JP3144097B2 - 新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なタンパク質、そ
れをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する形質転換体
およびそれを用いたタンパク質の産生法に関し、詳細に
は肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）を特定の位置で切断し
て不活性の１本鎖型から活性を有する２本鎖型へ変換さ
せるプロテアーゼ活性を有する新規なタンパク質の前駆
体タンパク質、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含
有する形質転換体およびそれを用いたタンパク質の産生
法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
ＨＧＦの生理活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験において
１本鎖型では見られず、２本鎖型になった場合にのみ発
現されることが確認されている。またヒトＨＧＦを遺伝
子組み換えの手法を用いて生産する場合、無血清培養下
では産生されるヒトＨＧＦの大半は１本鎖型であること
も確認されている。培養時における血清の添加の有無は
製造コストに大きな影響を与えるものであることから、
無血清培養下でＨＧＦを生産する方法が望まれていた。

【０００３】本発明者らの一部は先に、哺乳動物の血清
中にかかる１本鎖型ＨＧＦを２本鎖型に変換するプロテ
アーゼが存在し、このプロテアーゼは、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３４，００
０ダルトンのタンパク質であることを見出した（特願平
３−２７１３６２号）。しかし該タンパク質は血清中に
極微量しか存在しないため、精製してその標品を得るた
めには多大な労力を要するという問題があった。また、
かかる約３４，０００ダルトンのタンパク質は活性型の
タンパクであることから、その安定性にも懸念が残され
ていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らの一部は、該
プロテアーゼを前駆体としてヒト血しょうから精製し、
この前駆体はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約９６，０００ダルトンのタンパク質で
あることを見出した（特願平４−２０８０３４号）が、
本発明者らは、当該タンパク質と同等の活性を有するタ
ンパク質を容易に調製することを目的として鋭意検討を
重ねた結果、かかる前駆体タンパク質をコードする遺伝
子を初めて取得し、その結果遺伝子工学的手法を用いて
該タンパク質を大量生産できることを見出し、本発明を
完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明の要旨は、配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする
タンパク質、それをコードする遺伝子、該遺伝子がコー
ドするポリペプチドを発現するベクター、形質転換体お
よびこれらを用いた当該タンパク質の産生法に存する。
以下、本発明につき詳細に説明する。

【０００６】本発明における新規タンパク質は、配列表
の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質で
あり、それがプロセッシングを受けた後に１本鎖型ＨＧ
Ｆを２本鎖型ＨＧＦに変換するという成熟型のプロテア
ーゼ活性を有するようになる範囲であれば、一部のアミ
ノ酸を除去、置換、修飾または追加する等の改変を行っ
たものも本発明に含まれる。

【０００７】上記タンパク質をコードする遺伝子として
は、例えば配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表さ
れる核酸配列を部分配列として含有してなるものや、配
列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるもの等が
挙げられる。かかる遺伝子のＤＮＡ断片は、例えば以下
のようにして得ることができる。本発明のタンパク質を
コードするｃＤＮＡライブラリーとしては、市販のヒト
肝臓から調整されたものが利用できる。このｃＤＮＡラ
イブラリーから、ファージミドを斎藤らの方法（プロシ
ーディングス オブ ナショナル アカデミー サイエ
ンス ユー エス エー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，８３，８６６４−８６６８（１
９８６））により感染させ、培養する。培養後に形成さ
れたコロニーを、部分ＤＮＡ断片あるいは本発明のタン
パク質の部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有する
ＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼー
ション法（「モレキュラー クローニング」，コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー，３２０−３２
８（１９８２））によって選択し、目的とするＤＮＡ断
片を得ることができる。

【０００８】このコロニーハイブリダイゼーション法に
使用するプローブとしては、ポリメラーゼチェイン反応
（以下、「ＰＣＲ」と略す）法（サイエンス［Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ］，２３９，４８７−４９１（１９８８））によ
って得られる本発明タンパク質をコードする遺伝子の部
分ＤＮＡ断片が用いられる。具体的には、配列表の配列
番号４に記載のＤＮＡ断片を＋鎖ＤＮＡプライマー、配
列表の配列番号５に記載のＤＮＡ断片を−鎖ＤＮＡプラ
イマーとしてＰＣＲを行い、得られた配列表の配列番号
２に記載のＤＮＡ断片を作成してプローブとして用い
る。また本発明タンパク質のアミノ酸配列より推定され
るＤＮＡ配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いることもできる。

