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JP3313730B2 - クラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法 - Google Patents

クラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法

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JP3313730B2
JP3313730B2 JP51941397A JP51941397A JP3313730B2 JP 3313730 B2 JP3313730 B2 JP 3313730B2 JP 51941397 A JP51941397 A JP 51941397A JP 51941397 A JP51941397 A JP 51941397A JP 3313730 B2 JP3313730 B2 JP 3313730B2
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バレ，ミジェエル アンジェル モレノ
ニエト，マニュエル イエズス ロペス
デ ラ ビエヤ，アルフォンソ フアン コラドス
アルバ，アレヤンドロ ビタレール
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アンティビオティコス，ソシエダ アノニマ
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発酵の間に存在する可溶性ホスフェートの濃度を厳密
に制御し、脂質、好ましくはトリグリセリドのような炭
素源を任意に用いることで、ストレプトマイセス・クラ
ブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）の選択され
た株を発酵させることにより、クラブラン酸及び／又は
その塩を生産するための方法が記載される。
先行技術 クラブラン酸は、式： の分子であり、その有用性はβ−ラクターゼと呼ばれる
酵素を阻害する能力に基づく。その酵素は、大腸菌及び
クレブシエラ・エアロゲネス（Klebsiella aerogenes）
等のようないくつかのグラム陽性及びグラム陰性病原性
微生物が有しており、それらの作用のため、いくつかの
β−ラクタム抗生物質に対する耐性をそれらに与える。
結果として、前記抗生物質と混合されたクラブラン酸は
それらの抗菌範囲を増加させる。
クラブラン酸の生産は、例えばストレプトマイセス・
クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ATCC270
64及びストレプトマイセス・ジュモンジネンシス（Stre
ptomyces Jumonjinensis）NRRL5741等のようなストレプ
トマイセス（Streptomyces）属に属するいくつかの株に
より行われることが知られている。
初期の特許（ヨーロッパ特許0,182,522B1）に既に開
示されているように、クラブラン酸の産生は、例えばグ
リセロール又はマルトースのような同化可能な炭素源が
最初にのみ添加されるかわりに発酵の間に添加される場
合に、バッチ発酵において増加され得る。しかしなが
ら、この方法において得られたこの生産の増加はかなり
低い。従って、本発明の目的は、先行技術で周知である
方法により得られるより明らかに多い生産量でクラブラ
ン酸及び／又はその塩を得るための方法を供することで
ある。
多くの著者が抗生物質の生産へのホスフェートの阻害
効果を証明した（Martin,J.F.,1977,Adv.Biochem.Eng.
6:105〜127）。特に、ストレプトマイセス・クラブリゲ
ルスによるセファロスポリンの合成へのホスフェートの
阻害が見い出されており、（Ｌbbe,C.et.al.1985,Arc
h.Microbiol.140:317−320 and Lbbe,C.et al.1984,F
EMS Microbiol.Lett.25:75−79;Aharonowithz,Y.et al.
