JP3127449B2

JP3127449B2 - 抗体の測定法

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Publication number: JP3127449B2
Application number: JP02162056A
Authority: JP
Inventors: 道雄伊藤; 實小倉; 英毅神野
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1989-07-28
Filing date: 1990-06-20
Publication date: 2001-01-22
Anticipated expiration: 2016-01-22
Also published as: JPH03128462A; US5583054A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、抗原・抗体反応により、特定の抗原に対す
る試料中の抗体の量及び抗体の免疫グロブリンクラスの
判別を決定する方法に関する。特に、医療診断の分野に
おける感染症や自己免疫疾患の鑑別診断ための血清検査
のごとく臨床検査法としての抗体測定法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］感染症や自己免疫疾患では、患者の血清中に疾患固有
の抗原に対する抗体が出現する。従来の臨床検査では単
に抗体の有無を調べていたが、近年病因や病態の詳細な
把握を目的として、抗体量の定量及び抗体の免疫グロブ
リンクラス（ヒトの場合、IgG,IgA,IgM,IgD,IgEの５種
類が存在する）の判別が注目されている。

例えば、感染症の診断の場合、該感染症の病原体に対
する抗体の存在からは単に過去の該感染症の既往の有無
しかわからないが、抗体量の変動や免疫グロブリンクラ
スを知ることにより、感染の時期や病勢の進行状況につ
いての手掛かりが得られる。具体的には、例えば「ウイ
ウス抗体測定結果の解釈」という題で「日本臨床」誌第
43巻・秋季臨時増刊号下巻第27頁（昭和60年）に紹介さ
れているように、風疹の診断においてはIgM抗体の検出
が必要である。

測定する免疫グロブリンクラスは同じでも、多種の抗
原のうちどの抗原と反応するのかを調べる場合もある。
例えばアレルギー疾患の診断において重要となる免疫グ
ロブリンクラスはIgEであるが、起因物質であるアレル
ゲン種類の特定及び該アレルゲンと反応するIgE量を測
定するRAST法（放射性アレルゲン吸着試験）が有用な試
験法として実施されている。

従来この分野において、特に定量的測定法として主導
的役割を果たしてきたのはRIA及びEIAである。RIA,EIA
は高感度で定量が可能なばかりでなく、調べようとする
抗体の免疫グロブリンクラスをも判別可能なため診断的
意義には高いものがあるが、抗原と反応した抗体を分
離、洗浄しなければならず、操作が面倒で時間がかかる
欠点がある。また、分離、洗浄等試料を扱う操作が多い
と試料からの感染の危険も無視できない。加えてRIAに
は放射性廃棄物問題、特殊設備の必要性など取り扱い上
難点が多い。EIAには標識別として酵素を用いる関係
上、反応時間や温度の管理が厳しい、妨害反応の影響を
受け易いといった弱点がある。

臨床検査分野における主な抗体測定技術として、上記
RIA及びEIAのほかに、受身血球凝集法、ラテックス凝集
法が挙げられるが、これらは判定が定性に限られ免疫グ
ロブリンクラス判別ができない、検出感度が比較的低い
等の欠点がある。こうした欠点を一部改良するものとし
て、抗原担持磁性粒体及び抗グロブリン抗体担持血球を
用いる抗体の免疫グロブリンクラス別検出法が開示され
ている（特開昭60−177265号公報）。

上記のような凝集法を用いて特定の抗原に対する抗体
クラスの判別・定量を行うためには、該抗原担持担体粒
子と試料中の該抗原反応性の抗体との反応の結果生ずる
凝集量を測定する必要がある。この際、該抗原担持担体
粒子のみによる抗体の凝集、また、試料血清中に大量に
存在する、該抗原とは非結合性の免疫グロブリンによっ
ても、抗体の免疫グロブリンクラスに対する特異性を持
つ物質を担持した粒子どうしの凝集がおこり得るため、
まず抗原担持担体粒子と試料を反応させ、その反応物を
分離・洗浄して該抗原とは非結合性の免疫グロブリンを
除いた後、免疫グロブリンクラスに対する特異性を持つ
物質を担持した不溶性担体粒子を反応させるといった、
操作上最も面倒な洗浄・再懸濁工程が依然必須であるこ
と、判定までの所要時間が長いこと、検出感度がRIA,EI
Aに及ばないこと等の問題は未解決であった。

