JP3085704B2

JP3085704B2 - ドロソフィラ細胞におけるｈｉｖ蛋白の発現

Info

Publication number: JP3085704B2
Application number: JP02500753A
Authority: JP
Inventors: ヨハンセン，ハンネ・ランチ; ローゼンバーグ，マーティン
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1989-11-29
Publication date: 2000-09-11
Anticipated expiration: 2015-09-11
Also published as: EP0446272A1; AU4755290A; CA2003794A1; WO1990006358A1; PT92477A; NO912099D0; AU630649B2; EP0446272A4; CA2003794C; KR910700344A; NO314090B1; DK175461B1; FI113475B; IL92470A0; IL92470A; KR0152525B1; NO912099L; JPH04501954A; DK104991A; DK104991D0

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、一般に、ドロソフィラ細胞におけるHIV蛋
白の発現および発現した遺伝子産生物の精製に関する。
さらに詳しくは、本発明は、この発現系による新規な変
異体gp160およびgp120遺伝子産生物の産生に関する。

発明の背景ヒト免疫不全ウイルス型１（HIV−１）は、AIDSとし
て公知の後天性免疫不全症候群の病因学的作用体であ
る。このレトロウイルスは、長末端繰返し構造（LTR
s）、gag、polおよびenv遺伝子、および他の遺伝子を含
む完全遺伝構造を有する。このレトロウイルスは、単独
でまたは協力して、保護免疫応答誘発能を有するワクチ
ン剤としての可能性のある多くのウイルス抗原を有す
る。

その中で、より有望なHIV−１抗原は、ウイルスエン
ベロープ糖蛋白（gp160）またはその特異フラグメント
である。env遺伝子はウイルスエンベロープの160キロダ
ルトン（kd）先駆糖蛋白をコードする。gp160は、翻訳
後、ウイルス表面に存する120kd糖蛋白（gp120）と41kd
糖蛋白（gp41）に分割される。

gp120、511アミノ酸糖蛋白は、gp160糖蛋白のアミノ
末端の３分の２に位置し、ウイルスの表面に暴露され
る。gp120はウイルスとその細胞レセプター、ヘルパーT
₄リンパ球、マクロファージおよび免疫系の他の細胞と
の相互作用に重要である。かくしてgp120はウイルス感
染の組織選択性を決定し、シンシチウム形成との関連を
介してHIVの細胞変性に関与している。

gp160のカルボキシル末端から誘導されるgp41、345ア
ミノ酸蛋白は、HIV−１の細胞膜内蛋白である。gp41は
細胞原形質膜の脂質二重層に蛋白を固定する一連の疎水
性アミノ酸を含有する。gp41のカルボキシル末端はウイ
ルス粒子に突き出ていると考えられている。gp41または
その一部は、細胞の表面で発現したHIV糖蛋白と表面T₄
レセプターを表示する細胞との融合の原因であると考え
られている。この融合の原因であると考えられているgp
41部はアミノ末端に位置する。かかる融合はウイルス複
製の役割を果たすと考えられている。例えば、エム・コ
ワルスキー（M.Kowalski）ら、サイエンス（Science）,
237:1351〜55（1987）；ディー・エム・ナイト（D.M.Kn
ight）ら、サイエンス、236:837〜36（1987）参照。

これらのウイルス糖蛋白は、ウイルス粒子の表面から
外部に突出しているウイルス性スパイクのような３次構
造をとる。約70〜80のスパイクが各新規合成ウイルス粒
子を結合していると考えられる。ウイルス粒子は年数を
経ると、スパイクが消滅するため、gp120とgp41の間の
関連が弱くなることは明らかである。かくして、新規合
成ウイルス粒子の場合、このウイルス糖蛋白スパイク
が、感染後の免疫系に対して影響を受けやすい最も直接
的な標的であると考えられる。

ウイルス中和抗体はgp120およびgp41エピトープに対
抗して定方向であると報告されている。特異中和抗体の
標的部位が、gp120糖蛋白分子の３′ハーフに位置する
ことが特に注目に値する。

したがって、HIV−１のenv遺伝子が多くの最近の研究
の標的となっている。体液および細胞の両方のこれら抗
原に対する免疫応答の誘発を報告したグループにより、
グリコシル化gp160の発現が、以前に、哺乳動物細胞お
よびある種のバキュロウイルス昆虫細胞にて得られた。
gp120をいくつかの系で異種プロモーターと組み合わせ
て使用して発現させた。例えば、エス・チャクラバルチ
（S.Chakrabarti）ら、ネイチャー（Nature）（Londo
n）,320:535（1986）；エス・アイ・フー（S.I.Hu）
ら、ネイチャー（London）,320:537（1986）；およびエ
ム・ピー・キエニー（M.P.Kieny）ら、バイオテクノロ
ジー（Biotechnology）,4:790（1986）参照。

エル・エイ・ラスキー（L.A.Lasky）らは、サイエン
ス（Science）,233:209〜212（1986）において、哺乳動
物細胞、特に、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）
細胞にトランスフェクションについてのenv遺伝子変異
体を含有する多くのプラスミドを構築した。これらは、
env蛋白のアミノ酸配列（＃61〜＃531）、HBsAgポリＡ
シグナル、DHFR遺伝子およびSV40の複製開始点に相にて
接合した糖蛋白（gD）蛋白の最初の50アミノ酸を含むプ
ラスミドにおいてコードされる遺伝子産生物を分泌し
た。組換体エンベロープ抗原はそのアミノ末端でgDの25
アミノ酸を有し、gp120から調製された変異体からの30
残基を欠き、さらにgp41配列を欠失して産生された。得
られた遺伝子は長さが520のアミノ酸であった。CHO細胞
にトランスフェクションした場合、細胞−調整上澄はgp
130と称される130kd蛋白を含有した。