【０００９】さらに上記のスクリーニング陽性のコロニ
ーから、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラ
ー クローニング」，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，８５（１９８２））によりＤＮＡを調
製し、適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後、
ｐＵＣ１８等のプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇ
ｅｒらのジデオキシ法（プロシーディングス オブ ナ
ショナル アカデミーサイエンス ユー エス エー
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，
７４，５４６３（１９７７））によって目的とするＤＮ
Ａ断片の塩基配列を決定することができる。

【００１０】このようにして決定されるＤＮＡ断片の塩
基配列（例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列
を部分配列として含むもの、配列表の配列番号３に記載
の塩基配列で表されるもの）は、配列表の配列番号１に
示す本発明タンパク質をコードしている。また本発明の
かかるＤＮＡ断片としては、それがプロセッシングを受
けた後に１本鎖型ＨＧＦを２本鎖型ＨＧＦに変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる範囲であれば、一部
の塩基を除去、置換、修飾または追加する等の改変を行
ったものも含まれる。

【００１１】上記のようにして得られるＤＮＡ断片は、
その５’末端を修飾して常法に従って発現ベクターのプ
ロモーターの下流に挿入され、大腸菌、枯草菌、酵母、
動物細胞宿主等の細胞内に導入される。次に本発明タン
パク質の産生方法につき詳細に説明する。発現ベクター
としては、上記のようにして得られた本発明タンパク質
をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを
含有しているものが好適に使用される。例えば大腸菌、
枯草菌等の微生物を宿主とするときには、発現ベクター
はプロモーター、リボゾーム結合（ＳＤ）配列、当該タ
ンパク質遺伝子、転写終結配列およびプロモーターを制
御する遺伝子よりなることが好ましい。

【００１２】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
Ｐ_L 、Ｐ_R 、Ｔ₅ ファージの初期遺伝子のプロモーター
であるＰ₂₅、Ｐ₂₆プロモーター等が挙げられる。また、
これらは例えばｐａｃプロモーター（アグリカルチュラ
ル アンド バイオロジカル ケミストリー［Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．］，５２，９８３−９８８
（１９８８））のように独自に改変、設計された配列で
もよい。

【００１３】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでもよいが、１６ＳリボソームＲＮ
Ａの３’末端領域の相補的な配列を４塩基以上連続して
有するコンセンサス配列を持つ合成ＤＮＡ配列でもよ
い。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、非依存性
のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐ
オペロンターミネーター等を有している方が好ましい。

【００１４】さらにこれらの発現に必要な因子の発現プ
ラスミド上での配列順序としては、５’上流側からプロ
モーター、ＳＤ配列、当該タンパク質遺伝子、転写終結
因子の順に並ぶことが望ましい。また、発現ベクター上
のＳＤ配列と当該タンパク質遺伝子とのユニットを複数
個同方向に挿入することにより、ベクター上の転写単位
のコピー数を増加させる方法（特開平１−９５７９８号
公報）を用いることもできる。

【００１５】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）、市販
のｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）等が挙げられ
る。また、融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧ
ＥＸシリーズ（ファルマシア社製）等も同様に使用する
ことができる。宿主細胞の形質転換法としては、常法に
従い行うことができる。

【００１６】形質転換体の培養は、モレキュラー クロ
ーニング（コールド スプリングハーバー ラボラトリ
ー，１９８２年）に記載の方法に準じて行うことができ
る。上記したように、宿主細胞としては大腸菌、枯草
菌、酵母等の微生物を使用することができるが、本発明
タンパク質が多くのシステイン残基を含み、そのシステ
イン残基間のチオール結合の位置およびタンパク質の高
次構造が活性の維持に影響を与える可能性があることを
考慮すると、動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細
胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３
Ａ細胞等を用いて当該タンパク質遺伝子を発現させるこ
とが望ましい。

