JP3303481B2 - 反応性小胞体および形成剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、反応性小胞体形成剤、
およびこれを小胞体形成成分として含む反応性小胞体に
関する。さらに詳しくは医薬の運搬体、検査薬、診断
薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオ
エレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、
種々の機能性リポソームまたは脂肪乳剤等の小胞体の調
製に用いられる反応性小胞体形成剤、およびこれを小胞
体形成成分として含む反応性小胞体に関する。

【０００２】

【従来の技術】リポソームはリン脂質の二分子膜からな
る小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特
に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用
が注目されているが、リポソーム表面上または膜中に機
能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリ
ポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題と
なっている。

【０００３】従来、リポソーム表面上または膜中への機
能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆し
たリポソームの表面上の多糖上に置換したアミノエチル
カルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサク
シニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法
（Biochem. Biophys. Acta., 898, 323(1987)）、ある
いはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加え
ておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じ
たアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法
（J. Biol. Chem., 255, 10509(1980)）などがある。

【０００４】しかし、これらの従来法では、リポソーム
調製後にリポソーム膜表面上での多段階の化学反応を行
う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量
が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混
入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点
がある。

【０００５】一方、リポソームを生体内へ投与したと
き、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉され
るため、十分な効果が得られないことが指摘されている
（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。そこで、この網内
系器官で捕捉されてしまう問題点や、あるいはリポソー
ム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題
点を改善する方法として、リポソームの表面にポリエチ
レングリコール鎖を導入することが試みられている（例
えば、特開平１−２４９７１７号公報、FEBS letters,
268, 235(1990)）。また、ポリエチレングリコールで修
飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維
持できることが明らかになっている（Biochem. Biophy
s. Acta., 1066, 29-36(1991)）。しかし、このような
方法により得られるポリエチレングリコール鎖の導入さ
れたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソ
ーム表面上に機能性物質を固定化することはできない。

【０００６】さらに、特開平４−３４６９１８号公報に
は、マレイミド基を有するリポソームにまずチオール基
を付与したタンパク質（チオール化タンパク質）を反応
させ、次いで残存マレイミド基にチオール基を付与した
ポリアルキレングリコール（チオール化ポリアルキレン
グリコール）部分を含む化合物を反応させることによ
り、網内系器官での取込の改善された薬剤含有抗体結合
リポソームが得られることが記載されている。しかし、
このリポソームでは、抗体がポリアルキレングリコール
層の下部に隠蔽され、標的部位の抗原との反応が妨げら
れるため、期待される効果が十分には得られないという
問題点がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
問題点を解決するため、リポソームその他の小胞体にポ
リアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、このポ
リアルキレンオキシド鎖の先端に、簡単にかつ効率よく
種々の機能性物質を共有結合により固定化することがで
き、しかも機能性物質の導入量を多くすることが可能な
反応性小胞体形成剤、およびこの小胞体形成剤を小胞体
形成成分として含む反応性小胞体を提供することであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は次の反応性小胞
体形成剤および反応性小胞体である。 （１）下記一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘
導体からなることを特徴とする反応性小胞体形成剤。

【化３】 〔式中、Ｒ¹Ｃ（＝０）およびＲ²Ｃ（＝０）は炭素数３
〜３０の脂肪酸のアシル残基を表わし、同一でも異なっ
ていてもよい。Ｒ³は水素原子またはメチル基、ＡＯは
炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキ
レン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わ
す。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも
異なっていてもよく、またランダム状に付加していて
も、ブロック状に付加していてもよい。Ｙは次の有機基
を表わす。

【化４】 （ここで、ｐは２または３、ｑは０〜３の整数を表わ
す。）Ｍは水素原子またはアルカリ金属原子を表わ
す。〕 （２）上記（１）記載の反応性小胞体形成剤の一種以上
を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反応性小
胞体。

【０００９】本発明において、一般式〔１〕のＲ¹Ｃ
（＝０）、Ｒ²Ｃ（＝０）で表わされる脂肪酸のアシル
残基は、炭素数（カルボニル基の炭素も含む）３〜３
０、好ましくは８〜２０のアシル残基である。このよう
なアシル残基の具体的なものとしては、プロピオン酸、
酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリ
ン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグ
ノセリン酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２
−エチルヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレ
イン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−
オクタデカジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イ
ソステアリン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノー
ル酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中
に水酸基を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられ
る。

【００１０】これらの中では、安定なリポソームまたは
脂肪乳剤が形成できるという理由から、ミリスチン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オ
クタデカジエン酸のアシル残基が好ましく、特にパルミ
チン酸、ステアリン酸、オレイン酸のアシル残基が好ま
しい。Ｒ¹Ｃ（＝０）とＲ²Ｃ（＝０）とは同一であって
もよいし、異なっていてもよい。