近年の論文、エル・エイ・ラスキー（L.A.Lasky）
ら，セル（Cell）,50:975〜986（1987）は、gp120糖蛋
白とその細胞レセプター,CD₄の間の相互作用を論じてい
る。gp120のアミノ酸＃410〜421中に含まれる12アミノ
酸を欠失させることにより、完全な結合喪失が得られ
た。同様に、417位で１個のアミノ酸置換は結合の減少
をもたらした。

前記のコワルスキーらは、欠失および挿入突然変異を
HIV−１のHTLV−III_B株から誘導されるエンベロープ糖
蛋白をコードするプラスミドに導入した。さらに、該プ
ラスミドはart遺伝子を有した。tat遺伝子産生物を発現
する哺乳動物のCD4＋およびCD4−細胞株をトランスフェ
クション受容株として用い、形質変換された細胞の融合
する能力を研究した。

前記のナイトらは、哺乳動物細胞におけるHIVのart/t
rsトランスアクチベーター蛋白の発現を記載している。
これらHIV蛋白の発現に用いられる哺乳動物細胞株はCOS
−７サル細胞株であった。これらのプラスミドはプロモ
ーターとしてHIV LTRおよびSV40からのRNAプロセッシ
ングシグナルを用い、機能性メッセンジャーRNAとして
挿入DNAを発現した。gp120を発現するために、プラスミ
ドpENV160が開発され、それはHIV LTRに融合されるenv
遺伝子の完全なコード領域を有する。

エス・ダブリュ・パイル（S.W.Pyle）は、エイズ・レ
サーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルセス（Aids
Research and Human Retroviruses）,3（４）:387（19
87）において、イムノアフィニティクロマトグラフィー
によるHIV感染H9細胞の培養液からのgp120糖蛋白の精製
を開示している。

さらに米国特許第4725669号はヒトH9/HTLV−III細胞
株から得られる約160kdおよび120kdの糖蛋白を開示し、
それは各々、約90kdの非グリコシル化基を有する。

フォックス（Fox）は、バイオテクノロジー（Biotech
nology）,6:116（1988）において、MicroGeneSysにより
開発されたVAXSYN HIV−１ワクチンを報告している。
この報告はこのワクチンのいずれの細部も開示していな
い。

ディー・エル・ライン（D.L.Lynn）らは、「遺伝子発
現の調整機構」、Eds.Allan R.Liss Inc.,359〜368頁
（1988）において、バキュロウイルスであるオートグラ
ファカリフォルニカ（Autographacalifornica）のポリ
ヘドロンプロモーターのビハインドの完全gp160遺伝子
のクローニングを開示している。これらの組換体ウイル
スで感染された昆虫細胞は、細胞溶解によって細胞から
放出される蛋白を発現する。gp160との該蛋白共移入はg
p120およびgp41に分裂せず、グリコシル化され、細胞膜
に付着する。Ｎ−グリカナーゼで脱グリコシル化する
と、該蛋白は約96kdの分子量を有した。該組換体蛋白
は、HIV感染H9細胞からの蛋白と、gp120の組換体フラク
ションに対する抗血清と、gp120そのものと、gp41のペ
プチドフラグメントと、ヒトAIDS血清と免疫反応性であ
った。

アール・エル・ウィリー（R.L.Willey）らは、プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシス・オブ・ユー・エス・エイ（Proc.Na
t'l Acad.Sci.,USA）,83:5038（1986）において、gp120
蛋白におけるアミノ酸の超可変部を論じている。最近の
報告、アール・エル・ウィリーらのジャーナル・オブ・
バイロロジー（J.Virol.）,62（１）:139（1988）は、
感染性に必要なenv遺伝子内の領域を研究した。特に、g
p120遺伝子内の４つのＮ−結合グリコシル化部位のAsp
コドンでのアミノ酸置換が開示されている。

ダブリュ・アール・ガラハー（W.R.Gallagher）は、
セル,50:327（1987）において、HIVの膜内外蛋白gp41の
融合ペプチド配列を開示している。

エス・ディー・プトニー（S.D.Putney）らは、サイエ
ンス,234:1392（1986）において、HIV env遺伝子のイー
・コリー産生フラグメントに対する中和抗体の産生を開
示している。

ビー・ジェイ・ボンド（B.L.Bond）らは、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.）,6（６）:2080（1986）において、ドロソフィラ・
メラノガスター（Drosophila melanogaster）アクチン5
C遺伝子の構築を開示している。該報告はアクチン5C遺
伝子の２つのトランスクリプション出発部位およびディ
ー・メラノガスター宿主細胞に挿入された細菌クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子とプロ
モーター配列の間の融合を開示している。

ピー・ジェイ・バー（P.J.Barr）らは、ワクチン（Va
ccine）,5:90（1987）において、酵母サッカロミセス・
セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のHIV蛋白
の発現を開示している。