【００１７】動物細胞のプロモーターとしては種々のも
のが報告されているが、例えばＳＶ４０プロモーター、
メタロチオネイン遺伝子のプロモーター等を用いること
ができる。このプロモーターの下流に分泌シグナルおよ
び当該タンパク質遺伝子のＤＮＡ断片とを転写方向に従
って挿入する。この場合、当該遺伝子のＤＮＡ断片を２
〜３個結合したものを挿入してもよいし、また当該遺伝
子のＤＮＡ断片の５’上流側にプロモーターを結合した
ＤＮＡ断片を単位とし、転写方向を揃えて２〜３個結合
したものを挿入してもよい。

【００１８】上記当該タンパク質遺伝子には、その下流
にポリアデニル化部位が存在することが望ましい。例え
ばＳＶ４０ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子、メテロチオネ
イン遺伝子等由来のポリアデニル化部位を当該タンパク
質遺伝子の下流に１つ存在させる。また、当該タンパク
質遺伝子にプロモーターを結合したＤＮＡ断片を２〜３
個タンデムに挿入する方法を用いた場合には、当該タン
パク質遺伝子それぞれの３’側にそれぞれポリアデニル
化部位を存在させることが可能である。さらにＳＶ４０
遺伝子、ウサギβ−グロビン等の動物由来の遺伝子、化
学的に合成されたエクソン、イントロンのスプライシン
グシグナル配列等を当該タンパク質遺伝子の上流または
下流に挿入することも高発現のために有効な手段であ
る。

【００１９】上記の発現ベクターを用いて動物細胞、例
えばＣＨＯ細胞を形質転換する際には、選択マーカーを
用いることが望ましい。選択マーカー遺伝子を該発現ベ
クターのポリアデニル化部位下流に順方向あるいは逆方
向に挿入しておくと、形質転換体を得る際に、選択マー
カー遺伝子を含む別のプラスミドを二重形質転換する必
要がなくなる。このような選択マーカーとしては、メト
トレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子（ジャーナル
オブ モレキュラー バイオロジー［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．］，１５９，６０１（１９８２））、抗生物質
Ｇ−４１８耐性を与えるＮｅｏ遺伝子（ジャーナル オ
ブ モレキュラー アプライド ジェネティクス［Ｊ．
Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．］，１，３２７（１９
８２））、ミコフェノール酸耐性を与える大腸菌由来の
Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子（プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー サイエンス ユー エス エー
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，
７８，２０７２（１９８１））、抗生物質ハイグロマイ
シン耐性を与えるｈｐｈ遺伝子（モレキュラー アンド
セルラー バイオロジー［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．］，５，４１０（１９８５））等が挙げられる。

【００２０】これらの各耐性遺伝子の５’上流側にはプ
ロモーター、例えば前述のＳＶ４０由来のプロモーター
が挿入されており、また各耐性遺伝子の３’下流側に
は、前述のポリアデニル化部位が含まれている。Ｉｎｖ
ｉｔｏｒｏｇｅｎ社から市販されている発現ベクターｐ
ｃＤＮＡ／Ｎｅｏは、選択マーカーとしてネオマイシン
の耐性遺伝子を最初から有しており、このようなベクタ
ーを用いてもよい。発現ベクターに上記のような選択マ
ーカー遺伝子が挿入されていない場合には、形質転換体
の選択マーカーを有するベクター、例えばｐＳＶ２Ｎｅ
ｏ（ジャーナルオブ モレキュラー アプライド ジェ
ネティクス［Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．］，
１，３２７（１９８２））、ｐＭＢＧ（ネイチャー［Ｎ
ａｔｕｒｅ］，２９４，２２８（１９８１））、ｐＳＶ
２ｇｐｔ（プロシーディングスオブ ナショナル アカ
デミー サイエンス ユー エス エー［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，７８，２０７２
（１９８１））、ｐＡｄ−Ｄ２６−１（ジャーナル オ
ブ モレキュラー バイオロジー［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．］，１５９，６０１（１９８２））等を当該タンパ
ク質遺伝子の発現ベクターと共に二重形質転換し、選択
マーカー遺伝子の表現形質により形質転換体を容易に選
択できる。