また、WO89/01161号公報には、モノクローナル抗体を
担持した磁性体含有粒子と検体中の抗原を反応させ、さ
らに抗体を担持した磁性体を含有しない不溶性担体粒子
を反応させた後、磁場を付与して未反応の磁性体含有粒
子と各粒子及び抗原から成る凝集塊を分離し、残存する
磁性体を含有しない抗体担持不溶性担体粒子の量を測定
し、その濁度の減少から被検体中の抗原を定量する方法
が開示されているが、抗体の免疫グロブリンクラスの判
別については全く記載されてなく、抗体量の測定かつ抗
体の免疫グロブリンクラスの判別が可能であり、さらに
短時間で処理できる高感度の測定法が望まれていた。

［問題点を解決するための手段］そこで本発明者らは、該抗原担持担体粒子と試料中の
該抗原反応性の抗体との反応の結果生ずる凝集量を直接
測定するのではなしに、該凝集物を分離した残りの未反
応分を測定することにより間接的に該反応を定量出来る
こと、免疫グロブリン分子（抗体クラス）に対する特異
性を持つ物質を磁性体含有担体とすることにより、該凝
集物の分離を容易に行い得ることに着目し、本発明の基
本構想を得た。更に実際に実験を重ねた結果、驚くべき
ことに、従来法では必須である、該抗原と試料中抗体と
の反応後の分離洗浄操作が、本法では省略しても充分目
的が達せられる事、従来法より短い所要時間で、しかも
EIAを上回る感度が可能であることを見出し本発明に到
達した。

即ち本発明の要旨は、特定の抗原に対する試料中の抗
体の量及び該抗体の免疫グロブリンクラスの別を、該抗
原を担持させた不溶性担体粒子と、免疫グロブリンと特
異的に反応する物質を担持させた不溶性担体粒子を用い
て測定する方法であって、不溶性担体粒子に該抗原を担
持させた物を第一試薬、免疫グロブリン分子と特異的に
反応し得る物質を磁性体含有粒子に担持させた物を第二
試薬とし、該抗原に対する抗体を含むと考えられる試料
を不溶性担体と反応させ、反応後の分離洗浄操作を行う
ことなく免疫グロブリンに特異的に反応する物質を担持
させた磁性体含有粒子を作用させ、試料中に存在した該
抗原に対する抗体を介して抗原担持不溶性担体粒子と磁
性体含有粒子を凝集させた後に、磁場を付与して磁性体
含有粒子及び磁性体含有粒子を含む凝集物を側方に集
め、磁性体含有粒子と凝集せずに残った未反応の抗原担
持不溶性担体粒子量を目視乃至は光学的に検知すること
により、試料溶液中の抗体量を測定すると共に、磁性体
含有粒子担持物質の特異性から試料中の該抗体の免疫グ
ロブリンクラスを知ることを特徴とする抗体測定法に存
する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明で言う「抗原」とは、人、或は動物に対し抗体
産生を惹起する能力のあるすべての物質のうち、例えば
診断等特別の目的の下に選択された単一或は複数の物
質、乃至はそれらを含有する混合物を指す。例えば感染
症の診断を目的とした場合のウイルスやバクテリア、乃
至はそれらの構成成分である特定のタンパク質や糖鎖等
が挙げられる。

抗原担持用の「不溶性担体粒子」としては例えば赤血
球などの細胞やゼラチン粒子、リポゾーム等のマイクロ
カプセル類、ポリビニルトルエン、ポリスチレン等のラ
テックス粒子のような有機高分子物質、カーボンブラッ
ク等の無機微粒子、または、各種金属及び金属化合物コ
ロイド粒子が用いられるが、光学的に測定する都合上反
応媒体中での分散性に優れ、容易に沈降しないものが好
ましい。

「免疫グロブリンと特異的に反応する物質」とは、Ig
G,IgA,IgM,IgD,IgEもしくはそれらの抗体軽鎖部分に対
する抗体、プロテインＡまたは補体成分の一種であるC1
q等のように、ある種の抗体分子の特徴を選択的に認識
して結合する能力を有する物質を言う。但し、該免疫グ
ロブリンそれ自身の持つ抗体活性に基づく反応物質、即
ち抗原として該免疫グロブリンと反応する物質はここに
含まない。

