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JP3233285B2 - 冷光分析における放射冷光測定方法 - Google Patents

冷光分析における放射冷光測定方法

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JP3233285B2
JP3233285B2 JP50501492A JP50501492A JP3233285B2 JP 3233285 B2 JP3233285 B2 JP 3233285B2 JP 50501492 A JP50501492 A JP 50501492A JP 50501492 A JP50501492 A JP 50501492A JP 3233285 B2 JP3233285 B2 JP 3233285B2
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セ ア エス バイオ アンテルナシィオナル
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、測定媒質に起因して生じるある種の測定
擾乱を修正することができるようにされた、ルミネセン
ス分析における放射ルミネセンス測定方法に関する。
現在、各種の免疫分析が生体液中の化合物の定性分析
あるいは定量分析に広く用いられている。現行の技術に
あっては、螢光定量分析が重要になってきている。実際
に、螢光定量分析には、測定を高感度をもって迅速に行
えること、螢光化合物により標識化された試薬が安定し
ていて安全であること、比較的低いコストで行えること
等の多４くの利点がある。
螢光を利用する検出方法は、本質的に極めて高感度で
あり、特に、変調可能なレーザ光源を使用する場合に
は、放射性標識試薬を用いる免疫分析に比して、検出下
限をより小なるものとすることができるものであること
が知られている（I.Wieder:“Immunofluorescence and
related staining techniques",1978,Elsevier）。
斯かる方式の分析においてトレーサとして用いること
ができる多数の螢光分子が既に文献に記載されており、
それらのなかで、希土類錯体が極めて有用な特性を有し
ている。
“トレーサ”とは、ルミネセンスを直接的に放射する
発光分子又はルミネセンス放射を誘起できる発光分子で
あり、このような分子は、分析試薬と結合し、その直接
的な又は誘起されたルミネセンス放射に基づいて、被検
試料についての検出及び／又は測定が行われるようにす
る。
そして、希土類錯体のうちの特定のものとして希土類
クリプテートを用いる分析が、例えば、ヨーロッパ特許
出願:EP 0 321 353,EP 0 180 492及びEP 0 232 348ある
いは国際特許出願:WO 90/04791に記載されている。
希土類クリプテートは、含塩蛋白質媒質中において非
常に安定であるという利点を有しており、斯かる特性
は、均質免疫分析の場合において特に重要である。
このようなもとにあっても、測定感度は以下に挙げら
れる如くの各種の干渉パラメータによって制限されるこ
とになる。
・ 測定媒質の光学的特性、特に、測定媒質中に存在し
て励起され、螢光トレーサの波長に近い波長及び／又は
大なる強度をもってルミネセンス放射を行う分子の寄生
放射に起因する螢光；励起光の損失をまねく光吸収；測
定媒質が透明でない場合における光拡散特性。
・ 測定媒質中に存在する抑制剤による放射螢光の消光
作用（quenching）。
・ 設備の構成、特に、設備に起因する寄生反射。
これらの干渉パラメータは、測定感度及び再現性に相
当な影響を及ぼす。
斯かる問題のいくつかについては、既に、各種の技術
によって解決されている。
特に、螢光測定にあたって時分割法をとることによ
り、寄生放射（暗騒音）を部分的に排除できることにな
る。斯かる方法の原理は、比較的長い放射寿命を有する
トレーサ分子から放射された螢光を、測定媒質中に存在
する他の分子の放射寿命が尽きた後に測定することにあ
る。従って、時分割法がとられる場合には、比較的長い
放射寿命を有する螢光トレーサ分子（例えば、希土類キ
レート，希土類クリプテート等）を使用することが必要
とされる。
しかしながら、上述の如くの方法の如何なるものによ
っても、測定媒質の光学的特性（特に、光吸収性）に起
因する測定感度が制限される問題は十分には解消されて
いない。実際、測定媒体のフィルタ効果を避けるために
提案された技術の場合、容易にかつ低コストをもって実
施できるものではなく、また、測定感度の向上を再現性
良く達成することはできない。また、被検試料を大幅に
希釈する解釈法は、検出感度に悪影響を及ぼす。
さらに、２重励起光束システムが用いられる場合に
は、高価な設備及び標準化に困難が伴う測定容器を使用
することが必要とされるとともに、被検試料についての
螢光測定に先立って測定媒体による螢光の吸収を系統的
に測定することが要され、検出操作あるいは測定操作が
煩雑なものとなってしまう。
一方、ヨーロッパ特許出願:EP 0 355 849には、被検
試料についての螢光測定値の信頼性を検証し、内部基準
に照らして螢光測定値を修正できる方法及びその方法を
実施するための装置が記載されている。斯かる方法の場
合、被検試料についての測定に先立って、２つの参照試
料、即ち、測定媒質のみを含む“ブランク”と特定媒質
及び螢光マーカとについての測定を行うことが必要とさ
れる。
ヨーロッパ特許出願:EP 0 091 126には、被検試料に
ついての螢光測定と並行して、螢光測定値の修正のた
め、被検試料の光透過率及び励起エネルギのゆらぎを測
定する螢光分析システムが記載されている。斯かるシス
テムにあっては、励起光を通過させる特定の測定セルが
必要とされる。何故なら、光透過率の測定は、励起光束
の光路内で行わなければならないからである。
さらに別のシステムにあっては、例えば、ヨーロッパ
特許出願:EP:0 174 722及びEP 0 241 268に記載されて
いる如くの、励起光束分割システムが用いられる。
斯かるもとで、この発明に係るルミネセンス分析にお
ける放射ルミネセンス測定方法は、同一波長の励起光を
受けて同時に励起されるとき、直接的にあるいは誘導放
出によって、異なる波長λ１及びλ２のルミネセンスを
夫々放射する参照発光化合物と発光トレーサ化合物とを
使用し、参照発光化合物から放射された波長λ１のルミ
ネセンスについての測定によって得られる測定値によっ
て、発光トレーサ化合物から放射された波長λ２のルミ
ネセンスについての測定によって得られる測定値を修正
することを特徴とするものとされる。
“参照発光化合物”とは、直接的もしくは誘導放出に
よってルミネセンスを放射する発光分子であり、直接的
もしくは間接的なルミネセンス放射が、分析試薬系によ
って擾乱を受けることがないものとされる。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法において使