【００２１】以上のような方法で、選択される当該タン
パク質遺伝子を含有する細胞について選択マーカーを変
更して二重形質転換を繰り返すことは、発現量を上昇さ
せ得ることができるので好ましい。発現ベクターの動物
細胞への導入は、リン酸カルシウム法（ビロロジー［Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ］，５２，４５６（１９７３））、エレ
クトロポレーション法（ジャーナル オブ メンブレン
バイオロジー［Ｊ．Ｍｅｎｂｒ．Ｂｉｏｌ．］，１
０，２７９（１９７２））等が挙げられる。

【００２２】形質転換された動物細胞の培養は、常法に
より浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地
としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等を用い、５〜１
０％の血清存在下もしくは適当な成長因子の存在下、ま
たは無血清下にて培養する。当該タンパク質を産生して
いる動物細胞は、その培養上清中に産生された当該タン
パク質を分泌することから、この組換え体の培養上清か
ら当該タンパク質の分離精製を行うことが可能である。
具体的には、生産された当該タンパク質を含む培養上清
を各種クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換樹脂、
ヘパリン固定化樹脂、疎水クロマト用樹脂、アフィニテ
ィークロマト用樹脂等を適宜組み合わせたクロマトグラ
フィーにて精製することにより、当該タンパク質を単離
精製することができる。

【００２３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定される
ものではない。 実施例１ 本発明タンパク質の精製および部分アミノ酸
配列の決定 特願平４−２０８０３４号の実施例２に記載の方法に従
って、ヒト血しょうより、セリンプロテアーゼで処理す
ることにより１本鎖型ＨＧＦを２本鎖型ＨＧＦに変換す
るプロテアーゼ活性を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にて約９６，０００ダルトンの分子量を
示すタンパク質を得た。この精製されたタンパク質を、
緩衝液Ａ（６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレン
ジアミン４酢酸塩および１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐ
Ｈ８．５））中で、２−メルカプトエタノールにより、
４０℃、２時間還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を
加え、窒素ガス下、室温、遮光下で１時間反応させ、カ
ルボキシメチル化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ
Ｃ４カラム（ワイ エム シー社製）に添加し、アセ
トニトリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１
０％から７０％まで３０分間の濃度勾配溶出を行い、１
本の主要なピークを分取した。

【００２４】このピークを２Ｍ尿素を含む０．１％重炭
酸アンモニウム溶液に溶解し、ＴＰＣＫ−トリプシン
（マイルス ラボラトリー社製）またはＴＬＣＫ−キモ
トリプシン（マイルス ラボラトリー社製）により酵
素：基質＝１：５０で３７℃、１６時間反応させた。そ
れを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に添加
し、アセトニトリル／イソプロピルアルコール（３／
７）濃度０％から８０％まで１時間の濃度勾配溶出を行
い、複数のペプチド断片を得た。

【００２５】これらのペプチド断片を真空乾燥した後、
５０％トリフルオロ酢酸６０μｌに溶解し、ポリブレン
処理したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製＄４７０Ａシークエンサーで
エドマン分解し、アミノ酸配列を決定した。フェニルチ
オヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は、三菱化成
社製のＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ ＩＨＵ（０．４６×１
５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝
液，ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳおよび３８％アセト
ニトリル）による単一溶媒溶出を流速１．２ｍｌ／分、
温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍ
の吸光度で行った。これらのペプチドのうちの２つのペ
プチドのアミノ酸配列を、配列表の配列番号６および７
に示す。 実施例２ ＰＣＲ法による本発明タンパク質の部分ＤＮ
Ａ断片の調製 基質ＤＮＡは市販のヒト肝臓ｃＤＮＡバンク（クイック
クローン^TM ヒューマンリバーｃＤＮＡ、クロンテック
社製）を用いた。ＰＣＲは、パーキン エルマー シー
タス ＤＮＡ サーマル サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｙｃｌｅｒ）を使用して、ジーン アンプ キット（Ｇ
ｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、宝酒造製）を使って行っ
た。基質ＤＮＡ（１ｎｇ相当量）、１０倍濃度の反応緩
衝液（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭトリス塩酸バッフ
ァー（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂ および０．１
％（ｗ／ｖ）ゼラチン）１０μｌおよびそれぞれ１０ｍ
ＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを２μｌ
ずつ、プライマー＃１として配列表の配列番号４に記載
の＋鎖ＤＮＡプライマーおよびプライマー＃２として配
列表の配列番号５に記載の−鎖ＤＮＡプライマーをそれ
ぞれ１種類（１配列）のプライマーが０．１μＭになる
ようにして、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加
えて、滅菌脱イオン水で１００μｌの系とする。反応は
９４℃、１０分間の前処理後、９４℃で１分間（変性ス
テップ）、３７℃で２分間（アニーリングステップ）お
よび７２℃で３分間（伸長ステップ）のインキュベーシ
ョンを３０サイクル行った。最後に７２℃で７分間のイ
ンキュベーションを行い、反応を終了した。得られた反
応液をフェノール：クロロホルム＝１：１で抽出し、エ
タノール沈澱を行った。この沈澱を２１．５μｌの滅菌
脱イオン水に溶解した後、１０倍濃度の制限酵素緩衝液
（５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１０
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび
１ｍＭＤＴＴ）２．５μｌおよび制限酵素ＢｇｌＩＩ１
μｌ（１５ユニット）を加え、３７℃で２時間反応させ
た後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、３
２３ｂｐのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラ
グメントを回収し、エタノール沈澱を行った。

