JP3278652B2

JP3278652B2 - Ｈｉｖ抗体の同時検出および識別のための迅速アッセイ

Info

Publication number: JP3278652B2
Application number: JP2000510023A
Authority: JP
Inventors: バラリ，アナドルゼラ・エス; ハケツト，ジヨン・アール，ジユニア; ヒツクマン，ロバート・ケイ; バリテツク，ビンセント，ジユニア; ネクローズ，エリザベス・シー; ゴールデン，アラン・エム; ブレナン，キヤサリン・エイ; デビア，スシル・ジー
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2002-04-30
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: DE69827642T2; ATE282828T1; CA2300374A1; US5922533A; EP1004023A2; WO1999009410A3; ES2234143T3; WO1999009410A9; WO1999009410A2; JP2001516027A; CA2300374C; EP1004023B1; DE69827642D1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、全般に、免疫アッセイに関し、より詳細に
は、短い処理時間で、試験サンプルにおける１型ヒト免
疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）のＭ群、ＨＩＶ−１の
Ｏ群、および２型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−
２）に対する抗体を検出して識別するために有用な免疫
アッセイに関する。

【０００２】現在、ＨＩＶ−１の２つの主要な系統発生
的な群は「Ｍ」群および「Ｏ」群と名付けられている。
Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓ他、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕ
ｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ１９９５、ＬｏｓＡｌａ
ｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌ
ｏｓＡｌａｍｏｓ、ＮＭ（１９９５）。単離されたＭ
群ＨＩＶ−１は、互いに系統性発生的にはほぼ等しい距
離にある亜群（Ａ〜Ｊ）にさらに分けられている。主と
して、Ｍ群が世界各地で単離されている。Ｏ群ＨＩＶ−
１ウイルスの配列に関する最も初期の報告により、この
ウイルスは、他のＨＩＶ−１亜群と同様にチンパンジー
のウイルスに密接に関連していることが示された。例え
ば、Ｌ．Ｇ．Ｇｕｒｔｌｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６８：１５８１〜１５８５（１９９４）；Ｍ．Ｖａｎ
ｄｅｎＨａｅｓｅｖｅｌｄｅ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ６８：１５８６〜１５９６（１９９４）；ＤｅＬｅ
ｙｓ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６４：１２０７〜１２
１６（１９９０）；ＤｅＬｅｙｓ他、米国特許第５，３
０４，４６６号；Ｌ．Ｇ．Ｇｕｒｔｌｅｒ他、欧州特許
公開第０５９１９１４Ａ２号を参照のこと。Ｏ群の配列
は、今日までに明らかにされたＨＩＶ−１配列の中で最
も大きく異なっている。Ｏ群ＨＩＶ−１株は、西部中央
アフリカ（カメルーン、赤道ギニア、ガボンおよびナイ
ジェリア）に固有であるが、Ｏ群ウイルスの感染患者
は、現在、ベルギー、フランス、ドイツ、スペインおよ
び米国において確認されている。例えば、Ｒ．ＤｅＬｅ
ｙｓ他（上記）；Ｐ．Ｃｈａｒｎｅａｕ他、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ２０５：２４７〜２５３（１９９４）；Ｉ．Ｌ
ｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６９：５６４０〜５６４９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｍ
ｐｌｅ他、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２３：３６９〜３７０
（１９９５）；Ａ．Ｍａｓ他、ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕ
ｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１２：１６４７〜１６
４９（１９９６）；Ｍ．Ａ．Ｒａｙｆｉｅｌｄ他、Ｅｍ
ｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ
ｓ２：２０９〜２１２（１９９６）、およびＭ．Ｐｅ
ｅｔｅｒｓ他、ＡＩＤＳ１１：４９３〜４９８（１９
９７）を参照のこと。

【０００３】Ｍ群ＨＩＶ−１の血清型は、大部分は、発
現したウイルスタンパク質（抗原）のアミノ酸配列によ
って、特に、コア領域およびエンベロープ（ｅｎｖ）領
域を含むウイルスタンパク質によって特徴づけられてい
る。これらの抗原は、構造的および機能的に類似してい
るが、特定の抗原に関して特異な抗体応答を誘発する多
様なアミノ酸配列を有する。

【０００４】ＨＩＶ−１感染を検出するための重要な血
清学的標的の１つは、４１，０００の分子量を有する膜
貫通タンパク質（ＴＭＰ）の糖タンパク質（ｇｐ）４１
である。ｇｐ４１は、ＨＩＶに関して血清陽性であると
考えられる個体において持続した強い抗体応答を誘発す
る高免疫原性タンパク質である。このタンパク質に対す
る抗体は、特に、血清変換時に最初に現れるものであ
る。ｇｐ４１に対する免疫応答は、ＡＩＤＳの臨床的段
階と同様に、無症候時において、抗ｇｐ４１抗体がほぼ
全般的に存在することによって明らかにされているよう
に、疾患の全期間を通して比較的強く残っているようで
ある。ｇｐ４１に対する抗体応答の大部分は、ｇｐ４１
内において十分に特徴付けられた免疫支配領域（ＩＤ
Ｒ）に対するものである。

【０００５】ＨＩＶ−２感染者は、西アフリカの最初の
固有地域以外のヒトにおいて認められており、そして西
アフリカに住んだことがある欧州人またはこの地域の出
身者との性的な関係を有した人々、およびこの固有地域
出身の性的パートナーとの同性愛者などにおいて報告さ
れている。２型ＨＩＶ（ＨＩＶ−２）によるＡＩＤＳの
治療が、現在、世界中で報告されている。例えば、Ａ．
Ｇ．Ｓａｉｍｏｔ他、Ｌａｎｃｅｔｉ：６８８（１９
８７）；Ｍ．Ａ．Ｒｅｙ他、Ｌａｎｃｅｔｉ：３８８
〜３８９（１９８７）；Ａ．Ｗｅｒｎｅｒ他、Ｌａｎｃ
ｅｔｉ：８６８〜８６９（１９８７）；Ｇ．Ｂｒｕｃ
ｋｅｒ他、Ｌａｎｃｅｔｉ：２２３（１９８７）；
Ｋ．Ｍａｒｑｕａｒｔ他、ＡＩＤＳ２：１４１（１９
８８）；ＣＤＣ、ＭＭＷＲ３７：３３〜３５（１９８
７）；Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ、Ｎａｔｕｒｅ３３２：２
９５（１９８８）を参照のこと。

【０００６】血清学的研究により、ＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２はそれらのコア抗原において多数の共通したエ
ピトープを有する一方で、これらの２つのウイルスのエ
ンベロープ糖タンパク質は交差反応性がほとんどないこ
とが示されてる。Ｆ．Ｃｌａｖｅｌ他、ＡＩＤＳ１：
１３５〜１４０（１９８７）。エンベロープ抗原のこの
ような限られた交差反応性は、ＨＩＶ−１に関する現在
利用可能な血清学的アッセイが、ＨＩＶ−２に対する抗
体を有するヒト血清のいくつかと反応しないことがある
理由を説明するものであると考えられている。Ｆ．Ｄｅ
ｎｉｓ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２６：１０００
〜１００４（１９８８）。最近発行された米国特許第
５，０５５，３９１号は、ＨＩＶ−２ゲノムの遺伝子地
図を明らかにし、そしてこのウイルスを検出するための
アッセイを提供している。

【０００７】Ｏ群ＨＩＶ−１に対する抗体の存在を検出
するために、ＨＩＶ−１（Ｍ群）および／またはＨＩＶ
−２に対する抗体の検出に必要な現在利用可能な免疫ア
ッセイの能力に関する関心が高まりつつある。Ｉ．Ｌｏ
ｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａ他、Ｌａｎｃｅｔ３４３：
１３９３〜１３９４（１９９４）；Ｃ．Ａ．Ｓｃｈａｂ
ｌｅ他、Ｌａｎｃｅｔ３４４：１３３３〜１３３４
（１９９４）；Ｌ．Ｇｕｒｔｌｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５１：１７７〜１８４（１９９
５）。これらの免疫アッセイによりＯ群が検出され得る
かどうかを分析するという問題を大きくしているのは、
Ｏ群ＨＩＶ−１単離体に感染し、かつ／またはそれに対
する抗体を有する患者の血清サンプルの入手が限られて
いることである。今日までのところ、西部中央アフリカ
以外では、Ｏ群ＨＩＶ−１単離体に感染していると診断
された患者はほとんどおらず、このため、研究者は、こ
のウイルスに関して、西部中央アフリカ諸国の患者をス
クリーニングしなければならない。西部中央アフリカで
のスクリーニング手順は、このようなアッセイを行うた
めに必要な時間ならびにそのために必要とされる装置の
両方によって妨げられている。

【０００８】Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２に対する抗体を検出するために利用可能な従来
の結合アッセイは、通常、結果を得るために約２時間か
ら４時間またはそれ以上の時間を必要とする。このよう
なアッセイはさらに、操作するために電気を必要とする
インキュベーターおよび標識読み取り装置を含む様々な
装置を利用することを含む。このようなアッセイは、特
異的な結合メンバーの免疫反応物、通常は抗体および抗
原の免疫反応物を含む：この場合、この特異的な結合対
の一方は、シグナル発生化合物により標識される（例え
ば、抗体は、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、放射
性同位体、直接目で確認できる標識などで標識され
る）。分析物の含有が疑われる試験サンプルは、標識さ
れた試薬（例えば、標識された抗分析物抗体）と混合し
て、免疫反応が起こるのに十分な時間および条件下でイ
ンキュベーションすることができる。反応混合物は、続
いて、この分析物／標識された試薬の複合体と会合する
標識（結合した標識化試薬）、あるいは分析物との複合
体を形成しなかった標識（遊離状態の標識化試薬）のい
ずれかを検出するために分析される。分析物の存在およ
び／または量は、通常、固定化されている標識された試
薬および結合メンバーに結合する分析物の容量、あるい
は不溶性の相補的な結合メンバーによって示される。

【０００９】このようなアッセイを行い、そして結果を
得るために通常必要とされる時間が長すぎる（すなわ
ち、２時間〜４時間である）か、あるいはアッセイを行
うために必要な装置および／または電気が得られない状
況および場所が存在する。そのような状況では、好まし
い試験は、安価でなければならず、装置をほとんどまた
は全く必要としないことが望ましく、そして５分もの少
ない時間でスクリーニングアッセイの結果が得られるこ
とが望ましい。

【００１０】試薬を含浸させた試験ストリップを特異的
な結合アッセイにおいて使用することはよく知られてい
る。例えば、米国特許第４，３６１，５３７号（Ｄｅｕ
ｔｓｃｈ他）および米国特許第５，１６０，７０１号
（ＢｒｏｗｎＩＩＩ他）を参照のこと。そのような手
順において、試験サンプルが試験ストリップの一部分に
加えられ、そして試験ストリップ材の中を移動する、す
なわち、毛管作用で移動する。従って、検出または測定
され得る分析物は、おそらくは、試験サンプル自身、ま
たは別に添加された溶液であり得る溶出溶媒の助けによ
って試験ストリップ材の中またはそれに沿って通過す
る。分析物は、分析物に対する相補的な結合メンバーが
固定化されている試験ストリップ上の捕獲帯域または検
出帯域の内部にまで移動し、あるいはそのような帯域を
通り抜ける。分析物が検出帯域で結合する程度は、試験
ストリップ内に同様に取り込まれ得る標識された試薬、
または別に加えることができる標識された試薬の助けに
より測定することができる。

【００１１】一般に、試験ストリップは、毛管作用（す
なわち、米国特許第４，９５６，３０２号（Ｇｏｒｄｏ
ｎ他）において例示されているような毛管作用による移
動作用またはクロマトグラフィー的作用）によって溶液
を移動させることができる物質を含む。試験ストリップ
における異なる領域または帯域は、分析物がそのような
帯域に輸送されるか、またはそのような帯域を通過した
ときに、検出可能なシグナルを生成させるために必要な
アッセイ試薬を含有する。そのようなデバイスは化学ア
ッセイおよび結合アッセイの両方に好適であり、そして
展開溶液を使用して、分析物を試験ストリップに沿って
移動させる。さらに、これまでのアッセイは、検出可能
なシグナルを生成させるために必要なアッセイ試薬の安
定性および効率を確認するために、典型的には、各製造
ロットからの１つまたは複数のストリップを陽性および
陰性の両方の対照について別途アッセイすることが少な
くとも必要である。

【００１２】従って、Ｍ群ＨＩＶ−１および／またはＯ
群ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に対する抗体の
分離または同時検出を行うために開発されたアッセイシ
ステムは、試験サンプル中のウイルスのどれかまたはそ
のすべてに対する抗体の特異的な存在を検出し、その一
方でそれらを識別するために有用な試薬を含有しなけれ
ばならない。従って、ＨＩＶのＭ群、ＨＩＶのＯ群およ
びＨＩＶ−２に対する抗体のみと反応し得る試薬が必要
である：ただし、このような試薬は互いに交差反応を全
く示さないか、あるいは限られた交差反応を示す。この
ような試薬を取り込むことができ、そして個体をスクリ
ーニングして、短時間で結果を得るために使用すること
ができる廃棄可能なアッセイデバイスを提供することは
また有益である。

【００１３】（発明の要旨）本発明は、試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体を含む分析物
を同時に検出して識別するための方法を提供する。この
方法は、（ａ）試験サンプルを、近位端および遠位端を
有し、分析サンプルを毛管作用によって近位端から遠位
端の近くにまで移動させ、そして分析物に対する少なく
とも１つの固定化された捕捉試薬を含有するストリップ
を有する分析デバイスと、分析物および捕捉試薬の結合
による捕捉試薬／分析物複合体が形成されるのに十分な
時間および条件下で接触させること；および（ｂ）スト
リップ上の捕捉試薬部位での可視的な色の変化を検出す
ることによって、分析物（１つまたは複数）の存在を決
定することを含み、Ｏ群ＨＩＶ−１のための捕捉試薬
は、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２および
配列番号５４、配列番号５８および配列番号６０からな
る群より選択されるポリペプチドを含み、Ｍ群ＨＩＶ−
１のための捕捉試薬は配列番号５６のポリペプチドを含
み、そしてＨＩＶ−２のための捕捉試薬は配列番号５５
のポリペプチドを含む。好ましくは、上記のポリペプチ
ド捕捉試薬は組換え技術により製造されるが、精製タン
パク質（ポリペプチド）または合成ペプチドが利用され
得ることも包含される。固定化された捕捉試薬は、文
字、数字、アイコン、または記号として配置することが
できる。さらに、この方法は、近位端および固定化され
た患者捕捉試薬の間の位置においてストリップに含有さ
れる表示用試薬を含む。この表示用試薬はシグナル発生
化合物を含む。このような化合物は、発色体、触媒、発
光性化合物、化学発光性化合物、放射性元素、および直
接的な可視標識からなる群より選択される。好ましく
は、表示用試薬は、コロイド状金属粒子、コロイド状非
金属粒子、染色粒子または着色粒子、およびリポソーム
からなる群より選択される直接的な可視試薬を含む。表
示用試薬は、非金属粒子としてセレンをさらに含む。試
験サンプルは、好ましくは体液である。このような体液
は、全血、血漿、血清、尿および唾液からなる群より選
択される。

【００１４】本発明はさらに、試験サンプルにおけるＯ
群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対す
る抗体を含む分析物を同時に検出して識別するための分
析デバイスを提供する。このデバイスは、近位端および
遠位端を有し、分析サンプルを毛管作用によって近位端
から遠位端の近くにまで移動させることができ、そして
分析物に対する少なくとも１つの固定化された捕捉試薬
を、分析物および捕捉試薬を結合させるために含有する
ストリップを含み、そしてＯ群ＨＩＶ−１のための捕捉
試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２お
よび配列番号５４、配列番号５８および配列番号６０か
らなる群より選択されるポリペプチドを含み、Ｍ群ＨＩ
Ｖ−１のための前記捕捉試薬は配列番号５６のポリペプ
チドを含み、そしてＨＩＶ−２のための前記捕捉試薬は
配列番号５５のポリペプチドを含む。このポリペプチド
は、好ましくは、組換え技術により製造されるが、精製
タンパク質（ポリペプチド）および合成ペプチドが使用
され得ることも包含される。分析デバイスは、文字、数
字、アイコン、または記号として配置されている固定化
された捕捉試薬をさらに含む。さらに、分析デバイス
は、近位端および固定化された患者捕捉試薬の間の位置
においてストリップに含有される表示用試薬を含む。こ
の表示用試薬はシグナル発生化合物を含み、このような
化合物は、発色体、触媒、発光性化合物、化学発光性化
合物、放射性元素、および直接的な可視標識からなる群
より選択される。好ましくは、表示用試薬は、コロイド
状金属粒子、コロイド状非金属粒子、染色粒子または着
色粒子、およびリポソームからなる群より選択される直
接的な可視試薬を含む。試験サンプルは、好ましくは体
液である。このような体液は、全血、血漿、血清、尿お
よび唾液からなる群より選択される。