用できる参照発光化合物は、本来の放射波長をもって、
あるいは、例えば、分析試薬系に起因するスペクトルシ
フトが生じた場合の如くに、別の波長をもって直接的に
ルミネセンスを放射できるものとされる。さらに、この
発明に係る放射ルミネセンス測定方法において使用でき
る参照発光化合物は、場合によっては、特に、エネルギ
伝達による均質分析法の場合における如くに、誘導放出
によって間接的にルミネセンスを放射できるものとされ
る。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法において
は、波長λ１の放射ルミネセンスと波長λ２の放射ルミ
ネセンスとが同時に検出されることにより、その利点が
一層生かされる。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法によれば、
一つの励起光束を使用するもとで、測定媒質の光学的特
性に起因する測定擾乱が排除され、それにより、複雑な
設備を必要とすることなく、ルミネセンス分析における
放射ルミネセンスの測定を容易かつ簡単に行うことがで
きる。
参照発光化合物と発光トレーサ化合物とについての放
射波長λ１及びλ２は、測定媒質による吸収に起因する
放射ルミネセンスの擾乱が、参照発光化合物からの放射
ルミネセンスと発光トレーサ化合物からの放射ルミネセ
ンスとの両者に同じ様に生ずるようにすべく、相互に近
接したもの（例えば、差が100nm）であることが好まし
い。
さらに、この発明に係る放射ルミネセンス測定方法に
あって有利なことは、被検試料を特殊な測定槽内に配す
る必要がないことである。
そして、この発明に係る放射ルミネセンス測定方法に
あっては、参照発光化合物からの波長λ１の放射ルミネ
センス（信号）についての測定により得られた測定値に
基づいて、波長λ２の放射ルミネセンス（信号）につい
ての測定により得られた測定値が修正される。斯かる修
正は、例えば、波長λ２の信号についての測定により得
られた測定値を波長λ１の信号についての測定により得
られる測定値によって除することによって行われる。ま
た、別の修正手法、例えば、この発明に係る放射ルミネ
センス測定方法の実施に用いられる設備に組み込まれ、
参照発光化合物からの波長λ１の信号を測定するチャン
ネルにおける測定レベルを設定する方法もとられ得る。
斯かる際には、設定された測定レベルに達した場合、波
長λ２の信号を測定するチャンネルにおける測定が停止
され、それにより、波長λ２の信号を測定するチャンネ
ルにおいて得られた測定値は、直ちに修正される。
さらに、当業者にとって周知の修正方法がとられても
よい。
この発明における好ましい態様に従えば、同一波長の
励起光を受ける際、直接的あるいは誘導放出によって相
互に異なる波長λ１及びλ２の信号を夫々放射する参照
螢光化合物と螢光トレーサ化合物とを使用し、参照螢光
化合物から放射される螢光に媒質の光学的特性を反映さ
せ、螢光トレーサ化合物から発せられた信号についての
測定により得られる測定値を、参照螢光化合物から発せ
られた信号についての測定により得られる測定値によっ
て修正するようにされる。
このようにされることにより、血清媒質中における均
質分析の場合、通常にあっては、有効な測定感度が得ら
れる被検試料の濃度がmicromol/のオーダーに制限さ
れるが、この発明に係る放射ルミネセンス測定方法によ
れば、有効な測定感度が得られる被検試料の濃度がpico
mol/のオーダーにまで拡大される。
また、この発明における好ましい態様に従えば、参照
発光化合物と発光トレーサ化合物とは同一の化合物とさ
れる。
この発明の斯かる態様に基づく第１の実施例は、被検
試料を含む可能性のある媒質中における被検試料の量を
あらわすルミネセンスについての測定を、発光トレーサ
化合物からの放射ルミネセンスの波長とは異なる波長の
ルミネセンスについての測定をもって行うものとされる
均質方法の実施に際して用いられるのが好ましい。
このような例は、例えば、被検試料をあらわす信号が
発光ドナー化合物と発光アクセプタ化合物との間のエネ
ルギ伝達に起因する場合にとられる。この場合、発光ア
クセプタ化合物は、波長λ２の信号の放射を行い、一
方、参照発光化合物としての役割を果たす発光ドナー化
合物が、波長λ１の信号の放射を行う。さらに、斯かる
例は、発光トレーサ化合物が、分析試薬系と結合するか
否かに応じて相互に異なる波長λ１及びλ２の夫々を有
した信号の放射を行う場合にとられる。
“均質方法”とは、測定前に分析成分を分離する必要
のない分析方法である。
驚くべきことには、波長λ１をもって参照発光化合物
から発せられる信号の強度は実質的に一定であることが
判った。従って、参照発光化合物から発せられた信号の
変化は、被検試料を含まない状態の測定媒質の光学的特
性にのみ依存することになる。
エネルギ伝達に起因するルミネセンス放射の場合、被
検試料の量及び測定媒質の光学的特性を反映する信号
は、波長λ２を有するものの検出によって得られ、波長
λ１を有するものについての測定値に基づいて修正され
る。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法における上
述の第１の実施例は、好ましくは、被検試料を含む可能
性のある媒質中における被検試料の検出及び／又は測定
をルミネセンスを利用して行う均質方法が、以下の１）
〜５）の各ステップを含むものとされる過剰方法の助け
を得たもとで実施されるに際して用いられる。
１）被検試料を含む媒質中に、少なくとも１つの被検試
料に対するレセプタから成り、発光ドナー化合物と結合
した第１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、１つ又は複数の被検試料に対する他のレセ
プタから成り、発光アクセプタ化合物と結合した第２の
試薬を添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、発光ドナー化合物に
ついての励起波長に相当する波長を有した光によって励
起するステップ； ５）発光ドナー化合物から発せられた波長λ１を有する
信号を測定し、それにより得られる測定値を参照値とし
て使用するもとで、エネルギ伝達により生じた波長λ２
を有する信号を測定するステップ。
また、この発明に係る放射ルミネセンス測定方法にお
ける上述の第１の実施例は、好ましくは、被検試料を含
む可能性のある媒質中における被検試料の検出及び／又
は測定をルミネセンスを利用して行う均質方法が、以下
の１）〜５）の各ステップを含むものとされる競合方法
の助けを得たもとで実施されるに際して用いられる。
１）被検試料を含む媒質中に、被検試料に対するレセプ
タから成り、発光ドナー化合物と結合した第１の試薬を
添加するステップ； ２）媒質に、発光アクセプタ化合物と結合した第２の試