【００２６】このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターのＢ
ａｍＨＩ部位に挿入した後、常法に従って塩基配列を決
定した。決定したＰＣＲフラグメントの塩基配列を、配
列表の配列番号２に示す。 実施例３ 本発明タンパク質をコードする完全長ＤＮＡ
断片を含むクローンのスクリーニング 上記実施例２で作製した３２３ｂｐのＰＣＲ断片をモレ
キュラー クローニング（コールド スプリング ハー
バー ラボラトリー，１９８２年）に記載の方法に従
い、³²Ｐ標識することによりスクリーニング用プローブ
とした。スクリーニング用のライブラリーとしては、プ
リメイド ラムダ ファージ ライブラリー（ストラテ
ジーン社製）４９才男性由来ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラ
リーを用いた。大腸菌はＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラテジ
ーン社製）を用い、約５００万プラークとなるように上
記のファージを感染させ、ＮＺＹ培地で１晩生育させた
後、デュポン社製のジーン スクリーン プラスにトラ
ンスファーさせた。そのメンブレンを０．１Ｍ水酸化ナ
トリウム−０．５Ｍ塩化ナトリウムが染み込んだろ紙上
に２分間静置し、続いて１．５Ｍ塩化ナトリウム−０．
５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が染み込んだ
ろ紙上で５分間静置した。このフィルターの処理を更に
２回繰り返した後、２×ＳＳＣ（２倍ＳＳＣ）でフィル
ターを洗浄し、乾いたろ紙上で風乾した。次にこのメン
ブレンに１２０ｍＪ／ｃｍ²のＵＶ照射を行うことによ
り、メンブレンに移したＤＮＡの固定を行った。

【００２７】こうして処理したメンブレン５枚を、５０
ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナ
トリウムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液５０ｍｌに浸漬
し、６５℃で２時間保持した。次に上記のＰ標識プロー
ブ５ｎｇ／ｍｌ、鮭精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ、５０
ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナ
トリウムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液４０ｍｌに浸漬
し、６５℃で１６時間保持した。その後メンブレンを取
り出し、２×ＳＳＣで室温５分間、０．１×ＳＳＣで室
温３０分間２回の順に洗浄した後、常法に従ってオート
ラジオグラフィーを行い、ポジティブクローンを得た。 実施例４ ＤＮＡ断片のサブクローニングおよび塩基配
列の決定 実施例３で得られたポジティブのファージクローンよ
り、エキシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）法により直接プ
ラスミドにした。シングルプラークより５００μｌのＳ
Ｍ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸バッファー，ｐＨ７．
５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウムおよび０．０１％ゼラチン）と２０μｌのクロロホ
ルムによりファージを抽出した。上記の２００μｌファ
ージ抽出液と２００μｌＸＬ１−Ｂｌｕｅおよび１μｌ
のＲ４０８ヘルパーファージを３７℃、１５分間処理し
た後、２×ＹＴ培地５ｍｌを加えて３７℃で３時間振と
う培養を行った。続いて７０℃で２０分間処理した後４
０００ｇで５分間遠心分離し、上清を得た。上清の１０
０倍希釈液２０μｌをＸＬ１−Ｂｌｕｅ ２００μｌと
混ぜ、３７℃で１５分間処理した後、その内２μｌをア
ンピシリン４０μｌ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に播い
た。出現してきたコロニーのうち２４個のプラスミドを
取得、解析し、塩基配列を決定した。決定した塩基配列
を、配列表の配列番号３に示す。この塩基配列をもとに
本発明のタンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号
１）を決定した。