免疫グロブリンと特異的に反応する物質を担持させた
磁性体を含有する「不溶性担体粒子」としては、アガロ
ース、デキストラン及びカルボキシメチルセルロース等
の多糖類並びにゼラチン、重合化アルブミン等のタンパ
ク質及びタンパク質誘導体も用いられるが、より好まし
くはスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合
物および／またはメタクリル酸エステル誘導体等の重合
によって得られる合成高分子が用いられる。該不溶性担
体に担持させる「磁性体」としては、鉄及び四酸化三鉄
等の磁性酸化鉄、或はこれらと他の金属乃至は金属酸化
物との混合物及び合金であって残留磁気のないものが好
ましく、また、平均粒径は10〜200Åであることが好ま
しい。これらを５〜100重量％、さらに好ましくは15〜6
5重量％の割合で上記担体に含有させる。

上記不溶性担体粒子および磁性体含有粒子の平均粒径
は、0.1〜10μｍ、好ましくは0.2〜３μｍであるものが
用いられる。両粒子の組合せとしては不溶性担体粒子の
平均粒径が0.5〜３μｍのものと磁性体含有粒子の平均
粒径が0.2〜２μｍのものとの組合せ、好ましくは、不
溶性担体粒子の平均粒径が１〜2.5μｍのものと磁性体
含有粒子の平均粒径が0.5〜1.5μｍのものとの組合せが
用いられる。かかる粒子の平均粒径は、不溶性担体粒子
の平均粒径が小さすぎると単位重量あたりの表面積が大
きくなり抗原担持量が多くなって該不溶性担体粒子どう
しの凝集を引き起こしやくすなり、さらにこの凝集反応
は、検体成分の影響が少ない600〜1000nmの波長で測定
する場合、濁度の増加として検出されるため感度低下の
原因となるので好ましくない。この凝集反応は、磁性体
含有粒子の平均粒径が大きすぎる場合にも起り得る。ま
た、不溶性担体粒子の平均粒径が大きすぎると粒子の自
然沈降が早まり、磁性体含有粒子の平均粒径が小さすぎ
ると磁場による分離に時間がかかり、それぞれ実用的で
ない。

担体粒子に抗原あるいは免疫グロブリンクラスと特異
的に反応する物質を担持させる方法としては、物理吸
着、官能基を利用した共有結合何れでもよい。

担体粒子と担持させる物質の量比については特に制限
はないが、担持物質に対し重量比で５〜200倍量の担体
粒子を用いると、多くの場合良い結果が得られる。

抗原を担持させた不溶性担体粒子と、免疫グロブリン
クラスと特異的に反応する物質を担持させた磁性体含有
粒子は、該抗原に対する抗体を含むと考えられる試料溶
液と混合し反応させる。反応開始時の混合は十分に行う
必要があるが、均一に混合された後は混合を止め放置し
て反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応と同様
にpH5〜10、好ましくはpH7〜９にて行う。温度について
は、２〜50℃の範囲で実施可能であるが、望ましくは室
温乃至は37〜40℃で反応させる。反応時間は、反応直後
から１昼夜まで任意であるが、感度、操作性を考慮し
て、通常５〜60分の範囲で設定される。これらの反応条
件は、以降の工程についても同様である。

目的のpHを維持するために、通常緩衝液が用いられ
る。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン等が用いられるが、中性から弱
アルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用可能であ
る。多くの場合、非特異反応を避けるために、塩化ナト
リウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタンパク質が
添加される。

抗原担持不溶性担体粒子と試料、及び免疫グロブリン
と特異的に結合する物質を担持させた磁性体含有粒子を
混合すると、試料中に含まれる抗体が担体粒子表面上の
抗原に結合し、さらにこの抗原に結合した抗体と磁性体
含有粒子上に担持された物質とが結合することにより不
溶性担体粒子と磁性体含有粒子間の凝集が成立する。こ
の場合、不溶性担体粒子上に担持された抗原と試料中抗
体、或は試料中抗体と磁性体含有粒子上に担持された物
質のいずれの結合が先行しても、或は同時進行しても良
いが、抗原担持不溶性担体と試料中抗体を先ず反応させ
た後に免疫グロブリンクラスに特異的に反応する物質を
担持させた磁性体含有粒子を作用させた方が、その逆の
順序の場合に比べ、磁性体含有粒子の反応効率上昇によ
る感度向上が期待でき、より好ましい。