薬を添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、発光ドナー化合物に
ついての励起波長に相当する波長を有した光によって励
起するステップ； ５）発光ドナー化合物から発せられた波長λ１を有する
信号を測定し、それにより得られる測定値を参照値とし
て使用するもとで、エネルギ伝達により生じた波長λ２
を有する信号を測定するステップ。
さらに、この発明に係る放射ルミネセンス測定方法に
おける上述の第１の実施例は、好ましくは、被検試料を
含む可能性のある媒質中における被検試料の検出及び／
又は測定をルミネセンスを利用して行う均質方法が、以
下の１）〜５）の各ステップを含むものとされる競合方
法の助けを得たもとで実施されるに際して用いられる。
１）被検試料を含む媒質中に、被検試料に対するレセプ
タから成り、発光アクセプタ化合物と結合した第１の試
薬を添加するステップ； ２）媒質に、発光ドナー化合物と結合した第２の試薬を
添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、発光ドナー化合物に
ついての励起波長に相当する波長を有した光によって励
起するステップ； ５）発光ドナー化合物から発せられた波長λ１を有する
信号を測定し、それにより得られる測定値を参照値とし
て使用するもとで、エネルギ伝達により生じた波長λ２
を有する信号を測定するステップ。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法の他の好ま
しい利用態様にあっては、被検試料に対する少なくとも
１つのレセプタは、固形担体に固定される。
この発明における他の好ましい態様に従えば、参照発
光化合物と発光トレーサ化合物とは、同一波長の光によ
り励起できる別個の化合物とされ、参照発光化合物は、
被検試料の量の測定に用いられるルミネセンスの波長と
は異なる波長のルミネセンスを放射するものとされる。
この発明の斯かる態様に基づく第２の実施例は、被検
試料を含む可能性のある媒質中における被検試料の検出
及び／又は測定を、均質方法により行うにあたって用い
られるのが特に好ましい。その場合、発光トレーサ化合
物と結合された試薬と、発光トレーサ化合物からの信号
を変調できる重い原子又は重い原子を含む物質と結合さ
れた試薬とが使用される。斯かる類の分析方法は、ヨー
ロッパ特許出願:EP 0 232 348に記載されている。
このような方法の場合、被検試料に対するレセプタと
結合した波長λ２のルミネセンスを放射する発光トレー
サ化合物以外に、波長λ１のルミネセンスを放射し、重
い原子の作用による変調がなされず、測定媒質の光学的
特性を反映する信号を発生し、参照発光化合物としての
役割を果たす別の遊離発光化合物が用いられる。これら
発光トレーサ化合物と遊離発光化合物とは、同一波長の
光によって励起される。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法における上
述の第２の実施例は、好ましくは、被検試料を含む可能
性のある媒質中における被検試料の検出及び／又は測定
を、以下の１）〜５）の各ステップを含むものとされる
均質方法により行うにあたって用いられる。
１）被検試料を含む媒質中に、被検試料に対するレセプ
タから成る第１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、被検試料及び少なくとも１つの被検試料に
対するレセプタのうちから選択した第２の試薬を添加
し、第１及び第２の試薬のうちの一方を発光トレーサ化
合物と結合させるとともに、他方には重い原子または重
い原子を含む物質と参照発光化合物とを添加するステッ
プ； ３）第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を励起するステップ； ５）発光トレーサ化合物から発せられた波長をλ２とす
る信号を重い原子の作用によって変調し、斯かるもと
で、参照発光化合物から発せられる波長λ１を有する信
号を測定するステップ。
このような、参照発光化合物と発光トレーサ化合物と
が別個の化合物とされる第２の実施例にあっても、さら
に、第１の実施例の場合と同様に、被検試料を含む可能
性のある媒質中における被検試料の検出及び／又は測定
をルミネセンスを利用して行う均質方法が、以下の１）
〜５）の各ステップを含むものとされる過剰方法の助け
を得たもとで実施されるに際して用いられるのが好まし
い。但し、第２の実施例の場合には、試薬添加段階の１
つにおいて、参照発光化合物としての役割を果たす化合
物が添加される。
このようにして、参照発光化合物から発せられる波長
λ１を有する信号が測定されるとともに、エネルギ伝達
により生じる波長λ２を有する信号が測定される。そし
て、波長λ２を有する信号の測定値が、波長λ１を有す
る信号の測定値に基づいて修正される。
本願においては、以下の如くに幾つかの言葉の定義が
なされている。
・“被検試料”は、検出及び／又は測定の対象とされる
物質あるいは類似する物質群を意味する。
・“レセプタ”は、被検試料の一部に結合することがで
きる物質を意味する。
・“重い原子”は、螢光分子の近傍にあって螢光分子の
スピン軌道結合の増加を誘起できる原子番号の大きい原
子である。適切な重い原子の例としては、ハロゲン原
子，水銀，タリウム，鉛，銀が挙げられる。
・“少なくとも１つの重い原子を含む物質”は、少なく
とも１つの重い原子を含む化学物質又は少なくとも１つ
の重い原子と結合できる化学物質を意味する。
この発明における好ましい態様に従えば、測定媒質
は、血清媒質の如くの生物学的媒質とされる。
参照発光化合物及び／又は発光トレーサ化合物とし
て、螢光化合物が用いられるのが望ましい。螢光化合物
としては、例えば、テルビウム、ユーロピウム、ジスプ
ロシウム、サマリウム又はネオジムのキレートあるいは
クリプテートが使用されるのが望ましく、特に、テルビ
ウム又はユーロピウムが選択されることが好ましい。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法が用いられ
る被検試料の検出及び／又は測定を行う方法にあって
は、ヨーロッパ特許出願:EP 0 180 492及びEP 0 321 35
3に記載されている希土類クリプテートが選択されるの
が望ましい。
ヨーロッパ特許出願:EP 0 180 492に記載されている
如くのテルビウム・クリプテート、即ち、Tb−トリスビ
ピリジン、又は、ユーロピウム・クリプテート、即ち、
Eu−トリスビピリジン、あるいは、ヨーロッパ特許出
願:EP 0 321 353に記載されているEu−トリスビピリジ
ンジアミン及びTb−トリスビピリジンジアミンが使用さ
れるのが好ましい。
また、この発明における好ましい態様に従えば、螢光
ドナー化合物が、ユーロピウム・クリプテートであり、
螢光アクセプタ化合物が、アロフィコシアニン、アロフ
ィコシアニンＢ、Ｃフィコシアニン及びＲフィコシアニ
ンのうちから選択されることが望まれる。