1977,Arch.Microbiol.115:169−173;Jhang,J.et al.198
9,FEMS,57:145−150）、前記微生物によるクラブラン酸
の合成へのホスフェートの阻害効果も見い出されている
（Lebrihi,A.et al.1987,Appl.Microbiol.Biotechnol.2
6:130−135;Romero,J.et al.1984,Appl.Microbiol.Biot
echnol.20:318−325）。しかしながら、先の論文に報告
される発見と反対に、我々は、驚くべきことに、クラブ
ラン酸の産生へのホスフェートの否定的効果のかわり
に、培養培地中の可溶性ホスフェートレベルが最適範囲
に達し、その範囲が維持される場合にクラブラン酸及び
／又はその塩の産生が本質的に増加することを見い出し
た。更に、我々は、培養培地中の可溶性ホスフェートの
濃度の厳密な制御が、栄養素の実際の添加より、その糸
の生産の増加により大きな影響を有することを見い出し
た。ストレプトマイセス・クラブリゲルスのバッチ又は
半連続（フェド・バッチ（fed−batch））培養を、クラ
ブラン酸、並びに他の抗生物質又は分子、典型的に二次
代謝物の産生のために用いた。本明細書の目的のため
に、バッチ培養という言葉は、栄養素が最初にのみ培養
培地内に導入され、そのブイヨンがその過程の終りにお
いてのみ発酵タンクから抽出される発酵を示す。半連続
（フェド・バッチ）培養という言葉は、栄養素が最初ば
かりでなくその発酵全体を通してもその培養培地内に導
入され、そのブイヨンがその過程の終りにのみ発酵タン
クから抽出される発酵を示す。クラブラン酸のバッチ又
はフェド・バッチ生産の過程は、粘度の大きな増加が最
初におこり、結果としてより長期間に生産段階を延長す
るために許容されるレベルの溶解酵素を維持することが
困難となるいくつかの特別の特徴を示す。結果として、
菌糸体のフラグメンテーション、粘度の減少及び生産量
の減少がおこり、その過程の終了が避けられない。
生物量、アミノ酸及び他の一次代謝物を得るために連
続培養が有利に適用される（Hospodka,J.1966,Theoreti
cal and Methodological Basis of Continuous Culture
of Microorganisms,pp 493−645;Malek,J and Fencl,
Z.eds.Academic Press New York）。しかしながら、二
次代謝物（抗生物質）を得るための連続培養の使用は、
本当に開示されておらず、又は限られた効能で行われて
いる（Vu−Trong,K.and Grey,1982 Biotechnol.Bioengi
neering 24:1093−1103;Trangott C.S.et al.1993 Apo
l.Microbiol.Biotechnol.39:433−437;Noack.D.1988,J.
Bas.Microbiol.28:101−106）。本明細書の目的のため
に、連続培養という言葉は、栄養素が最初及び発酵全体
を通しての両方で培養培地内に導入され、そしてブイヨ
ンのいくつかの部分がその終りにおいてばかりでなく発
酵全体を通して発酵タンクから抽出される発酵を含む。
我々は、可溶性ホスフェートを培養培地に加える及び／
又は発酵全体を通してその濃度を制御及び固定すること
により、高生産量で連続培養においてクラブラン酸及び
／又はその塩を得ることが可能で有利であることを見い
出した。連続培養において、その培養物を適切に希釈す
ることにより、その過程全体を通して粘度が次第に減少
し、それにより撹拌量の増加なしにより長期間、溶解酸
素の濃度が維持される（40％超）ことを可能にし、菌糸
体のフラグメンテーション及びクラブラン酸の生産期間
の長期化を防止する。栄養素及び水の添加の結果とし
て、設置容量の完全な充填が達成され、そのことは、適
切な作動容量を維持するために、継続的又は連続的のい
ずれかでの発酵過程全体を通してのブイヨンの連続的抽
出を必要とする。この方法において、その過程全体を通
して培養培地に適切なホスフェートを添加することによ
り、その過程を制御することにより、発酵サイクルの長
期化及び全生産量の増加が得られ、かわりに幾何的な設
置容量当りの生産収率を増加させる。