【００１５】さらに、本発明は、特異的な結合アッセイ
において使用される試験キットを提供する。この試験キ
ットは、試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群Ｈ
ＩＶ−１およびＨＩＶ−２に特異的な抗体の存在または
量を決定するための分析デバイスを含み、そして近位端
および遠位端を有するストリップをさらに含む：ただ
し、試験サンプルは毛管作用によって近位端から遠位端
の近くにまで移動することができ、そしてストリップ
は、分析物、補助的な特異的結合メンバー、および表示
用試薬からなる群より選択される選択される要素に結合
する固定化された捕捉試薬を含有する。Ｏ群ＨＩＶ−１
のための捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配
列番号５２および配列番号５４、配列番号５８および配
列番号６０からなる群より選択されるポリペプチドを含
み、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は配列番号５
６のポリペプチドを含み、そしてＨＩＶ−２のための前
記捕捉試薬は配列番号５５のポリペプチドを含む。この
ポリペプチドは、好ましくは、組換え技術により製造さ
れる。精製タンパク質または合成ペプチドもまた使用す
ることができることが包含される。表示用試薬はシグナ
ル発生化合物を含み、このような化合物は、発色体、触
媒、発光性化合物、化学発光性化合物、放射性元素、お
よび直接的な可視標識からなる群より選択される。好ま
しくは、表示用試薬は、コロイド状金属粒子、コロイド
状非金属粒子、染色粒子または着色粒子、およびリポソ
ームからなる群より選択される直接的な可視試薬を含
む。試験キットは、陽性の試薬対照および陰性の試薬対
照をさらに含む。

【００１６】（発明の詳細な説明）従来のアッセイよりも短い時間でＭ群ＨＩＶ−１、Ｏ群
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に関するスクリーニングが
できることが、迅速な結果が患者のカウンセリングおよ
び治療のために必要な状況で求められている特徴であ
る。そのようなスクリーニングアッセイは、従来のスク
リーニングアッセイと同じような程度の感度および特異
性が、さらに一層短い時間で得ることができなければな
らない。本発明はそのようなアッセイを提供し、そして
以下に本発明を説明する。

【００１７】下記の用語は、別途示されていない限り、
下記の意味を有する。

【００１８】用語「試験サンプル」は、分析物（目的の
抗体または目的の抗原など）の供給源である個体の身体
成分をいう。このような成分はこの分野では周知であ
る。試験サンプルは、供給源から得られるように直接的
に、あるいはその性質を改変するような前処理を行った
後で使用することができる。このような試験サンプルに
は、本明細書中において記載されている方法により試験
することができる生物学的サンプルが含まれ、そして全
血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、ならびに呼
吸器管、腸管および生殖泌尿管の様々な外分泌物、涙、
唾液、乳汁、白血球、ミエローマなどのヒトおよび動物
の体液；および細胞培養上清などの生物学的液：固定さ
れた組織標本；および固定された細胞標本が含まれる。
試験サンプルは、血液からの血漿の調製、粘性液の希釈
などの前処理を使用前に調製できる；処理方法には、抽
出、ろ過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活性化、および試
薬の添加が含まれ得る。そのような前処理はまた、液体
媒体を得るために、あるいは分析物を放出するために、
分析物の含有が疑われる固体材料を改変することを含む
こともできる。

【００１９】本明細書中で使用されている「分析物」
は、試験サンプルに存在し得る検出され得る物質であ
る。分析物は、天然に存在するその特異的な結合メンバ
ー（抗体など）が存在するか、または特異的な結合メン
バーをそれに関して調製することができる任意の物質で
あり得る。従って、分析物は、アッセイにおいて１つま
たは複数の特異的な結合メンバーに結合し得る物質であ
る。「分析物」にはまた、任意の抗原性物質、ハプテ
ン、抗体、およびその組合せが含まれる。特異的な結合
対の成分として、分析物は、天然に存在する特異的な結
合性パートナー（対）によって、例えば、ビタミンＢ１
２を測定するための特異的な結合対の成分としての固有
因子タンパク質の使用、葉酸を測定するための葉酸結合
性タンパク質の使用、または炭水化物を決定するための
特異的な結合対の成分としてのレクチンの使用によって
検出することができるが、これらに限定されない。分析
物には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチ
ド標的など、ハプテン、抗体、高分子、およびその組合
せなどの任意の抗原性物質が含まれるが、これらに限定
されない。

【００２０】「分析物類似体」は、分析物に特異的な結
合メンバーと交差反応する物質をいうが、分析物自身が
交差反応するよりも大きい程度で、あるいは小さい程度
で交差反応し得る。分析物類似体は、分析物類自体が目
的の分析物と共通した少なくとも１つのエピトープ部位
を有する限り、改変された分析物、ならびに分析物分子
のフラグメントまたは合成された部分を含むことができ
る。分析物類似体の例は、分析物分子全体の少なくとも
１つのエピトープと同じものを有し、その結果、分析物
類似体が分析物に特異的な結合メンバーに結合し得る合
成されたペプチド配列である。

【００２１】本発明は、特異的な結合メンバーを利用す
るアッセイを提供する。本明細書中で使用されている
「特異的な結合メンバー」は、特異的な結合対の一方の
成分である。すなわち、そのような分子の一方が化学的
または物理的な手段により第２の分子に特異的に結合す
る２つの異なる分子である。従って、一般的な免疫アッ
セイの抗原および抗体の特異的な結合対に加えて、他の
特異的な結合対には、例えば、ビオチンおよびアビジ
ン、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配
列、エフェクター分子およびレセプター分子、補酵素お
よび酵素、酵素阻害剤および酵素などが含まれ得るが、
これらに限定されない。さらに、他の特異的な結合対に
は、例えば、相補的なペプチド配列、ペプチド配列およ
びその配列またはタンパク質全体に特異的な抗体、ポリ
マー状の酸および塩基、色素およびタンパク質結合体、
ペプチドおよび特異的なタンパク質結合体（例えば、リ
ボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼ
Ｓ−タンパク質）が含まれるが、これらに限定されな
い。さらに、特異的な結合対には、元の特異的な結合メ
ンバーの類似体である成分（例えば、分析物類似体）が
含まれ得る。特異的な結合対成分には、タンパク質、ペ
プチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的などが含まれ得
る。免疫反応性の特異的な結合メンバーには、抗原、抗
原フラグメント、抗体および抗体フラグメント（モノク
ローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）、なら
びにその複合体（組換えＤＮＡ分子によって形成される
複合体を含む）、葉酸を測定するための葉酸結合タンパ
ク質、または炭水化物を決定するための特異的な結合対
の成分としてのレクチンの使用が含まれる。

【００２２】本明細書中で使用されている用語「ハプテ
ン」は、抗体に結合することができるが、キャリアタン
パク質に結合されない限り、抗体生成を誘発することが
できない部分的な抗原または非タンパク質結合メンバー
をいう。

【００２３】「標識された試薬」としてもまた示される
「表示用試薬」は、ＨＩＶの特異的な結合メンバーに結
合させた（結びつけた）外部の手段によって検出できる
測定可能なシグナルを発生し得るか、またはそのような
シグナルを発生する「シグナル発生化合物」（「標
識」）を含む。表示用試薬はまた、ＨＩＶの特異的な結
合対の抗体成分であることに加えて、任意の特異的な結
合対のメンバーであり得る。これには、ビオチンまたは
抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物または
レクチン、相補性ヌクレオチド配列、エフェクター分子
またはレセプター分子、酵素補因子または酵素、酵素阻
害剤または酵素などのハプテン−抗ハプテン系のいずれ
か一方が含まれる。免疫反応性の特異的な結合メンバー
は、抗体、抗原、あるいはサンドイッチアッセイの場合
のようにＨＩＶに、競合アッセイの場合のように捕捉試
薬に、または間接的なアッセイの場合のように補助的な
特異的結合メンバーに結合し得る抗体／抗原複合体であ
り得る。シグナル発生化合物と特異的な結合メンバーと
の結合は共有結合または非共有結合であり得るが、その
結合方法は本発明には重要ではない。標識により、表示
用試薬は、試験サンプル中の分析物の量に直接的または
間接的に関連する検出可能なシグナルを生成することが
できる。表示用試薬の特異的な結合対成分は、分析物に
直接結合するように、あるいは補助的な特異的結合メン
バーによって分析物に間接的に結合するように選択され
る。標識された試薬は、試験デバイスに組み込むことが
でき、あるいは試験溶液を得るために、試験サンプルと
一緒にすることができ、あるいは試験サンプルとは別に
デバイスに加えることができ、あるいは捕獲部位で再度
沈澱させるか、または可逆的に固定化することができ
る。さらに、結合メンバーは、適切な結合方法によっ
て、アッセイの前あるいはその間に標識することができ
る。

【００２４】包含される様々な「シグナル発生化合物」
（「標識」）には、発色体、酵素などの触媒、フルオレ
セインおよびローダミンなどの発光化合物、ジオキセタ
ン類、アクリジニウム類、フェナントリジウム類および
ルミノールなどの化学発光化合物、放射性元素、および
直接的な可視標識が含まれる。酵素の例には、アルカリ
ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼなどが含まれる。直接的な可視標識の例
には、金などのコロイド状金属粒子、セレンなどのコロ
イド状非金属粒子、染色されたプラスチックまたは染色
された微生物などの染色粒子または着色粒子、着色また
は着色可能な有機ポリマーラテックス粒子（Ｄｕｒａｃ
ｙｔｅ（登録商標）、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ、ＩＬ）から入手可
能な誘導体化された赤血球）、リポソーム、または直接
的な可視物質を含有する他のベシクルなどが含まれる。
特定の標識を選択することは重要ではない。標識は、そ
れ自身によるシグナル（可視的に検出可能な着色された
有機ポリマーラテックス粒子など）、あるいは装置によ
り測定可能なシグナル（発光化合物または放射能標識元
素など）、あるいは酵素／基質シグナル生成システムな
どの１つまたは複数のさらなる物質と組み合わせて検出
可能なシグナルを生成させることができる。様々な異な
る標識された試薬は、標識、または標識された試薬の特
異的な結合メンバーの成分を変えることによって得るこ
とができる。その選択には、所望の検出手段によって検
出され得る分析物の検討が含まれることは当業者により
理解されている。

【００２５】セレン、着色粒子またはブラックラテック
スなどの可視的に検出可能な粒子を標識として使用する
場合、標識された試薬の結合メンバー（１つまたは複
数）は、粒子に結合させることができる。あるいは、そ
のような結合メンバー（１つまたは複数）は異なるバッ
チの粒子に結合させることができ、そしてその後、粒子
は混合することができる。

【００２６】「シグナル生成成分」は、別のアッセイ試
薬と反応し、あるいは分析物と反応して、分析物の存在
を示し、かつ／またはいくつかのアッセイ特性が満たさ
れていることを示すために役立つ反応生成物またはシグ
ナルを生成し得る任意の物質をいう。シグナル生成成分
は、可視的手段または装置的手段によって検出すること
ができる。本明細書中で使用されている「シグナル生成
システム」は、所望の反応生成物またはシグナルを得る
ために必要なアッセイ試薬の集団をいう。従って、１つ
または複数のシグナル生成成分は、検出可能なシグナル
を発生させるために、標識と反応させることができる。
例えば、標識が酵素である場合、検出可能なシグナル
は、検出可能な反応生成物を得るために、酵素を１つま
たは複数の基質と反応させることによって、あるいはさ
らなる酵素および基質と反応させることによって増幅さ
れる。

【００２７】本発明の好ましい実施形態において、可視
的に検出可能な標識は、標識された試薬の標識成分とし
て使用され、それによって試験サンプル中の分析物の存
在または量が、検出部位におけるさらなるシグナル生成
成分を必要とすることなく、直接可視的に、あるいは装
置により読み取られる。使用するために適切な物質に
は、金などのコロイド状金属、および着色粒子、ならび
にコロイド状のセレン粒子、テルル粒子およびイオウ粒
子などの非金属コロイドが含まれる。

【００２８】「固定化（された）捕捉試薬」は、１つま
たは複数の「捕獲部位」を形成するために、固相支持体
またはクロマトグラフィーストリップの一部に、または
その表面に取り付けられている１つまたは複数の特異的
な結合メンバーをいう。そのような捕獲部位において、
分析物、陽性の対照試薬および／または標識された試薬
がストリップの表面に固定化されるか、あるいは固定化
された試薬は、ストリップを通り抜ける分析物および／
または標識された試薬の移動を示す。その取り付け方法
は、本発明には重要ではない。固定化された捕捉試薬
は、未結合のアッセイ試薬および試験サンプルの残り成
分から分析物および／または標識された試薬を実質的に
分離することによって検出可能なシグナルの観測を容易
にする。さらに、固定化試薬は、任意の適切な結合方法
によって、アッセイを行う前に、あるいはアッセイを行
っている間に固相に固定化することができる。

【００２９】典型的には、本発明の捕獲部位は、固定化
された捕捉試薬と分析物との間の特異的な結合反応が生
じるように固相支持体の定められた部分または規定され
た部分である。これにより、固相支持体の他の部分とは
対照的に、１つまたは複数の捕獲部位で固定化されてい
る標識の検出が容易になる。この規定された部位は、典
型的には固相支持体の５０％未満であり、好ましくは固
相支持体の１０％未満である。固定化された試薬は、浸
漬することによって、ペンで刻むことによって、毛細管
または試薬ジェットプリンティングもしくはバイオドッ
ティングの使用による分注を行うことによって、あるい
は任意の他の分注技術によって固相材に加えることがで
きる。さらに、捕獲部位は、例えば、標識がそのような
部位に固定化されていない場合でも、固相材上での捕獲
部位の位置が可視的にまたは装置により決定され得るよ
うに色素で印を付けることができる。好ましくは、固定
化された試薬は、捕獲部位が試験サンプルと直接接触し
ないようにストリップに配置される。すなわち、試験サ
ンプルは、固定化された試薬と接触する前に、ストリッ
プの少なくとも一部を通過する毛管作用によって移動し
なければならない。

【００３０】固定化された捕捉試薬は、固相材の表面ま
たはその内部において、１つの捕獲部位または検出部位
に、あるいは多数の部位に提供され得る。本発明の好ま
しい実施形態により、固定化された患者捕捉試薬（１つ
または複数）および固定化された手順上の捕捉試薬が提
供される。固定化された捕捉試薬はまた、異なる検出様
式または測定様式を得るために様々な形態で提供され得
る。例えば、固定化された捕捉試薬は、文字、数字、ア
イコンまたは記号、またはその任意の組合せとして配置
することができる。文字として配置される場合、固定化
された捕捉試薬は、１個の文字であり得るか、あるいは
「ＰＯＳ」、「ＮＥＧ」または「ＯＫ」などの単語また
は省略語を形成する文字の組合せであり得る。あるい
は、固定化された捕捉試薬は、１つの記号として、ある
いはまたは記号の組合せとして配置することができる：
例えば、プラス、マイナス、チェックマーク、縞、ひし
形、三角形、長方形、円、楕円、正方形、矢印、線分、
またはその任意の組合せなど。固定化された捕捉試薬
は、固相材の表面またはその内部において、離れた捕獲
部位として、あるいは試薬の「バンド」として提供され
得る。あるいは、固定化された試薬は、捕獲部位を形成
するために、実質的に均一であるように固相材の大部分
にわたって分布し得る。患者捕獲部位におけるシグナル
生成の程度は、試験サンプル中の分析物の量に関係す
る。陽性対照を使用する場合、陽性対照の捕獲部位にお
けるシグナル生成の程度は、所望する場合には、ストリ
ップに加えられた陽性の対照試薬の量に関係する。