参照発光化合物あるいは発光レーサ化合物として、燐
光化合物（例えば、エリシン又はエリスロシン）が使用
可能である。その場合、ヨーロッパ特許出願:EP 0 71 9
91及びEP 0 314 406に記載されている如くのクロロフィ
ル，ヨーロッパ特許出願:EP 0 071 991に記載されてい
る如くのポルフォリン、及び、国際特許出願:WO 88 047
77に記載されている如くのフタロシアニンのうちから選
択された螢光アクセプタ化合物が使用されるのが望まし
い。
燐光ドナー化合物が使用される液状媒質中で分析が行
われる場合、読取りは、固形担体をもって、もしくは、
測定媒質に酸素捕獲分子が添加されることによって行な
われる。斯かる技術は、当業者に周知である。
クロロフィル及びフタロシアニンは、発光ドナー化合
物としてユーロピウム・クリプテートが使用される場
合、螢光アクセプタ化合物として使用される。
さらに、この発明における好ましい態様に従えば、参
照発光化合物及び発光トレーサ化合物は、１μ秒間より
長い寿命を有することが望まれる。
参照発光化合物及び発光トレーサ化合物を励起できる
光源としては、変調可能な光源が使用されることが望ま
れる。斯かる変調可能な光源については、例えば、ラコ
ウィツ（Lakowicz）による論文：“Principles of fluo
rescent spectroscopy",1983,p96〜100に記載されてい
る。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法は、特に、
螢光免疫分析、取り分け、競合分析法及び過剰分析法
（Landon:Clin.Biochem.1981,18,253及びSoini他:Clin,
Chem.1979,25,353）に適用されるのが望ましく、特に、
血清媒質中での免疫分析に用いられるに好適である。
この発明に係る放射ルミネセンス測定方法の実施に用
いられる装置は、励起光源と、励起によって放射された
光束に対する集束手段と、２つの異なる波長のルミネセ
ンスを測定する手段とを備えたものとされることを特徴
とする。さらに、斯かる装置は、励起によって放射され
た光束を分割する手段を有したものとされることが望ま
しい。
このような装置の一例が、第１図に示されている。
第１図に示される装置にあっては、励起光源１が備え
られており、また、励起に適した波長の光を選択的に通
過させるフィルタ３に向けて励起光束を平行光束化させ
るレンズ２が備えられている。励起光束の光軸に対して
45度の角度をもって設置されたダイクロイック・フィル
タ４は、紫外光を反射して可視光を透過させ、また、励
起光束を反射して、被検試料が配されたマイクロプレー
ト６に励起光束を集束させるレンズ５に入射させる。レ
ンズ７は、レンズ５と協働して、レンズ５及びダイクロ
イック・フィルタ４を通過した、マイクロプレート６に
配された被検試料からの放射ルミネセンスを集光させ
て、放射光束を分割するダイクロイック・フィルタ８に
入射させる。フィルタ９及び10は、参照発光化合物及び
発光トレーサ化合物から夫々発せられた信号を、光電子
増倍管11及び12に選択入射させる。
この発明は、以下に述べられる、発明を限定するもの
ではない実施例が参照されることにより、一層明瞭に理
解される。
第１の実施例 プロラクチンの均質免疫分析において添加されるテルビ
ウム・クリプテート（トリスビピリジンジアミン（T
b3+））の検出による波長665nmの螢光についての測定値
の修正 この実施例は、抗原標準の検知及びプロラクチン濃度
が未知の５つの血清試料の分析において実施された。
方法： この分析においては、螢光ドナー化合物としてユーロ
ピウム・クリプテート（トリスビピリジンアミン（E
u3+））（トレーサ）が使用され、参照発光化合物とし
てテルビウム・クリプテート（トリスビピリジンジアミ
ン（Tb3+））が使用された。これらの化合物は、ヨーロ
ッパ特許出願:EP 0 321 353（第３及び第４の実施例）
に記載されている如くにして調製された。
螢光アクセプタ化合物としては、アロフィコシアニン
（シアノテック、米国）が使用された。
プロラクチンの２つのエピトープを識別する抗プロラ
クチン・モノクローナル抗体E1及び3D3（セ・ア・エス
・バイオ アンテルナシオン、フランス）が使用され
た。ユーロピウム・クリプテート（トリスビピリジンジ
アミン（Eu3+））又はアロフィコシアニンによって標識
化された抗体の調製について以下に述べられる。
なお、下記においては、次の如くの省略表記が用いら
れる。
APC ＝アロフィコシアニン（allophycocyanine） DTT ＝ジチオトレイトール（dithiothreitol） EuTBP＝ユーロピウム・クリプテート：トリスビピリ
ジンジアミン（cryptate d'eeuropium trisbipyridine
diamine（EU3+）） HSA ＝人間血清アルブミン（serum albumine humain
e） IgG ＝免疫グロブリンＧ（immunoglobuline G） SPDP ＝Ｎ−スクシンイミジル ３（２−ピリジルジ
チオ）プロピオナート（Ｎ−succinimidyl 3（２−pyri
dyldithio）propionate） sulfo−SMCC＝スルフォスクシンイミジル ４（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラ
ート（sulfosuccinimidyl 4（Ｎ−maleimidomethyl）cy
clohexane 1−carboxylate） １）IgG E1−APCの調製 ａ）sulfo−SMCCによるAPCの賦活 60％硫酸アンモニウム溶液中の沈殿物の形で市販され
ているAPC（3mg）を遠心分離した。上澄液のの除去後、
残渣を250μの100mM燐酸塩緩衝液（pH7.0）で回収
し、次いで、場合によっては存在する懸濁粒子の除去の
ため0.8μｍのフィルタで濾過した。
上述の緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂
（ファーマシア、スウエーデン）を使用し、排除クロマ
トグラフィーによって濾液を精製した。排除溶液中に溶
離されたAPCの濃度が、波長を650nmとする光に対するモ
ル吸光係数が731,000M-1・cm-1（ε650nm＝731,000M-1
・cm-1）となるように設定された。
APCの賦活は、100mM 燐酸塩緩衝液（pH7.0）中にお
ける6.9mMの比率をもって調製したsulfo−SMCC溶液を添
加し、穏やかに攪拌しながら室温において１時間反応さ
せることによって実施した（sulfo−SMCC/APC モル比:
15〜75）。次いで、100mM 燐酸塩及び5mM EDTAから成
る緩衝液（pH6.5）中に置かれたG25微細イオン交換樹脂
によって、APC−マレイミドを精製し、IgG 3D3に結合
する前に４℃に保持した。