【００２８】

【発明の効果】本発明により、１本鎖ＨＧＦを活性型の
２本鎖ＨＧＦに変換するプロテアーゼ活性を有するポリ
ペプチドの前駆体タンパク質をコードする新規なＤＮＡ
断片が得られ、その塩基配列が明らかにされた。その当
該タンパク質遺伝子を挿入された発現ベクターを宿主細
胞に導入することにより、当該タンパク質を大量、安
定、かつ容易に生産することが可能になり、当該タンパ
ク質から成熟型のプロテアーゼが生産できると考えられ
る。

【００２９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６５５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Met Gly Arg Trp Ala Trp Val Pro Ser Pro Trp Pro Pro Pro Gly Leu 1 5 10 15 Gly Pro Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Arg Gly 20 25 30 Phe Gln Pro Gln Pro Gly Gly Asn Arg Thr Glu Ser Pro Glu Pro Asn 35 40 45 Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ile Pro Thr Ile Leu Val Thr Ser Val Thr 50 55 60 Ser Glu Thr Pro Ala Thr Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gly Pro Gln Ser 65 70 75 80 Gly Gly Leu Pro Pro Pro Pro Arg Ala Val Pro Ser Ser Ser Ser Pro 85 90 95 Gln Ala Gln Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg Pro Cys Arg Phe Pro Phe 100 105 110 Arg Tyr Gly Gly Arg Met Leu His Ala Cys Thr Ser Glu Gly Ser Ala 115 120 125 His Arg Lys Trp Cys Ala Thr Thr His Asn Tyr Asp Arg Asp Arg Ala 130 135 140 Trp Gly Tyr Cys Val Glu Ala Thr Pro Pro Pro Gly Gly Pro Ala Ala 145 150 155 160 Leu Asp Pro Cys Ala Ser Gly Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Ser 165 170 175 Asn Thr Gln Asp Pro Gln Ser Tyr His Cys Ser Cys Pro Arg Ala Phe 180 185 190 Thr Gly Lys Asp Cys Gly Thr Glu Lys Cys Phe Asp Glu Thr Arg Tyr 195 200 205 Glu Tyr Leu Glu Gly Gly Asp Arg Trp Ala Arg Val Arg Gln Gly His 210 215 220 Val Glu Gln Cys Glu Cys Phe Gly Gly Arg Thr Trp Cys Glu Gly Thr 225 230 235 240 Arg His Thr Ala Cys Leu Ser Ser Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys 245 250 255 His Leu Ile Val Ala Thr Gly Thr Thr Val Cys Ala Cys Pro Pro Gly 260 265 270 Phe Ala Gly Arg Leu Cys Asn Ile Glu Pro Asp Glu Arg Cys Phe Leu 275 280 285 Gly Asn Gly Thr Gly Tyr Arg Gly Val Ala Ser Thr Ser Ala Ser Gly 290 295 300 Leu Ser Cys Leu Ala Trp Asn Ser Asp Leu Leu Tyr Gln Glu Leu His 305 310 315 320 Val Asp Ser Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Gly Pro His Ala 325 330 335 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Val Val 340 345 350 Lys Asp Ser Ala Leu Ser Trp Glu Tyr Cys Arg Leu Glu Ala Cys Glu 355 360 365 Ser Leu Thr Arg Val Gln Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro 370 375 380 Glu Pro Ala Ser Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys 385 390 395 400 Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro 405 410 415 Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala Ile Tyr Ile Gly Asp Ser Phe Cys 420 425 430 Ala GLy Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 435 440 445 Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gln 450 455 460 His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gln Thr Phe Gly Ile Glu 465 470 475 480 Lys Tyr Ile Pro Tyr Thr Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His 485 490 495 Asp Leu Val Leu Ile Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asp Arg Cys Ala Thr 500 505 510 Arg Ser Gln Phe Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr 515 520 525 Phe Pro Ala Gly His Lys Cys Gln Ile Ala Gly Trp Gly His Leu Asp 530 535 540 Glu Asn Val Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro 545 550 555 560 Leu Val Ala Asp His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp 565 570 575 Ile Ser Pro Asn Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp 580 585 590 Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly 595 600 605 Val Ala Tyr Leu Tyr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg 610 615 620 Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp 625 630 635 640 Ile Asn Asp Arg Ile Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser 645 650 655