【００３１】用語「陰性対照」または用語「陰性の対照
試薬」と交換可能に使用することができる「陰性の結合
性試薬」は、任意の標識された試薬の非特異的な結合ま
たは凝集の存在を決定するために使用される任意の物質
をいう。陰性の対照試薬は、例えば、抗原、抗体または
抗体フラグメントなどの特異的な結合メンバーを含む物
質であり得る。さらに、陰性の対照試薬は、試験ストリ
ップ上のそれ以外の試薬と同じ種または異なる種から、
あるいは２つ以上の種の組合せから得ることができる。
試験ストリップ上の陰性の対照試薬から得られる検出可
能なシグナルの存在は、無効な試験であったことを示
す。

【００３２】「補助的な特異的結合メンバー」は、表示
用試薬または固定化された捕捉試薬の特異的な結合メン
バーに加えて、アッセイにおいて使用される特異的な結
合対の任意の成分をいう。１つまたは複数の補助的な特
異的結合メンバーをアッセイにおいて使用することがで
きる。例えば、補助的な特異的結合メンバーは、例え
ば、分析物自身が表示用試薬に直接結合できない場合
に、表示用試薬を目的の分析物に結合させることができ
る。あるいは、補助的な特異的結合メンバーは、例え
ば、分析物自身が固定化捕捉試薬に直接結合できない場
合に、固定化された捕捉試薬を目的の分析物に結合させ
ることができる。このような補助的な結合メンバーは、
アッセイデバイスに組み込むことができ、あるいは別個
の試薬溶液としてデバイスに加えることができる。

【００３３】「固相支持体」または「クロマトグラフィ
ー材」または「ストリップ」は、デバイスの反応部位を
含み、そして分析物または試験サンプルが毛管作用によ
り輸送され得る任意の適切な多孔性、吸着性、吸収性、
等方性または毛細作用性の物質をいう。多数の材料が互
いに流動流的に接触しており、それによって試験サンプ
ルがそのような物質の間を通過することができる限り、
ストリップは単一の材料または複数の材料から作製でき
ることが理解される（例えば、それぞれの帯域、部分、
層、領域または部位は、異なる材料から作製することが
できる）。流動流的な接触は、試験サンプルの少なくと
もいくつかの成分（例えば、分析物）が多孔性材料の帯
域の間を通過することを可能にし、そして好ましくは、
異なる帯域の間の接触境界に沿って一様である。

【００３４】従って、合成的に改変された天然の物質、
合成された物質、または天然に存在する物質は、固相支
持体として使用することができ、紙、セルロースならび
に酢酸セルロースおよびニトロセルロースなどのセルロ
ース物質の紙（繊維状）または膜（微孔性）；ガラス繊
維；織物（天然に存在する織物（例えば、綿）および合
成織物（例えば、ナイロン）の両方）などを含む。多孔
性物質は、検出可能なシグナルの生成を妨害してはなら
ない。クロマトグラフィー材は固有の強度を有し得る
か、あるいは強度は補強剤によって提供され得る。

【００３５】ストリップ材の個々の大きさは、関与する
試験サンプルの大きさ、アッセイプロトコル、シグナル
の検出手段および測定手段などに依存して便宜的なもの
である。例えば、大きさは、クロマトグラフィー材によ
って吸収され得る試験サンプルの量と同様に、流体の移
動速度を調節するために選ぶことができる。

【００３６】適する場合には、１つのアッセイデバイス
における多数のストリップの組合せを可能にするストリ
ップの大きさを選ぶ必要がある。試験溶液、浸透溶液ま
たはシグナル生成成分と接触したときに色が変化するこ
とによって結合アッセイの完了（すなわち、アッセイ標
示物の終わり）を示す試薬をクロマトグラフィー材の遠
位端に有することもまたは本発明の範囲に含まれる。水
を含有する試験溶液と接触したときに色が変化する試薬
は、ＣｕＳＯ_４、Ｃｏ（ＮＯ_３）_２などの脱水した遷移
金属塩である。緩衝化された浸透溶液のｐＨに応答する
ｐＨ表示用色素もまた選択することができる。例えば、
フェノールフタレインは、８．０〜１０．０の間のｐＨ
を有する浸透溶液と接触したときに、透明（すなわち、
無色）から鮮やかなピンク色に変化する。

【００３７】捕捉試薬は、それらがそれぞれのその標識
された試薬の流動経路内に位置するならば、１つまたは
複数の経路において試験ストリップに沿って任意のとこ
ろに設置することができる。流体がストリップを移動し
ているとき、流動の十字流がほとんどないことが当業者
により理解されている。従って、流体流に接触するすべ
ての移動し得る試薬もまた、流動流の方向に移動する。
すなわち、試薬は、実質的には、ストリップを横切るよ
うには移動しない。

【００３８】本発明はさらに、結合アッセイを行うため
のキットを提供する。例えば、本発明によるキットは、
図１２に示されている試験ストリップなどの試験ストリ
ップを含むことができ、あるいは上記に記載されている
ような試薬ならびに輸送溶液および／または試験サンプ
ル前処理試薬が組み込まれた櫛形またはカード型のデバ
イスを含むことができる。当業者に知られている他のア
ッセイ成分には、緩衝液、安定化剤、界面活性剤、細菌
阻害剤などが含まれ、これらもまた、アッセイデバイス
または別個の試薬溶液に存在し得る。

【００３９】本発明は、任意に、デバイスの周囲に非反
応性のカバー（これはまた、エンクロージャーまたはケ
ーシングと呼ばれる）を含む。好ましくは、このような
カバーは、少なくとも、捕獲部位との接触および捕獲部
位の汚染を防止するためにストリップを包む。カバーは
また、一定量の試験サンプルおよび／または浸透溶液の
収容および／または含有を容易にする適用パッドに隣接
する隆起した領域を含むことができる。あるいは、カバ
ーは、文字、数字、アイコンまたは記号あるいはその任
意の組合せの形態で切り取られた１つまたは複数の領域
を含むことができる。このような実施形態において、切
り取られた１つまたは複数の領域は、ストリップが完全
に包み込まれたときに、１つまたは複数の特定の捕獲部
位に必要な構造を形成している。加えられた試験サンプ
ルが、ストリップの一部を最初に通過することなく、ス
トリップの十分な部分が捕獲部位と接触しないように包
み込まれることが好ましい。

【００４０】デバイスの別の構成要素は、付加的な特徴
であり得るが、試験サンプル適用パッドである。この適
用パッドは、試験サンプルが適用パッドからストリップ
に通過または移動し得るようにストリップ物質の一方の
端（これは近位端と呼ばれる）と流動流的に接触してい
る。流動流的な接触には、クロマトグラフィー材に対す
る適用パッドの物理的な接触、ならびに流体が依然とし
てパッドとストリップとの間を通過することができる途
中の空間またはさらなる物質によるパッドのストリップ
からの分離が含まれる。適用パッドの実質的に全体は、
試験サンプルが適用パッドの実質的に任意の部分を通し
てストリップの近位端に通過することを可能にするクロ
マトグラフィー材を覆うことができる。あるいは、適用
パッドの一部のみが、クロマトグラフィー材と流動流的
に接触していてもよい。適用パッドは、試験サンプルを
クロマトグラフィー材に移動させるとことができ、そし
てクロマトグラフィー材の総容量に等しいか、あるいは
それよりも多い量の試験サンプルを吸収することができ
る任意の物質であり得る。

【００４１】適用パッドにおける使用に好ましい物質に
は、ニトロセルロース、多孔性ポリエチレン製のフリッ
トまたはパッド、およびガラス繊維ろ紙が含まれる。そ
のような物質はまた、分析物およびアッセイ試薬と適合
性し得るように選択しなければならない。

【００４２】さらに、適用パッドは、典型的には、それ
に拡散し得るように、あるいは拡散し得ないように取り
付けられた１つまたは複数のアッセイ試薬を含有する。
適用パッドに含有され得る試薬には、検出可能なシグナ
ルを生成するために必要な標識された試薬、補助的な特
異的な結合メンバーおよびシグナル生成システムの成分
が含まれるが、これらに限定されない。例えば、結合ア
ッセイにおいて、標識された試薬は適用パッドに含有さ
れることが好ましい。標識された試薬は、試験サンプル
が加えられることによってパッドからストリップに放出
され、それによってデバイスを使用する前に試験サンプ
ルおよび標識された試薬を一緒にしなければならないこ
とが省略される。適用パッドにおけるアッセイ試薬の単
離はまた、反応性試薬を別々にし、そして製造プロセス
を容易にする。

【００４３】いくつかの場合によって、適用パッドはま
た、試験サンプルおよび試薬に関する最初の混合部位お
よび反応部位として機能する。好ましい実施形態におい
て、適用パッド物質は、ストリップ物質単独によって達
成される速度よりも早い速度で試験サンプルを吸収する
ように選択される。典型的には、パッド物質はストリッ
プ物質よりも２倍〜５倍早く流体を吸収するように選択
される。好ましくは、パッドはストリップ物質よりも４
倍〜５倍早く流体を吸収する。

【００４４】本発明の必要に応じて行われる実施形態に
おいて、ゼラチンが、適用パッドのすべてまたは一部を
包み込むために使用される。典型的には、そのような封
じ込めは、魚のゼラチンで適用パッドの表面をコーティ
ングすることによって得られる。このようなコーティン
グの効果は、適用パッドに含有される試薬の安定性を大
きくすることである。試験サンプルをコーティングされ
た適用パッドに加えることによって、ゼラチンは溶解
し、それによって試薬の溶解が可能になる。本発明の別
の実施形態において、試薬を含有する適用パッドは、デ
バイスの保管寿命を大きくするために乾燥または凍結乾
燥される。凍結乾燥された適用パッドは、風乾された適
用パッドよりも強いシグナルが得られることが見出され
ている。さらに、凍結乾燥された適用パッドは、安定性
がより長い期間維持されることが見出されている。適用
パッドに含有される試薬は、試験サンプルをパッドに加
えることによって再水和される。

【００４５】本発明はまた、ろ過手段を加えることによ
って改変することができる。このようなろ過手段は、適
用パッドの上部に、あるいは適用パッドとストリップ物
質との間に置かれた別個の物質であり得る。あるいは適
用パッド自体の物質を、そのろ過能力に関して選ぶこと
ができる。ろ過手段には、試験サンプルから一定の大き
さを超える粒子を除くために使用される任意のフィルタ
ーまたは捕捉デバイスが含まれ得る。例えば、血漿が適
用パッドによって収容され、そしてクロマトグラフィー
材に移される流体であるように、フィルター手段を使用
して、赤血球を全血サンプルから除くことができる。

【００４６】本発明のさらに別の実施形態は、適用パッ
ドとクロマトグラフィー材との間に置かれているか、あ
るいは適用パッドを覆っている多孔性物質の１つまたは
複数のさらなる層の使用を包含する。そのようなさらな
るパッドまたは層は、適用パッドからストリップへの試
験サンプルの流速を制御する手段として役立ち得る。そ
のような流速調節は、試験サンプルおよび試薬（１つま
たは複数）の適用パッドにおける反応のために長いイン
キュベーション時間が望ましい場合には好ましい。ある
いは、そのような層は、試験サンプルが加えられるまで
は適用パッドの試薬（１つまたは複数）から分離されて
いることが好ましいさらなるアッセイ試薬（１つまたは
複数）を含有することができる。あるいは、そのような
層は、未反応のアッセイ試薬がクロマトグラフィー材へ
通過することを防ぐために役立つ得る。

【００４７】少量の非水性または粘性の試験サンプルが
適用パッドに加えられた場合、試薬（１つまたは複数）
および試験サンプルを適用パッドから移動させ、そして
ストリップを通過させるために、緩衝化された溶液が好
ましい浸透溶液または輸送溶液を用いらなければならな
いことがある。水性の試験サンプルが使用される場合、
輸送溶液は、一般に必ずしも必要ではないが、デバイス
を通過する流動特性を改善するために、あるいは試験サ
ンプルのｐＨを調節するために使用することができる。
輸送溶液は、典型的には、約５．５〜約１０．５の範囲
のｐＨを有し、より好ましくは約６．５〜約９．５の範
囲のｐＨを有する。ｐＨは、結合アッセイにおいて、特
異的な結合メンバーの間で大きなレベルの結合親和性が
維持されるように選択される。しかし、表示用試薬の標
識成分が酵素である場合、ｐＨはまた、酵素的なシグナ
ル生成システムにおける発色に必要な大きな酵素活性が
維持されるように選択しなければならない。例示的な緩
衝液には、リン酸塩、炭酸塩、バルビタール、ジエチル
アミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔ
ｒｉｓ）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパノールなどが含まれる。輸送溶液および試
験サンプルは、適用パッドと接触させる前に一緒にする
ことができる。あるいはそれらは、続けて適用パッドに
接触させることができる。

【００４８】所定量のシグナル生成成分および補助的な
試薬をデバイスに組み込むことができ、それによって、
さらなるプロトコル工程または試薬の添加を行わなけれ
ばならないことが避けられる。従って、固定化され得る
２つ以上の試薬が適用パッドおよび／またはストリップ
物質に提供されることもまた本発明の範囲内である。

【００４９】本発明によりアッセイデバイスおよび方法
が提供されるが、この場合、デバイスは、患者サンプル
での１回のアッセイを行うために、あるいは患者サンプ
ルで多数のアッセイを行うために液体を輸送し得るクロ
マトグラフィー材のストリップを使用する。そのような
デバイスには、ストリップと流動流的に接触している試
験サンプル適用パッドであって、クロマトグラフィー材
への試験サンプルの流れを調節するために、試験サンプ
ルをろ過するために、そしてアッセイ試薬の送達および
／または混合を行うために機能する試験サンプル適用パ
ッドが含まれる。アッセイ試薬は、適用パッドならびに
クロマトグラフィー材に組み込むことができる。デバイ
スでの試薬含有部位の構造を変えることによって、アッ
セイの定性的表示および定量的表示を得ることができ
る。好ましくは、試薬は、アッセイを実質的に自己完結
性にするように、そしてアッセイ結果の検出および定量
を容易にするようにデバイスに配置される。この場合、
試薬含有部位および／または結合アッセイでの反応から
生じる１つまたは複数の検出可能なシグナルを、装置に
よって、あるいは直接可視的な観察によって検出するこ
とができる。

【００５０】本発明は、試験サンプルにおけるＭ群ＨＩ
Ｖ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する抗体
を同時に検出して識別するためのアッセイ、およびこの
ような検出および識別を同時に行うための分析デバイス
を提供する。サンドイッチアッセイ形式において、分析
物（例えば、Ｍ群ＨＩＶ−１に対する抗体）の含有が疑
われる試験サンプルを所定量の表示用試薬（この場合、
標識化された抗種抗体［Ａｂ^＊］）と接触させて、分析
物／表示用試薬の複合体（Ａｂ−Ａｂ^＊）を含有する反
応混合物を形成させる。表示用試薬（Ａｂ^＊）は、試験
デバイスとは別であってもよく、あるいは好ましくは試
験デバイスに組み込まれていてもよい。次いで、得られ
る反応混合物は試験ストリップの中を移動する。反応混
合物は、個別に固定化された分析物に特異的な結合メン
バー（［｜−Ａｇ］）を含有する捕捉試薬部位（Ｍ群Ｈ
ＩＶ−１に対する部位、Ｏ群ＨＩＶ−１に対する部位、
およびＨＩＶ−２に対する部位）と接触し、表示用試薬
から離れて分析物での部位で結合する。従って、捕捉試
薬は、Ａｂ−Ａｂ^＊複合体に結合して、捕獲部位で検出
され得る固定化された｜−Ａｂ−Ａｇ−Ａｂ^＊複合体を
形成することができる。さらに、反応混合物はまた、試
験ストリップの中をさらに移動して、アッセイ表示用部
位の終端に存在する試薬と反応し得る。