発明の記載 従って、本発明は、エレーション及び撹拌での液中発
酵において、バッチ、半連続又は連続培養において、ス
トレプトマイセス・クラブリゲルスATCC27064及び／又
はその変異体の選択された株を培養することにより、ク
ラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法であ
って、発酵の最初及び全体で培養培地中に存在する可溶
性ホスフェートの濃度が、用いられる培養の各々のタイ
プにより、バッチ培養における発酵の最初において500
〜4000mg/、又は半連続（フェド・バッチ）もしくは
連続培養において、発酵の最初において150〜600mg/
の間、そして後者の全体を通して20〜150mg/の間の範
囲内に固定及び／又は維持されることを特徴とする方法
を提供する。
本発明によるクラブラン酸及び／又はその塩を生産す
るための方法は、同化可能なＣ及びＮ源の存在下、任意
に無機塩の存在下で行われる。発酵は、好気的条件下で
液中培養で行われる。
最適発酵温度は、有利には、20℃〜40℃の間、特に22
℃〜30℃の間にある。
Ｃ源は各々（バッチ培養の場合）最初にのみ、又は半
連続（フェド・バッチ）もしくは連続培養の場合、断続
的もしくは連続的添加により発酵全体を通して、単一又
は複合栄養素として添加され得る。用いられる株によ
り、これらのＣ源は炭水化物（デキストラン、スター
チ、及びマルトース等）、グリセロールのようなポリオ
ール、例えば脂質（主に天然又は合成のいずれかのトリ
グリセリド）及び一般に微生物の増殖を許容するいずれ
かの他のＣ源を含む。我々は特に、脂質及びより詳しく
は天然もしくは合成トリグリセリドが本発明の方法を行
うための好ましいソースの１つとして考えられ得ること
を見い出し、他方先行技術においてこの効果を示すもの
はない。実際、我々は、このような炭素源を用いて、培
養培地（バッチ培養）への１回の最初の添加によっての
みでさえ、クラブラン酸及び／又はその塩の産生が、単
に可溶性ホスフェートの濃度が本発明に規定される限界
内にあることを注意することによって明白に増加し得る
ことを発見した。
培養培地は例えば大豆ミール、コーンスチープ液、可
溶性留出物、イーストエキス、綿−種子穀粉、ペプト
ン、カゼイン又は硫酸アンモニウムのような有機又は無
機Ｎの同化可能なソースも有する。
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、鉄、カルシウ
ム及びマグネシウム、クロライド、スルフェート及びホ
スフェートのような種々の無機塩も培養培地中に組み込
まれ得る。
クラブラン酸濃度は、高性能液体クロマトグラフィー
を用いて測定することが好ましいが、例えばクレブシェ
ラ・エアロゲネス（Klebsiella aerogenes）のようなβ
−ラクタマーゼを産生する微生物を用いることにより、
微生物学的に決定され得る。
ブイヨンからのクラブラン酸又はその塩の抽出は、他
の抗生物質、特に他のβ−ラクタムがイオン交換樹脂も
しくは溶媒又はいずれかの他の周知の慣用的方法を用い
て抽出される様式で行われ得る。
開始培地中の可溶性ホスフェートは、例えば市販のキ
ット（Boehringer Mannheim Automated Analysis for B
M/Hitachi System 704）により、簡単かつ迅速な手順に
より測定され得る。その方法の原理は、モリブデン酸ア
ンモニウムとの無機リンの反応である。次にこの無機リ
ンはホスフェートとして表現される。可溶性ホスフェー
トを分析するために、（培養ブイヨンから均一に取られ
た）サンプルは、固体を除去するために孔サイズ0.45μ
ｍのMilliporeフィルター又はその類似物を通して事前
にろ過されるべきである。このサンプルは、可溶性ホス
フェートの濃度が減菌過程に従って変動し得るので、培
養培地の減菌の後に取られるべきである。
全ホスフェートのアッセイは、全ブイヨンの1mlを取
り、1mlの硫酸及び5mlの硝酸を加えることによって行わ
れる。この溶液を、最終容量1mlの透明な溶液となるま
で加熱することによりエバポレートする。その最終容量
を蒸留水で25mlにし、可溶性ホスフェートについて先に
言及される方法によりアッセイする。
バッチ様に発酵を行う場合、発酵の始めにおける可溶
性ホスフェートの最適レベルは500〜4000mg/の間、好