ｂ）SPDPによるIgG E1の賦活 同時に、100mM 燐酸塩緩衝液中における10mg/mlの比
率のIgG E1の5mgを、ジオキサン中における6.4mMの比
率のSPDP（ピアース、米国）の溶液をSPDP/IgG E1モル
比をもって添加することにより賦活した。室温において
35分間賦活した後、100mM燐酸塩及び5mM EDTAから成る
緩衝液（pH6.5）中に置かれたG25微細イオン交換樹脂に
よって、IgG−２−ピリジンを精製した。
蛋白質を濃縮し、最終濃度が19mMとなるDTT（シグ
マ、米国）の溶液によって、２−ピリジルジサアルフア
イド基を還元した。100mM 燐酸塩及び5mM EDTAから成
る緩衝液（pH6.5）中に置かれたG25微細イオン交換樹脂
によって、DTT及びピリジン−２−チオンを除去した。
波長を280nmとする光に対するモル吸光係数が210,000M
-1・cm-1（ε280nm＝210,000M-1・cm-1）となるよう
に、IgG−SHの濃度が設定された。
ｃ）IgG E1−SHとAPC−マレイミドとの共役化 IgG E1−SH1mgあたり2.51mgの活性APCを添加して、
マレイミドにチオール基を結合させた。暗所において穏
やかに攪拌しながら４℃で18時間インキュベートした
後、最終濃度が20mMとされる100mM Ｎ−メチルマレイ
ミド溶液（シグマ、米国）を添加し、室温において１時
間に亙って遊離している残存チオール基を結合させた。
100mM 燐酸塩緩衝液（pH7.0）中に置かれたTSK G300
0SWイオン交換樹脂（ベックマン、米国）によりゲル濾
過することによって、反応媒質を精製した。
精製され第１ピークで溶離された共役系のAPC濃度及
びIgG E1濃度を、波長を280nm及び650nmとするルミネ
センスの吸収に基づき、下式に従って求めた。
［APC］M/＝A650nm/710,000 ［IgG］M/＝（A280nm−Ａ′280nm）/210,000 式中、Ａ′280nmは、波長280nmにおけるAPC−マレイ
ミドの寄与をあらわす。
共役系に1g/の割合で人間血清アルブミン（HSA）を
添加し、次いで、分割して−20℃において凍結させた。
２）共役系IgG 3D3−Eu TBPの調製 IgG E1について上述されたプロトコルに基づき、IgG
3D3−SHを調製した。但し、この場合、SPD P/IgG3D3モ
ル比を7.5とした。
20mM 燐酸塩及びジメチルホルムアミド10容量％から
成る緩衝液（pH7.0）中で、Eu TBP 5mg（５・10-6Mo
l）に20mM sulfo−SMCCをモル比2.5をもって添加した。
室温において45分間賦活した後、場合によっては生成
する沈殿物の除去のため、反応媒質を0.8μｍのフィル
タによって濾過した。20mM 燐酸塩及びジメチルホルア
ミド10容量％から成る緩衝液（pH7.0）中に置かれたMom
o Qイオン交換樹脂（ファーマシア、スウエーデン）を
使用し、NaClによるショックのもとで、望ましくない反
応生成物（sulfo−SMCC、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ド、（Ｎ−マレイミドメチル）カルボン酸）を除去し
た。
比:A307nm/A280nmから、波長を307nmとする光に対す
るモル吸光係数が25,000M-1・cm-1（ε307nm＝25,000M
-1・cm-1）となるように、Eu TBPマレイミドの濃度が
設定された。
同様に、Eu TBPマレイミドとIgG 3D3−SHとのモル
比が10〜40となるもとで、抗体に固定されたチオール基
とマレイミド基とを反応させた。
その後、４℃のもとにおいて18時間インキュベート
し、Ｎ−メチルマレイミドによって（場合によっては残
存する遊離の）チオール基をブロックした後、４℃のも
とにおいて100mM 燐酸酸塩緩衝液（pH7.0）中で、未結
合のEu TBPを透析によって完全に除去した（透析浴中
の螢光の増加）。
このようにして得られる共役溶液の特性は、波長を30
7nm及び280nmとする光に対する吸収度合によって設定さ
れ、実験的に求められた比:A307nm/A280nmによって定め
られるグリプテートの光吸収が考慮されて、下記の如く
の値によって表される。
Eu TBP−マレイミドのモル吸収係数： ε307nm＝25,000M-1・cm-1 IgG 3D3−SHのモル吸収係数： ε280nm＝210,000M-1・cm-1 ε307nm＝0M-1・cm-1 ３）12ピットのバー（マイクロチップ ラボシステム、
フィンランド）に下記のものを順次供給した。
・ 標準試料（ELSA−PRLキットの標準プロラクチン
（セ・ア・エス・バイオ アンテルナシオン、フラン
ス），新生子牛の血清）又は被検試料（人間血清）100
μ、 ・ 100mM燐酸塩と150mM NaFとBSA（牛の血清アルブミ
ン）1g/とから成る緩衝液（pH7.0）中で抗体濃度0.5g
/mlの、ユーロピウム・クリプテート（トリスビピリジ
ンジアミン（Eu3+））で標識化した抗プロラクチンモノ
クロナール抗体3D3 100μ、 ・ 100mM 燐酸塩と150mM NaFとBSA 1g/とから成
る緩衝液（pH7.0）中で抗体濃度７μg/mlの、アロフイ
コシアニンで標準化した抗プロラクチンモノクロナール
抗体E150μ、 ・ 100mM 燐酸塩と150mM NaFとBSA 1g/とから成
る緩衝液（pH7.0）中で濃度10-7Mのテルビウム・クリプ
テート（トリスビピリジンジアミン（Tb3+））50μ。
そして、37℃のもとにおいて１時間インキュベートし
た後、２つのプロトコルに基づき、各ピットの傾向を測
定した。
第１プロトコルの場合、測定遅延時間50μ秒及び積算
時間400μ秒として、波長665nmの螢光を間欠的に測定し
た。測定時間は１秒間である。励起は、周波数1,000Hz
をもって点滅フラッシュランプによって行なった。励起
波長は、干渉フィルタによって、トリスビピリジンジア
ミン（Eu3+）及びトリスビピリジンジアミン（Tb3+）に
よる吸収ピークとなる307nmに設定された。エネルギ伝
達に起因する大なる螢光強度は、インキュベート媒質中
のプロラクチン抗原の濃度に比例するものとなる。
測定は、参照発光化合物及び螢光アクセプタ化合物夫
々のルミネセンス放射に適合した干渉フィルタを使用
し、ARCUS螢光光度計（エル・カー・ベー、スウエーデ
ン）によって行った。
さらに、後述される第２の実施例についての説明中に
記載されているプロトタイプ螢光光度計を使用して１つ
の工程で測定に行うことにもできる。その場合、測定の
ために、96ピットのマイクロプレート（ダイナテック、
米国）が使用された。
そして、標準曲線FLUO665nm＝ｆ（［プロラクチ
ン］）がトレースされ、５つの被検試料の濃度が測定さ
れて得られた結果が第Ｉ表に示される。