【００５１】図１３を参照すると、アッセイに必要な試
験デバイス（１８）は、離れた別個の捕獲領域におい
て、Ｍ群ＨＩＶ−１（２６）、Ｏ群ＨＩＶ−１（２８）
およびＨＩＶ−２のｇｐ４１（３０）に由来する選択さ
れた特異的な高度に精製された組換え抗原のそれぞれ領
域が設置され、そして乾燥されたニトロセルロース膜ス
トリップ（２４）を含む。試験デバイス（１８）はさら
に結合パッド（３２）を含む。このパッドは、ニトロセ
ルロースをブロッキングするためのタンパク質を含有す
る流体に懸濁された抗種抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇ
Ｇ）との感受性を有するセレンコロイドを提示するガラ
ス繊維フィルター（３４）を含み、このフィルターは、
組み立ての前に乾燥され、そしてニトロセルロース膜
（２４）の遠位端（２０）に固定されている。デバイス
（１８）の全体は、ニトロセルロース膜（２４）の上面
と接触して、結合パッド（２０）に取り付けられている
接着性表面（３８）を有する上部の透明な積層材（３
６）、およびニトロセルロース膜（２４）の底面（４
８）と接触している接着性表面（３８）を有する底部の
積層材（４８）によって所定の位置に固定的に保持され
ている。試験流体は、遠位端（２０）から近位端（２
２）に流れて、３つの離れた別個の捕獲領域のそれぞれ
と接触する。デバイスはまた、抗種（すなわち、抗ヒ
ト）結合体が置かれている試験サンプルパッドで反応性
帯域（４０）を有する。デバイスはまた、好ましくは、
デバイスにおける何らかの残留流体を吸収するためのブ
ロッター（４４）を有し、そしてアッセイの完了を示す
ための部位（４６）を有する。（捕獲領域および／また
は試験サンプル反応性帯域での）読み取りは、実験室装
置の助けを借りることなく可視的に直接読み取ることが
でき、あるいは装置によって自動的に行うことができ
る。さらに、試験デバイスは、成型されたプラスチック
または他の適切な材料のケーシング（４２）の中に包み
込むことができる。

【００５２】アッセイは下記のように行われる。ヒト血
清などの試験サンプルを、好ましくは緩衝液（５０ｍＭ
のＴＲＩＳ（ｐＨ８．４）、１％ｗ／ｖの固体ウシ血清
アルブミン［ＢＳＡ］、０．４％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−４０５（登録商標）、１．５％ｗ／ｖのカゼイ
ン、３％ｗ／ｖのウシＩｇＧ、４％ｗ／ｖの大腸菌溶解
物からなる溶出緩衝液、ｐＨ８．２；１μｌの血清を１
００μｌの溶出緩衝液で希釈する）で前もって希釈し、
試験デバイスの遠位端（２０）で抗ＩｇＧコロイド結合
体と接触させる。試験サンプル中のＩｇＧを抗ＩｇＧコ
ロイドによって結合させ、複合体は、吸収パッド（好ま
しくは、ニトロセルロース膜）の長さ方向に沿ってクロ
マトグラフィー的に分離される。複合体が流れるに従っ
て、複合体は、ＨＩＶ組換え抗原が前もって加えられて
いる離れた帯域（図１３、３０、２６および２８の各部
位）を通り抜ける。複合体が組換え抗原に特異的な抗体
を含有する場合、離れた帯域のいずれかで反応が起こ
り、そして赤色帯が適切な帯域（１つまたは複数）で現
れる。多数の特異性を同時に決定することができる。さ
らに、試験される３つのすべての抗原に関して陽性で、
まとめた試験サンプルからなる陽性対照は、この３つの
帯域のすべてで陽性に反応し得る。あるいは、試験にお
ける抗原のそれぞれと反応し得る陽性の対照サンプル
は、抗体がアッセイされているそれぞれの分析物に関し
て別々に流すことができる。

【００５３】Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２に対する抗体分析物は、このようなアッセイに
おいて、本明細書中に記載されているポリペプチド（ア
ミノ酸）配列の全体または一部を含む合成ポリペプチ
ド、組換えポリペプチドまたは精製ポリペプチドを捕獲
捕捉試薬として使用することによって検出可能であり得
ることも意図され、そして本発明の範囲に含まれる。
「精製タンパク質」（または「精製ポリペプチド」）
は、目的のポリペプチドが天然に会合している細胞成分
を実質的に含まない、すなわち、そのような細胞成分の
約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましく
は約９０％未満を含む目的のポリペプチドまたはそのフ
ラグメントを意味する。精製方法はこの分野では知られ
ている。本明細書中において交換可能に使用されている
「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」ま
たは「組換え技術により製造されたポリペプチド」は、
その起源または操作に基づいて、実際に会合し、かつ／
または実際に結合しているポリペプチド以外のポリペプ
チドに結合しているポリペプチドのすべてまたは一部と
会合していないポリペプチドを表す。組換えまたはコー
ドされるポリペプチドまたはタンパク質は、示されてい
る核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。その
ようなポリペプチドまたはタンパク質はまた、化学合成
または組換え発現システムの発現を含む任意の方法で得
ることができる。さらに、本明細書中で使用されている
用語「合成（された）ペプチド」は、当業者にはよく知
られている方法によって化学合成することができる任意
の長さを有するアミノ酸のポリマー形態を意味する。こ
のような合成ペプチドは様々な適用において有用であ
る。

【００５４】Ｏ群ＨＩＶ−１に好ましい捕捉試薬は、配
列番号４８、配列番号５０、配列番号５２および配列番
号５４、配列番号５８および配列番号６０からなる群よ
り選択されるポリペプチド配列を含む。Ｍ群ＨＩＶ−１
に関する捕捉試薬は配列番号５６を含む。ＨＩＶ−２に
関する捕捉試薬は配列番号５５を含む。これらのポリペ
プチドは組換え技術によって製造されることが好まし
い。

【００５５】次に、本発明を実施例によって説明する
が、実施例は、本発明の精神および範囲を例示するもの
であり、本発明の精神および範囲を限定するものではな
い。

【００５６】実施例実施例１．クローニング遺伝子の構築および配列決定に必要なオリゴヌクレオチ
ドを、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ、ＣＡ）またはＯｌｉｇｏＥｔｃ．（Ｗｉｌｓｏｎ
ｖｉｌｌｅ、ＣＡ）で合成した。ＡｍｐｌｉＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼおよびＵｌＴｍａＤＮＡポリメラー
ゼを含むすべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬
をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）から購入し、そして
別途示されていない限り、製造者の仕様に従って使用し
た。ＰＣＲ増幅をＧｅｎｅＡｍｐ９６００サーマルサイ
クラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で行った。別途示
されていない限り、制限酵素をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入
し、そして消化を製造者の指示に従って行った。クロー
ニングのために使用したＤＮＡフラグメントは、別途示
されていない限り、アガロース（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）ゲ
ルで単離した。

【００５７】所望のフラグメントを切り出し、そしてＤ
ＮＡを、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットまたはＱＩＡ
ｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．、
Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて製造者の指示に
従って抽出した。ＤＮＡをＨ_２ＯまたはＴＥ［１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０；ＢＲＬ
ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０；ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）］に再懸濁した。連結を、Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社のＤＮＡ連結キット（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、ＬａＪｏｌ
ｌａ、ＣＡ）を使用して製造者の指示に従って行った。
連結は１６℃で一晩のインキュベーションにより行っ
た。

【００５８】細菌の形質転換は、ＭＡＸＥＦＦＩＣＩ
ＥＮＣＹＤＨ５αコンピテント細胞（ＢＲＬＬｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥｐｉｃｕｒｉ
ａｎＣｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテン
ト細胞（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙ
ｓｔｅｍｓ）を使用して製造者のプロトコルに従って行
った。別途示されていない限り、形質転換体および細菌
の再度の画線接種は、示されているように、１５０μｇ
／ｍｌアンピシリン（Ｍ１０９０；ＭｉｃｒｏＤｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌｏｍｂａｒｄ、ＩＬ）を含むＬＢ寒
天（Ｌｅｎｎｏｘ）平板、またはグルコースを２０ｍＭ
の最終濃度に補充したＬＢ寒天＋アンピシリン平板に播
種した。すべての細菌のインキュベーション（平板およ
び一晩の培養）は３７℃で一晩（約１６時間）行った。

【００５９】所望のクローンを同定するための形質転換
体のスクリーニングは、ミニプレップＤＮＡの配列決定
および／またはコロニーＰＣＲによって行った。ミニプ
レップＤＮＡは、別途示されていない限り、Ｑｉａｇｅ
ｎＴｉｐ２０ＰｌａｓｍｉｄＰｒｅｐＫｉｔ
またはＱｉａｇｅｎＱＩＡｗｅｌｌ８Ｐｌａｓｍ
ｉｄＰｒｅｐＫｉｔを用いて製造者の仕様に従って
行った。コロニーＰＣＲによるスクリーニングに関して
は、個々のコロニーを形質転換平板から拾い、１００μ
ｌの滅菌Ｈ_２Ｏを含有する滅菌された平底の９６ウエル
プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ、ＭＡ）
のウエルに移した。１／３の量を別のプレートに移して
４℃で保存した。元の９６ウエルプレートを５分間電子
レンジで処理して、細胞を破壊した。次いで、１μｌ量
をテンプレートとしてＰＣＲチューブに移した。１μｌ
の１０ＸＰＣＲ緩衝液、１μｌの２ｍＭの各ｄＮＴ
Ｐ、１μｌ（１０ｐｍｏｌ）のセンスプライマー、１μ
ｌ（１０ｐｍｏｌ）のアンチセンスプライマー、０．０
８μｌのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（０．
４ユニット）、および４．２μｌのＨ_２Ｏを含有する９
μｌのＰＣＲマスター混合物をＰＣＲチューブに加え
た。反応物を、一般に、９４℃で３０秒間、（プライマ
ーのアニーリング温度に依存して）５０℃〜６０℃で３
０秒間、および７２℃で６０秒間の２０サイクル〜２５
サイクルで増幅する。プライマーは挿入物に依存し、サ
イクル条件を、プライマーのアニーリング温度および予
想される生成物の長さに基づいて変更した。ＰＣＲサイ
クルを行った後、反応量の約１／３をアガロースゲルに
負荷して分析した。所望のクローンを含有するコロニー
を転写平板から拡大培養した。

【００６０】別途示されていない限り、ＤＮＡの配列決
定は、自動化されたＡＢＩＭｏｄｅｌ３７３Ｓｔ
ｒｅｔｃｈＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌ
ｍｅｒ）で行った。配列決定反応液を、ＦＳＴＡＣＳ
ＤｙｅＴｅｒｍＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の試薬および２５
０ｎｇ〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて製造者
の仕様に従って調製した。反応液をＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅ
ｐカラム（ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｎ．Ｊ．）で処理し、その後、
配列決定装置にかけた。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ３．０（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓＣｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）およびＧｅｎｅ
Ｗｏｒｋｓ２．４５（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｃ
Ａ）を使用して分析した。

【００６１】実施例２．Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１
１２のｅｎｖ配列の決定ウイルスＲＮＡを、ＨＡＭ１１２（Ｈ．Ｈａｍｐｌ他、
上記）と名付けられたＯ群ＨＩＶ−１単離体を感染させ
たヒト末梢血単核細胞の培養上清から、ＱＩＡａｍｐ
ＢｌｏｏｄＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）および製造者の指
示する手順を使用して抽出した。ＲＮＡを、ヌクレアー
ゼを含まない５０μｌ量の水（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉ
ｍｅ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）で溶出して、
−７０℃で保存した。ｅｎｖ領域配列を得るための方法
には、４つの重複するｅｎｖ遺伝子フラグメントのｃＤ
ＮＡ合成およびＰＣＲ（ネステッド）増幅が含まれる。
増幅産物を、直接、自動化されたＡＢＩＭｏｄｅｌ
３７３ＳｔｒｅｔｃｈＳｅｑｕｅｎｃｅｒで配列決
定した。増幅反応を、ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲ
ＫｉｔおよびＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＫｉｔ（Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて製造者の指示に従って
行った。オリゴヌクレオチドプライマーの位置は、ＨＩ
Ｖ−１ＡＮＴ７０ｅｎｖ配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓ他
編、上記）に対応する。ｅｎｖ１０Ｒ（ヌクレオチド
（ｎｔ）７９１〜７７２；配列番号６２）、ｅｎｖ１５
Ｒ（ｎｔ１５９２〜１５７４；配列番号６３）、ｅｎｖ
２２Ｒ（ｎｔ２３２１〜２３０２；配列番号６４）、ｅ
ｎｖ２６Ｒ（ｎｔ２５０〜２３２、ｅｎｖの３’；配列
番号６５）のプライマーを使用して、フラグメント１〜
４のｃＤＮＡをそれぞれ合成した。逆転写反応液を、４
２℃で３０分間、次いで９９℃で５分間インキュベーシ
ョンした。最初のＰＣＲ増幅は、９５℃で３０秒間、５
２℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３０サイクル
からなり、ｅｎｖ１Ｆ（ｎｔ１８４〜１６６、ｅｎｖの
５’；配列番号６６）およびｅｎｖ１０Ｒ（配列番号６
２）、ｅｎｖ７Ｆ（ｎｔ５６４〜５８６；配列番号６
７）およびｅｎｖ１５Ｒ（配列番号６３）、ｅｎｖ１２
Ｆ（ｎｔ１２８９〜１３０８；配列番号６８）およびｅ
ｎｖ２２Ｒ（配列番号６４）、ｅｎｖ１９Ｆ（ｎｔ２０
２０〜２０４０；配列番号６９）およびｅｎｖ２６Ｒ
（配列番号６５）のプライマーの組合せを、それぞれ、
フラグメント１〜４のために使用した。第２回目のＰＣ
Ｒ増幅（ネステッドＰＣＲ）に関しては、最初のＰＣＲ
反応液の５μｌをそれぞれテンプレートとして、ｅｎｖ
２Ｆ（ｎｔ３７〜１５、ｅｎｖの５’；配列番号７０）
およびｅｎｖ９Ｒ（ｎｔ７４０〜７２１；配列番号７
１）、ｅｎｖ８Ｆ（ｎｔ６３１〜６５０；配列番号７
２）およびｅｎｖ１４Ｒ（ｎｔ１４３７〜１４１６；配
列番号７３）、ｅｎｖ１３Ｆ（ｎｔ１３３３〜１３５
４；配列番号７４）およびｅｎｖ２１Ｒ（ｎｔ２２８２
〜２２６５；配列番号７５）、ｅｎｖ２０Ｆ（ｎｔ２１
２２〜２１４１；配列番号７６）およびｅｎｖ２５Ｒ
（ｎｔ１１１〜９４、ｅｎｖの３’；配列番号７７）の
プライマーの組合せとともに、それぞれ、フラグメント
１〜４のために使用した。２回目の増幅条件は、第１回
目に使用した条件と同一であった。フラグメントをアガ
ロースゲルで精製して、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡＥＸ
ＩＩＧＥＬＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて
抽出した。フラグメントの直接的な配列決定を、ネステ
ッドＰＣＲに使用したプライマーと、フラグメント１に
関してはｅｎｖ４Ｆ（配列番号７８）およびｅｎｖ５Ｒ
（配列番号７９）のプライマーとともに、フラグメント
２に関してはｅｎｖ１０Ｆ（配列番号８０）、ｅｎｖ１
１Ｆ（配列番号８１）、ｅｎｖ１１Ｒ（配列番号８
２）、ｅｎｖ１２Ｆ（配列番号６８）およびＡＧ１（配
列番号８７）のプライマーとともに、フラグメント３に
関してはｅｎｖ１５Ｆ（配列番号８３）およびｅｎｖ１
９Ｒ（配列番号８４）のプライマーとともに、フラグメ
ント４に関してはｅｎｖ２２Ｆ（配列番号８５）および
ｅｎｖ２４Ｒ（配列番号８６）のプライマーとともに使
用して行った。Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１１２に由
来するｅｎｖの推定アミノ酸配列を図１に示す。

