JP3227486B2 - 銅の測定方法 - Google Patents
銅の測定方法Info
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は銅の測定方法に関し、さ
らに詳しくは、ホロ型ガラクトースオキシダーゼを処理
し、酸素に結合している銅を遊離させ、銅を加えてホロ
化しないと活性を発現しないアポ型ガラクトースオキシ
ダーゼ（ＥＣ１．１．３．９）を生成せしめ、検体に含
まれる銅を用いアポ型ガラクトースオキシダーゼを活性
型へと変換し、変換したアポ型ガラクトースオキシダー
ゼ量を測定することによって検体中の銅を測定する高感
度な酵素的測定方法に関する。
らに詳しくは、ホロ型ガラクトースオキシダーゼを処理
し、酸素に結合している銅を遊離させ、銅を加えてホロ
化しないと活性を発現しないアポ型ガラクトースオキシ
ダーゼ（ＥＣ１．１．３．９）を生成せしめ、検体に含
まれる銅を用いアポ型ガラクトースオキシダーゼを活性
型へと変換し、変換したアポ型ガラクトースオキシダー
ゼ量を測定することによって検体中の銅を測定する高感
度な酵素的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】銅は生体内に広く分布する
必須微量金属の一つで、主に金属蛋白内にコファクター
として結合し、重要な生体反応が関与している。鉄の酸
化、銅運搬に関与するセルロプラスミン、呼吸に関与す
るチトクロームオキシダーゼ、コラーゲンなどの架橋形
成に関与するリジルオキシダーゼやアミンオキシダー
ゼ、メラニン代謝に関与するチロシナーゼ、エピネフリ
ン合成に関与するドーパミン−β−ヒドロキシダーゼ、
スーパーオキシドラジカル代謝に関与するスーパーオキ
シドジスムターゼなどが代表的な銅結合金属蛋白として
あげられる。
必須微量金属の一つで、主に金属蛋白内にコファクター
として結合し、重要な生体反応が関与している。鉄の酸
化、銅運搬に関与するセルロプラスミン、呼吸に関与す
るチトクロームオキシダーゼ、コラーゲンなどの架橋形
成に関与するリジルオキシダーゼやアミンオキシダー
ゼ、メラニン代謝に関与するチロシナーゼ、エピネフリ
ン合成に関与するドーパミン−β−ヒドロキシダーゼ、
スーパーオキシドラジカル代謝に関与するスーパーオキ
シドジスムターゼなどが代表的な銅結合金属蛋白として
あげられる。
【０００３】臨床分析の分野では、銅測定における対象
は血清・血漿または、尿が、一般に使用され、代謝異常
や疾病が判定されてきている。血液中では、銅の大部分
がセルロプラスミンに結合し、上記の様に、鉄のトラン
スフェリンへの結合促進あるいは、銅の運搬および血液
中での保持などの生理的役割に関与している。
は血清・血漿または、尿が、一般に使用され、代謝異常
や疾病が判定されてきている。血液中では、銅の大部分
がセルロプラスミンに結合し、上記の様に、鉄のトラン
スフェリンへの結合促進あるいは、銅の運搬および血液
中での保持などの生理的役割に関与している。
【０００４】血液中の銅は、正常値で男性：１２．９〜
２１．１μｍｏｌ／Ｌ、女性：１６．２〜２５．０μｍ
ｏｌ／Ｌと極微量しか含まれていない。日常診療では、
血清銅高値よりも、Ｗｉｌｓｏｎ病やＫｉｎｋｙ Ｈａ
ｉｒ病に代表されるような低値を示した時が問題となる
ので、正常値よりもさらに微量な銅を正確に測定する測
定方法が望まれている。
２１．１μｍｏｌ／Ｌ、女性：１６．２〜２５．０μｍ
ｏｌ／Ｌと極微量しか含まれていない。日常診療では、
血清銅高値よりも、Ｗｉｌｓｏｎ病やＫｉｎｋｙ Ｈａ
ｉｒ病に代表されるような低値を示した時が問題となる
ので、正常値よりもさらに微量な銅を正確に測定する測
定方法が望まれている。
【０００５】銅の測定方法としては、原子吸光法やキレ
ート比色法が一般的に用いられているが、原子吸光法は
高価な特殊機器を必要とするばかりでなく、フレーム原
子化法では多量の抗体が必要であるにもかかわらず、血
清・血漿検体では感度不良であり、グラファイト炉原子
化法では感度が高すぎるため検体希釈が必要で、そのた
め器具からの汚染によるコンタミネーションが懸念され
る。臨床検査ではキレート比色法が広く使われている。
キレート比色法は臨床検査室ならばどこにでもある使用
用途の広い自動分析機に適用できることで、原子吸光法
よりはるかに優れているが、上記の通り、血清・血漿検
体に銅は微量にしか含まれていないので、感度および正