上記の抗原担持不溶性担体粒子と免疫グロブリンクラ
スと特異的に反応する物質を担持させた磁性体含有粒子
の使用割合は、1:20〜20:1、好ましくは1:4〜4:1の範囲
から選ばれる。この範囲を越えていずれかの粒子の割合
が多くなると、抗原担持不溶性担体粒子どうしの凝集、
あるいは、磁性体含有粒子どうしの凝集がおこり、感度
低下の原因となるので好ましくない。

抗原担持不溶性担体と試料中の抗体との反応では次の
２通りの場合が考えられる。

１）抗体１分子が２粒子と結合し凝集を起こす。

２）抗体１分子は１粒子とのみ反応し粒子間の凝集は起
こらない。

通常のラテックス凝集反応においては、１）の結果を
測定するので２）の反応が少ないほど好ましいが、本発
明では１）が少なく２）が多いほど望ましい。何故なら
１）の反応は抗体のクラスを問わず起こり得、光学的測
定に影響を与えるので、抗体クラス別定量の精度を低下
させる要因となるからである。

上記（１）の反応が少なく（２）の反応が多くなる具
体的な方法としては、物理吸着あるいは共有結合により不溶性担体粒子に抗
原を高密度に担持させる。

通常使用する不溶性担体の粒子径約0.1〜0.8μｍより
大きい約１μｍ以上、好ましくは、１〜2.5μｍの不溶
性担体を使用し、不溶性担体粒子１個あたりの抗原数を
増やす。

反応液中の不溶性担体粒子の濃度を低くしたり、粒径
が約１μｍ以上、好ましくは、１〜2.5μｍと大きく、
かつ粒子が自然沈降をおこさない程度の高比重の不溶性
担体粒子を使用する等により、粒子どうしの衝突（粒子
間の衝突確率）を減少させる。

しかしながらこうした精度低下要因も実用上差し支え
ない程度であれば良いのであって、事実、抗原担持不溶
性担体粒子の量、担持抗原量、粒径を適当に選択（好適
な例として、不溶性担体粒子の平均粒径を１〜2.5mと
し、かつ磁性体含有粒子の平均粒子を0.5〜1.5μｍと
し、さらに不溶性担体粒子と磁性体含有粒子の使用割合
を1:0.8〜２とすることが挙げられる。）することによ
り、１）の反応を相対的に抑制したり、あるいは１）の
反応は起こっても光学的測定結果への影響を最小限に抑
えることができる。

従って本発明は、その反応様式において２）のみに限
定されるものではなく、１）,2）いずれの場合も包含す
る。

磁場のかけ方に関しては、磁性体含有粒子及び磁性体
含有粒子を含む凝集物を５〜20分で分離できるような磁
場の強度及び反応系の形状が好ましい。分離に要する時
間が短すぎると、一般に感度、再現性の低下を招き、長
すぎると操作性を悪化させる。こうした理由から反応系
の大きさは比較的小さい法が扱い易い。96穴マイクロプ
レートなどは個々のウェルのサイズは小さく、ウェル間
の隙間に小磁石を置けば、マイクロプレートを利用した
EIAと同様にマイクロプレートリーダを用いて容易に定
量できるので本発明の実施に適した材料である。磁石と
しては、永久磁石、電磁石等を使用する。

磁場により磁性体含有粒子を分離すると、磁性体含有
粒子と凝集を起こした抗原担持担体粒子も一緒に分離さ
れるので、分離後の、未反応の抗原担持担体粒子を含む
反応溶液の濁度乃至は担体粒子量を測定することによ
り、該抗原と試料中の抗体との反応の度合いを容易に知
ることが出来る。即ち該抗原と試料中の抗体との反応が
強い程、濁度（吸光度）は小さくなる。