【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：３２９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 直接の起源：Quick-cloneTM ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Clonet
ech社製） 配列 GGATCC CAG ATT GCG GGC TGG GGC CAC TTG GAT GAG AAC GTG AGC GGC 48 Gln Ile Ala Gly Trp Gly His Leu Asp Glu Asn Val Ser Gly 1 5 10 TAC TCC AGC TCC CTG CGG GAG GCC CTG GTC CCC CTG GTC GCC GAC CAC 96 Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Asp His 15 20 25 30 AAG TGC AGC AGC CCT GAG GTC TAC GGC GCC GAC ATC AGC CCC AAC ATG 144 Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Pro Asn Met 35 40 45 CTC TGT GCC GGC TAC TTC GAC TGC AAG TCC GAC GCC TGC CAG GGG GAC 192 Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp Ala Cys Gln Gly Asp 50 55 60 TCA GGG GGG CCC CTG GCC TGC GAG AAG AAC GGC GTG GCT TAC CTC TAC 240 Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly Val Ala Tyr Leu Tyr 65 70 75 GGC ATC ATC AGC TGG GGT GAC GGC TGC GGG CGG CTC CAC AAG CCG GGG 288 Gly Ile Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg Leu His Lys Pro Gly 80 85 90 GTC TAC ACC CGC GTG GCC AAC TAT GTG GAC TGG AT GGATCC 329 Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp 95 100 105