ましくは800〜1600mg/の間であることが見い出され
た。
用いられる開始材料の性質及びその濃度のため、可溶
性ホスフェートのレベルがこれらの限界より十分に高く
又は低いなら、それは修正されるべきである。この終り
に、そのレベルが下限より低い場合、要求されるレベル
に到するまで、例えばカリウム又はナトリウム塩の形態
で減菌の前又は後により多くの無機ホスフェートが添加
され得る。あるいは、そのレベルが極めて高いなら、可
溶性ホスフェートの部分は、いずれかの沈殿剤を添加す
ることにより、例えば水酸化カルシウムもしくは酢酸カ
ルシウムのようなカルシウム化合物により、又はこの目
的が得られるのを確実にするいずれかの他のシステムに
より、沈殿され得る。
本発明によれば、バッチ培養における培地中の開始可
溶性ホスフェートの制御がない発酵系と比較して、産生
量の５倍までの増加が観察された。表１は、可溶性ホス
フェートの最適レベルで、及びこのレベル外で行われた
いくつかの発酵の結果を示す。
割合の増加（％）は、最終値（μg/ml）に100をかけ
て、この値を（72時間の場合）311又は（92時間の場
合）420で割った結果として表されたクラブラン酸及び
／又はその塩の生産量を意味とすると理解される。これ
は可溶性ホスフェートレベルが最適範囲外にある発酵の
結果を表す。
このホスフェートは、次の表２の結果に反映されるよ
うに、発酵ブイヨン中で可溶性であるべきである。この
表において、同様のレベルの全ホスフェートが、最適範
囲内であるか否かに依存する極めて異なる結果での発酵
を導く。
異なるホスフェートレベルにおける微生物の増殖の差
は少くとも主要な因子としては産生量の差の原因となる
ようではない。表３において、ホスフェートレベルがも
う一度産生量の増加の原因であるかのように、同様の増
殖において異なる生産量のレベルがあることが観察され
た。菌糸体容量は、10分間、2500gでの遠心で測定した
（ｇは重力を示す）。
発酵の間、ホスフェートの、及び全体の発酵を通して
まかれる栄養素の残りのフェド・バッチ添加の過程を行
うことができる。全可溶性ホスフェート（開始及び添加
したもの）の最適レベルはバッチモードにおけるレベル
より少し低く、400〜2000mg/の間にあることが見い出
された。
この投入量は、開始レベルが150〜600mg/の間であ
り、発酵全体を通しての可溶性ホスフェートのレベルが
20〜150mg/の間であるように行われるべきである。こ
の終りに、それを示される限界内に維持するために、ホ
スフェートレベルを上昇又は下降させることのいずれが
要求されるかによって、バッチ発酵の場合として、可溶
性ホスフェートイオン又はいずれかの沈殿剤カルシウム
化合物の投入が行われる。表４は、開始及び添加により
存在する異なる濃度の可溶性ホスフェートで行われたい
くつかの半連続発酵の結果を示す。
添加されたホスフェートの全量は、その添加が開始時
のかわりに発酵全体を通して行われる場合に産生量を損
うことなくかなり高くなることが観察され得る。行われ
た全てのテストは、そのレベルが要求される値より低い
発酵番号8,9及び10並びにそのレベルが高い番号16を除
き、示されるレベルにおける発酵全体を通して可溶性ホ
スフェートの濃度を維持した。
連続培養において、培養物の適切な希釈により、その
過程全体を通して粘度は次第に減少し、これにより撹拌
量を増やすことなく、より長期間、溶解酸素の濃度が維
持（40％超）されることが可能になり、菌糸体のフラグ
メンテーションを避け、そしてクラブラン酸の生産期間
の長期化を可能にする。栄養素及び水の添加の結果とし
て、設置容量の完全な充填が達成され、それは、適切な
作動容量を維持するためにブイヨンの連続的抽出を必要
とする。この方法において、その過程全体を通して培養
培地内に可溶性ホスフェートを添加することによりその
過程を制御することにより、発酵サイクルの長期化及び
全生産量の増加が達成され、次に設置容量当りの生産収
率を増加させる。
先の場合におけるような連続培養において、バッチに
おいて、そして半連続モードにおいて、可溶性ホスフェ
ートの開始時の添加が行われる。この添加は、バッチ及
び半連続培養において、150〜600mg/、好ましくは最
初200〜400mg/のオーダー、同じオーダーのブイヨン