この際、磁性体含有粒子の一部が分離しきれずに残
り、未反応抗原担持担体粒子と共に測定に掛かる場合が
あるが、実用上問題のない程度であれば構わない。

光学的に検知する方法としては、最も単純には、照明
下黒色背景上で、抗原担持不溶性担体粒子残存量に応じ
た濁度の違いを直接肉眼で観測しても良いが、各種比色
計や濁度計を用いれば定量が可能である。測定光波長と
しては可視光または近赤外光相当の波長が、好ましくは
600〜1100nmが用いられる。さらにはレーザー光を用い
たフローサイトメトリー法等を適用して残存粒子数を直
接計測しても良い。

定量を行う場合は、予め該抗体濃度既知品を、或は抗
体基準品を試料として測定を行い、得られた定量値を試
料の抗体濃度に対して図示すれば該抗体の検量線が得ら
れるので、濃度未知試料の反応定量値から該抗体の濃度
が求められる。

［実施例］以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は以下に限定されるものではない。

〔実施例１〕抗カルジオリピン抗体の測定（試薬の調製法）１）カルジオリピン抗原担持炭末懸濁液の調製炭末（三菱化成社製サーマルカーボンMT、粒径0.3μ
ｍ）10mgを4mlのエタノールに懸濁し分散する。炭末は
沈澱、凝集し易いので適宜超音波処理して分散させる
（以降の工程も同様）。分散後遠心して炭末を沈澱さ
せ、上清を除去した所へ、カルジオリピン0.03％、レシ
チン0.03％、コレステロール0.9％、及びエタノール溶
液4mlを加え再分散させ、更に30分撹拌して均質化す
る。続いて0.1Mリン酸緩衝食塩液（以下、「PBS」と略
記する）（pH7.4）3.2mlを激しく撹拌している中へ、こ
の炭末懸濁液全量を手早く滴下し、更にPBS溶液16.4ml
を加え10分間激しく撹拌し続けることにより抗原を含む
脂溶性成分を炭末表面に吸着させる。吸着が完了したら
遠心し上清を除去して、塩化コリン10％を含むリン酸緩
衝液（pH7.4）20mlを添加し再分散して試薬とする。こ
うして出来た炭末懸濁液は、梅毒試薬の一種であるRPR
法（炭末凝集の肉眼判定による抗カルジオリピン抗体検
出法）用試薬としても、市販品と同等以上の感度を持
つ。

２）抗IgG、IgM抗体Ｆ（ab′）_２担持磁性体含有ラテッ
クスの調製家兎にヒトIgG、或はヒトIgMを免疫して得られた抗血
清をベンス・ジョーンズ蛋白（χ及びλ）により吸収
し、得られたIgG、IgMのＨ鎖特異的抗血清から常法によ
りIgG抗体画分を取り、ペプシンにて消化後、分子ふる
いカラムクロマトグラフィーにてＦ（ab′）_２を得る。
一方ローヌプーラン社製磁性体含有ラテックス（エスタ
ポールSML266、粒径0.7μｍ、10％）1mlを精製水19mlと
充分に混合の後、遠心分離（10000rpm、10分）して上清
を除き、洗浄ラテックスペレットとする。そこへ0.1Mト
リス塩酸緩衝液（pH8）（以下、「トリス緩衝液」と略
記する）10mlに、先に精製した抗IgG、乃至は抗IgM抗体
Ｆ（ab′）₂4mgを溶解した抗体溶液を加え再分散し、更
に１時間撹拌して磁性体含有ラテックス表面上にＦ（a
b′）_２を担持させる。再度遠心して上清を除き、0.3％
ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝液10mlにて再分
散、懸濁し安定化させた後、もう一度遠心して0.05％ア
ジ化ナトリウムを含むトリス緩衝液10ml中に懸濁し、４
〜10℃で保存する。