【００６２】実施例３．Ｏ群ＨＩＶ−１のｅｎｖｇｐ
１２０／ｇｐ４１の合成遺伝子の構築図２は、Ｏ群ＨＩＶ−１のｅｎｖｇｐ１２０／ｇｐ４
１の合成遺伝子構築体を作製するために使用した方法を
示す。ｅｎｖｇｐ１２０／ｇｐ４１配列は、Ｏ群ＨＩ
Ｖ−１単離体ＨＡＭ１１２（配列番号６１）（Ｈ．Ｈａ
ｍｐｌｅ他）に基づいた。ＨＡＭ１１２のｅｎｖ配列の
決定は、上記の実施例２に概略が示されている。ｅｎｖ
ｇｐ１２０のＣ末端の４５アミノ酸およびｅｎｖｇ
ｐ４１の３２７アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチ
ドを設計した（ヌクレオチド＃１は、合成遺伝子におけ
るｇｐ１２０の最初のコドンの最初の塩基である）。合
成遺伝子は、天然のＨＡＭ１１２のｇｐ４１に対して、
ｇｐ４１の大きな疎水性（Ｈ）領域（膜貫通領域）を含
む２６アミノ酸（ヌクレオチド６４３〜７２０）の欠失
を有する。従って、構築された合成ｇｐ４１遺伝子の全
長は３２７アミノ酸である。

【００６３】合成オリゴヌクレオチドにおいて、天然の
ＨＩＶ−１のコドンを、大腸菌における組換えタンパク
質の発現レベルを増大させるために、大腸菌のコドン使
用偏りに適合するように変更した。例えば、Ｍ．Ｇｏｕ
ｙおよびＣ．Ｇａｕｔｉｅｒ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１０：７０５５（１９８
２）；Ｈ．ＧｒｏｓｊｅａｎおよびＷ．Ｆｉｅｒｓ、Ｇ
ｅｎｅ１８：１９９（１９８２）；Ｊ．Ｗａｔｓｏｎ
他（編）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆ
ｔｈｅＧｅｎｅ、第４版、ＢｅｎｊａｍｉｎＫｕ
ｍｍｉｎｇＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、４４０頁
（１９８７）を参照のこと。遺伝子の構築方法には、相
補性末端を有する一連の重複するオリゴヌクレオチドの
合成が含まれる（Ｏｓｙｎ−ＡからＯｓｙｎ−Ｌ、Ａ〜
Ｌとして表される）。アニーリングさせたとき、末端
は、相補鎖を伸長させるためのプライマーとして役立っ
た。

【００６４】次いで、フラグメントをＰＣＲにより増幅
した。このプロセス（オリゴヌクレオチドの「ＰＣＲ再
編成（ｋｎｉｔｔｉｎｇ）」）を繰り返して、遺伝子フ
ラグメントを順次大きくした。オリゴヌクレオチドＯｓ
ｙｎ−５’は、ｐＬベクターｐＫＲＲ８２６へのクロー
ニングのために設計された。発現ベクターｐＫＲＲ８２
６は、米国特許出願第０８／３１４，５７０号（これは
参考として本明細書中に援用される）に記載されている
λｐＬプロモーターベクターｐＳＤＫ８１６の改変体で
ある。ｐＫＲＲ８２６は、温度感受性のｃＩリプレッサ
ー（抑制）遺伝子（Ｂｅｎａｒｄ他、Ｇｅｎｅ５：５
９［１９７９］）を含有するｐＢＲ３２２の高コピー数
型誘導体である。しかし、ｐＫＲＲ８２６は、翻訳ター
ミネーターｒｒｎＢｔ１を有しておらず、そして、ｐＳ
ＤＫ８１６に対して、逆方向でλｐＬプロモーターおよ
びλｐＲプロモーターを有する。ｐＫＲＲ８２６のポリ
リンカー領域は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの制限酵
素部位を含有し、ＡＴＧの開始コドンを有していない。
最適な発現は、（Ｎ末端のメチオニンを含む）遺伝子挿
入物の５’端をＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたとき
に得られる。Ｏｓｙｎ−５’は、クローニングするため
のＥｃｏＲＩ制限部位、および組換えタンパク質の適正
な翻訳を開始させるためのＡＴＧコドン（メチオニン）
を含有するように設計された。アンチセンスのオリゴヌ
クレオチドＯｓｙｎ−Ｏ３’（配列番号１５）、Ｏｓｙ
ｎ−Ｐ３’（配列番号１６）およびＯｓｙｎ−Ｍ（Ｍ）
（配列番号１４）はそれぞれ、２つの連続した翻訳終了
コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ）およびＢａｍＨＩ制限部位を
含有する。外側のプライマーであるＯｓｙｎ−５’（配
列番号１１）およびＯｓｙｎ−Ｍ（Ｍ）（配列番号１
４）を使用した場合、全長のｇｐ４１（３２７アミノ
酸）遺伝子が合成された（ｐＧＯ−１１ＰＬ；配列番号
５２）。外側のオリゴヌクレオチドであるＯｓｙｎ−
５’（配列番号１１）およびＯｓｙｎ−３’（配列番号
１５）は、１９９アミノ酸の切形ｇｐ４１産物が得られ
た（ｐＧＯ−９ＰＬ；配列番号４８）。あるいは、外側
のオリゴヌクレオチドであるＯｓｙｎ−５’（配列番号
１１）およびＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号１６）は、長
さが１６９アミノ酸の切形ｇｐ４１産物が得られた（ｐ
ＧＯ−８ＰＬ；配列番号５８）。

【００６５】合成遺伝子はまた、ＣＭＰ−ＫＤＯシンセ
ターゼ（ＣＫＳ）融合タンパク質として発現させた。合
成遺伝子のｐＫＲＲ８２６からｐＪＯ２００（これは米
国特許出願第５７２，８２２号に記載されており、参考
として本明細書中に援用される）へのＰＣＲ媒介による
移動を、代わりの外側のセンスオリゴヌクレオチドＰＣ
Ｒ（プライマー（５’末端）、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ
（配列番号２５）を用いて行った。Ｏｓｙｎ−５’ＣＫ
ＳはＥｃｏＲＩ制限部位を含有し、そして発現ベクター
ｐＪＯ２００においてＣＫＳに対して合成遺伝子挿入物
の読み枠が合った融合体が生じた。３’の外側のプライ
マー（アンチセンス）Ｏｓｙｎ−Ｍ（配列番号１４）、
Ｏｓｙｎ−Ｏ３’（配列番号１５）およびＯｓｙｎ−Ｐ
３’（配列番号１６）をＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番
号２５）と組み合わせて使用して、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ
（配列番号５４）、ｐＧＯ−９ＣＫＳ（配列番号５０）
およびｐＧＯ−８ＣＫＳ（配列番号６０）をそれぞれ作
製した。これらの工程を下記に詳しく示す。

【００６６】Ａ．合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再編
成３つのＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を下記のように
調製した：（１）反応１Ｂ：ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ（２．５Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに４０μＭの
核ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ
ＴＰ）、そして２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドＯ
ｓｙｎ−Ａ（配列番号３）およびＯｓｙｎ−Ｄ（配列番
号５）、そして０．２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチ
ドＯｓｙｎ−Ｂ（配列番号１７）およびＯｓｙｎ−Ｃ
（配列番号４）；（２）反応２Ａ：ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３
Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ
_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各オリゴヌ
クレオチドＯｓｙｎ−Ｅ（配列番号６）およびＯｓｙｎ
−Ｈ（配列番号９）、そして０．２５ｐｍｏｌの各オリ
ゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｆ（配列番号７）およびＯｓ
ｙｎ−Ｇ（配列番号８）；および（３）反応３Ｂ：ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３
Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ
_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各オリゴヌ
クレオチドＯｓｙｎ−Ｉ（配列番号１０）およびＯｓｙ
ｎ−Ｌ（配列番号１３）、そして０．２５ｐｍｏｌの各
オリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｊ（配列番号１８）およ
びＯｓｙｎ−Ｋ（配列番号１２）。

【００６７】増幅は、９７℃で３０秒間、５２℃で３０
秒間、そして７２℃で６０秒間の２０サイクルからなっ
た。次いで、反応液を７２℃で７分間インキュベーショ
ンし、そして４℃で保った。ＰＣＲにより得られた生成
物１Ｂ、２Ａおよび３Ｂを１％ゲルアガロースゲルでゲ
ル単離した。

【００６８】Ｂ．反応１Ｂおよび反応２Ａから得られた
ＰＣＲ産物のＰＣＲ再編成ＰＣＲ反応液を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３
Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ
_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、２４．４ｐｍｏｌのオリゴ
ヌクレオチドＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）および２
５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−Ｐ３’（配
列番号１６）、そして上記の実施例３のセクション１Ａ
から得られた約１０ｎｇのゲル単離した１Ｂおよび２Ａ
の生成物を用いて調製した。サイクル条件は、実施例３
のセクション１Ａの場合と同じであった。２回目の増幅
を行って、より多くの所望する産物を作製した。これ
は、４９ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’（配列番号１１）、
５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号１６）、お
よびテンプレートとして最初のＰＣＲから得られた５μ
ｌのＰＣＲ産物を用いて上記のＵｌＴｍａ混合物（１０
０μｌの反応容量）を作製することによって行われた。
これらの反応液を９４℃で９０秒間インキュベーション
し、次いで上記（セクション３Ａ）のＰＣＲサイクルを
行った。Ｏｓｙｎ−５’／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産
物を上記のようにゲル単離した。

【００６９】Ｃ．Ｏｓｙｎ−５’−Ｏｓｙｎ−Ｐ３’の
ＰＣＲ産物のクローニングＯｓｙｎ−５’−Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物を、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの制限エンドヌクレアーゼで
消化し、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し
て、ゲル単離したベクターｐＫＲＲ８２６（上記）に連
結した。連結産物を使用して、ＤＨ５αコンピテント細
胞を形質転換した。所望のクローンを、ｐＫＲＲＥｃｏ
ＲＩフォワード（配列番号３８）およびｐＫＲＲＢａｍ
ＨＩリバース（配列番号３９）のオリゴヌクレオチドを
使用するコロニーＰＣＲによって同定した。ミニプレッ
プＤＮＡをｐＧＯ−８候補クローンＡ２の一晩培養物か
ら調製して、Ｏｓｙｎ−５’−Ｏｓｙｎ−Ｐ３’プラス
ミド挿入物を、ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード（配列番
号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配列番号３
９）、４１ｓｙ−１（配列番号４４）および４１ｓｙ−
２（配列番号４１）のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて配列決定した。

【００７０】Ｄ．ｐＧＯ−８候補クローンＡ２の改変１００μｌ容量のＰＣＲ反応液を、ＵｌＴｍａＤＮＡ
ポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝液、ならびに１．
５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍ
ｏｌのオリゴヌクレオチドＯｓｙｎ−５’−ｒｅｐａｉ
ｒ（配列番号２４）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｐ３’
（配列番号１６）、およびテンプレートＡ２として、
（上記の反応から得られた）約１ｎｇのｐＧＯ−８候補
クローンミニプレップＤＮＡを用いて調製した。反応液
を９４℃で９０秒間インキュベーションし、次いで９４
℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で６０
秒間の２０サイクルで増幅した。次いで、Ｏｓｙｎ−
５’−ｒｅｐａｉｒ／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物を
ゲル単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
した。消化した産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで
消化したｐＫＲＲ８２６ベクターに連結した。連結産物
を使用して、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し
た。所望のクローンを、ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワード
（配列番号３８）およびｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース
（配列番号３９）のオリゴヌクレオチドを使用するコロ
ニーＰＣＲによって同定した。ｐＧＯ−８候補クローン
６を一晩培養して、ミニプレップＤＮＡを調製した。Ｏ
ｓｙｎ−５’−ｒｅｐａｉｒ／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’プラス
ミド挿入物の配列決定を、ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワー
ド（配列番号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配
列番号３９）、４１ｓｙ−１（配列番号４４）および４
１ｓｙ−２（配列番号４１）のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて行った。配列決定の結果に基づいて、ｐ
ＧＯ−８候補クローン＃６をｐＧＯ−８ＰＬ／ＤＨ５α
と名付けた。配列番号５７はコード領域のヌクレオチド
配列を示す。図５は、ｐＧＯ−８ＰＬ組換えタンパク質
のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。ｐＧＯ−８Ｐ
Ｌ組換えタンパク質は、Ｎ末端メチオニン、４５アミノ
酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１
２単離体）および１６９アミノ酸のｅｎｖｇｐ４１
（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。

【００７１】Ｅ．ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１の構築ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１（配列番号５９はコード領域
のヌクレオチド配列を示す）は、組換えタンパク質ｐＧ
Ｏ−８ＣＫＳをコードする。図６は、ｐＧＯ−８ＣＫＳ
のアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。このタンパク
質は、２４６アミノ酸のＣＫＳ／ポリリンカー、４５ア
ミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ
１１２単離体）および１６９アミノ酸のｅｎｖｇｐ４
１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。
ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１の構築を下記のように行っ
た。

【００７２】ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、Ｕｌ
ＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝
液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄ
ＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番
号２５）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｐ３’（配列番号
１６）、および約１ｎｇのｐＧＯ−８ＰＬクローン＃６
ミニプレップＤＮＡを用いて調製した。反応液を９４℃
で９０秒間インキュベーションし、次いで９４℃で３０
秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の２
５サイクルで増幅した。次いで、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ
／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物をゲル単離した。Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ
／Ｏｓｙｎ−Ｐ３’のＰＣＲ産物およびベクターｐＪＯ
２００を消化した。消化したｐＪＯ２００ベクターをゲ
ル単離して、消化したＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ
−Ｐ３’のＰＣＲ産物に連結した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅス
ーパーコンピテント細胞を連結物で形質転換して、２０
ｍＭグルコースを補充したＬＢ＋アンピシリン平板に播
種した。コロニーを同じタイプの平板に再度画線培養し
て単離した。ｐＧＯ−８ＣＫＳ／ＸＬ１のクローンを、
ＬＢブロス＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｓｉｇ
ｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）＋２０ｍＭグルコー
ス（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）で一晩培
養して増殖させた。連結保存物（０．５ｍＬの一晩培養
物＋０．５ｍＬグリセロール）を作製し、そしてＤＮＡ
を配列分析のために調製した。下記のオリゴヌクレオチ
ドを配列決定プライマーとして使用した：ＣＫＳ−１
（配列番号３０）、ＣＫＳ−２（配列番号３１）、ＣＫ
Ｓ−３（配列番号３２）、ＣＫＳ−４（配列番号３
３）、４３４６１（配列番号２）、４３２８５（配列番
号１）、４１ｓｙ−１Ｂ（配列番号２９）、４１ｓｙ−
２Ｂ（配列番号３４）、ＣＫＳ１７６．１（配列番号１
９）、およびＣＫＳ３５８３（配列番号２０）。

【００７３】Ｆ．ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αの構築図３Ａ〜図３Ｄは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αの構築に
含まれる工程の概略図を示す。ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５
αは、組換えタンパク質ｐＧＯ−９ＰＬをコードする。
配列番号４７は、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αのコード領
域のヌクレオチド配列を示す。図７は、ｐＧＯ−９ＰＬ
組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４８）を例
示する。このタンパク質は、Ｎ末端メチオニン、４５ア
ミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ
１１２単離体）および１９９アミノ酸のｅｎｖｇｐ４
１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）からなる。
ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αの構築は下記のように行っ
た。

【００７４】工程１．１００μｌのＰＣＲ反応液を、Ｕ
ｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝
液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄ
ＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’（配列番号１
１）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｈ（配列番号９）、お
よびテンプレートとして、（上記の実施例３のセクショ
ンＤから得られた）約２ｎｇのｐＧＯ−８候補クローン
６ミニプレップＤＮＡを用いて調製した。反応液を９４
℃で１２０秒間インキュベーションし、次いで９４℃で
３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間
の８サイクルで増幅した。

【００７５】工程２．１００μｌのＰＣＲ反応液を、Ｕ
ｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝
液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄ
ＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’（配列番号１
１）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｏ３’（配列番号１
５）、およびテンプレートとして、工程１の１０μｌの
ＰＣＲ反応液を用いて調製した。反応液を９４℃で１２
０秒間インキュベーションし、次いで９４℃で３０秒
間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で６０秒間の１８
サイクルで増幅し、その後、７２℃で５分間インキュベ
ーションした。