エッチ・ヨハンセン（H.Johansen）ら、第28回アニュ
アル・ドロソフィラ・コンファレンス（28th Annual Dr
osophila Conference）,p.41（1987）は、主に、ドロソ
フィラ・メタロチオネイン・プロモーターによって調整
されたイー・コリーgalK遺伝子がドロソフィラ細胞株に
て発現されたことを示す要約である。

エイ・ヴァンデルストラテン（A.Vanderstraten）ら
の、日本、ユニバーシティー・オブ・トーキョー・プレ
ス（1987）の無脊椎動物および魚組織培養における第７
回国際会議の会報、要約、およびエイ・ヴァンデルスト
ラテンらの「無脊椎動物および魚組織培養」、東京、日
本科学学会、ワイ・クロダら編、131〜134頁（1988）
は、培養中、ディー・メラノガスター細胞の外来性遺伝
子の発現において用いるヒグロマイシンＢ選択系を開示
している出版物である。該要約は該系を共導入に用い、
イー・コリー・ga1K遺伝子および哺乳動物オリジンの他
の遺伝子を過剰発現することに着目している。

かくして、当該分野において、ワクチンおよび診断薬
として使用するHIV蛋白の高濃度産生に対する要望がな
お残っている。

発明の要約第１の態様において、本発明は、所望の蛋白について
のDNAコーディング配列およびドロソフィラ細胞内での
蛋白コーディング配列の転写およびその後の翻訳に必要
な調節配列からなるHIV env遺伝子発現ユニットを提供
する。

関連態様において、本発明は本発明の遺伝子発現ユニ
ットからなるDNAベクターを提供する。

もう一つの関連態様において、本発明は本発明のDNA
ベクターでトランスフェクションしたドロソフィラ細胞
を提供する。

さらなる関連態様において、本発明はHIV env蛋白ま
たは本発明のトランスフェクションした昆虫細胞で産生
されるその誘導体を提供する。該誘導体はアミノ酸の欠
失、付加、置換または再配列またはその化学修飾のよう
な、野性型HIV env蛋白における抗体によって認識され
る能力を保持するいずれのHIV env蛋白も包含する。

別の態様において、本発明は免疫保護量および非毒性
量の本発明によって産生されたHIV env蛋白からなる、H
IV感染に対する保護を刺激するワクチンを提供する。

さらに本発明は、本発明のドロソフィラ細胞産生HIV
蛋白を有する、生物流体試料中のHIV感染の存在を検出
するのに有用な診断薬を提供する。加えて、本発明のen
v蛋白は、CD₄またはその誘導体のようなHIV結合蛋白ま
たは蛋白様物質の同定または単離に用いることができ
る。

本発明はまた、HIV env蛋白またはその免疫原性誘導
体の調製方法に関する。該方法は、細胞の培養に適した
培地中、HIV env遺伝子発現ユニットでトランスフェク
ションしたドロソフィラ細胞を培養することを包含す
る。該適当な培地中にて培養したトランスフェクション
細胞は問題の蛋白を発現する能力を有する。その後、該
蛋白を細胞または細胞培地から収集することができる。

本発明はさらに、マチュアgp120にて、さらにまたgp1
60非プロセス細胞間蛋白内に存するエピトープと反応す
るモノクローナル抗体に結合するHIV蛋白またはそのフ
ラグメントを精製する方法を提供する。この種の抗体の
うち、マウスモノクローナル抗体を178.1と称する。

本発明の他の態様および詳細を以下の記載にて開示す
る：発明の詳説本発明の方法および発現系は、ドロソフィラ細胞構造
における高水準のHIV蛋白、特にgp120、gp160およびそ
の誘導体の産生を促進す。外来性DNAまたは宿主細胞に
悪影響を及ぼすことなく、外来性DNAを宿主細胞に導入
させる標準クローニング技法を用いることによって該ド
ロソフィラ細胞をトランスフェクションする。そのよう
に構築した組換体ドロソフィラ細胞はHIV蛋白を産生す
る。

HIV蛋白が感染昆虫細胞の細胞溶解によってのみ得ら
れる従来のバキュロウイルス系とは対照的に、本発明の
方法は、HIV蛋白に関する連続細胞発現系を提供する。
分泌後、従来技法を用いて培地から精製することによっ
て蛋白を得ることができる。また、蛋白は細胞間または
膜結合で得られるかもしれない。該蛋白は従来方法を用
いて細胞から抽出してもよい。さらには、膜結合蛋白は
種々の細胞関連検定を用いてもよい。

本発明の実施に用いる好ましいドロソフィラ細胞株
は、ディー・メラノガスターS₂株である。S₂細胞［シュ
ナイダー（Schneider），ジャーナル・オブ・エンブリ
オロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルホロジー
（J.Embryol.Exp.Morph.）27:353（1972）］は、多倍数
胚ドロソフィラ細胞の安定細胞培養体である。DNAトラ
ンスフェクション技法によるドロソフィラS₂細胞中への
gp160またはそのサブユニットgp120またはgp41またはそ
の誘導体用のcDNAコーディング配列の導入は、意外にも
大量の糖蛋白を産生する。S₂ドロソフィラ細胞の使用
は、室温にて高密度まで増殖するその能力を含み、しか
しそれに限定されることなく、多くの利点を有する。該
選択系の安定な組込みは、細胞染色体中に1000コピーま
でのトランスフェクションした遺伝子発現ユニットを産
生した。