表Ｉ表 標準ELSA−PRL ［プロラクチン］μUI/ml STD0 0 STD1 165 STD2 300 STD3 920 STD4 3100 STD5 6500 被検血清 ［プロラクチン］（FLUO665）μUI/ml Ech1 141 Ech2 951 Ech3 113 Ech4 287 Ech5 699 第２プロトコルの場合、第１プロトコルの場合と同様
に、波長665nmの螢光を測定した。しかしながら、各ピ
ットにおける第２の測定は、同一の読取時間パラメータ
（遅延時間，積算時間及び測定時間）のもとで、第２の
励起後に波長545nmを有する螢光について行った。この
ようにして、波長545nmの螢光についての間欠的な測定
により得られる測定値は、参照被検媒質の光学的特性を
反映するトリスビピリジンジアミン（（Tb3+）により放
射されたルミネセンスに応じたものとなる。
標準曲線FLUO665nm/FLUO545nm＝ｆ（［プロラクチ
ン］）がトレースされ、５つの被検試料が測定されて得
られた結果が第II表に示される。
表II表 標準ELSA−PRL ［プロラクチン］μUI/ml STD0 0 STD1 165 STD2 300 STD3 920 STD4 3100 STD5 6500 被検血清 [プロラクチン](FLUO665/FLUO545)μUI/ml Ech1 580 Ech2 428 Ech3 417 Ech4 71 Ech5 2044 さらに、基準時点において、螢光免疫分析キットELSA
−PRLが用いられて５つの被検試料が分析され、得られ
た結果が第III表に示される。
第III表 ［プロラクチン］μUI/ml ELSA−PRL FLUO665 FLUO665/FLUO545 Ech1 612 141 580 Ech2 395 951 428 Ech3 425 113 417 Ech4 59 287 71 Ech5 1870 699 2044 上述の結果から明らかな如く、螢光強度（FLUO665/FL
UO545）についての測定値の修正を行う方法によるプロ
ラクチン試料の濃度測定値は、無修正の665nmの螢光強
度についての測定値のみから濃度を測定した場合とは異
なり、ルミネセンス免疫分析キットELSA−PRLが用いら
れて得られた結果と一致している。
第２の実施例 プロラクチンの均質免疫螢光分析における抗体−クリ
プテート共役系からの波長620nmの螢光についての測定
値の応じた波長665nmの螢光についての測定値の修正。
螢光についての測定は、下記のプロトタイプ螢光光度
計によって行った。
励起源（波長337nm）として、レーザ装置N2 VSL 337
（エル・エス・アイ、米国）が使用された。発振周期は
3n秒に設定され、周波数10Hzで反復させた。波長337nm
以外の励起を行うことになる寄生光束を完全に除去すべ
く、励起源からの光束はフィルタ（コーニング、米国）
を通過するものとされた。
励起源からの光束は、測定チャンバに入った後、紫外
光を反射して可視光を透過する性質を有し、光束の光軸
に対して45度の角度をもって設置されたダイクロイック
・フィルタによって反射される。ダイクロイック・フィ
ルタで反射された光束は、熔融シリカレンズによって測
定用のマイクロプレートに設けられた測定ピットに集束
される。
マイクロプレートの測定ピットにおける被検試料から
放射された螢光は、立体角20度をもって集光され、上述
のレンズによって平行光束化されてダイクロイック・フ
ィルタを通過する（可視螢光）。被検試料からの螢光
（信号）の波長に基づいて定まる特性を具えた干渉フィ
ルタにより、信号を妨害する光が除去された後、信号強
度が光電子増倍管（ハママツR2949）によって測定され
るものとされる。
使用されたフォトン・カウンタは、SR−400（スタン
フォード リサーチ システム）である。そして、レー
ザ装置は、インタフェースRS 232を介してコンピュー
タ:IBM PC−ATによって制御されるものとされた。光電
子増倍管に起因する脈動は、空白時間（tg）中に記録さ
れ、遅延時間（td）後、光電子増倍管の信号／雑音比を
最適化するため、フォトン・カウンタによって別個に選
択されるレベルよりも高くなるよう定められた。
コンピュータ:IBM PC−ATによって駆動制御されるＸ
−Ｙテーブルが設けられ、斯かるＸ−Ｙテーブルは、チ
ャージ機構、励起光束に対する位置決機構、96ピットを
順次自動的に読取る機構及びステップモータを含んで構
成され、測定用のマイクロプレートを任意に位置決めで
きるものとされた。
I.血清に依存するクリプテート共役系の波長620nmの信
号の変化 96ピットの白色のマイクロプレート（ダイナテック、
米国）に下記のものを供給した。
・ 血清100μ、 ・ 100mM 燐酸塩とHSA1g/と150mM NaFとから成る
緩衝液（pH7.5）中で抗体濃度0.5μg/mlの抗プロラクチ
ン抗体／ユーロピウム・クリプテート共役系200μ、
使用したユーロピウム・クリプテートは、ヨーロッパ特
許出願:EP 0 321 353（第３及び第４の実施例）に記載
されている如くにして調製されたトリスビピリジンジア
ミン（Eu3+）である。
使用した抗プロラクチン抗体は、抗体3D3（セ・ア・
エス・バイオアンテルナシオン、フランス）である。
抗体3D3/ユーロピウム・クリプテート共役系は、第１
の実施例に関連しての記載の如くに調製した。
37℃のもとにおいて１時間インキュベートした後、測
定遅延時間50μ秒及び積算時間400μ秒として、波長620
nmの螢光を間欠的に測定した。測定期間は、１秒間とし
た。
分光測光器Lambda 15（パーキン エルマー、英国）
を用いて、波長310nmの螢光についての測定値からの血
清の黒化濃度を測定した。その結果は第IV表に示され
る。
第IV表 血清 Do（310nm） 信号（620nm） １ 0.66 25693 ２ 3.3 7754 ３ 0.33 33156 ４ 0.90 24959 上記の結果から、測定された信号は、血清の黒化濃度
に対する依存度が大なるもとで変化することが明らかで
ある。
上述の条件のもとでは、微量の分析を行うことは不可
能である。何故なら、結果は、血清中の被検試料の量に
依存するのみならず、血清の黒化濃度にも依存するから
である。
II.アクセプタからの信号の修正 次いで、マイクロプレート中に下記のものを順次供給
して、免疫分析を行った。
・ 血清100μ、 ・ 上述の燐酸塩緩衝液中で抗体濃度0.5μg/mlの抗プ
ロラクチンモノクロナール抗体3D3/トリスビピリジンジ
アミン（Eu3+）共役系100μ、 ・ 上述の燐酸塩緩衝液中で抗体濃度3.5μg/mlの抗プ
ロラクチンモノクロナール抗体E1/アロフイコシアニン
共役系100μ。
この抗プロラクチンモノクロナール抗体E1（セ・ア・
エス・バイオ アンテルナシオン、フランス）／アロフ
ィコシアニン（シアノテック、米国）共役系は、第１の
実施例に関連する記載の如くに調製した。
測定は、波長665nmの螢光について行い、この測定値
は、測定媒質の光学的特性を反映する波長620nmの螢光
についての測定値で除すことによって修正した。