【００７６】次いで、Ｏｓｙｎ−５’／Ｏｓｙｎ−Ｏ
３’のＰＣＲ産物をゲル単離し、そしてＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＫＲＲ８２６ベク
ターに連結した。次に、連結産物を使用して、ＤＨ５α
コンピテント細胞を形質転換した。ｐＧＯ−９ＰＬの候
補クローン３を一晩培養して、ミニプレップＤＮＡを調
製した。Ｏｓｙｎ−５’／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のプラスミ
ド挿入物を、プライマーとして下記のオリゴヌクレオチ
ドを用いて配列決定した：ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワー
ド（配列番号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配
列番号３９）、４１ｓｙ−１Ｃ（配列番号４０）、４１
ｓｙ−２（配列番号４１）、４１ｓｙ−３（配列番号４
２）および４１ｓｙ−４（配列番号２３）。次いで、ｐ
ＧＯ−９ＰＬクローン＃３を再度画線培養して単離し
た。単離したコロニーを拾い、それを一晩培養して増殖
させ、そして凍結保存物（０．５ｍｌグリセロール＋
０．５ｍｌの一晩培養物）を作製した。保存物は−８０
℃で保存した。その配列を、上記のプライマーを使用し
て確認した。このクローンをｐＧＰ−９ＰＬ／ＤＨ５α
と名付けた（配列番号４７はコード領域のヌクレオチド
配列を表し、配列番号４８はコード領域のアミノ酸配列
を表す）。ｐＧＰ−９ＰＬ／ＤＨ５αを再度画線し、一
晩培養して増殖させて、ミニプレップＤＮＡを調製した
（この調製物をＨ５とした）。

【００７７】Ｇ．ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築図３Ａ〜図３Ｄは、ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築に
含まれる工程の概略図を示す。ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ
１は、組換えタンパク質ｐＧＯ−９ＣＫＳをコードす
る。図８は、ｐＧＯ−９ＣＫＳ組換えタンパク質のアミ
ノ酸配列（配列番号５０）を示す。このタンパク質は、
２４６アミノ酸のＣＫＳおよびポリリンカー、それに続
く４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩＶ−
１、ＨＡＭ１１２単離体）および１９９アミノ酸のｅｎ
ｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）
からなる。ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築は下記のよ
うに行った。

【００７８】２つのＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）
を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１
Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭ
の各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ
（配列番号２５）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｏ３’
（配列番号１５）、および（上記の実施例３のセクショ
ンＦから得られた）１ｎｇのｐＧＯ−９ＰＬ候補クロー
ン３ミニプレップＤＮＡを用いて調製した。各反応液を
９４℃で１２０秒間インキュベーションし、次いで９４
℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で１２
０秒間の２４サイクルで増幅し、その後、７２℃で５分
間インキュベーションした。次いで、Ｏｓｙｎ−５’Ｃ
ＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰＣＲ産物をゲル単離した。
次いで、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰ
ＣＲ産物をおよびベクターｐＪＯ２００をＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで消化した。消化したｐＪＯ２００ベク
ターをゲル単離し、そして消化したＯｓｙｎ−５’ＣＫ
Ｓ／Ｏｓｙｎ−Ｏ３’のＰＣＲ産物に連結した。ＸＬ１
−Ｂｌｕｅコンピテント細胞を連結物で形質転換して、
２０ｍＭグルコースを補充したＬＢ＋アンピシリン平板
に播種した。コロニーを同じタイプの平板で再度画線培
養して単離した。クローンｐＧＯ−９ＣＫＳの候補クロ
ーン４を、ＬＢブロス＋１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリ
ン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）＋２０ｍ
Ｍグルコース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．）で一晩培養して増殖させた。凍結保存物（０．５
ｍｌの一晩培養物＋０．５ｍｌグリセロール）を作製
し、そして配列決定分析のためにＤＮＡを調製した。下
記のオリゴヌクレオチドを配列決定プライマーとして使
用した：ＣＫＳ−１（配列番号３０）、ＣＫＳ−２（配
列番号３１）、ＣＫＳ−３（配列番号３２）、ＣＫＳ−
４（配列番号３３）、４３４６１（配列番号２）、４３
２８５（配列番号１）４１ｓｙ−１Ｂ（配列番号２
９）、４１ｓｙ−２Ｂ（配列番号３４）、４１ｓｙ−３
Ｂ（配列番号３５）、ＣＫＳ１７６．１（配列番号１
９）、ＣＫＳ３５８３（配列番号２０）およびｐＴＢ−
Ｓ８（配列番号２８）。クローンｐＧＯ−９ＣＫＳの候
補クローン４をｐＧＰ−９ＣＫＳ／ＸＬ１と名付けた
（配列番号４９はコード領域のヌクレオチド配列を表
し、配列番号５０はコード領域のアミノ酸配列を表
す）。

【００７９】Ｈ．ＯｓｙｎＩ−Ｍフラグメントの構築ＯｓｙｎＩ−Ｍフラグメントを下記のように構築した。
１００μｌのＰＣＲ反応液を、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（２．５Ｕ）、１Ｘ緩衝液、５０μＭの
各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩ−ＰＣＲ（配列番号２
６）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｍ（配列番号１４）、
および１０μｇのゲル単離したＰＣＲフラグメント３Ａ
（上記の実施例３、セクションＡ）を使用して調製し
た。反応液を９５℃で１０５秒間インキュベーション
し、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そ
して７２℃で６０秒間の１５サイクルで増幅し、次いで
７２℃で７分間保持した。ＯｓｙｎＩ−Ｍと名付けたＰ
ＣＲ産物をゲル単離し、そしてＰＣＲＩＩベクター
（ＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）に、製造者が指示する
手順に従ってクローニングした。得られた連結産物を使
用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。プラ
スミドのミニプレップＤＮＡをクローンＩＭ−６の一晩
培養物から作製して、遺伝子挿入物の配列決定を、５６
７５９（配列番号４５）および５５８４８（配列番号４
６）のオリゴヌクレオチドを用いて行った。

【００８０】Ｉ．ＰＣＲフラグメントＩ／６ＲおよびＩ
Ｍ−６Ｆの合成および再編成これらは下記の手順で行った。

【００８１】工程１．下記のＰＣＲ反応液（１００μｌ
容量）を調製した：（ａ）Ｉ／６ＲならびにＡｍｐｌｉ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）、１Ｘ緩衝
液、５０μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩ−ＰＣＲ
（配列番号２６）、５０ｐｍｏｌのＩＭ−６Ｒ（配列番
号２２）、およびテンプレートとして、（実施例３のセ
クションＨから得られた）２８１ｎｇのクローンＩＭ−
６；（ｂ）６Ｆ／ＭならびにＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（２．５Ｕ）、１Ｘ緩衝液、５０μＭの各
ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩＭ−６Ｆ（配列番号２
１）、５０ｐｍｏｌのＭ−ＰＣＲ（配列番号２７）、お
よびテンプレートとして、（実施例３のセクションＨか
ら得られた）２８１ｎｇのクローンＩＭ−６。

【００８２】反応液を９５℃で１０５秒間インキュベー
ションし、次いで、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒
間、そして７２℃で６０秒間の２０サイクルで増幅し、
次いで７２℃で７分間保持した。次に、ＰＣＲ産物のＩ
／６Ｒおよび６Ｆ／Ｍを、上記の手順に従ってゲル単離
した。

【００８３】工程２．ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）
を、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１
Ｘ緩衝液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭ
の各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＩ−ＰＣＲ（配列番号２
６）、５０ｐｍｏｌのＭ−ＰＣＲ（配列番号２７）、約
５０ｎｇのＩ／６Ｒ、および約２０ｎｇの６Ｆ／Ｍを用
いて調製した。反応液を９５℃で１０５秒間インキュベ
ーションし、次いで、９４℃で１５秒間、５５℃で３０
秒間、そして７２℃で６０秒間の２０サイクルで増幅
し、次いで７２℃で７分間保持した。ＰＣＲ産物を製造
者の指示に従ってＣｅｎｔｒｉ−ｓｅｐカラム（Ｐｒｉ
ｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）で処理した。

【００８４】Ｊ．ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αの構築図４Ａ〜図４Ｆは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αの構築
に含まれる工程の概略図を示す。ｐＧＯ−１１ＰＬ／Ｄ
Ｈ５αは組換えタンパク質ｐＧＯ−１１ＰＬをコードす
る。図９は、ｐＧＯ−１１ＰＬ組換えタンパク質のアミ
ノ酸配列（配列番号５２）を示す。このタンパク質は、
Ｎ末端メチオニン、４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０
（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離体）および３２７
アミノ酸のｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ
１１２単離体）からなる。ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５α
の構築は下記のように行った。

【００８５】実施例３のセクションＩから得られた最終
ＰＣＲ産物およびｐＧＯ−９ＰＬベクター（実施例３の
セクションＦのミニプレップＨ５）を、ＡｇｅＩおよび
ＢａｍＨＩで続いて消化した。次いで、消化したｐＧＯ
−９ＰＬを、子ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＢＲ
ＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３
７℃で１５分間処理して、フェノール／クロロホルム抽
出を行い、そしてＮａＯＡｃおよびＥｔＯＨを用いて沈
澱させた。ベクター（ｐＧＯ−９ＰＬ）を続いてゲル単
離した。消化したｐＧＯ−９ＰＬおよび消化したＰＣＲ
産物を連結した。連結産物を使用して、ＤＨ５αコンピ
テント細胞を形質転換した。コロニーを再度画線培養し
て単離した。次いで、クローンｐＧＯ１１−４を同定し
て、再度画線培養して単離した。凍結保存物の作製およ
び配列決定用ミニプレップＤＮＡの調製を行うために、
ｐＧＯ１１−４の一晩培養物を調製した。クローンｐＧ
Ｏ１１−４の配列決定を、下記のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて行った：ｐＫＲＲＥｃｏＲＩフォワー
ド（配列番号３８）、ｐＫＲＲＢａｍＨＩリバース（配
列番号３９）、４１ｓｙ−１Ｃ（配列番号４０）、４１
ｓｙ−２（配列番号４１）、４１ｓｙ−３（配列番号４
２）、４１ｓｙ−４（配列番号２３）、４１ｓｙ−５Ｂ
（配列番号４３）、４１ｓｙ−５Ｃ（配列番号３６）お
よび４１ｓｙ−６Ｂ（配列番号３７）。配列決定の結果
に基づいて、このクローンをｐＧＰ−１１ＰＬ／ＤＨ５
αと名付けた（配列番号５１はコード領域のヌクレオチ
ド配列を表し、配列番号５２はコード領域のアミノ酸配
列を表す）。

【００８６】Ｋ．ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築図４Ａ〜図４Ｇは、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築
に含まれる工程の概略図を示す。ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／
ＸＬ１は組換えタンパク質ｐＧＯ−１１ＣＫＳをコード
する。図１０は、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ組換えタンパク質
のアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。このタンパク
質は、２４６アミノ酸のＣＫＳおよびポリリンカー、そ
れに続く４５アミノ酸のｅｎｖｇｐ１２０（Ｏ群ＨＩ
Ｖ−１、ＨＡＭ１１２単離体）および３２７アミノ酸の
ｅｎｖｇｐ４１（Ｏ群ＨＩＶ−１、ＨＡＭ１１２単離
体）からなる。ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築は下
記のように行った。

【００８７】ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、Ｕｌ
ＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）および１Ｘ緩衝
液、ならびに１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、４０μＭの各ｄ
ＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−５’ＣＫＳ（配列番
号２５）、５０ｐｍｏｌのＯｓｙｎ−Ｍ（配列番号１
４）、およびテンプレートとして、（実施例３のセクシ
ョンＪから得られた）１ｎｇのｐＧＯ１１−４を用いて
調製した。反応液を９４℃で１０５秒間インキュベーシ
ョンし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、
そして７２℃で１２０秒間の２０サイクルで増幅し、そ
の後、７２℃で５分間インキュベーションした。Ｏｓｙ
ｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−ＭのＰＣＲ産物をゲル単離
した。次いで、Ｏｓｙｎ−５’ＣＫＳ／Ｏｓｙｎ−Ｍの
ＰＣＲ産物およびベクターｐＪＯ２００をＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで消化した。消化したｐＪＯ２００ベク
ターをゲル単離した。一晩（１６℃）の連結を、消化し
たＰＣＲ産物を用いて行った。ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパ
ーコンピテント細胞を連結物で形質転換して、２０ｍＭ
グルコースを補充したＬＢ＋アンピシリン平板に播種し
た。コロニーを同じ平板で再度画線培養して単離した。
次いで、クローンｐＧＯ−１１ＣＫＳの候補クローン２
を一晩培養した（ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍｌカルベニ
シリン＋２０ｍＭグルコース）。凍結保存物（０．５ｍ
ｌの８０％グリセロール＋０．５ｍｌの一晩培養物）を
作製し、そして配列決定分析のためにミニプレップＤＮ
Ａを調製した。下記のオリゴヌクレオチドを配列決定分
析プライマーとして使用した：ＣＫＳ−１（配列番号３
０）、ＣＫＳ−２（配列番号３１）、ＣＫＳ−３（配列
番号３２）、ＣＫＳ−４（配列番号３３）、４３４６１
（配列番号２）、４３２８５（配列番号１）４１ｓｙ−
１Ｂ（配列番号２９）、４１ｓｙ−２Ｂ（配列番号３
４）、４１ｓｙ−３Ｂ（配列番号３５）、４１ｓｙ−４
（配列番号２３）、４１ｓｙ−５Ｃ（配列番号３６）、
４１ｓｙ−６Ｂ（配列番号３７）、ＣＫＳ１７６．１
（配列番号１９）、ＣＫＳ３５８３（配列番号２０）お
よびｐＴＢ−Ｓ８（配列番号２８）。ｐＧＯ−１１ＣＫ
Ｓクローン＃２をｐＧＰ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１と名付け
た。配列番号５３は、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１のコ
ード領域のヌクレオチド配列を表す。配列番号５４は、
ｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１のコード領域のアミノ酸配
列を表す。

【００８８】実施例４．ｐＨＩＶ２１０／ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅの構築図１１は、ｐＨＩＶ−２１０組換えタンパク質のアミノ
酸配列（配列番号５５）を示す。このタンパク質は、２
４７アミノ酸のＣＫＳ／ポリリンカー配列、ｅｎｖｇ
ｐ１２０（＃４３２〜４９１；ＨＩＶ−２単離体Ｄ１９
４．１０）に由来する６０アミノ酸、および１５９アミ
ノ酸のｅｎｖｇｐ３６（＃４９２〜６５０；ＨＩＶ−
２単離体Ｄ１９４．１０）からなる。ｐＨＩＶ２１０／
ＸＬ１−Ｂｌｕｅの構築は下記のように行った。

【００８９】ＨＩＶ−２単離体Ｄ１９４．１０のゲノム
ＤＮＡ［Ｈ．Ｋｕｈｎｅｌ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：６１４２（１９９
０）］はＥＭＢＬ３λクローニングベクターにクローニ
ングされていた。Ｈ．Ｋｕｈｎｅｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２３８３〜
２３８７（１９８９）、およびＨ．Ｋｕｈｎｅｌ他、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：
６１４２（１９９０）を参照のこと（これらは参考とし
て本明細書中に援用される）。Ｄ１９４．１０を含むλ
クローン（λＡ１０）をＤｉａｇｅｎＣｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）から受け取
った。ＰＣＲ反応液（１００μｌ容量）を、Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（３．７５ユニット）、各
２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ
ＴＰ、０．５μｇのプライマー３６３４（配列番号８
８；ＨＩＶ−２単離体Ｄ１９４．１０（ＥＭＢＬアクセ
ス番号Ｘ５２２２３）の７４３７位〜７４５５位にアニ
ーリングする）、０．５μｇのプライマー３６３６（配
列番号８９；８０９５位〜８０７７位にアニーリングす
る）、１ＸＰＣＲ緩衝液、および５μｌのλＡ１０
ＤＮＡ（１：５０に希釈）を使用して調製した。反応液
を９４℃で５分間インキュベーションし、次いで、９４
℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で２分間の３５サ
イクルで増幅し、その後、７２℃で５分間インキュベー
ションした。ＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で
抽出し、そしてＤＮＡをエタノール（ＡＡＰＥＲＡｌ
ｃｏｈｏｌ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｓｈ
ｅｌｂｙｖｉｌｌｅ、ＫＹ）で沈澱させた。ＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、１．５％アガロ
ースゲル（ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロース、ＦＭＣ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎ
ｅ）でゲル精製した。精製した産物を、ＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩで消化したｐＪＯ２００ベクターに、８０
０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を使用して連結した。ＸＬ１
−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）を、２μｌの連結物を用いて、製造者によって
概略されているように形質転換し、そしてアンピシリン
（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）を
補充したＬＢ平板に播種した。一晩の培養を、５０μｇ
／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭグル
コース（Ｓｉｇｍａ）を補充したＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ
ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌ
ａｎｄ、ＮＹ）に単一コロニーを接種することによって
行った。凍結保存物を、０．３ｍｌの８０％グリセロー
ルを０．７ｍｌの一晩培養物に加えることによって作製
した。混合した後、保存物を−７０℃で保存した。ミニ
プレップＤＮＡを、アルカリ溶解法、その後のＰＥＧ沈
澱を使用して一晩培養物から調製した。配列決定反応
を、７−デアザ−ｄＧＴＰＲｅａｇｅｎｔＫｉｔお
よびＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｕ
ｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）
を用いて製造者によって概略されているように行った。
反応液を、製造者の推奨に従ってＩＢＩゲル装置を使用
して６％アクリルアミドゲル（ＧＩＢＣＯＢＲＬＧ
ｅｌ−Ｍｉｘ６）で泳動した。配列決定の結果に基づ
いて、ｐＨＩＶ−２１０クローン＃７をｐＨＩＶ−２１
０と名付けた。ｐＨＩＶ−２１０のコード領域のアミノ
酸配列を配列番号５５として示す。