他のドロソフィラ細胞媒体系もまた本発明において有
用である。おそらく有用な細胞は、例えば、無血清細胞
株であるKC−Ｏドロソフィラ・メラノガスター（Drosop
hila Melanogaster）細胞株［シュルツ（Schultz）ら，
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシス・オブ・ユー・エス・エイ,83:94
28（1986）］である。KC−Ｏ株を用いる予備研究は、ト
ランスフェクションはS₂細胞の場合よりもより困難であ
ることを示唆している。有用であるかもしれない別の細
胞株は、ドロソフィラ・ハイダイ（Drosophila hydei）
からの細胞株である。該ハイダイ細胞株を用いて蛋白発
現を得ることができる；しかしながら、この細胞株への
トランスフェクションは非常に低い効率で発現されるト
ランスフェクションしたDNAをもたらしうる［シンクレ
イアー（Sinclair）ら、モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,5:3208（198
5）］。本発明にて用いることのできる他の利用可能な
ドロソフィラ細胞株はS₁およびS₃を包含する。

本発明の使用に選択されるドロソフィラ細胞は、例え
ば、M₃培地を包含する種々の適当な培地にて培養するこ
とができる。M₃培地は、pH6.6での平衡塩と必須アミノ
酸の処方からなる。該培地の調製法は、実質的にリンド
クイスト（Lindquist）,DIS,58:163（1982）に記載され
ている。ドロソフィラ細胞の増殖用の他の通常の培地も
また用いることができる。

本発明によれば、HIV蛋白遺伝子発現ユニットを含む
組換体DNA分子またはベクターを用い、選択したドロソ
フィラ細胞をトランスフェクションすることができる。
遺伝子発現ユニットは、選択したHIV蛋白用またはその
誘導体用のDNAコーディング配列を有する。かかる誘導
体は、伝統的遺伝子処理法、例えば、変異誘発、制限エ
ンドヌクレアーゼ処理、合成配列を含む他の遺伝子配列
の連結を用いて遺伝子配列を操作することにより得るこ
とができる。例えば、ティー・マニアティス（T.Maniat
is）ら、ニューヨーク，コールド・スプリング・ハーバ
ー，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，
モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニ
ュアル（1982）参照。

HIV DNAコーディング配列が最近公表された。ラトナ
ー（Ratner）ら、ネイチャー,313:277〜284（1985）ま
たはワイン−ホブソン（Wain−Hobson）ら、セル,40:9
〜17（1985）参照。ヌクレオチド配列もまたGenBankか
ら入手可能である（クローンBH10,ラトナーら、前
掲）。

本発明のコーディング配列からなるDNA分子は、公知
方法を用いてHTLV−III感染細胞から誘導することがで
きる（ハン（Hahn）ら、ネイチャー,312:166〜169（198
4）、または別法として標準オリゴヌクレオチド技法に
より合成することができる。さらには、広く入手可能な
クローン化DNAコーディング配列を有する多くの組換体
宿主細胞がある。

ついで、該誘導体はDNA合成法を包含する標準技法に
より調製することができる。かかる誘導体は、例えば、
蛋白の結合能力または生物特性に有意な悪影響を及ぼす
ことなく、１またはそれ以上のアミノ酸が置換され、付
加されまたは欠失したgp120またはgp160分子を包含す
る。これら蛋白の誘導体はまた、標準化学修飾法、例え
ば、アシル化、メチル化により調製してもよい。

さらに遺伝子発現ユニットは、HIV蛋白コーディング
配列の転写およびその後の宿主細胞における翻訳および
発現に必要であるかまたは望ましい調節領域からなる。
該調節領域は、代表的には、RNAポリメラーゼ結合にお
いて、RNA転写の開始において作用するプロモーター領
域を有する。該プロモーター領域は、代表的には、HIV
蛋白コーディング配列より上流にて見いだされている。

好ましいプロモーターはドロソフィラ起源のもの、例
えば、ドロソフィラ・メタロチオネイン・プロモーター
である［ラストフスキー−ペリー（Lastowski−Perry）
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）,260:1527（1985）］。この誘導性プ
ロモーターは、金属、例えば、CuSO₄の存在下にて遺伝
子の高水準転写を示す。ドロソフィラ・メタロチオネイ
ン・プロモーターの使用は、該発明の発現系において非
常に高いコピー数においてさえ十分な調節の保持が得ら
れる。これは、該金属の調節効果がコピー数が増加する
につれて減少する哺乳動物細胞における哺乳動物メタロ
チオネイン・プロモーターの使用と全く対照的である。
ドロソフィラ発現系において、この保持した誘導効果は
高コピー数でのドロソフィラ細胞における遺伝子産生物
の発現を増加させる。

ドロソフィラアクチン5C遺伝子プロモーター［ビー・
ジェイ・ボンド（B.J.Bond）ら、モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,6:2080
（1986）］もまた望ましいプロモーター配列である。ア
クチン5Cプロモーターは構成プロモーターであり、金属
の付加を要しない。したがって、パーヒュージョン系の
ような大規模の生産系において用いるには、ドロソフィ
ラ・メタロチオネイン・プロモーターよりも該プロモー
ターが好適である。さらなる利点は、培地中にて高濃度
の銅が不在であることが、長期間、細胞のより活性な状
態を維持することである。