第１の実施例に示した検量線によって求め、場合によ
っては修正した濃度値を、標準として放射免疫分析セッ
トELSA−PRLを使用して得られた数値と比較した。その
結果は第Ｖ表に示される。
第Ｖ表には、夫々、ELSA−PRLによる分析結果よって
求めたプロラクチンの濃度値（ELSA），波長665nmの螢
光についての測定値の未修正値によって求めたプロラク
チンの濃度値（FIA665）、及び、波長665nmの螢光につ
いての測定値の修正値（FIS665/620）によって求めたプ
ロラクチンの濃度値の夫々が単位μU/mlをもって示さ
れ、さらに、波長620nmの螢光についての測定値（FLUO
620）とが示されている。
第Ｖ表 試料No. ELSA FIA665/620 FIA665 FLUO620 １ 358 394 195 42148 ２ 530 592 91 28272 ３ 65 92 18 40495 ４ 153 178 94 43363 ５ 251 289 86.7 38007 ６ 161 146 86.4 44531 ７ 179 189 77 40873 ８ 285 297 161 41403 ９ 310 330 106 35214 10 2744 3427 1470 31670 11 196 153 15 36551 12 244 198 55 38134 13 447 477 300 40340 14 251 234 350 58615 上記の結果から、測定された信号は、被検血清試料に
依存して変化することが明らかである。
事実、抗体／クリプテート共役系は、被検試料に比し
て過剰に依存するので、波長620nmの螢光についての信
号測定値（錯体に結合されていない共役系に対応）は略
一定となる。
さらに明らかな如く、波長665nmの螢光についての信
号測定値（FIA665）から求めたプロラクチン濃度値は、
標準分析によって得られた数値に対応せず、一方、修正
測定値から得られた数値は標準分析値に略一致する。
これらの関係は、第２図および第３図において曲線に
よって示されている。第２図及び第３図の夫々の横軸に
は、ELSA−PRLキットが用いられて求めたプロラクチン
濃度［PRL］μUI/ml ELSAがとられ、また、第２図の縦
軸には、修正測定値FIA665/620から求められた濃度［PR
L］μUI/ml（665nm/620nm）がとられ、また、第３図の
縦軸には、未修正測定値FIA665/620から求められた濃度
［PRL］μUI/ml（665nm）がとられている。
フロントページの続き (72)発明者 ジォル エティエンヌ ジャン−ピエー ル フランス 30200 バニュール−シー− セーズ アレ ドュ ロマラン ２ (72)発明者 プヤ ドミニク フランス 30150 ロキュモール リュ ジェラール フィリップ (72)発明者 デュモン クリストーフェ フランス 60150 トロッテ ルール クゥイジィ (56)参考文献 特開 昭62−240864（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／7757（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 21/76 G01N 21/64 G01N 33/542

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】同一波長の励起光を受けて同時に励起さ
    れ、直接的あるいは誘導放出によって、相互に異なる波
    長λ１及びλ２のルミネセンスを夫々放射する参照発光
    化合物と発光トレーサ化合物とを使用し、上記参照発光
    化合物から放射された波長λ１のルミネセンスについて
    の測定によって得られる測定値によって、上記発光トレ
    ーサ化合物から放射された波長λ２のルミネセンスにつ
    いての測定によって得られる測定値を修正することを特
    徴とするルミネセンス分析における放射ルミネセンス測
    定方法。
  2. 【請求項２】参照発光化合物と発光トレーサ化合物と
    が、同一化合物とされることを特徴とする請求の範囲第
    １項記載の方法。
  3. 【請求項３】参照発光化合物と発光トレーサ化合物と
    が、相互に異なる化合物とされることを特徴とする請求
    の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】参照発光化合物と発光トレーサ化合物と
    が、螢光化合物であることを特徴とする請求の範囲第1,
    2又は３項記載の方法。
  5. 【請求項５】参照発光化合物と発光トレーサ化合物と
    が、希土類金属キレート又はクリプテートであることを
    特徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方
    法。
  6. 【請求項６】参照発光化合物と発光トレーサ化合物と
    が、１秒間より長い寿命を有することを特徴とする請求
    の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】参照発光化合物から放射された波長λ１の
    ルミネセンスと発光トレーサ化合物から放射された波長
    λ２のルミネセンスとを同時に測定することを特徴とす
    る請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】被検試料を含む可能性のある媒質中におけ
    る被検試料の検出及び／又は測定をルミネセンスを利用
    して行う均質方法の実施に際して用いられ、同一波長の
    励起光を受けて同時に励起され、直接的あるいは誘導放
    出によって、相互に異なる波長λ１及びλ２のルミネセ
    ンスを夫々放射する参照発光化合物と発光トレーサ化合
    物とを使用し、上記参照発光化合物から放射された波長
    λ１のルミネセンスについての測定によって得られる測
    定値によって、上記発光トレーサ化合物から放射された
    波長λ２のルミネセンスついての測定によって得られる
    測定値を修正することを特徴とするルミネセンス分析に
    おける放射ルミネセンス測定方法。
  9. 【請求項９】被検試料を含む可能性のある媒質中におけ
    る被検試料の検出及び／又は測定をルミネセンスを利用
    して行う均質方法が、 １）被検試料を含む媒質中に、少なくとも１つの被検試
    料に対するレセプタから成り、発光ドナー化合物と結合
    した第１の試薬を添加するステップ、 ２）上記媒質に、１つ又は複数の上記被検試料に対する
    他のレセプタから成り、発光アクセプタ化合物と結合し
    た第２の試薬を添加するステップ、 ３）上記第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された