【００９０】実施例５．Ｏ群ＨＩＶ−１の組換えｇｐ４
１抗原構築体を有する大腸菌株の増殖および誘導ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の一晩培養した種培養物を、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムを補充した５
００ｍｌの滅菌したＥｘｃｅｌｌＴｅｒｒｉｆｉｃ
Ｂｒｏｔｈ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒ
ｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）から入手可能）で調製し
て、３２℃または３７℃の振盪回転式インキュベーター
に置いた。１００μｌの接種物を、種培養物から、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムを補充した１リッ
トルの滅菌したＥｘｃｅｌｌＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒ
ｏｔｈを含有するフラスコに移した。培養物を、培養物
が中期対数増殖に達するまで３７℃でインキュベーショ
ンし、次いで１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラ
クトシド）を用いて３７℃で３時間インキュベーション
した。あるいは、ｐＬ構築体を、培養物が中期対数増殖
に達するまで３２℃でインキュベーションし、次いで培
養物の温度を４２℃に変えることによって３時間誘導し
た。誘導した後、細胞を、標準的な手順に従って、遠心
分離によってペレット化して集めた。ペレット化された
細胞は、さらに処理するまで−７０℃で保存した。

【００９１】実施例６．大腸菌において不溶性封入体と
して産生されたＯ群ＨＩＶ−１組換えｇｐ４１抗原の単
離および可溶化実施例５から得られた凍結細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ
（ｐＨ８）、１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、８％（ｗ／ｖ）のスクロース、５％のＴｒｉ
ｔｏｎＸ−１００（登録商標）（ｖ／ｖ）、１ｍＭの
ＰＭＳＦ、および１μＭのペプスタチンＡを含有する冷
溶解緩衝液でホモジネーションすることによって再懸濁
した。リゾチームを、１ｇの処理細胞あたり１．３ｍｇ
の濃度でホモジネートに加えた。得られた混合物を氷上
で３０分間インキュベーションして、細胞を溶解した。
封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離し
た。このようにしてペレット化された封入体を、（１）
溶解緩衝液；（２）１０ｍＭＮａＥＤＴＡ（ｐＨ
８）、３０％（ｗ／ｖ）スクロース；および（３）水
で、順次、洗浄してペレット化した。洗浄した封入体を
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１０ｍＭＮａＥＤ
ＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌおよび３Ｍ尿素で再懸濁し
て、氷上で１時間インキュベーションした。次いで、封
入体を可溶化タンパク質から遠心分離によって分離し
た。ペレット化した封入体を、７ＭグアニジンＨＣｌ、
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１％（ｖ／ｖ）β
−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）において４℃で一晩
かけて完全に可溶化した。可溶化した組換え抗原を遠心
分離によって澄明化して、０．２μｍのフィルターに通
し、そしてクロマトグラフィーによる精製を行うまで−
２０℃以下で保存した。

【００９２】実施例７．クロマトグラフィーによるＯ群
ＨＩＶ−１の組換えｇｐ４１抗原の精製実施例６から得られた可溶化されたＯ群ＨＩＶ−１の組
換えｇｐ４１抗原を、２工程の方法によって下記のよう
に精製した。不溶性抗原のグアニジンＨＣｌ抽出物を、
５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、８Ｍ尿素および０．１
％ＢＭＥ（ｖ／ｖ）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−３００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー
によって精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を使用して、画分を分析した。組換えｇｐ４１抗原を
含有する画分をまとめ、次いで、限外ろ過によって濃縮
した。組換え抗原の濃縮物を４％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）お
よび５％ＢＭＥ（ｗ／ｖ）により室温で３時間処理し
た。ＳＤＳ処理した抗原を、２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ
８）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＭ
Ｅ、０．１％ＳＤＳ（ｖ／ｖ）で平衡化したＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌＳ−３００カラムでのサイズ排除クロマト
グラフィーによってさらに精製した。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動を使用して、画分を分析した。精製
された組換えｇｐ４１抗原を含有する画分をまとめ、
０．２μｍのフィルターに通して、−７０℃で保存し
た。

【００９３】実施例８．Ｍ群ＨＩＶ−１抗原の調製プラスミドｐＴＢ３１９を含有する細胞を、実施例５に
記載されているように増殖させて誘導した。本質的には
米国特許第５，１２４，２５５号（これは参考として本
明細書中に援用される）の実施例５に記載されているよ
うに、細胞を溶解して、封入体を処理した。続いて、ペ
レット化した物質を、ＳＤＳ、リン酸塩（ｐＨ６．８）
において可溶化し、次いでＳ−３００カラムでのクロマ
トグラフィーに供した。

【００９４】実施例９．ＨＩＶ−２抗原の調製ｐＨＩＶ−２１０／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（上記の実施
例４）を、実施例５に記載されているように増殖させて
誘導した。細胞を、リン酸塩、ＭｇＣｌ_２、ＮａＥＤ
ＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）を含有
し、ベンゾナーゼ、リゾチームおよびＰＭＳＦを補充し
た緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解した。封入体を遠心分離
によって可溶性タンパク質から分離した。ペレットを、
蒸留水；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、デオ
キシコール酸塩、ＮａＣｌ、リン酸塩（ｐＨ７．０）；
５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）；尿素およびＳＤＳを
含むリン酸塩（ｐＨ７．０）＋ＢＭＥで、順次、洗浄し
た。タンパク質を、ＳＤＳ、リン酸塩（ｐＨ７．０）お
よびＢＭＥにおいて可溶化し、次いでＳ３００カラムで
のクロマトグラフィーに供した。

【００９５】実施例１０．Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２を同時に検出して識別するための
１工程免疫クロマトグラフィーアッセイＡ．試薬の調製１．セレン（Ｓｅ）コロイド懸濁物を、実質的には下記
のように調製した：ＳｅＯ_２を水に０．０６２５ｇｍ／
ｍｌの濃度に溶解した。次いで、アスコルビン酸塩を水
に０．３２ｇｍ／ｍｌの濃度に溶解して、７０℃の水浴
で２４時間加熱した。次いで、アスコルビン酸塩溶液を
０．００６５ｇ／ｍｌに水で希釈した。ＳｅＯ_２溶液
を、希釈したアスコルビン酸塩溶液に素早く加えて、４
２℃でインキュベーションした。インキュベーション
を、少なくとも４２時間後で、５４２ｎｍおよび５８８
ｎｍの間の波長における最大吸光度が３０を超えたとき
に終了した。コロイド懸濁物を２℃〜８℃に冷却し、そ
の後、保存した。セレン懸濁物は、ＡｂｂｏｔｔＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ、Ｉ
Ｌ；コード２５００１）から入手することができる。

【００９６】２．セレンコロイド／抗体コンジュゲート
を下記のように調製した。セレンコロイド懸濁物を、蒸
留水における吸光度が２５（ＯＤ５００〜５７０）にな
るように濃縮した。次いで、１ＭＭＯＰＳを１０ｍＭ
（ｐＨ７．２）の最終濃度になるように加えた。ヒトＩ
ｇＧのＦｃ領域に特異的なヤギの抗体（あるいはヒトＩ
ｇＧのＦｃ領域に特異的な他の種の抗体）を５０ｍＭリ
ン酸塩緩衝液で０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次
いで、得られた抗体調製物を、上記のようにして調製し
たセレンコロイド懸濁物に、抗体の最終濃度が７５μｇ
／ｍｌになるように加えて混合した。攪拌を４０分間続
けた。次いで、１（重量）％のウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）をこの溶液に加えて、セレンコロイド／抗体結合
体の溶液をさらに１５分間攪拌し、そして５０００ｘｇ
で９０分間遠心分離した。その後、上清の９０％を除
き、ペレットを残った上清で再懸濁した。このセレン−
ＩｇＧ結合体をガラス繊維パッドにコーティングする直
前に、結合希釈液（１重量％のカゼイン、０．１重量％
のＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（登録商標）、および５０
ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２））で１：１０に希釈し
た。

【００９７】３．手順上の対照試薬を、ＨＩＶ−１（Ｍ
群）、ＨＩＶ−１（Ｏ群）およびＨＩＶ−２の陽性血清
の混合物として調製した。これは、アッセイの陽性対照
として別個のストリップデバイスで利用される。

【００９８】４．使用した陰性の対照試薬は、アッセイ
の陰性対照として別個の試験デバイスで利用される正常
なヒトであった。

【００９９】Ｂ．適用パッドの調製適用パッドの物質は、樹脂結合型のガラス繊維ろ紙（Ｌ
ｙｄａｌｌ）を含む。（上記のパラグラフ２に記載され
ている）約０．１ｍｌの調製した結合体を適用パッドに
加える。

【０１００】Ｃ．クロマトグラフィー材の調製すべての試薬を、電荷および偏向による試薬噴射によっ
てニトロセルロース膜に加える。このニトロセルロース
は、感圧性接着剤でコーティングされたＭＹＬＡＲ（登
録商標）膜によって支持されている。

【０１０１】試験サンプル捕捉試薬を、（ａ）Ｏ群ＨＩ
Ｖ−１捕捉試薬（ｐＧＯ−９／ＣＫＳ、配列番号５０）
に関して、上記のように調製された特異的抗原を０．５
ｍｇ／ｍｌの濃度に噴射用希釈液（１００ｍＭＴｒｉ
ｓ（ｐＨ７．６）、ならびに１重量％スクロース、０．
９％ＮａＣｌ、および５μｇ／ｍｌフルオレセイン）
で希釈することによって、（ｂ）Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜
群）捕捉試薬（ｐＴＢ３１９、配列番号５６）に関し
て、同様に希釈することによって、そして（ｃ）ＨＩＶ
−２捕捉試薬（ｐＨＩＶ−２１０、配列番号５５）に関
して、同様に希釈することによって調製した。０．０９
８μｌの第１の捕捉試薬（Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜群）試
薬；配列番号５６）をストリップの指定された捕獲部位
に加えて、１つの患者捕獲部位を組み立てた。同様に、
０．０９８μｌの第２の捕捉試薬（Ｏ群ＨＩＶ−１試
薬；配列番号５０）をストリップの指定された捕獲部位
に加えて、１つの患者捕獲部位を組み立て、そして０．
０９８μｌの第３の捕捉試薬（ＨＩＶ−２試薬；配列番
号５５）をストリップの指定された捕獲部位に加えて、
１つの患者捕獲部位を組み立てた。

【０１０２】Ｄ．ＨＩＶに対する抗体の存在に関する迅
速アッセイ試験サンプルの血清、全血、唾液および尿のサンプルに
おけるＨＩＶに対する抗体の存在に関する迅速アッセイ
を下記のように行った。１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆチューブにおいて、５μｌの血清および６００μｌの
サンプル溶出緩衝液（ＳＥＢ）（５０ｍＭＴｒｉｓ、
１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ
−４０５（登録商標）（ｖ／ｖ）、１．５％カゼイン
（ｗ／ｖ）、３％ウシＩｇＧ（ｗ／ｖ）、４％大腸菌
溶解物（ｗ／ｖ）［ｐＨ８．２］を含有する）を混合し
た。この混合物の４滴をＳＴＡＲ部分のサンプルウエル
に加えた。次いで、１μｌの血清または全血をマイクロ
タイタープレートのウエルで１００μｌのＳＥＢに加
え、そしてニトロセルロースストリップをウエルに加え
た。その後、１μｌの血清または全血を、本発明のサン
プルウエルの試験デバイスに直接スポットして、４滴の
ＳＥＢを加えた。唾液を試験する場合、５０μｌまたは
７５μｌの唾液を、マイクロタイタープレートのウエル
で、それぞれ、５０μｌまたは２５μｌのＳＥＢに加
え、そしてニトロセルロース試験ストリップをウエルに
加えた。尿を試験する場合、５０μｌの尿をマイクロタ
イタープレートのウエルで５０μｌのＳＥＢに加え、そ
してニトロセルロース試験ストリップをウエルに加え
た。あるいは、１００μｌの尿をマイクロタイタープレ
ートのウエルで使用して、ＳＥＢを使用することなくニ
トロセルロース試験ストリップを加えた。

【０１０３】サンプル中のＩｇＧは結合パッド内のセレ
ン−ヤギ抗ヒトＩｇＧコロイドにより結合し、そして複
合体は、ニトロセルロース膜試験ストリップの長さ方向
に沿ってクロマトグラフィー的に分離された。このスト
リップには、ｐＧＯ−９ＣＫＳ（配列番号５０）、ｐＴ
Ｂ３１９（Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜群）、配列番号５６）
およびｐＨＩＶ２１０（ＨＩＶ−２、配列番号５５）の
３つの組換え抗原が、精密な液滴サイズを使用して確実
な置き換え分配をもたらすバイオドット装置を使用して
前もって１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられている。次い
で、試験デバイスを室温で２分間インキュベーションし
て、結果を可視的に読み取った。

【０１０４】Ｅ．混合された全血のアッセイ１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、陽
性が確認されたＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１または
ＨＩＶ−２の全血サンプル、あるいは陰性が確認された
Ｏ群ＨＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の全
血サンプルのいずれかに由来する１μｌの血液の等量
を、５μｌの陰性が確認されたＯ群ＨＩＶ−１、Ｍ群Ｈ
ＩＶ−１またはＨＩＶ−２の血清に１００μｌのＳＥＢ
と一緒に加えて混合した。この混合物を本発明の試験デ
バイスのサンプルウエルに加えた。

【０１０５】サンプル中のＩｇＧは結合パッド内のセレ
ン−ヤギ抗ヒトＩｇＧコロイドにより結合し、そして複
合体は、ニトロセルロース膜試験ストリップの長さ方向
に沿ってクロマトグラフィー的に分離された。このスト
リップには、ｐＧＯ−９ＣＫＳ（配列番号５０）、ｐＴ
Ｂ３１９（Ｍ群ＨＩＶ−１（Ｂ亜群）、配列番号５６）
およびｐＨＩＶ２１０（ＨＩＶ−２、配列番号５５）の
３つの組換え抗原が、精密な液滴サイズを使用して確実
な置き換え分配をもたらすバイオドット装置を使用して
前もって１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられている。次い
で、試験デバイスを室温で２分間インキュベーションし
て、結果を可視的に読み取った。

【０１０６】Ｆ．結果抗原１に対する抗体が試験サンプル中に存在した場合、
可視的な反応が、抗原１の捕獲帯域領域およびアッセイ
完了帯域において示され、そして抗原２または抗原３の
各領域では見られなかった。抗原２に対する抗体が試験
サンプル中に存在した場合、可視的な反応が、抗原２の
捕獲帯域領域およびアッセイ完了帯域において示され、
そして抗原１または抗原３の各領域では見られなかっ
た。抗原３に対する抗体が試験サンプル中に存在した場
合、可視的な反応が、抗原３の捕獲帯域領域およびアッ
セイ完了帯域において示され、そして抗原１または抗原
２の各領域では見られなかった。さらに、陰性対照は、
抗原１、抗原２および抗原３の各帯域において反応（可
視的な反応）を示さなかったが、アッセイ完了帯域にお
いて反応し得る。陽性対照（抗原１、抗原２および／ま
たは抗原３に対する既知の抗体）は、それが抗原／抗体
反応で特異的に結合する適切な抗原の帯域で反応し得
る。陽性反応が抗原捕獲帯域の１つで生じているが、ア
ッセイ完了帯域で生じていない場合には、効果を無効と
見なして、試験を繰り返した。