【００１１】一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシア
ルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であ
り、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシト
リメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ
−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン
基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、
１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒド
ロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基
である。一般式〔１〕のｎは１〜１０００、好ましくは
１０〜３００、さらに好ましくは２０〜１２０の正数で
ある。

【００１２】ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の
種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場
合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加し
ていてもよい。親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエ
チレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この
場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異な
るアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオ
キシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付
加しているのが望ましい。ポリアルキレンオキシド鎖に
親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加モ
ル数を多くする。

【００１３】一般式〔１〕のＹは前記構造式〔２〕で表
わされる有機基である。一般式〔１〕のＲ³は水素原子
またはメチル基である。一般式〔１〕のＭは水素原子ま
たはナトリウムもしくはカリウム等のアルカリ金属原子
である。

【００１４】一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質
誘導体を製造するには、例えば一方の末端にカルボキシ
ル基、他方の末端に水酸基を有するポリアルキレングリ
コール誘導体と、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ）とを反応させて活性型とした後、ホスファチジル
エタノールアミン類を反応させ、次に得られた化合物に
Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を反応
させる方法などにより、容易に製造することができる。
ポリアルキレングリコール誘導体としてα−ヒドロ−ω
−カルボキシル−ポリオキシエチレン、ホスファチジル
エタノールアミン類としてジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン（ＤＰＰＥＡ）またはその塩を用い
た場合の反応式を次に示す。なお、式中Ｍおよびｎは前
記と同じものを示す。

【００１５】

【化５】

【００１６】また上記の製造方法の他にも、上記ポリア
ルキレングリコール誘導体のカルボキシル基を、塩化チ
オニル、クロロギ酸イソブチルなどを用いて酸クロリド
化した化合物、あるいはコハク酸イミド、カルボニルジ
イミダゾールなどにより活性エステル化した化合物と、
ホスファチジルエタノールアミン類とを反応させ、得ら
れた化合物にＣＤＩを作用させる方法などによっても容
易に製造することができる。

【００１７】さらに、一般式〔１〕においてＹがｑ＝０
の有機基である反応性リン脂質誘導体の製造は、両末端
に水酸基を有するポリアルキレンオキシド１モルに対し
て２モル以上の割合でＣＤＩを反応させ、得られた化合
物とホスファチジルエタノールアミン類とを反応させる
ことにより、容易に行うことができる。

【００１８】これらの反応は無溶媒で、あるいは水、ト
ルエン、ベンゼン、アセトニトリル、メタノール、１，
４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、クロロホルムな
どの溶媒中で、大気中または窒素、アルゴン、ヘリウム
もしくは二酸化炭素などの不活性ガス雰囲気下に、−４
０〜１２０℃、好ましくは０〜６０℃で、１０分間〜２
４０時間、好ましくは１時間〜４８時間、攪拌すること
により行うのが望ましい。反応終了後は、得られた反応
混合物はそのまま、あるいは蒸留、再結晶、再沈澱、吸
着剤処理、カラム処理、ゲル濾過、限外濾過、透析など
により精製・単離した後、反応性小胞体形成剤として使
用することができる。

【００１９】本発明の反応性小胞体形成剤は、アミノ
基、水酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級
アミノ基に対して高い反応性のあるオキシカルボニルイ
ミダゾール基を有しているので、このような官能基を有
する機能性物質と容易に反応し、共有結合が形成され
る。このため、本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形
成成分として用いることにより、小胞体にポリアルキレ
ンオキシド鎖を導入できるとともに、前記官能基を有す
る機能性物質に対する反応性を付与することができる。

【００２０】本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞
体形成剤を小胞体形成成分として含有し、前記官能基を
有する機能性物質に対する反応性を有するものである。
反応性小胞体形成剤は一種単独で含有されていても、二
種以上が組合されて含有されていてもよい。また小胞体
形成成分としては本発明の反応性小胞体形成剤の他に小
胞体を形成し得る他の小胞体形成成分が含まれていても
よい。

【００２１】本発明において小胞体とは、反応性小胞体
形成剤または反応性小胞体形成剤と他の小胞体形成成分
の親水基が界面の水相に向って配向した構造を有する粒
子を意味する。具体的なものとしては、二分子膜からな
る閉鎖小胞であるリポソーム、植物油およびリン脂質な
どの混合物が乳化された脂肪乳剤、またはミセルなどが
あげられる。