他の公知ドロソフィラ・プロモーターの例は、例え
ば、誘導熱衝撃（Hsp70）およびCOPIA LTRプロモーター
を包含する。SV40初期プロモーターは、ドロソフィラ・
メタロチオネイン・プロモーターよりも低水準の発現を
示す。例えば、鳥類のラウス肉腫ウイルス（Rous sarco
ma virus）LTRおよびシミアンウイルス（SV40初期プロ
モーター）を包含する細胞発現ベクターに通常用いられ
るプロモーターは、ドロソフィラ系にて低い機能および
発現を示す。

HIV蛋白用の望ましい遺伝子発現ユニットまたは発現
ベクターは、HIV蛋白コーディング配列を望ましいシグ
ナル配列に融合することにより構築してもよい。該シグ
ナル配列が宿主細胞からの蛋白の分泌に直接機能する。
かかるシグナル配列は組織プラスミノーゲン活性化因子
（tPA）の配列から誘導してもよい。他の利用可能なシ
グナル配列は、例えば、ヘルペス・シンプレッウスウイ
ルス遺伝子HSV−1 gDから誘導されるものを包含する
［ラスキー（Lasky）ら、サイエンス、前掲］。

HIV DNAコーディング配列が、ついでSV40初期ポリＡ
領域のようなポリアデニル化（ポリＡ）領域が続く。RN
A転写物のポリアデニル化にて機能するポリＡ領域が、
転写の安定化に役割を果たしていることは明らかであ
る。同様のポリＡ領域が、天然に存する種々の遺伝子か
ら誘導できる。ポリアデニル化および転写物安定化機能
が有意に悪影響を及ぼさないならば、この領域もまた修
飾し、その配列を変えることができる。

組換体DNA分子はまた、遺伝子選択マーカー、ならび
にHIV蛋白遺伝子機能を有していてもよい。該選択マー
カーは、トランスフェクションした宿主細胞において容
易に検出しうる表現型変化をもたらすいずれの遺伝子ま
たは遺伝子類とすることができる。かかる表現型変化
は、例えば、ヒグロマイシンＢ耐性についての遺伝子の
ような薬剤耐性とすることができる。

別法として、薬剤メトトレキセイト（methotrexate）
および原核生物のジヒドロホレートレダクターゼ（DHF
R）遺伝子を用いる選択系をドロソフィラ細胞で用いる
ことができる。該細胞の内因性真核生物のDHFRはメトト
レキセイトにより抑制される。したがって、メトトレキ
セイトに対して非感受性である原核生物のDHFRを含有す
るプラスミドで細胞をトランスフェクションし、メトト
レキセイトで選択することによって、原核生物DHFRでト
ランスフェクションし、発現する細胞のみが生存する。
形質転換した哺乳動物および細菌細胞のメトトレキセイ
ト選択と異なり、ドロソフィラ系において、最初に、高
コピー数のトランスフェクタントまでメトトレキセイト
を用いることができる。保護原核生物DHFR遺伝子を組み
入れた細胞のみが生存する。付随して、これらの細胞が
重要な遺伝子発現ユニットを有する。

本発明に従って得られる例示的プラスミドはpgp160△
32であり、それはgp160のＮ−末端32アミノ酸配列をtPA
の第１アミノ酸、セリンで置換しているgp160誘導体を
包含する。このプラスミドをさらに実施例１に記載す
る。

もう一つ別のかかるプラスミドベクターは、最初の32
アミノ酸をセリンで置換し、216アミノ酸のカルボキシ
ル欠失を含むgp160配列を有するpgp120F△32である。こ
のプラスミドもまた実施例１に記載する。

本発明の誘導体蛋白を示すさらにもう一つ別のプラス
ミドはpgp120△32であり、セリンで置換されるＮ−末端
での第１の32アミノ酸を減じたgp120の完全なコーディ
ング配列を有する。加えて、プラスミドpgp120△274
は、第１の274アミノ末端アミノ酸をtPAの第１のアミノ
酸、セリンで置換し、gp160のプロセッシング部位まで
のgp120の保持アミノ酸を有するgp120蛋白配列を含有す
る。これらのベクター構築を実施例１においてさらに詳
細に記載する。

いったん、HIV蛋白遺伝子発現ユニットを含有する組
換体DNA分子または発現ベクターが構築されたならば、
標準トランスフェクション技法を用いて選択されたドロ
ソフィラ細胞中にそれをトランスフェクションすること
ができる。かかる技法は当該分野における当業者にとっ
て公知であり、例えば、リン酸カルシウム共沈降、細胞
融合、エレクトロポレーション（electroporation）、
微量注入およびウイルス性トランスフェクションを包含
する。

本発明においては、２つのベクター系を用いて、ドロ
ソフィラ細胞中に所望のHIV蛋白または誘導体の遺伝子
発現ユニットおよび用いる選択系のコーディング領域を
共トランスフェクションすることができる。本発明の好
ましい具体例は、HIV蛋白発現ユニットを有するベクタ
ー、例えば、pgp120△32、およびヒグロマイシンＢ遺伝
子発現ユニットを含有するベクター、例えば、pCOHYGRO
を用いるHIV蛋白の調製である。pgp120△32は、ドロソ
フィラ・メタロチオネイン・プロモーターからなる発現
ユニット、gp120遺伝子の誘導体、およびSV40ポリＡ部
位を有する。gp120発現ユニットをpCOHYGROベクター系
と組み合わせ、ヒグロマイシンＢ耐性の選択についての
利点を極限まで高めることにより、S₂ドロソフィラ細胞
中においてgp120誘導体を得る。この系と共に、抗生物
質のヒグロマイシンＢを用い、トランスフェクションベ
クターを有するこれらの細胞を選択することができる。
この具体例についてのさらに完全な記載を実施例２に示
す。

