【００２９】

【表３】

【００３０】実施例５及び６ 実施例１の試薬組成において、反応溶液はそのまま、Ru
標識抗体液に非加熱ウサギ血清５％（対照：最終的にウ
サギ血清10％）、非加熱馬血清５％（実施例５）、非加
熱羊血清５％（実施例６）をそれぞれ添加して、非特異
反応の大きい検体を用いて非特異反応を抑制する効果を
測定し、その結果を表４に示した。

【００３１】

【表４】

【００３２】対照に比べて、馬血清又は羊血清を加えた
ものは非特異反応が抑制された。なお、この非特異の大
きい検体を3000rpm、10分遠心後に測定したら、74mAU/m
Lであった。

【００３３】

【発明の効果】以上述べたごとく、本発明は、ヒトフイ
ブリン様関連物質に反応する抗体及び／又はトロンビン
を試薬に加えて、血清又は血漿中のPIVKA-IIを特異的に
しかも高感度に測定することができるという効果を奏す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/531 G01N 33/574 C12Q 1/56

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトフイブリン様関連物質に反応する抗
   体及び／又はトロンビンを試薬に添加し、血清又は血漿
   中のPIVKA-IIを測定する免疫学的測定法。
2. 【請求項２】 前記トロンビンとしてトロンビンを含む
   動物血清及び／又は精製トロンビンを用いる請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】 前記ヒトフイブリン様関連物質に反応す
   る抗体として抗フイブリノーゲン及び／又は抗フイブリ
   ンを用いる請求項１又は２記載の方法。