【００２２】本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式
〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体を一種単独
で、または二種以上組合せて、あるいは小胞体を形成し
うる他の小胞体形成成分、例えば大豆レシチン、卵黄レ
シチン、その他のリン脂質類、コレステロールやイント
ラリピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラ
ワー油などと混合して使用することにより、反応性リポ
ソームをはじめ反応性脂肪乳剤、反応性ミセルなどの反
応性小胞体を形成することができる。この場合、小胞体
は公知の方法により製造することができる。本発明の反
応性小胞体形成剤を用いて得られた反応性小胞体は、一
般式〔１〕で表わされる化合物中のオキシカルボニルイ
ミダゾール基を官能基として利用して、種々の機能性物
質を共有結合により導入することができる。

【００２３】次にそれぞれの反応性小胞体について詳し
く説明する。代表的な反応性小胞体である反応性リポソ
ームは、反応性小胞体形成剤を膜形成成分（小胞体形成
成分）として含有するものである。反応性小胞体形成剤
の含有量は、反応性小胞体形成剤および他の膜形成成分
の合計量に対して０．０１〜５０モル％、好ましくは
０．５〜３０モル％であるのが望ましい。０．０１モル
％未満では期待される効果が小さく、また５０モル％を
超えるとリポソームの安定性が低下するため、一般的に
は使用されない。一般式〔１〕で表わされる反応性リン
脂質誘導体は、一種類のものが含有されていても、二種
以上のものが組合されて含有されていてもよい。

【００２４】反応性小胞体形成剤と混合して用いられる
他の膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成
成分として用いられているものが制限なく使用できる。
具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオ
リピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチ
ン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルグリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和
基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリ
セリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグ
リセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂
質；その他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジ
ルポリエチレングリコール、「Biochem. Biophys. Act
a., 1066, 29-36(1991)」に記載されているホスファチ
ジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反
応物、およびこれらの混合物などがあげられる。

【００２５】反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤
およびレシチン、その他のリン脂質、コレステロール等
の他の膜形成成分を、有機溶媒等の適当な溶媒に溶解
し、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、
超音波法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール
注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／
Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、
種々の公知の方法によりリポソーム化することにより製
造することができる。また、これらの製造法を選択する
ことにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソー
ム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態
を有する反応性リポソームを製造することができる。

【００２６】このようにして得られた反応性リポソーム
は、リポソーム膜の内外表面にポリアルキレンオキシド
からなるスペーサーを介してオキシカルボニルイミダゾ
ール基が結合しているので、アミノ基、水酸基、チオー
ル基などの官能基、特に第１級アミノ基を有する機能性
物質を効率よくかつ簡単にリポソームの二分子膜上にポ
リアルキレンオキシドからなるスペーサーを介して、ウ
レタン結合、カーボネート結合またはチオカーボネート
結合により化学的に固定化することができる。

【００２７】反応性リポソームに固定化できる機能性物
質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、
蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標
識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性
化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他
のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホル
モン等の生理活性物質；医薬などがあげられる。

【００２８】反応性リポソーム上への機能性物質の固定
化反応は、種々の緩衝液等の水系溶媒、またはこれらの
水系溶媒とアセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフ
ラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン
等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと機
能性物質とを−１０〜１２０℃、アミノ基との反応の場
合は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０
℃、水酸基またはチオール基との反応の場合は好ましく
は４０〜１２０℃で、５分間〜１０００時間、好ましく
は３０分間〜７２時間攪拌下に反応させる方法などによ
り、一段階で容易に行うことができる。これらの条件外
では、リポソームの安定性が悪くなるため好ましくな
い。

【００２９】リポソーム表面上でのアミノ基を有する機
能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようにな
る。式中、Ｒ³、ＡＯ、ｎは前記と同じものを示す。

【化６】

【００３０】また、反応性リポソームの内部には、一般
のリポソームと同様に種々の物質を公知の方法により封
入することが可能である。被封入物質としては、例えば
色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発
光化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化
合物、熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激
応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、
脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物
質；医薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコー
ル、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性
高分子類などがあげられる。固定化反応または封入操作
の終了後は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠
心分離、静置沈降分離等の方法により精製を行うことが
できる。

【００３１】機能性物質を固定化したリポソームは、ポ
リアルキレンオキシド鎖の先端に機能性物質が固定化さ
れているので、ポリアルキレンオキシド鎖に邪魔される
ことなく機能性物質の作用が十分に発揮される。また、
ポリアルキレンオキシド鎖が導入されているので、従来
からのポリアルキレンオキシド鎖導入の効果、例えば長
期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、リポソー
ム内部に封入した物質の漏れ防止などの効果も期待でき
る。このため反応性リポソームは、医薬の運搬体、検査
薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクタ
ー、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代
替品など、種々の機能性リポソームとして利用できる。