（操作方法） RPR法（前述）にて陽性（検出限界希釈倍率16倍）の
梅毒患者血清、及び対照として陰性の健常者血清を、0.
1％ウシ血清アルブミン及び0.9％食塩を含む0.1Mトリス
塩酸緩衝液（pH8.2）（以下、「TBS緩衝液」と略記す
る）にて20倍を始めとして２倍ずつ段階的に320倍まで
希釈系列を用意し、96穴マイクロプレートのウェルに各
希釈系列試料及び対照としてTBS緩衝液をそれぞれ100μ
を各２ウェルずつ分注する。そこへカルジオリピン抗
原担持炭末懸濁液をトリス緩衝液にて２倍希釈したもの
を50μずつ分注後、ただちにマイクロプレート側方を
軽く10秒ほど叩いて内容物を混合し、室温にて30分間放
置、反応させる。続いて抗IgG担持磁性体含有ラテック
ス及び抗IgM担持磁性体担持ラテックスをトリス緩衝液
にて８倍に希釈したものを、それぞれ50μずつ試料の
各希釈系列当たり１ウェルずつ分注し、同様に軽く叩い
て混合して10分間室温放置、反応させた後、3mmφの小
型棒磁石をマイクロプレート各ウェル外側面４方向から
10分間作用させて磁性体含有ラテックスを側方に集め
る。そして各ウェル内に磁性体含有ラテックスと凝集せ
ずに残った抗原担持炭末懸濁液の濁度を、マイクロプレ
ートリーダ（日本インターメッド社製、NJ−2000）を用
いて波長620nmにて定量した。

表１に結果を示す。

抗IgG、IgMいずれの抗体担持磁性体含有ラテックスと
も陽性血清希釈試料に対しては320倍希釈品でも反応
し、RPR法の感度を大幅に上回った。一方陰性試料とは
いずれの希釈倍率試料も反応を示さなかった。

〔実施例２〕リウマトイド因子の測定リウマトイド因子は慢性関節リウマチ患者血清中に見
出される抗ヒトIgG自己抗体で、他の動物IgG、特にウサ
ギIgGと交差反応する事が多い。リウマトイド因子の抗
体クラスはIgMが一般的だが、IgG,IgAも出現し、抗体ク
ラスと病因との関係が注目されている。

（試薬の調製法）１）ウサギIgG担持ラテックス試薬の調製ウサギγ−グロブリン（Fr II、IgGを70〜90％含む）
4mgをトリス緩衝液10mlに溶解し、同様にトリス緩衝液
にて調製した粒径2.02μのポリビニルトルエンラテック
ス（セラジェン社製）２％懸濁液と30分撹拌混合してラ
テックス表面にウサギγ−グロブリンを担持させる。遠
心分離後（10000rpm、10分）上清を除き、0.3％ウシ血
清アルブミン含有トリス緩衝液20mlを加え、撹拌30分に
て再分散し、更に超音波処理し分散度を高めラテックス
を安定化させる。引き続いて遠心分離の後、0.05％アジ
化ナトリウムを含むトリス緩衝液20mlに分散、懸濁して
４〜10℃にて保存する。

２）抗IgG、IgA、IgM抗体Ｆ（ab′）_２担持磁性体含有
ラテックスの調製法。

家兎にヒトIgG、ヒトIgA、或はヒトIgMを免疫して得
られた抗血清をベンス・ジョーンズ蛋白（χ及びλ）に
より吸収し、得られたIgG、IgA、IgMのＨ鎖特異的抗血
清から常法によりIgG抗体画分を取り、ペプシンにて消
化後、分子ふるいカラムクロマトグラフィーにてＦ（a
b′）_２を得る。一方ローヌプーラン社製磁性体含有ラ
テックス（エスタポールSML266、粒径0.7μｍ、10％）1
mlを精製水19mlと充分に混合の後、遠心分離（10000rp
m、10分）して上清を除き、洗浄ラテックスペレットと
する。そこへトリス緩衝液10mlに、先に調製した抗Ig
G、乃至は抗IgM抗体Ｆ（ab′）₂4mgを溶解した抗体溶液
を加え再分散し、更に１時間撹拌して磁性体含有ラテッ
クス表面上にＦ（ab′）_２を担持させる。再度遠心して
上清を除き、0.3％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩
衝液10mlにて再分散、懸濁し安定化させた後、もう一度
遠心して0.05％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝液10
mlに懸濁し、４〜10℃で保存する。