中の次のレベルにおいて、20〜150mg/がより長期間
（50〜100時間）、維持されるより一般に少い。
バッチ又は半連続発酵におけるような連続培養におい
て、可溶性ホスフェート塩もしくはカルシウム化合物又
は他の有効な金属イオン封鎖剤の投入が、各々の場合に
必要とされる開始濃度を確立し、発酵の間、要求される
濃度を維持するために行われる。全可溶性ホスフェート
塩の添加は、半連続発酵に用いられるそれと同様である
か、又はそれより少し多い。
更に、ブイヨンの粘度を700cP未満の値に維持する目
的で、32日間後から培養培地に水が添加される。それ
は、古典的な系において加えられる栄養素の量を増加さ
せ、溶解酸素のレベルを40％超に維持し、そしてクラブ
ラン酸の生産期間を150〜170時間、延長させることを許
容する。
その過程の完了時に、古典的な培養では0.9〜1.1であ
るのに対して、1.5〜1.6の全希釈が一般に達成され、設
置された幾何的容量を経済的に価値あるものとする。そ
の過程は、栄養素を発酵全体を通して連続的に開始培地
に加えることにより行われる。これらの栄養素は主に炭
素源である。100時間後から、そのブイヨンの連続的又
は継続的な抽出が、容量を一定に維持し、培地の粘度を
700cP未満にする目的で、１日当り発酵槽の容量の2.5〜
14％の割合で行われる。その過程は、160〜170時間まで
延長され得る。
フェド・バッチ及び連続培養での、異なる栄養素及び
可溶性ホスフェートの異なるレベル又は投入量での実施
例19〜25を表５に再現する。
詳説するために、以下の実施例を記載する。
実施例１（比較例） 次の組成で接種培地を調製する： pHを6.7に調節し、培地をフラスコ当り40mlの割合で2
50mlエーレンマイカーフラスコ内に入れる。そのフラス
コに栓をして20分間、121℃で減菌する。
これにより調製された培地に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジンでのストレプトマイセス
・クラブリゲルスATCC27064の変異のステップ及び紫外
光での変異のいくつかのステップにより得られたクラブ
ラン酸を過剰産生する変異株の胞子の懸濁液を接種す
る。この懸濁液は、増殖及び胞子形成を許容することが
できる栄養培地で、斜面又はプレートから調製される。
接種後、その培地を5cmの偏心距離で250rpmでロタリ
ーアジテーター上で25℃で２日間、インキュベートす
る。
これにより調製された培養物を次の組成の５％発酵培
地の割合で接種するのに用いる。
培地のpHを7.0に調整し、その培地をフラスコ当り30m
lの割合で250mlフラスコ内に入れる。そのフラスコに栓
をし、121℃で20分間、減菌する。滅菌後、可溶性ホス
フェートをフラスコの１つにおいて測定し、100ml/の
値を得る。
実施例により、表１に示される発酵番号:1の結果を示
すために、0.5mlの0.5％水酸化カルシウム溶液を各々の
フラスコに加えた。その添加の後、フラスコの１つにお
いて、可溶性ホスフェートのレベルを再びアッセイし、
18mg/の値を得た。そのレベルにおいて、前記発酵番
号:1を行った。
これにより調製され、接種された発酵培地を5cmの偏
心距離で250rpmでロータリーアジテーター内で25℃でイ
ンキュベートする。96時間のインキュベーションにおい
て、得られたクラブラン酸の産生量は420μg/ml（HPL
C）であった。
実施例２（比較例） その手順は実施例１の場合と同じであるが水酸化カル
シウムの添加を行わない。結果として、100mg/の可溶
性ホスフェートを有する培地中で発酵を行う。96時間の
インキュベーションの後、クラブラン酸の産生量は790
μg/ml（HPLC）であった。（表１の発酵番号:2を参照の
こと）。
実施例３ 手順は実施例１の場合と同じであるが、この場合にお
いて、水酸化カルシウムの添加を行わず、pHを調節する
前に添加された0.12％のリン酸−カリウムが発酵培地の
調合に含まれる。減菌した後、１つのフラスコから可溶
性ホスフェートをアッセイし、発酵が900mg/の可溶性
ホスフェートを有する培地中で行われることを確立す
る。96時間のインキュベーションの後、クラブラン酸の
産生量は2210μg/ml（HPLC）であった（表１の発酵番
号:3を参照のこと）。
実施例４ 手順は実施例３と同じであるが、この場合、0.21％の