確さに満足のいかないことが多い。
ート比色法が一般的に用いられているが、原子吸光法は
高価な特殊機器を必要とするばかりでなく、フレーム原
子化法では多量の抗体が必要であるにもかかわらず、血
清・血漿検体では感度不良であり、グラファイト炉原子
化法では感度が高すぎるため検体希釈が必要で、そのた
め器具からの汚染によるコンタミネーションが懸念され
る。臨床検査ではキレート比色法が広く使われている。
キレート比色法は臨床検査室ならばどこにでもある使用
用途の広い自動分析機に適用できることで、原子吸光法
よりはるかに優れているが、上記の通り、血清・血漿検
体に銅は微量にしか含まれていないので、感度および正
確さに満足のいかないことが多い。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記した従来
の欠点を一挙に解決して、生体内の、特に血清中の銅の
量を正確にかつ熟練を要することなく簡便、迅速に測定
することができ、自動化ないし多検体処理を可能とす
る、血清銅の高感度分析システムを新規に開発すること
の足掛かりとなるものである。
の欠点を一挙に解決して、生体内の、特に血清中の銅の
量を正確にかつ熟練を要することなく簡便、迅速に測定
することができ、自動化ないし多検体処理を可能とす
る、血清銅の高感度分析システムを新規に開発すること
の足掛かりとなるものである。
【０００７】本発明は、上記目的を達成するためになさ
れたものであって、本発明者らは、微量な銅をすみやか
に、かつ、正確に測定するために、銅と各種酵素活性と
の関係を詳細に検討した結果、ガラクトースオキシダー
ゼであって、望ましくは銅を結合しているホロ型ガラク
トースオキシダーゼを処理し、酵素に結合している銅を
遊離させ、銅を加えてホロ化しないと活性を発現しない
アポ型ガラクトースオキシダーゼが、微量な銅を測定す
るのに必要な測定レンジを持つように、検体から添加さ
れる銅濃度の違いによりアポ型ガラクトースオキシダー
ゼの活性が変化することを知り、そしてその変化を測定
することによって微量な銅量が測定できることを確認
し、本発明を完成するに至った。
れたものであって、本発明者らは、微量な銅をすみやか
に、かつ、正確に測定するために、銅と各種酵素活性と
の関係を詳細に検討した結果、ガラクトースオキシダー
ゼであって、望ましくは銅を結合しているホロ型ガラク
トースオキシダーゼを処理し、酵素に結合している銅を
遊離させ、銅を加えてホロ化しないと活性を発現しない
アポ型ガラクトースオキシダーゼが、微量な銅を測定す
るのに必要な測定レンジを持つように、検体から添加さ
れる銅濃度の違いによりアポ型ガラクトースオキシダー
ゼの活性が変化することを知り、そしてその変化を測定
することによって微量な銅量が測定できることを確認
し、本発明を完成するに至った。
【０００８】本発明によれば、微量な銅であっても、ガ
ラクトースオキダーゼが増幅作用を示すことにより１個
の銅に対して多数の応答が得られるために、いままでの
従来法には全くなかったような高感度が図れるという利
点を有している。
ラクトースオキダーゼが増幅作用を示すことにより１個
の銅に対して多数の応答が得られるために、いままでの
従来法には全くなかったような高感度が図れるという利
点を有している。
【０００９】ガラクトースオキシダーゼが銅を結合して
いる蛋白酵素であることは知られている（ＡＲＣＨＩＶ
ＥＳ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩ
ＯＰＨＹＳＩＣ １６５， ４５６〜４６７， １９７
４， ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．１６， Ｎ
ｏ．８，１５９７〜１６０１，１９７７など）。さらに
アポ−ガラクトースオキシダーゼの調製法（Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ｖｏｌ．９， ８７〜９
２）及び、アポ−ガラクトースオキシダーゼのホロ化法
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．
１７，９６１０〜９６１３，１９９０）なども公知技術
となっている。サラニマタ、ガラクトースオキシダーゼ
を臨床検査に応用しようとするアイデア（メディアサー