（操作方法）（１） RAHA法との比較 RAHA法（ウサギIgG感作ヒツジ赤血球凝集法によるリ
ウマトイド因子検出法）により力価検定済みのリウマチ
患者血清20検体を、0.1％ウシ血清アルブミン及びTBS緩
衝液にて100倍希釈したものを、マイクロプレートを用
意してIgG、IgA、IgM各クラス検出用に100μずつ３つ
のウェルに分注し、そこへウサギγ−グロブリン担持ラ
テックス懸濁液をトリス緩衝液にて８倍希釈したものを
50μずつ分注後、ただちにマイクロプレート側方を軽
く10秒ほど叩いて内容物を混合し、室温にて10分間放
置、反応させる。続いて抗IgG、乃至は抗IgA、抗IgM抗
体担持磁性体含有含有ラテックスをトリス緩衝液にて８
倍に希釈したものを、それぞれ50μづつ試料の各希釈
系列当たり１ウェルずつ分注し、同様に軽く叩いて混合
して10分間室温放置、反応させた後、3mmφの小型棒磁
石をマイクロプレート各ウェル外側面４方向から10分間
作用させて磁性体含有ラテックスを側方に集める。そし
て各ウェル内に磁性体含有ラテックスと凝集せずに残っ
たウサギ−γグロブリン担持ラテックス懸濁液の濁度
を、マイクロプレートリーダ（日本インターメッド社
製、NJ−2000）を用いて波長620nmにて定量し、RAHA法
による力価と比較した。表２に結果を示す。

概ねRAHA法のタイターが高いものほど反応する傾向に
あるが、特にIgMクラスとの相関が強い。

（２） EIA法との比較（１）の検討の結果、IgG、IgA、IgMいずれのクラス
のリウマトイド因子をも含む事が分かっている１検体を
選び、TBS緩衝液にて60倍から３倍希釈列で131220倍希
釈品までを調製して、（１）と同様に測定し、EIA法と
比較した。

EIA法は次のように行った。磁性体含有ラテックスに
担持させたものと同一の抗ヒトIgG、IgA、IgM Ｆ（a
b′）_２に向島の方法（「日本臨床」第37巻・夏期増刊
号第112頁（1979年））に従ってパーオキシダーゼ標識
した。マイクロプレートにPBS緩衝液溶解100μg/mlウサ
ギγ−グロブリンを吸着させ、更にウシ血清アルブミン
PBS緩衝液処理したものを固相として同一検体の20倍か
ら３倍希釈列で43740倍希釈品までを調製し、50μウ
ェルに分注、37℃で２時間反応させた。次にPBS緩衝液
でプレートを５回洗浄の後、上記標識抗体の1000〜2000
倍希釈品50μを分注し37℃、２時間反応させた。続い
て10回PBS緩衝液洗浄を行ってから、４−アミノアンチ
ピリンを発色剤として室温で30分反応後、前記マイクロ
プレートリーダを用いて490nmの波長にて測定した。

結果を第1,2,3図に示す。

EIA法では反応が強いほど吸光度が増大するので、検
体希釈倍率が高くなるに従って吸光度は減少するが、本
発明においては、反応は濁度の減少として測定されるの
で、検体希釈倍率が高くなり反応性が低下するほど濁度
は増加する。

EIA、本法とも最大吸光度変化量は約0.6であるので、
50％反応値に相当する。吸光度0.3に対応する検体希釈
倍率で比較すると、IgGで５倍、IgAで90倍、IgMで12
倍、EIAに比べ本法のほうが検出感度的に優れているこ
とが分かる。

［発明の効果］本発明の方法によれば、従来の方法では必須であった
分離・洗浄等の面倒な操作を行うことなく、安全で、し
かもRIAやEIAに優るとも劣らない高感度で、抗体の量の
測定、さらに免疫グロブリンクラスの判別を決定するこ
とが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、リウマチ患者血清検体希釈倍率とIgGクラス
リウマトイド因子反応性の関係について、本発明（●）
及びEIA法（○）で比較した図面である。反応性はそれ
ぞれの吸光度で示した。第２図及び第３図は、第１図と同様にして同一検体の、
それぞれIgA、IgMクラスリウマトイド因子の反応性につ
いて示した図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭55−156866（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−177265（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−38656（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 515 G01N 33/53 G01N 33/553