【００３２】なお、反応性リポソームを製造する際、他
の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することによ
り、重合性の反応性リポソームとすることができる。重
合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用
することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オク
タデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、
野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂
発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものな
どがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４
−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリン
が好ましい。

【００３３】重合性リポソームは、リポソーム調製後
に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ
線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレ
ドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または
有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容
易に重合を行うことができる。このようにして得られた
重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているの
で、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等に
より粉末状に調製し、安定して使用することができる。

【００３４】他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤
は、本発明の反応性小胞体形成剤と、大豆油、サフラワ
ー油等の植物油と、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリ
ン脂質と、必要により添加される他の添加剤、例えばイ
ントラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助
剤、安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性
物質などを含む油脂混合物が乳化されたものである。油
脂混合物中に占める反応性小胞体形成剤の含有量は、
０．０１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％
であるのが望ましい。

【００３５】反応性脂肪乳剤は、公知の方法により製造
することができる。例えば、反応性小胞体形成剤、植物
油、リン脂質および必要により配合する添加剤を混合、
加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳化し、次にマ
ントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナイザー等で均
質化する方法などにより製造することができる。

【００３６】このようにして得られた反応性脂肪乳剤に
は、反応性リポソームの場合と同様にして、同様の機能
性物質を容易に固定化することができる。このため反応
性脂肪乳剤は、医薬の運般体、検査薬、診断薬、センサ
ー、固定化触媒などとして利用できる。

【００３７】上記以外の反応性小胞体である反応性ミセ
ルは、本発明の反応性小胞体形成剤だけからなるもので
あっても、レシチン、その他のリン脂質、コレステロー
ル等の他の成分が含有されているものであってもよい。
反応性ミセルも反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質
を固定化することができ、同様の用途に利用できる。

【００３８】

【発明の効果】本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式
〔１〕で表わされる構造を有しているので、小胞体にポ
リアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、このポ
リアルキレンオキシド鎖の先端に、簡単にかつ効率よく
種々の機能性物質を共有結合により固定化することがで
き、しかも機能性物質の導入量を多くすることができ
る。

【００３９】本発明の反応性小胞体は、上記小胞体形成
剤を小胞体形成成分として含有しているので、ポリアル
キレンオキシド鎖が導入されるとともに、小胞体にポリ
アルキレンオキシドからなるスペーサーを介して、簡単
にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定
化することができ、しかも機能性物質の導入量を多くす
ることができる。

【００４０】

【実施例】以下、実施例により、さらに詳細な説明を行
うが、本発明はこれらに限定されるものではない。 合成例１ α−ヒドロ−ω−カルボキシル−ポリオキシエチレン
（Ｍｗ：約３０００、重合度：約６５）１．０ｇ（０．
３ｍｍｏｌ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド
６８ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル１０ｍｌに溶
解させ、５℃で１時間攪拌した。次にジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン２１７ｍｇ（０．３ｍｍ
ｏｌ）を溶解させた酢酸エチル溶液１０ｍｌを加え、さ
らに６時間攪拌し、０℃で一晩静置した後、析出物をろ
過除去した。次に、ろ液にカルボニルジイミダゾール４
９ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌
し、得られた反応混合物をヘキサン１００ｍｌ中に注ぎ
込み、沈澱物をろ過回収し、目的の下記反応性リン脂質
誘導体を白色粉末状で得た（収率８８％）。反応の進行
は、ＩＲスペクトル（ＫＢｒ法）により、中間体はホス
ファチジルエタノールアミン中のアミノ基（Ｎ⁺Ｈ ₂ 伸
縮、３０００ｃｍ^-1）の消失およびアミド結合（Ｃ＝Ｏ
伸縮、１６４７ｃｍ^-1）の生成により、また目的物はポ
リエチレングリコール誘導体の末端の水酸基（ＯＨ伸
縮、３４２８ｃｍ^-1）の消失およびオキシカルボニルイ
ミダゾール結合（カルボニル結合）の生成（１７６０ｃ
ｍ^-1；Ｃ＝Ｏ伸縮）により確認した。

【化７】

【００４１】実施例１−１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）に、
合成例１で得られた反応性リン脂質誘導体を前記二者に
対して１０ｗｔ％（２．４ｍｇ、０．７μｍｏｌ）茄子
型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、
凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、
バス型超音波照射およびボルテックスミキサーにより多
重層リポソームを得た。また、さらにエクスツルーダー
により３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネート
製メンブランを順次通過させ、大きな単層の反応性リポ
ソームを得た。得られた反応性リポソームの粒径をレー
ザー散乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ
３７０ＨＰＬ、商標）を用いて測定したところ、平均粒
径は２５５ｎｍ（ＣＶ値１８％）であった。