【０１０７】（ｉ）血液、尿および唾液における抗体に
関するアッセイ（０１０９、４０６８および４４７５
の患者番号によって同定される）３人の患者の血液、尿
および唾液を、本明細書中に記載されている本発明のニ
トロセルロース固相デバイスで、上記のアッセイプロト
コルに従って試験した。０１０９、４０６８および４４
７５の各患者の血液試験サンプルおよび尿試験サンプル
は、それぞれ、抗原１（ｐＴＢ３１９、配列番号５６）
と反応した。４０６８および４４７５の患者の唾液試験
サンプルもまた抗原１と反応したが、患者０１０９の唾
液試験サンプルは本発明の試験デバイスでは反応しなか
った。患者０１０９の唾液試験サンプルを、その後、標
準的なＥＩＡによって再試験して、ＨＩＶ−１ｇｐ４１
に対する抗体には反応しないことを確認した。このこと
は、患者０１０９の唾液試験サンプルに関して得られた
結果は有効であったことを示す。

【０１０８】（ｉｉ）ＨＩＶ抗体に関して陰性サンプル
のアッセイ図１４は、４個の試験デバイスの写真であ
り、２つの陰性血清試験サンプルおよび２つの陰性全血
試験サンプルを試験して得られた結果を示し、それぞれ
は同じ２つの陰性血清と混合された。サンプルは、関連
する抗原に特異的な抗体を含有していなかった。試験サ
ンプルは、Ｏ、Ｍまたは２のいずれかの位置における反
応を示す縞が見られないことによって示されるように、
本試験でアッセイした後に陰性であった（すなわち、反
応しなかった）。試験サンプルは、試験サンプル反応性
帯域における陽性反応の縞によって示されているように
それぞれの試験デバイスに存在した。

【０１０９】（ｉｉｉ）Ｍ群ＨＩＶ−１の抗体に関する
アッセイ図１５は、１０個の試験デバイスの写真であ
り、５つのＭ群ＨＩＶ−１血清、およびＭ群ＨＩＶ−１
陽性血清と混合された５つの全血サンプルを試験して得
られた結果を示す。図１５において認められるように、
Ｍ群ＨＩＶ−１サンプルは、Ｍ群ＨＩＶ−１抗原（ｐＴ
Ｂ３１９、中央の帯域）に特異的な抗体を含有し、そし
てＭ群ＨＩＶ−１抗原帯域において反応線が現れた。そ
して可視的な反応線を、１０個の試験デバイスの９個の
「Ｍ」と標識されたアッセイ完了帯域で認めることがで
きる。バンドがＭ群ＨＩＶ−１抗体の捕獲帯域において
１つの試験デバイスに存在しているが、試験サンプルは
アッセイ完了帯域にまで達していなかった。従って、こ
のサンプルに関してはアッセイを繰り返す必要があっ
た。交差反応性が、Ｏ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の
捕捉試薬について認められなかったことに留意するこ
と。

【０１１０】（ｉｖ）Ｏ群ＨＩＶ−１の抗体に関するア
ッセイ図１６は、４個の試験デバイスの写真であり、
２つの陽性と確認されたＯ群ＨＩＶ−１血清、およびＯ
群ＨＩＶ−１血清と混合された２つの全血試験サンプル
を試験して得られた結果を示す。図１６において認めら
れるように、Ｏ群ＨＩＶ−１サンプルは、Ｏ群ＨＩＶ−
１抗原に特異的な抗体を含有した：これは、Ｏ群ＨＩＶ
−１抗原捕獲帯域領域（「Ｏ」として示される最下段の
帯域）における陽性の縞の結果によって示された。可視
的な反応線を、それぞれのデバイスのアッセイ完了帯域
で認めることができる。Ｍ群ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−
２の捕獲抗原との交差反応は認められなかった（縞は認
められなかった）。

【０１１１】（ｖ）ＨＩＶ−２の抗体に関するアッセイ
図１７は、１０個の試験デバイスの写真であり、５つ
の陽性と確認されたＨＩＶ−２血清（左側の５個の試験
デバイス）、および５つのＨＩＶ−２血清と混合された
全血（右側の５個の試験デバイス）を試験して得られた
結果を示す。図１７から認めることができるように、Ｈ
ＩＶ−２サンプルは、ＨＩＶ−２抗原（ｐＨＩＶ２１
０、「２」によって示される上部の帯域）に特異的な抗
体を含有した：これはＨＩＶ−２抗原帯域における反応
縞によって示された。これらの試験サンプルおよびＯ群
ＨＩＶ−１抗原またはＭ群ＨＩＶ−１抗原に関する反応
は認められなかった。可視的な反応線を、それぞれのデ
バイスのアッセイ完了帯域で認めることができる。

【０１１２】（ｖｉ）Ｍ群ＨＩＶ−１、Ｏ群ＨＩＶ−
１、ＨＩＶ−２のサンプルおよび陰性サンプルのアッセ
イ図１８は、（左から右に）陰性試験サンプル、Ｍ群
ＨＩＶ−１陽性試験サンプル、Ｏ群ＨＩＶ−１陽性試験
サンプルおよびＨＩＶ−２陽性試験サンプルを個々に試
験した４個の試験デバイスの写真である。図１８から認
めることができるように、陰性の試験血清は抗原捕獲帯
域においていずれの抗原とも反応しなかったが、Ｍ群Ｈ
ＩＶ−１陽性試験サンプルはＭ群ＨＩＶ−１抗原とのみ
反応し、Ｏ群ＨＩＶ−１陽性試験サンプルはＯ群ＨＩＶ
−１抗原とのみ反応し、そしてＨＩＶ−２陽性試験サン
プルはＨＩＶ−２抗原とのみ反応した。可視的な反応線
を、それぞれのデバイスのアッセイ完了帯域で認めるこ
とができる。

【０１１３】使用した５つのＭ群ＨＩＶ−１試験サンプ
ルおよび２つのＯ群ＨＩＶ−１試験サンプルは、以前に
Ａｂｂｏｔｔ社の３Ａ７７ＥＩＡを使用して試験され、
そしてＰＣＲ増幅および配列決定が行われ、そして系統
発生的分析に基づいて分類された血清陽性と確認された
サンプルであった。使用した５つのＨＩＶ−２サンプル
は、Ａｂｂｏｔｔ社の３Ａ７７ＥＩＡを使用して血清陽
性であり、そしてＨＩＶ−２ウエスタンブロット試験に
よってＨＩＶ−２サンプルと確認された（Ｓａｎｏｆ
ｉ）。［図面の簡単な説明］

【図１】図１は、Ｏ群ＨＩＶ−１単離体ＨＡＭ１１２に
由来するｅｎｖタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番
号６１）を示す。

【図２】図２は、Ｏ群ＨＩＶ−１のｅｎｖｇｐ１２０
／ｇｐ４１の合成遺伝子構築体を作製するために使用し
た手順を示す：ｐＧＯ−８’挿入物＝Ｏｓｙｎ−５’か
らＯｓｙｎ−Ｐ３’まで；ｐＧＯ−９挿入物＝Ｏｓｙｎ
−５’からＯｓｙｎ−０３’まで；ｐＧＯ−１１挿入物
＝Ｏｓｙｎ−５’からＯｓｙｎ−Ｍまで；およびＨ＝Ｏ
群ＨＩＶ−１の疎水性領域（示されているように欠失さ
れる）。

【図３Ａ】図３Ａは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよび
ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる工程
の概略図を示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよび
ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる工程
の概略図を示す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよび
ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる工程
の概略図を示す。

【図３Ｄ】図３Ｄは、ｐＧＯ−９ＰＬ／ＤＨ５αおよび
ｐＧＯ−９ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる工程
の概略図を示す。

【図４Ａ】図４Ａは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図４Ｄ】図４Ｄは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図４Ｅ】図４Ｅは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図４Ｆ】図４Ｆは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図４Ｇ】図４Ｇは、ｐＧＯ−１１ＰＬ／ＤＨ５αおよ
びｐＧＯ−１１ＣＫＳ／ＸＬ１の構築において含まれる
工程の概略図を示す。

【図５】図５は、ｐＧＯ−８ＰＬ組換えタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号５８）を例示する。

【図６】図６は、ｐＧＯ−８ＣＫＳ組換えタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号６０）を示す。

【図７】図７は、ｐＧＯ−９ＰＬ組換えタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号４８）を例示する。

【図８】図８は、ｐＧＯ−９ＣＫＳ組換えタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号５０）を示す。

【図９】図９は、ｐＧＯ−１１ＰＬ組換えタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号５２）を例示する。

【図１０】図１０は、ｐＧＯ−１１ＣＫＳ組換えタンパ
ク質のアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。

【図１１】図１１は、ｐＨＩＶ−２１０組換えタンパク
質のアミノ酸配列（配列番号５５）を例示する。

【図１２】図１２は、本発明のために利用される試験デ
バイスの正平面図である。

【図１３】図１３は、図１２の線（２０）−（２２）に
沿って得られる、図１２に示す試験デバイスの断面図で
ある。

【図１４】図１４は、本発明のアッセイにおいて、（左
から右に）２個の陰性血清サンプル（左側の２個の試験
デバイス）、および陰性対照と混合された２個の陰性全
血試験サンプル（右側の２個の試験デバイス）の４個の
試験デバイスで得られた結果の写真である。

【図１５】図１５は、１０個の試験デバイスの写真であ
り、そして（左から右に）５個のＭ群ＨＩＶ−１血清
（左側の５個の試験デバイス）、およびＭ群ＨＩＶ−１
の陽性血清と混合された５個の全血試験サンプル（右側
の５個の試験デバイス）を試験して得られた結果を示
す。

【図１６】図１６は、（左から右に）４個の陽性と確認
されたＯ群ＨＩＶ−１血清（左側の２個の試験デバイ
ス）、およびＯ群ＨＩＶ−１の血清と混合された２個の
全血（右側の２個の試験デバイス）を試験したときに得
られた結果を示す４個の試験デバイスの写真である。

【図１７】図１７は、（左から右に）５個のＨＩＶ−２
と確認された陽性血清（左側の５個の試験デバイス）、
およびＨＩＶ−２血清と混合された全血（右側の５個の
試験デバイス）を用いて得られた結果を示す１０個の試
験デバイスの写真である。

【図１８】図１８は、（左から右に）陰性の試験サンプ
ル、Ｍ群ＨＩＶ−１陽性の試験サンプル、Ｏ群ＨＩＶ−
１陽性の試験サンプル、およびＨＩＶ−２陽性の試験サ
ンプルを個々に試験した４個の試験デバイスの写真であ
る。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハケツト，ジヨン・アール，ジユニアアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、メリル・コート・306 (72)発明者ヒツクマン，ロバート・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンデレイン、サウス・プレイリー・アベニユー・524 (72)発明者バリテツク，ビンセント，ジユニアアメリカ合衆国、イリノイ・60030、ワイルドウツド、ノース・サンセツト・アベニユー・33139 (72)発明者ネクローズ，エリザベス・シーアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイズレイク、チエロキー・トレイル・ 24323 (72)発明者ゴールデン，アラン・エムアメリカ合衆国、イリノイ・60091、ウイルメツト、ローレル・レイン・2516 (72)発明者ブレナン，キヤサリン・エイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、イースト・リンカーン・アベニユー・634 (72)発明者デビア，スシル・ジーアメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノースブルツク、フランズワース・レイン・2492 (56)参考文献特表平10−509587（ＪＰ，Ａ) 特表平８−510063（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 ZNA G01N 33/48 - 33/98

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、
Ｍ群ＨＩＶ−１、およびＨＩＶ−２に対する抗体を含む
分析物を同時に検出して識別するための方法であって、（ａ）前記試験サンプルを、近位端および遠位端を有
し、前記試験サンプルを毛管作用によって前記近位端か
ら前記遠位端の近くにまで移動させ、そして分析物に対
する少なくとも１つの固定化された捕捉試薬を含有する
ストリップを有する分析デバイスと、前記分析物および
前記捕捉試薬の結合による捕捉試薬／分析物の複合体を
形成させるのに十分な時間および条件下で接触させるこ
と；および（ｂ）前記ストリップ上の捕捉試薬部位での可視的な色
の変化を検出することによって分析物（１つまたは複
数）の存在を決定すること；を含み、Ｏ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は、配列番号４
８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列
番号５８および配列番号６０からなる群より選択される
ポリペプチドを含み、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉
試薬は配列番号５６のポリペプチドを含み、そしてＨＩ
Ｖ−２のための前記捕捉試薬は配列番号５５のポリペプ
チドを含む方法。
【請求項２】前記の固定化された捕捉試薬が、文字、
数字、アイコン、または記号として配置される、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】標識された試薬が、前記近位端と固定化
された患者捕捉試薬との間の位置で前記ストリップに含
有される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記ポリペプチド捕捉試薬が組換え技術
により製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記の標識された試薬がセレンである、
請求項３に記載の方法。
【請求項６】前記試験サンプルが体液である、請求項
１に記載の方法。
【請求項７】前記体液が、全血、血清、血漿、尿およ
び唾液からなる群より選択される、請求項６に記載の方
法。
【請求項８】試験サンプルにおけるＯ群ＨＩＶ−１、
Ｍ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を同時に検出して識別
するための分析デバイスであって、近位端および遠位端
を有し、そして前記試験サンプルを毛管作用によって前
記近位端から前記遠位端の近くにまで移動させることが
でき、分析物に対する少なくとも１つの固定化された捕
捉試薬を、前記分析物と前記捕捉試薬とを結合させるた
めに含有するストリップを含み；そしてＯ群ＨＩＶ−１
のための前記捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５
０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８および
配列番号６０からなる群より選択されるポリペプチドを
含み、Ｍ群ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は配列番号
５６のポリペプチドを含み、そしてＨＩＶ−２のための
前記捕捉試薬は配列番号５５のポリペプチドを含む分析
デバイス。
【請求項９】前記の固定化された捕捉試薬が、文字、
数字、アイコン、または記号として配置される、請求項
８に記載の分析デバイス。
【請求項１０】標識された試薬が、前記近位端と固定
化された患者捕捉試薬との間の位置で前記ストリップに
含有される、請求項８に記載の分析デバイス。
【請求項１１】前記の標識された試薬がセレンであ
る、請求項１０に記載の分析デバイス。
【請求項１２】前記試験サンプルが体液である、請求
項８に記載の分析デバイス。
【請求項１３】前記体液が、全血、血清、血漿、尿お
よび唾液からなる群より選択される、請求項１２に記載
の分析デバイス。
【請求項１４】前記ポリペプチド捕捉試薬が組換え技
術により製造される、請求項８に記載の分析デバイス。
【請求項１５】特異的な結合アッセイにおいて使用す
るためのキットであって、試験サンプルにおけるＯ群Ｈ
ＩＶ−１、Ｍ群ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の存在また
は量を決定するための分析デバイスを有し、近位端およ
び遠位端を有するストリップを含み、前記試験サンプル
は毛管作用によって前記近位端から前記遠位端の近くに
まで移動することができ、そして前記ストリップは、分
析物、補助的な特異的結合メンバー、および標識された
試薬からなる群より選択される要素に結合する固定化さ
れた捕捉試薬を含有し、そしてＯ群ＨＩＶ−１のための
前記捕捉試薬は、配列番号４８、配列番号５０、配列番
号５２、配列番号５４、配列番号５８および配列番号６
０からなる群より選択されるポリペプチドを含み、Ｍ群
ＨＩＶ−１のための前記捕捉試薬は配列番号５６のポリ
ペプチドを含み、そしてＨＩＶ−２のための前記捕捉試
薬は配列番号５５のポリペプチドを含むキット。
【請求項１６】前記の標識された試薬がセレンであ
る、請求項１５に記載の試験キット。
【請求項１７】陽性対照試薬をさらに含む、請求項１
５に記載の試験キット。
【請求項１８】陰性対照試薬をさらに含む、請求項１
５に記載の試験キット。
【請求項１９】前記ポリペプチド捕捉試薬が組換え技
術により製造される、請求項１５に記載の試験キット。