クル，ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５，２０９〜２１７，１９
８７）についても報告されてきている。しかしながら、
今までは、上記の如く血清・血漿中にあるような微量な
銅を実際問題として測定した例はまったくなかった。
いる蛋白酵素であることは知られている（ＡＲＣＨＩＶ
ＥＳ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩ
ＯＰＨＹＳＩＣ １６５， ４５６〜４６７， １９７
４， ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．１６， Ｎ
ｏ．８，１５９７〜１６０１，１９７７など）。さらに
アポ−ガラクトースオキシダーゼの調製法（Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ｖｏｌ．９， ８７〜９
２）及び、アポ−ガラクトースオキシダーゼのホロ化法
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．
１７，９６１０〜９６１３，１９９０）なども公知技術
となっている。サラニマタ、ガラクトースオキシダーゼ
を臨床検査に応用しようとするアイデア（メディアサー
クル，ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５，２０９〜２１７，１９
８７）についても報告されてきている。しかしながら、
今までは、上記の如く血清・血漿中にあるような微量な
銅を実際問題として測定した例はまったくなかった。
【００１０】本発明の方法は、銅を結合していないアポ
型ガラクトースオキシダーゼを調整し、その活性をもた
ないアポ−ガラクトースオキシダーゼを用い、微量な銅
をアポ−ガラクトースオキシダーゼに結合し、活性型の
ホロ−ガラクトースオキシダーゼの形成量により、銅含
量をオキシダーゼ活性量という形でとらえることによ
り、再現性良く高感度に測定することを可能にするもの
である。
型ガラクトースオキシダーゼを調整し、その活性をもた
ないアポ−ガラクトースオキシダーゼを用い、微量な銅
をアポ−ガラクトースオキシダーゼに結合し、活性型の
ホロ−ガラクトースオキシダーゼの形成量により、銅含
量をオキシダーゼ活性量という形でとらえることによ
り、再現性良く高感度に測定することを可能にするもの
である。
【００１１】本発明の方法に使用できるガラクトースオ
キシダーゼは、一般的に市販されているカビ由来（Ｄａ
ｃｔｙｌｉｕｍｄｅｎｔｒｏｉｄｅｓ）のものが推奨さ
れるが、蛋白内に銅を結合し、比較的容易に銅を遊離す
ることができ、さらに銅の添加によって活性の回復をお
ろしうるものならば、本発明の方法を応用できる。
キシダーゼは、一般的に市販されているカビ由来（Ｄａ
ｃｔｙｌｉｕｍｄｅｎｔｒｏｉｄｅｓ）のものが推奨さ
れるが、蛋白内に銅を結合し、比較的容易に銅を遊離す
ることができ、さらに銅の添加によって活性の回復をお
ろしうるものならば、本発明の方法を応用できる。
【００１２】購入した酵素は銅を結合しているのでアポ
化処理をしたのちに本発明の方法に適応する。
化処理をしたのちに本発明の方法に適応する。
【００１３】アポ−ガラクトースオキシダーゼの調整法
としては、ｐＨ処理あるいは、キレート剤処理などが挙
げられるが、ｐＨ処理は失活による活性低下を及ぼす危
険があるので、キレート剤処理を推薦する。キレート剤
としては、処理後アポ−ガラクトースオキシダーゼ中の
残存活性ができるだけ小さくなる試薬を用いる。つま
り、銅とのキレート安定度定数が大きなものを用いると
良い。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＣｙＤＴ
Ａ（トランス１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ”，Ｎ”−４酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレトリア
ミン５酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチルテトラミン６酢
酸）、ＥＤＴＰＯ（エチレンジアミンテトラキスメチレ
ンホスホン酸）、ο−フェナントロリン、ジチオピロカ
ーボネートなどで温和な条件にて処理し、一定時間放置