【００４２】実施例１−２ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性リン脂質誘導
体として下記の化合物を５ｗｔ％（１．０μｍｏｌ）用
いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２７８ｎｍ、
ＣＶ値２３％）。

【化８】

【００４３】実施例１−３ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性リン脂質誘導
体として下記の化合物を３０ｗｔ％（３．６μｍｏｌ）
用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２４８ｎ
ｍ、ＣＶ値２５％）。

【化９】

【００４４】実施例１−４ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性リン脂質誘導
体として下記の化合物を１ｗｔ％（０．１μｍｏｌ）用
いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２５０ｎｍ、
ＣＶ値２１％）。

【化１０】

【００４５】実施例１−５ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性リン脂質誘導
体として下記の化合物を５ｗｔ％（０．６μｍｏｌ）用
いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２５０ｎｍ、
ＣＶ値２１％）。

【化１１】

【００４６】実施例１−６ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性リン脂質誘導
体として下記の化合物を５ｗｔ％（０．１μｍｏｌ）用
いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２９１ｎｍ、
ＣＶ値２４％）。

【化１２】

【００４７】実施例１−７ 実施例１−１と同様にして、ただし反応性リン脂質誘導
体として下記の化合物を２０ｗｔ％（４．０μｍｏｌ）
用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２２１ｎ
ｍ、ＣＶ値１８％）。

【化１３】

【００４８】実施例１−８ 実施例１−１と同様にして、ただし卵黄ホスファチジル
コリンの代わりに１，２−ジ（２，４−オクタデカジエ
ノイル）−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＤＰ）を用
いて平均粒径２５４ｎｍ（ＣＶ値２３％）の重合性を有
する大きな単層の反応性リポソームを得た。このリポソ
ームに０．７５Ｍｒａｄのγ線照射を行い、ＤＯＤＰを
重合させた。得られた重合リポソームは、Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過後、凍結乾燥により粉
末状サンプルとした。このリポソーム粉末は、生理的食
塩水で膨潤させることにより再生することができた。

【００４９】実施例２ 実施例１−１で得られた反応性リポソーム溶液（固形分
量２．５ｗｔ％）０．５ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌの西
洋山葵ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）／０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を、４℃で２４時間攪
拌してＨＲＰを反応性リポソームに固定化した。これを
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、
含リポソーム分画を分取した。これにＨＲＰの基質であ
る１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／
ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベー
トし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐
色の呈色が見られた。この結果から、実施例１−１の反
応性リポソームは、ＨＲＰと攪拌するだけでＨＲＰを固
定化できることが確認できた。

【００５０】比較例１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）のみ
により、実施例１−１と同様の操作により、固形分量
２．５ｗｔ％の大きな単層のリポソームを得た。このリ
ポソーム溶液に実施例２と同様にしてＨＲＰを作用さ
せ、ゲル濾過により精製後、１，２−フェニレンジアミ
ン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃
で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０
μｌを加えたが、発色は見られなかった。この結果か
ら、反応性リン脂質誘導体を膜形成成分として含まない
比較例１のリポソームでは、ＨＲＰを固定化することが
できなかったことがわかる。

フロントページの続き (56)参考文献 欧州特許557199（ＥＰ，Ｂ１) Ｇ．Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ ｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ ｉｃａ Ａｃｔａ，1993年 ７月 ７ 日，1149，180−184 Ｇ．Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ ｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ ｉｃａ Ａｃｔａ，1993年 ５月27日, 157−168 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 47/18 A61K 9/127 C07F 9/10 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式〔１〕で表わされる反応性リ
   ン脂質誘導体からなることを特徴とする反応性小胞体形
   成剤。 【化１】 〔式中、Ｒ¹Ｃ（＝０）およびＲ²Ｃ（＝０）は炭素数３
   〜３０の脂肪酸のアシル残基を表わし、同一でも異なっ
   ていてもよい。Ｒ³は水素原子またはメチル基、 ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、 ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０
   ００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキ
   レン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状
   に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
   Ｙは次の有機基を表わす。 【化２】 （ここで、ｐは２または３、ｑは０〜３の整数を表わ
   す。）Ｍは水素原子またはアルカリ金属原子を表わ
   す。〕
2. 【請求項２】 請求項１記載の反応性小胞体形成剤の一
   種以上を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反
   応性小胞体。