もう一つ別の例として、ベクターpgp120△32およびpH
GCOからなる、DHFR遺伝子／メトトレキセイト選択系を
用いる発現系を用い、メトトレキセイト耐性細胞発現gp
120またはその誘導体を選択することができる。該ベク
ターpgp120△32は、プロモーターがドロソフィラ・メタ
ロチオネイン・プロモーターである、gp120遺伝子発現
ユニットとからなる。該pHGCOベクターはDHFR遺伝子発
現ユニットからなり、pgp120△32と一緒に共トランスフ
ェクションし、選択に必要なDHFR遺伝子を提供する。ド
ロソフィラ細胞の共トランスフェクションで選択可能な
マーカーが、参考のためにここに挙げる1987年５月８日
付けのヨハンセン（Johansen）らの米国特許出願第07/0
47736号に記載されている。

本発明によれば、ウィグラー（Wigler）ら、セル,16:
777（1979）に記載されている方法を用いて、該２つの
ベクターをS₂ドロソフィラ細胞に共トランスフェクショ
ンする。該ベクターを所望の個々のコピー数に依存する
種々の割合にて共トランスフェクションする。ついで、
該トランスフェクション細胞を、例えば、血清および適
当な選択剤、例えば、ヒグロマイシンＢまたはメトトレ
キセイト含有のM₃培地中にて選択する。

いったん適当なベクターが構築され、選択ドロソフィ
ラ細胞株中にトランスフェクションされた場合、gp120
の発現は誘発性プロモーター用の適当な誘発剤を添加す
ることにより誘発される。例えば、カルシウムまたは銅
がメタロチオネインプロモーターの誘発剤である。熱が
Hsp70プロモーターの誘発剤である。アクチン5Cプロモ
ーターのような構成プロモーターの場合、いずれの誘発
剤も発現に必要としない。

前記系におけるHIV蛋白コーディング配列の転写およ
び発現はモニター観察することができる。例えば、サザ
ンブロット分析を用い、gp120遺伝子のコピー数を測定
することができる。ノザンブロット検定は転写遺伝子配
列の大きさに関する知見を提供する［例えば、マニアテ
ィス（Maniatis）ら、前記、参照］。転写水準もまた定
量することができる。組換体細胞における選択HIV蛋白
の発現は、得られた糖蛋白についてのウエスタンブロッ
ト分析および活性試験を介して証明することができる
［実施例５参照］。

ドロソフィラS₂細胞が、特に、本発明の方法における
蛋白の高収率産生に適している。該細胞は室温（24±１
℃）で懸濁培養中に維持しうる。培地は、５〜10％（v/
v）熱不活性化胎児ウシ血清（FBS）を補足したM₃であ
る。本発明の好ましい具体例において、培地は５％FBS
を有する。誘導後、細胞を不血清培地にて培養する。pC
OHYGROベクター系を用いる場合、該培地をさらに300μg
/mlのヒグロマイシンＢで補足する。この培地におい
て、S₂細胞を、例えば、250ml〜2000mlのスピナーフラ
スコ中、50〜60rpmで撹拌しながら、懸濁培養中にて増
殖させることができる。細胞密度を、一般的には、1ml
当たり10⁶〜10⁷細胞に維持する。本発明の１具体例にお
いて、細胞を誘導前に、５％血清含有の培地中、1500ml
スピナーフラスコにて増殖させる。

細胞培養後、HIV蛋白を消費培地から、例えば、モノ
クローナル抗体アフィニティーカラムを使用することに
より単離することができる。他の公知蛋白精製工程、例
えば、金属キレート、種々のアフィニティークロマトグ
ラフィー工程または吸着クロマトグラフィーを用い、培
地からHIV蛋白を精製することができる。遺伝子産生物
を直接培地中に分泌する細胞株S₂の使用は、本発明の重
要な特徴である。培地への直接分泌は、効果的な１工程
精製系の利用を可能とする。HIV蛋白に対して定方向の
モノクローナル抗体カラムを用いる場合、消費培地を直
接該カラムに加え、リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）中
の1.5M KSCNを用いて該蛋白を溶出することができる。

本発明のHIV蛋白の大規模の効果的産生を容易にする
好ましい精製方法は、gp160中に存在する、およびマチ
ュア分泌gp120蛋白中に存在するエピトープに対して定
方向のモノクローナル抗体を含有するイムノアフィニテ
ィーカラムを用いる。かかるモノクローナル抗体は、１
以上の構造にて蛋白配列を認識する能力を有しているた
め好ましい。これらの特性を有し、種々のHIV蛋白、そ
の誘導体またはフラグメントのイムノアフィニティーカ
ラムにおいて有用な抗体を178.1を称する。このモノク
ローナル抗体を実施例３においてさらに詳細に記載す
る。該発明のこのようなカラムは、pH、温度等の適当な
従来条件下、178.1の特性を有する抗体をセファデック
ス（Sephadex）のような従来の吸着担体と組み合わせる
ことによって製造してもよい。かかる精製カラムおよび
操作を用い、本発明のHIV蛋白およびフラグメントを分
離することができる。