    後、得られた媒質をインキュベートするステップ、 ４）インキュベートされた媒質を、上記発光ドナー化合
    物についての励起波長に相当する波長を有した光によっ
    て励起するステップ、及び、 ５）上記発光ドナー化合物から発せられた波長λ１を有
    する信号を測定し、それにより得られる測定値を参照値
    として使用するもとで、エネルギ伝達により生じた波長
    λ２を有する信号を測定するステップ、 を含むものとされる過剰方法の助けを得たもとで実施さ
    れるものとされることを特徴とする請求の範囲第８項記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】被検試料を含む可能性のある媒質中にお
    ける被検試料の検出及び／又は測定をルミネセンスを利
    用して行う均質方法が、 １）被検試料を含む媒質中に、被検試料に対するレセプ
    タから成り、発光ドナー化合物と結合した第１の試薬を
    添加するステップ、 ２）上記媒質に、発光アクセプタ化合物と結合した第２
    の試薬を添加するステップ、 ３）上記第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された
    後、得られた媒質をインキュベートするステップ、 ４）インキュベートされた媒質を、上記発光ドナー化合
    物についての励起波長に相当する波長を有した光によっ
    て励起するステップ、及び、 ５）上記発光ドナー化合物から発せられた波長λ１を有
    する信号を測定し、それにより得られる測定値を参照値
    として使用するもとで、エネルギ伝達により生じた波長
    λ２を有する信号を測定するステップ、 を含むものとされる競合方法の助けを得たもとで実施さ
    れるものとされることを特徴とする請求の範囲第８項記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】被検試料を含む可能性のある媒質中にお
    ける被検試料の検出及び／又は測定をルミネセンスを利
    用して行う均質方法が、 １）被検試料を含む媒質中に、被検試料に対するレセプ
    タから成り、発光アクセプタ化合物と結合した第１の試
    薬を添加するステップ、 ２）上記媒質に、発光ドナー化合物と結合した第２の試
    薬を添加するステップ、 ３）上記第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された
    後、得られた媒質をインキュベートするステップ、 ４）インキュベートされた媒質を、上記発光ドナー化合
    物についての励起波長に相当する波長を有した光によっ
    て励起するステップ、及び、 ５）上記発光ドナー化合物から発せられた波長λ１を有
    する信号を測定し、それにより得られる測定値を参照値
    として使用するもとで、エネルギ伝達により生じた波長
    λ２を有する信号を測定するステップ、 を含むものとされる競合方法の助けを得たもとで実施さ
    れるものとされることを特徴とする請求の範囲第８項記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】被検試料を含む可能性のある媒質中にお
    ける被検試料の検出及び／又は測定をルミネセンスを利
    用して行う均質方法が、 １）被検試料を含む媒質中に、被検試料に対するレセプ
    タから成る第１の試薬を添加するステップ、 ２）上記媒質に、上記被検試料及び少なくとも１つの上
    記被検試料に対するレセプタのうちから選択した第２の
    試薬を添加し、上記第１及び第２の試薬のうちの一方
    を、発光トレーサ化合物と結合させるとともに、他方に
    は、蛍光分子の近傍にあって蛍光分子のスピン軌道結合
    の増加を誘起できる原子番号の大きい原子である重い原
    子、または、該重い原子を含む物質と参照発光化合物と
    を添加するステップ、 ３）上記第１及び第２の試薬の各々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された
    後、得られた媒質をインキュベートするステップ、 ４）インキュベートされた媒質を励起するステップ、及
    び、 ５）上記発光トレーサ化合物から発せられた波長をλ２
    とする信号を上記重い原子の作用によって変調し、斯か
    るもとで、上記参照発光化合物から発せられる波長λ１
    を有する信号を測定するステップ、 を含むものとされる競合方法の助けを得たもとで実施さ
    れるものとされることを特徴とする請求の範囲第８項記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】参照発光化合物から放射された波長λ１
    のルミネセンスと発光トレーサ化合物から放射された波
    長λ２のルミネセンスとを同時に測定することを特徴と
    する請求の範囲第９〜12項のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】少なくとも１つの被検試料に対するレセ
    プタを固形担体に固定することを特徴とする請求の範囲
    第９〜11項のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】励起光源と、該励起光源から放射された
    光束を集束する手段と、２つの相互に異なる波長のルミ
    ネセンスの夫々を同じ試料について測定する手段と、を
    含んで構成され、同一波長の励起光を受けて同時に励起
    され、直接的あるいは誘導放出によって、相互に異なる
    波長λ１及びλ２のルミネセンスを夫々放射する参照発
    光化合物と発光トレーサ化合物とを使用し、上記参照発
    光化合物から放射された波長λ１のルミネセンスについ
    ての測定によって得られる測定値によって、上記発光ト
    レーサ化合物から放射された波長λ２のルミネセンスに
    ついての測定によって得られる測定値を修正するルミネ
    センス分析における放射ルミネセンス測定方法の実施に
    用いられる装置。
  16. 【請求項１６】励起光源から放射された光束による励起
    に起因して放射されたルミネセンスを分割する手段を含
    むことを特徴とする請求の範囲第15項記載の装置。
  17. 【請求項１７】参照発光化合物からの波長λ１のルミネ
    センスを測定するチャンネルにおいて測定レベルを定
    め、次いで、該測定レベルに達したとき、波長λ２のル
    ミネセンスを測定するチャネルにおける測定を停止し
    て、上記波長λ２のルミネセンスの測定により得られた
    測定値を修正する手段を内蔵したことを特徴とする請求
    の範囲第15又は16項記載の装置。
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