リン酸−カリウムが調合内に含まれる。可溶性ホスフェ
ートを減菌後に１つのフラスコからアッセイし、1580mg
/の可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵が行わ
れることを確立する。この場合、全ホスフェートも測定
し、表２に見られ得るように2380mg/の値を得た。96
時間のインキュベーションにおいて、クラブラン酸の生
産量は2240μg/ml（HPLC）であった（表１の発酵番号:4
を参照のこと）。
実施例５ 手順は実施例３と同じであるが、この場合、0.4％の
リン酸−カリウムが調合内に含まれる。可溶性ホスフェ
ートを減菌後に１つのフラスコからアッセイし、3000mg
/の可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵が行わ
れることを確立する。96時間のインキュベーションにお
いて、クラブラン酸の生産量は1750μg/ml（HPLC）であ
った（表１の発酵番号:5を参照のこと）。
実施例６（比較例） 手順は実施例３の場合と同じであるが、この場合、0.
95％のリン酸−カリウムが調合内に含まれる。可溶性ホ
スフェートを減菌後に１つのフラスコからアッセイし、
7000mg/の可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵
が行われることを確立する。96時間のインキュベーショ
ンにおいて、クラブラン酸の生産量は780μg/ml（HPL
C）であった（表１の発酵番号:6を参照のこと）。
実施例７（比較例） 手順は実施例３と同じであるが、この場合、0.245％
の三塩基リン酸カルシウムが調合内に含まれる（リン酸
−カリウムは含まれない）。可溶性ホスフェートを減菌
後に１つのフラスコからアッセイし、230mg/の可溶性
ホスフェートの結果を得る。この場合、全ホスフェート
も測定し、2265mg/の値を得た（表３の発酵番号:7を
参照のこと）。96時間のインキュベーションの後、クラ
ブラン酸の生産量は920μg/ml（HPLC）であった。
実施例８〜18（表４を参照のこと） 実施例１に記載されるのと同じ組成の接種培地を調製
し、500mlの培地で2000mlエーレンマイヤーフラスコ内
に入れる。そのフラスコに栓をして、20分間、121℃で
減菌する。
接種を実施例１に用いられるのと同様の胞子懸濁液で
行う場合、培地を5cmの偏心距離で250rpmでロータリー
アジテーター上で25℃で２日間、インキュベートする。
この培地400mlを取り、次の組成の150リッターのタン
クに接種するのに用いる。
培地のpHを7.3に調節し、その培地を20分間、121℃で
減菌する。115rpmの撹拌、0.5v/v/分のエレーション及
び1kg/cm2のひ面体圧で、約30時間、28℃でインキュベ
ーションを行う。
先の条件下でインキュベートされた培養物45リッター
を取り、次の組成の450リッターのタンクに移す。
培地のpHを7.0に調節し、その培地を20分間、121℃で
減菌する。減菌後、可溶性ホスフェートを測定し、この
場合、200mg/〜300mg/の結果となる。必要に応じ
て、異なる開始濃度を得る目的で、この値を適切な容量
の１％リン酸−カリウム溶液を加えることにより（実施
例10,11,12,14,15及び16）、又はカルシウム化合物で
（実施例８、適切な容量のCa（OH）２で溶液を加えたも
の）調整する。可溶性ホスフェートを調節する場合、接
種培養物45リッターの移動を行い、発酵を開始する。後
者を25℃の一定温度、115rpm、最初の24時間0.5v/v/
分、25時間から発酵の終りまで1.5v/v/分を維持しなが
ら、0.5kg/cm2のひ面体圧下で行う。
発酵全体を通して異なる濃度の可溶性ホスフェート
を、異なる容量の減菌１％リン酸−カリウム溶液を加え
ることにより得た（実施例13〜18）。
6.8〜7.2の間に維持するためにpHの自動制御を行う。
次の添加も行う： 大豆油:10〜120時間に100ml/h 33％グリセロール:32〜120時間に400ml/h １％リン酸−カリウム:0〜25時間に400〜1400ml/h及び 25〜50時間に1500〜5000ml/h 120時間のインキュベーションの後、クラブラン酸の