この精製方法において、他のモノクローナル抗体を用
いることができる。HIV蛋白、特に、gp160またはgp120
に対する結合能を有する種々のモノクローナル抗体が当
該分野において開示されており、入手可能である。本発
明にて有用な他の新規モノクローナル抗体は、現在の常
法に従って開発することができる。

本発明によれば、ドロソフィラ細胞によって産生され
る糖蛋白は、完全に汚染物質、例えば、哺乳動物酵母、
細菌、さらに重要なのは、他のHIVウイルス性物質を有
していない。さらに、ドロソフィラ産生HIV蛋白は、他
の系、例えば、哺乳動物系によって報告されているもの
と異なる型のグリコシル化を有していることが示されて
いる。

本発明に従って得られたHIV蛋白および誘導体は、種
々の生成物において有用である。例えば、これら組換体
蛋白を、HIV感染患者の治療用の医薬組成物に用いても
よい。本発明によれば、かかる医薬組成物は、治療上有
効量の本発明のHIV蛋白または誘導体を医薬上許容され
る担体と混合してなる。該組成物は、非経口的、静脈内
的または皮下的のいずれかにより全身的に投与すること
ができる。全身投与する場合、本発明にて用いる治療組
成物は、パイロジェン不含の非経口的に許容される水溶
液の形態である。pH、等張性、安定性等を充分に考慮し
た、かかる非経口的に許容される蛋白溶液調製は、当該
分野における技術範囲内にある。

投与方法は、薬剤の作用を修飾する種々の因子、例え
ば、患者の症状、体重、性別および規定食、感染の重篤
度、投与期間および他の臨床因子を考慮して顧問医が決
定する。医薬処方の医薬担体および他の成分は当業者に
よって選択される。

加えて、本発明の組換体蛋白をワクチン成分として用
い、HIV感染の予防に哺乳動物患者に接種してもよい。
これらの蛋白は、単独でまたは他の組換体蛋白または治
療学上のワクチン剤と一緒に用いてもよい。かかるワク
チンの成分は当該分野における当業者によって決定され
る。

最後に、本発明の蛋白は、HIV感染の存在の検出用の
診断薬または血液、血清、唾液等のような生物流体にお
けるHIV感染に対する抗体として用いることができる。
さらに、該発明のこれらの蛋白を、生物流体および組織
におけるHIV−結合蛋白または他のHIV−結合物質、例え
ば、sCD4またはその誘導体の同定および／または単離す
る方法に用いることができる。したがって、該蛋白はか
かる方法を実施するための構成要素である。HIV−結合
物質を同定するには、本発明の蛋白とHIV−結合物質の
間の結合を促進する条件下、該蛋白を該物質または該物
質含有の不純混合物と接触させて用いる。結合の存在を
検出する従来の検定、例えば、放射能濃度等の検出もま
た該方法の一つである。したがって、蛋白と結合物質の
間の結合の存在はHIV結合の存在を示唆している。

同様に、混合物からHIV−結合物質を単離する方法に
おいて、結合事象を従来の操作に付し、混合物から本発
明の蛋白によって形成された結合存在物およびHIV−結
合物質を精製することができる。かかる診断系およびキ
ットの他の成分は、診断キットの従来成分であり、当業
者によって選択される。

以下の実施例は、本発明の例示的ベクターおよび形質
転換体の構築、好ましい精製系および糖蛋白gp120およ
びgp160の産生水準の測定検定を示す。これら実施例は
本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。

実質的には業者の指示に従って、制限酵素および他の
試薬を用いた。

実施例実施例1.ベクターの構築ａ）pMTtPA ドロソフィラの遺伝子発現用の基本ベクターとして、
tPA発現ベクターpMTtPA（別に、pDMtPAと称される）を
用いた。このベクターはベクターpML1、ポイゾン配列を
欠失したβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するスモールpB
R322ベクターの誘導体である［メロン（Mellon）ら、セ
ル（Cell）,27:297（1982）］。これらの配列はベクタ
ーの増幅に対して抑制的である。このベクターを小片の
pBR322を除去するSal1およびAat2で消化し、消化末端を
充填した。ついで、pBR322の欠失片を、末端−充填EcoR
1−Stu1フラグメントにおけるドロソフィラ・メタロチ
オネイン・プロモーター、つづいてtPAのシグナル配
列、プレペプチドおよび完全なコーディング領域を含有
するtPA配列を有するpDSPI［ディー・エス・プファー
（D.S.Pfarr）ら、DNA,4（６）:461（1985）］からの充
填Hind III−Sac1フラグメント含有カセットと置き換え
る。このフラグメント上にtPA遺伝子が、つづいてSV40
初期ポリアデニル化部位がある。

ｂ）pgp160△32 完全env遺伝子含有のHind III−Xba1フラグメントをH
IV−単離クローンBH10［エル・ラトナー（L.Ratner）
ら、前記;GenBank］から単離した。ついで、完全なgpl6
0配列をNco1−Xba1消化ベクターpDSP1に挿入した。得ら
れたベクター、SU2をNde1で消化し、ついで文豆ヌクレ
アーゼで処理し、その後Sac1で消化し、gp160遺伝子を
単離した。Nde1での消化は、アミノ酸＃32でgp160配列
を切断する。Sac1消化は、ポリリンカー含有のオリジナ
ルpDSP1ベクターの配列部を含む、gp160遺伝子の３′を
切断する。このフラグメントを、Bgl IIで消化した前記
発現ベクターpMTtPAに挿入し、末端−充填し、その後、
Sac1で切断し、マチュアtPA配列を欠失させる。該Bgl I
I部位はtPAの第１のアミノ酸に位置する。その結果、得
られたベクターpgp160△32は、gp160のＮ−末端32アミ
ノ酸をセリンで置換した修飾gp160蛋白をコードする。