後、キレート剤を完全に除去し本発明の方法に使用す
る。
としては、ｐＨ処理あるいは、キレート剤処理などが挙
げられるが、ｐＨ処理は失活による活性低下を及ぼす危
険があるので、キレート剤処理を推薦する。キレート剤
としては、処理後アポ−ガラクトースオキシダーゼ中の
残存活性ができるだけ小さくなる試薬を用いる。つま
り、銅とのキレート安定度定数が大きなものを用いると
良い。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＣｙＤＴ
Ａ（トランス１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ”，Ｎ”−４酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレトリア
ミン５酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチルテトラミン６酢
酸）、ＥＤＴＰＯ（エチレンジアミンテトラキスメチレ
ンホスホン酸）、ο−フェナントロリン、ジチオピロカ
ーボネートなどで温和な条件にて処理し、一定時間放置
後、キレート剤を完全に除去し本発明の方法に使用す
る。
【００１４】試料に含まれる銅によってホロ化を受け活
性型になったガラクトースオキシダーゼ活性は、溶存酸
素の消費量を測定するか、ガラクトースの減少量を測定
するか、発生する過酸化水素量を測定することによって
検出することができる。臨床検査上、一般的には過酸化
水素量を測定する方法が使われているので、その方法論
を推奨し、例を示す。
性型になったガラクトースオキシダーゼ活性は、溶存酸
素の消費量を測定するか、ガラクトースの減少量を測定
するか、発生する過酸化水素量を測定することによって
検出することができる。臨床検査上、一般的には過酸化
水素量を測定する方法が使われているので、その方法論
を推奨し、例を示す。
【００１５】第一はパーオキシダーゼ・色源体を使う方
法で、例えば、ο−ジアニシジンや、フェノール・４−
アミノアンテイピリンとパーオキシダーゼを用い過酸化
水素による縮合体の発色を測定する方法である。最近で
はさらに良い色源体が開発されてきている。
法で、例えば、ο−ジアニシジンや、フェノール・４−
アミノアンテイピリンとパーオキシダーゼを用い過酸化
水素による縮合体の発色を測定する方法である。最近で
はさらに良い色源体が開発されてきている。
【００１６】第二はグルタチオンパーオキシダーゼ法
（特願昭６２−４７７２５当社特許「生体物質のエンザ
イムアッセイ」）がある。これは試薬中に多量の還元剤
グルタチオンが存在するため検体中の還元物質の影響を
受けにくく、さらにグルタチオンリダクターゼを共役さ
せ、ＮＡＤＰＨの減少速度で検出するため還元物質のみ
ならずビリルビンなどの影響も回避することができる優
れた方法である。
（特願昭６２−４７７２５当社特許「生体物質のエンザ
イムアッセイ」）がある。これは試薬中に多量の還元剤
グルタチオンが存在するため検体中の還元物質の影響を
受けにくく、さらにグルタチオンリダクターゼを共役さ
せ、ＮＡＤＰＨの減少速度で検出するため還元物質のみ
ならずビリルビンなどの影響も回避することができる優
れた方法である。
【００１７】第三は、カタラーゼ法（Ｃｌｉｃ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，２１〜２７，１
９９２， Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２
９，１０７〜１１４，１９８５）で、これは、カタラー
ゼを用い発生した過酸化水素をエタノールと反応させ、
アセトアルデヒドを生成させる。アセトアルデヒドをア
セトアルデヒド脱水酵素とＮＡＤ（Ｐ）により酸化し、
その際に生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出することにより測
定する方法である。３４０ｎｍの吸収波長を使うことに
より、グルタチオンパーオキシダーゼ法同様にパーオキ
シダーゼ・色源体を用いる方法により、理論上干渉物質
の影響を受けにくい測定法である。
ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，２１〜２７，１
９９２， Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２