割合は表４に従って、990〜4020μg/mlの間で種々であ
る。
実施例19 培地の調製及び発酵条件の確立を、実施例８〜18（表
４）の通りに行うが、34g/の濃度のデキストリンを開
始サイクルに含めた。グリセロールの添加を省略し、We
ichol−92（Industria Quimica Lassemにより製造され
た60％のオレイン酸を含む合成トリグリセリド）及び１
％リン酸−カリウムのみを次の添加プログラムで供給し
た。
Weichol−92:10〜120時間に100ml/h リン酸−カリウム（１％）:0〜25時間に400〜1400ml/h及び 25〜50時間に1500〜5000ml/h 実施例20 手順は実施例19と同じであるが、合成トリグリセリド
Weichol−92の添加を大豆油のそれと置換する。
実施例21 手順は実施例19と同じであるが、発酵を172時間まで
延長し、減菌後の発酵槽の開始容量に対して24時間毎に
2.5％のブイヨン割合で、100時間の発酵後から全ブイヨ
ンの抽出を行う連続システムを確立する。
グリセロール（33％）、Priolube（Unichentaにより
製造されたグリセリルトリオレエート）及びリン酸−カ
リウム（１％）の添加を次のプログラムに従って、行っ
た。
Priolube:10時間〜最後に100ml/h Glycerol（33％）:32時間〜最後に400ml/h リン酸−カリウム（１％）:0〜25時間に400〜1400ml/
h及び 25〜50時間に1500〜5000m
l/h 実施例22 手順は実施例21に従うが、発酵を150時間まで延長
し、ブイヨンの抽出を24時間毎に９％の割合で行う。添
加は次のプログラムに従って修正する。
Priolube:10時間〜100時間に100ml/h 100時間〜最後に200ml/h グリセロール（33％）:32時間〜100時間に420ml/h 100時間〜最後に780ml/h リン酸−カリウム（１％）:0〜25時間に400〜1400ml/h 25〜50時間に1500〜5000ml/h 50時間〜最後に300ml/h 減菌水:32〜100時間に312ml/h 100時間〜最後に625ml/h 実施例23 手順は実施例22に従う。発酵を、24時間毎に14％の抽
出と共に、172時間まで延長する。減菌水の添加のプロ
グラムも、粘度レベルを低く維持するために含まれる。
Priolube:10時間〜100時間に130ml/h 100時間〜最後に240ml/h グリセロール（33％）:32時間〜100時間に515ml/h 100時間〜最後に960ml/h リン酸−カリウム（１％）:0〜25時間に400〜1400ml/h 25〜50時間に1500〜5000ml/h 50時間〜最後に300ml/h 減菌水:32〜100時間に630ml/h 100時間〜最後に1260ml/h 実施例24 手順は実施例23の通りであるが、開始発酵培地は全て
のその開始材料に対して30％だけ増加させる。発酵を15
5時間まで行い、抽出を24時間毎に14％で行う。用いた
添加のプログラムは次の通りである。
Priolube:10時間〜100時間に130ml/h 100時間〜最後に240ml/h グリセロール（33％）:32時間〜100時間に515ml/h 100時間〜最後に960ml/h リン酸−カリウム（１％）:0〜25時間に400〜1400ml/h 25〜50時間に1500〜5000ml/h 50時間〜最後に300ml/h 減菌水:32〜100時間に630ml/h 100時間〜最後に1260ml/h 実施例25 手順は実施例21の通りである。発酵を150時間まで延
長し、24時間毎に９％の割合で抽出を行う。グリセロー
ルの抽出を完全に省略し、トリグリセリドPriolubeの添
加量を増加させる。ホスフェート及び減菌水の添加量は
実施例22のそれと同一である。Priolubeの添加は次のプ
ログラムに従う。
Priolube:10時間〜100時間に320ml/h 100時間〜最後に590ml/h