【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：２０３３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 直接の起源：Pre-made Lambda phage Library、ヒト肝
臓（４９才、男）ｃＤＮＡ Library（Stratagene社製） 配列 ATGGGGCGCT GGGCCTGGGT CCCCAGCCCC TGGCCCCCAC CGGGGCTGGG CCCCTTCCTC 60 CTCCTCCTCC TGCTGCTGCT GCTGCTGCCA CGGGGGTTCC AGCCCCAGCC TGGCGGGAAC 120 CGTACGGAGT CCCCAGAACC TAATGCCACA GCGACCCCTG CGATCCCCAC TATCCTGGTG 180 ACCTCTGTGA CCTCTGAGAC CCCAGCAACA AGTGCTCCAG AGGCAGAGGG ACCCCAAAGT 240 GGGGGGCTCC CGCCCCCGCC CAGGGCAGTT CCCTCGAGCA GTAGCCCCCA GGCCCAAGCA 300 CTCACCGAGG ACGGGAGGCC CTGCAGGTTC CCCTTCCGCT ACGGGGGCCG CATGCTGCAT 360 GCCTGCACTT CGGAGGGCAG TGCACACAGG AAGTGGTGTG CCACAACTCA CAACTACGAC 420 CGGGACAGGG CCTGGGGCTA CTGTGTGGAG GCCACCCCGC CTCCAGGGGG CCCAGCTGCC 480 CTGGATCCCT GTGCCTCCGG CCCCTGCCTC AATGGAGGCT CCTGCTCCAA TACCCAGGAC 540 CCCCAGTCCT ATCACTGCAG CTGCCCCCGG GCCTTCACCG GCAAGGACTG CGGCACAGAG 600 AAATGCTTTG ATGAGACCCG CTACGAGTAC CTGGAGGGGG GCGACCGCTG GGCCCGCGTG 660 CGCCAGGGCC ACGTGGAACA GTGCGAGTGC TTCGGGGGCC GGACCTGGTG CGAAGGCACC 720 CGACATACAG CTTGTCTGAG CAGCCCTTGC CTGAACGGGG GCACCTGCCA CCTGATCGTG 780 GCCACCGGGA CCACCGTGTG TGCCTGCCCA CCAGGCTTCG CTGGACGGCT CTGCAACATC 840 GAGCCTGATG AGCGCTGCTT CTTGGGGAAC GGCACTGGGT ACCGTGGCGT GGCCAGCACC 900 TCAGCCTCGG GCCTCAGCTG CCTGGCCTGG AACTCCGATC TGCTCTACCA GGAGCTGCAC 960 GTGGACTCCG TGGGCGCCGC GGCCCTGCTG GGCCTGGGCC CCCATGCCTA CTGCCGGAAT 1020 CCGGACAATG ACGAGAGGCC CTGGTGCTAC GTGGTGAAGG ACAGCGCGCT CTCCTGGGAG 1080 TACTGCCGCC TGGAGGCCTG CGAATCCCTC ACCAGAGTCC AACTGTCACC GGATCTCCTG 1140 GCGACCCTGC CTGAGCCAGC CTCCCCGGGG CGCCAGGCCT GCGGCAGGAG GCACAAGAAG 1200 AGGACGTTCC TGCGGCCACG TATCATCGGC GGCTCCTCCT CGCTGCCCGG CTCGCACCCC 1260 TGGCTGGCCG CCATCTACAT CGGGGACAGC TTCTGCGCCG GGAGCCTGGT CCACACCTGC 1320 TGGGTGGTGT CGGCCGCCCA CTGCTTCTCC CACAGCCCCC CCAGGGACAG CGTCTCCGTG 1380 GTGCTGGGCC AGCACTTCTT CAACCGCACG ACGGACGTGA CGCAGACCTT CGGCATCGAG 1440 AAGTACATCC CGTACACCCT GTACTCGGTG TTCAACCCCA GCGACCACGA CCTCGTCCTG 1500 ATCCGGCTGA AGAAGAAAGG GGACCGCTGT GCCACACGCT CGCAGTTCGT GCAGCCCATC 1560 TGCCTGCCCG AGCCCGGCAG CACCTTCCCC GCAGGACACA AGTGCCAGAT TGCGGGCTGG 1620 GGCCACTTGG ATGAGAACGT GAGCGGCTAC TCCAGCTCCC TGCGGGAGGC CCTGGTCCCC 1680 CTGGTCGCCG ACCACAAGTG CAGCAGCCCT GAGGTCTACG GCGCCGACAT CAGCCCCAAC 1740 ATGCTCTGTG CCGGCTACTT CGACTGCAAG TCCGACGCCT GCCAGGGGGA CTCAGGGGGG 1800 CCCCTGGCCT GCGAGAAGAA CGGCGTGGCT TACCTCTACG GCATCATCAG CTGGGGTGAC 1860 GGCTGCGGGC GGCTCCACAA GCCGGGGGTC TACACCCGCG TGGCCAACTA TGTGGACTGG 1920 ATCAACGACC GGATACGGCC TCCCAGGCGG CTTGTGGCTC CCTCCTGACC CTCCAGCGGG 1980 ACACCCTGGT TCCCACCATT CCCTGCCTTG CTGACAATAA AGATATTTCC AAG 2033

【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 起源 生物名：ヒト 配列 CTCGGATCCC ARATNGCNGG NTGGGG 26 R : G or A, N : A, G, C or T

【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 起源 生物名：ヒト 配列 CTCGGATCCA TCCARTCNAC RTARTT 26 R : G or A, N : A, G, C or T

【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間フラグメント 起源 生物名：ヒト

【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間フラグメント 起源 生物名：ヒト

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を有することを特徴とするタンパク質。
2. 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列で
   表される核酸配列を部分配列として含有してなることを
   特徴とする請求項２記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号３に記載の塩基配列で
   表されることを特徴とする請求項２記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 プロモーターの下流に、請求項２記載の
   遺伝子を該遺伝子によってコードされるポリペプチドを
   発現するように組み込んだ発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載のベクターで宿主細胞を形
   質転換させて得られた形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培養して配
   列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるタン
   パク質を産生させる方法。