９，１０７〜１１４，１９８５）で、これは、カタラー
ゼを用い発生した過酸化水素をエタノールと反応させ、
アセトアルデヒドを生成させる。アセトアルデヒドをア
セトアルデヒド脱水酵素とＮＡＤ（Ｐ）により酸化し、
その際に生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出することにより測
定する方法である。３４０ｎｍの吸収波長を使うことに
より、グルタチオンパーオキシダーゼ法同様にパーオキ
シダーゼ・色源体を用いる方法により、理論上干渉物質
の影響を受けにくい測定法である。
【００１８】少し毛色の違った測定法としては蛍光分析
法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３８，１
３３〜１３６，１９８４，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ，Ｒｅｓ．，
ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．８，１０７７〜１０８４，１９８
３）が挙げられる。これらいずれの方法も、本発明の方
法に適応出来得る。
法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３８，１
３３〜１３６，１９８４，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ，Ｒｅｓ．，
ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．８，１０７７〜１０８４，１９８
３）が挙げられる。これらいずれの方法も、本発明の方
法に適応出来得る。
【００１９】以下、実施例により本発明の方法をさらに
具体的に説明するが、これによってなんら制限されるも
のではない。
具体的に説明するが、これによってなんら制限されるも
のではない。
【００２０】
【実施例１】 アポ−ガラクトースオキシダーゼの調整 ベーリンガー社製ガラクトースオキシダーゼ（５，００
０ｕｎｉｔｓ）に、１ｍＭ ジエチルジチオカルバメー
ト、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ バッファー、ｐ
Ｈ７．０を８０ｍｌ加えて、２５℃で１０分間反応させ
る。その後、Ｇ−２５で脱塩し、３２０ｕ／ｍｌの酵素
液５ｍｌを得た。
０ｕｎｉｔｓ）に、１ｍＭ ジエチルジチオカルバメー
ト、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ バッファー、ｐ
Ｈ７．０を８０ｍｌ加えて、２５℃で１０分間反応させ
る。その後、Ｇ−２５で脱塩し、３２０ｕ／ｍｌの酵素
液５ｍｌを得た。
【００２１】
【実施例２】 銅に対するｋｍ値測定 下記表１に示す組成にしたがって試薬Ｒ１．Ｒ２を調整
した。 ［表１］ 試薬Ｒ１： ４８ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ
７．２ ０．０７ｕ／ｍｌ アポ−ガラクトースオキシダーゼ 試薬Ｒ２： ９５ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．０ ０．５％ ガラクトース ０．０５ ｍｇ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ベーリンガ
ー社製） ０．０５ ｍｇ／ｍｌ ο−ジアニジン ［測定方法］９０μｌのＲ１に銅溶液１０μｌを加え、
３７℃にて５分間プレインキューベーションした。３０
０μｌのＲ２を加え、同温度にて２分間放置後の１分間
における４５０ｎｍの吸光度変化量を測定した。横軸に
銅のＲ１と銅溶液が混合されたときの銅濃度、横軸に吸
光度変化量をとり作図した。その結果を図１に示す。 ［結果］図１の如く、最終銅濃度１０μＭ以下ではまっ
たく酵素活性を示さず、実施例１の処理にて完全なアポ
−ガラクトースオキシダーゼが得られることがわかる。
さらに、この条件下での銅に対するｋｍ値は４３．９μ
Ｍが得られ、血清・血漿中の銅濃度を測定するのに相応
しい酵素であることがわかった。
した。 ［表１］ 試薬Ｒ１： ４８ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ