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロペス ニエト，マニュエル イエズス スペイン国，エー−24010 リオン，カ リェ マルケス デ サンティラーナ 23 (72)発明者 コラドス デ ラ ビエヤ，アルフォン ソ フアン スペイン国，エー−24010 リオン，カ リェ バルカルセル ３−テルセイロセ ー (72)発明者 ビタレール アルバ，アレヤンドロ スペイン国，エー−24001 リオン，カ リェ カルメン ３ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 17/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バッチ培養において、エレーション及び撹
    拌を伴う液中発酵において、ストレプトマイセス・クラ
    ブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ATCC27064又
    はそれから得られた変異体を培養することにより、クラ
    ブラン酸又はその塩を生産するための方法であって、発
    酵の開始時においてその培地中に存在する可溶性ホスフ
    ェートの確立された濃度が、500〜4000mg/lの間の範囲
    内に固定されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】半連続又は連続培養において、エレーショ
    ン及び撹拌を伴う液中発酵において、ストレプトマイセ
    ス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ATC
    C27064又はそれから得られた変異体を培養することによ
    り、クラブラン酸又はその塩を生産するための方法であ
    って、発酵の開始時においてその培地中に存在する可溶
    性ホスフェートの確立された濃度が150〜600mg/lの間の
    範囲内に固定されるか、発酵全体を通して20〜150mg/l
    の範囲内に維持されるか、又は発酵の開始時の濃度が15
    0〜600mg/lの間の範囲内に固定されて発酵全体を通して
    20〜150mg/lの範囲内に維持されることを特徴とする方
    法。
  3. 【請求項３】培養培地中に存在する可溶性ホスフェート
    の濃度が、可溶性ホスフェートイオンをそのいずれかの
    形態において前記培養培地に添加することにより、開始
    時に固定されるか、発酵全体を通して維持されるか、又
    は開始時に固定されて発酵全体を通して維持されること
    を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】培養培地中に存在する可溶性ホスフェート
    の濃度が、それが要求される限界を超える場合に沈殿さ
    せることにより、開始時において固定されるか、発酵全
    体を通して維持されるか、又は開始時に固定され発酵全
    体を通して維持されることを特徴とする請求項１又は２
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記可溶性ホスフェートが、カルシウム化
    合物を前記培養培地に添加することにより沈殿されるこ
    とを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】１以上の天然又は合成トリグリセリドから
    なり、発酵の開始時、それ全体を通して、又は発酵の開
    始時及び全体を通して添加される炭素源が用いられるこ
    とを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。
  7. 【請求項７】発酵の開始時、それ全体を通して、又は発
    酵の開始時及び全体を通して添加される１以上の天然又
    は合成トリグリセリドが炭素源として排他的に用いられ
    ることを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】前記発酵が20〜40℃の温度で行われること
    を特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記発酵が22〜30℃の温度で行われること
    を特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。
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