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】特定の抗原に対する試料中の抗体の量及び
該抗体の免疫グロブリンクラスの別を、該抗原を担持さ
せた不溶性担体粒子と、免疫グロブリンクラスと特異的
に反応する物質を担持させた不溶性担体粒子を用いて測
定する方法であって、不溶性担体粒子に該抗原を担持さ
せた物を第一試薬、免疫グロブリンクラスと特異的に反
応し得る物質を磁性体含有粒子に担持させた物を第二試
薬とし、該抗原に対する抗体を含むと考えられる試料を
不溶性担体と反応させ、反応後の分離洗浄操作を行うこ
となく免疫グロブリンに特異的に反応する物質を担持さ
せた磁性体含有粒子を作用させ、試料中に存在した該抗
原に対する抗体を介して抗原担持不溶性担体粒子と磁性
体含有粒子を凝集させた後に、磁場を付与して未反応の
磁性体含有粒子及び磁性体含有粒子を含む凝集物を側方
に集め、磁性体含有粒子と凝集せずに残った未反応の抗
原担持不溶性担体粒子量を目視乃至は光学的に検知する
ことにより、試料溶液中の抗体量を測定すると共に、磁
性体含有粒子担持物質の特異性から試料中の該抗体の免
疫グロブリンクラスを知ることを特徴とする抗体測定
法。
【請求項２】不溶性担体粒子が、細胞、ゼラチン粒子、
マイクロカプセル類、有機高分子物質、無機微粒子、ま
たは、金属及び金属化合物コロイド粒子であることを特
徴とする請求項（１）記載の抗体の測定法。
【請求項３】有機高分子物質がポリビニルトルエンまた
はポリスチレンであることを特徴とする請求項（２）記
載の抗体の測定法。
【請求項４】無機微粒子がカーボンブラックであること
を特徴とする請求項（２）記載の抗体の測定法。
【請求項５】免疫グロブリンクラスと特異的に反応し得
る物質が、IgG,IgA,IgM,Igd,IgEもしくはそれらの抗体
軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡまたはC1qである
ことを特徴とする請求項（１）記載の抗体の測定法。
【請求項６】磁性体含有粒子が多糖類、タンパク質およ
びタンパク質誘導体または合成高分子であることを特徴
とする請求項（１）記載の抗体の測定法。
【請求項７】合成高分子が芳香族ビニル化合物および／
またはメタクリル酸エステル誘導体の重合により得られ
ることを特徴とする請求項（６）記載の抗体の測定法。
【請求項８】磁性体含有粒子の磁性体が鉄または四酸化
三鉄であることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の
測定法。
【請求項９】磁性体含有粒子の磁性体の平均粒径が10〜
200Åであることを特徴とする請求項（１）記載の抗体
の測定法。
【請求項１０】磁性体含有粒子の磁性体含有量が５〜10
0重量％であることを特徴とする請求項（１）記載の抗
体の測定法。
【請求項１１】磁性体含有粒子の磁性体含有量が15〜65
重量％であることを特徴とする請求項（10）記載の抗体
の測定法。
【請求項１２】不溶性担体粒子および磁性体含有粒子の
平均粒径が0.1〜10μｍであることを特徴とする請求項
（１）記載の抗体の測定法。
【請求項１３】不溶性担体粒子および磁性体含有粒子の
平均粒径が0.2〜３μｍであることを特徴とする請求項
（12）記載の抗体の測定法。
【請求項１４】不溶性担体粒子の平均粒径が0.5〜３μ
ｍであり、かつ磁性体含有粒子の平均粒径が0.2〜２μ
ｍであることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の測
定法。
【請求項１５】不溶性担体粒子の平均粒径が１〜2.5μ
ｍであり、かつ磁性体含有粒子の平均粒径が0.5〜1.5μ
ｍであることを特徴とする請求項（14）記載の抗体の測
定法。
【請求項１６】不溶性担体粒子と磁性体含有粒子との使
用割合が1:20〜20:1であることを特徴とする請求項
（１）記載の抗体の測定法。
【請求項１７】不溶性担体粒子と磁性体含有粒子との使
用割合が1:4〜4:1であることを特徴とする請求項（16）
記載の抗体の測定法。
【請求項１８】不溶性担体粒子の平均粒径が１〜2.5μ
ｍであり、かつ磁性体含有粒子の平均粒径が0.5〜1.5μ
ｍであって、さらに不溶性担体粒子と磁性体含有粒子と
の使用割合が1:0.8〜２であることを特徴とする請求項
（１）記載の抗体の測定法。
【請求項１９】不溶性担体粒子及び磁性体含有粒子の各
担体粒子が担持させる物質に対し重量比で５〜200倍で
あることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の測定
法。