７．２ ０．０７ｕ／ｍｌ アポ−ガラクトースオキシダーゼ 試薬Ｒ２： ９５ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．０ ０．５％ ガラクトース ０．０５ ｍｇ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ベーリンガ
ー社製） ０．０５ ｍｇ／ｍｌ ο−ジアニジン ［測定方法］９０μｌのＲ１に銅溶液１０μｌを加え、
３７℃にて５分間プレインキューベーションした。３０
０μｌのＲ２を加え、同温度にて２分間放置後の１分間
における４５０ｎｍの吸光度変化量を測定した。横軸に
銅のＲ１と銅溶液が混合されたときの銅濃度、横軸に吸
光度変化量をとり作図した。その結果を図１に示す。 ［結果］図１の如く、最終銅濃度１０μＭ以下ではまっ
たく酵素活性を示さず、実施例１の処理にて完全なアポ
−ガラクトースオキシダーゼが得られることがわかる。
さらに、この条件下での銅に対するｋｍ値は４３．９μ
Ｍが得られ、血清・血漿中の銅濃度を測定するのに相応
しい酵素であることがわかった。
【００２２】
【実施例３】 定量曲線 下記表２に示す組成にしたがって試薬Ｒ１、Ｒ２を調整
した。 ［表２］ 試薬Ｒ１：１００ ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０ ５ ｕ／ｍｌ アポ−ガラクトースオキシダーゼ 試薬Ｒ２：実施例２と同試薬 試料Ｓ ：０〜５０μＭの銅溶液 ［測定方法］実施例２と同条件にて測定した。横軸に試
料中の銅濃度、縦軸に吸光度変化量をとり、試薬ブラン
クを差し引き作図した。その結果を図２に示す。 ［結果］図２にあるように０〜５０μＭまでの銅溶液に
て定量曲線が得られた。血清・血漿中の微量な銅であっ
ても高感度に測定できうることが分かった。
した。 ［表２］ 試薬Ｒ１：１００ ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０ ５ ｕ／ｍｌ アポ−ガラクトースオキシダーゼ 試薬Ｒ２：実施例２と同試薬 試料Ｓ ：０〜５０μＭの銅溶液 ［測定方法］実施例２と同条件にて測定した。横軸に試
料中の銅濃度、縦軸に吸光度変化量をとり、試薬ブラン
クを差し引き作図した。その結果を図２に示す。 ［結果］図２にあるように０〜５０μＭまでの銅溶液に
て定量曲線が得られた。血清・血漿中の微量な銅であっ
ても高感度に測定できうることが分かった。
【００２３】
【発明の効果】銅を結合しているホロ型ガラクトースオ
キシダーゼから銅を遊離させアポ型に変換し、該アポ型
ガラクトースオキシダーゼを含む反応系で銅を測定す
る。
キシダーゼから銅を遊離させアポ型に変換し、該アポ型
ガラクトースオキシダーゼを含む反応系で銅を測定す
る。
【図１】実施例２に記載した方法で測定した、アポ−ガ
ラクトースオキシダーゼの銅に対するｋｍ値を測定した
ものである。
ラクトースオキシダーゼの銅に対するｋｍ値を測定した
ものである。
【図２】実施例３に記載した方法で測定した、銅の定量
曲線をあらわしている。
曲線をあらわしている。
Claims (2)
- 【請求項１】銅の定量を行うに際し、アポ型ガラクトー
スオキシダーゼを用いることを特徴とする銅の測定方
法。 - 【請求項２】銅の定量を行うに際し、アポ型ガラクトー
スオキシダーゼを用いることを特徴とする銅の測定用試
薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01939793A JP3227486B2 (ja) | 1993-01-13 | 1993-01-13 | 銅の測定方法 |
| EP94300250A EP0607047A1 (en) | 1993-01-13 | 1994-01-13 | Method for measurement of copper |
| US08/563,257 US5728539A (en) | 1993-01-13 | 1995-11-28 | Enzymatic methods for measurement of minute amounts of copper |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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