ｃ）pgp120F△32 HIV−１表面糖蛋白gp160をコードする修飾遺伝子配列
含有の他のベクターを、pgp160△32をHind IIIおよびSa
c1で消化し、gp160のカルボキシル末端を除去すること
によって構築した。gp41をコードする配列の約３分の２
がこの消化により除去される。すなわち、このgp160配
列は、本来のgp160配列の最初の32アミノ酸および最後
の216アミノ酸を失っている。該欠失配列を、Hind III
−Sac1フラグメント上の停止コドンをコードするショー
ト合成リンカー配列と置き換えた。６−アミノ酸リンカ
ー配列は以下のとおりである：５′AGCTTTGACTGACTGAGCT3′ ｄ）pgp120△32 変異体gp160遺伝子含有のさらに別のベクターを、pgp
160△32をSty1およびXba1で消化し、蛋白gp41のすべて
の配列およびgp120糖蛋白配列のカルボキシル末端での
約30アミノ酸を欠失することにより構築した。このフラ
グメントを、Sty1部位からgp120−gp41のプロセッシン
グ部位までの適当なカルボキシル末端をコードする合成
Sty1−Xba1リンカー配列で置換した。この配列の後に停
止コドンがあった。その結果、この配列はgp120から最
初の32アミノ酸を減じたすべてのコーディング配列を有
し、gp41コーディング配列を全く有しなかった。

ｅ）pgp120△274 変異体gp120遺伝子含有のさらに別の例示的ベクター
を以下のように構築した:gp120の720塩基対カルボキシ
ル末端フラグメントを、pgp120△32をBgl IIで、ついで
Xba I消化で部分消化することにより単離した。このフ
ラグメントをtPA遺伝子の代わりにBgl II−Xba1切断pMT
tPA発現ベクターに挿入した。得られたベクターp120△2
74は、最初の274アミノ末端アミノ酸の代わりにtPAの最
初のアミノ酸、セリンを用いたgp120蛋白をコードす
る。

ｆ）pCOHYGRO BamH IおよびSma I部位含有の商業上入手可能なプラ
スミド、pUC18［BRL］を用いた。組入れCOPIA因子（357
塩基対）からの５′LTRをベクターpUC18のBamH I部位に
クローンし、pUCOPIAと称されるベクターを得た。COPIA
は、ドロソフィラゲノムから散乱することが判明した分
散中位反復配列の代表的なものである［ルビン（Rubi
n）ら、コールド・スプリング・ハーバー・シンプト・
クアント・バイオール（Cold Spring Harbor Symp.Quan
t.Biol.）,45:619（1980）］。ベクターpUCOPIAをSma I
部位で切断し、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼをコードするイー・コリー遺伝子（ヒグロマイシン
Ｂカセット）を、標準クローニング法を用いてpUCOPIA
にクローンした。該ヒグロマイシンＢカセットはベクタ
ーDSP−hygroから1481塩基対のHind III−BamH Iフラグ
メントにて単離した［ゲルツ（Gertz）ら、ジン（Gen
e）,25:179（1983）］。該ヒグロマイシンＢカセット
は、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子
をコードする配列およびSV40初期ポリＡ領域を有する。
Hind IIIおよびBamH I部位をT₄DNAポリメラーゼを用い
て充填し、ヒグロマイシンＢカセットをベクターpCOHYG
RO産生のベクターpUCOPIAのSma I部位に連結した。

実施例2.ドロソフィラS₂細胞へのトランスフェクション pCOHYGROを、前記のドロソフィラ・メタロチオネイン
・プロモーターの調節下、gp160変異体遺伝子を保持す
る１個のベクターと一緒にS₂ドロソフィラ細胞に共にト
ランスフェクションした。この実施例の目的に使用した
ベクターはpgp120△32である。トランスフェクション細
胞を、５％血清および300μg/mlのヒグロマイシンＢ含
有のM₃培地にて選択した。同一条件下で２〜３日後、非
トランスフェクション細胞は分割を停止し、死滅し始め
る。トランスフェクション培養にて安定した増殖ヒグロ
マイシンＢ耐性細胞を得るための選択期間は約２〜３週
間である。

種々のコピー数のgp120変異体遺伝子をその染色体中
に組み入れた培養体を得るために、２種のベクターの比
率を変えた。該実施例における比率は20:1であった。本
発明の他のgp160変異体ベクターに対して同様の比率を
用いた。この比率は、いずれのgp160変異体ベクターを
用いる場合でも同じである。

500μＭのCuSO₄でメタロチオネイン・プロモーターを
誘発した後、pgp120△32遺伝子産生物の発現を確認し
た。誘発細胞培養からの消費上澄のウエスタンプロット
分析は、約100kdにて単一帯を示した。

細胞上澄における変異体gp160遺伝子産生物の濃度
を、実施例４に記載のgp120ELISA検定を用い、標準体と
して精製したウイルスgp120を用いて測定した。５×10⁶
細胞/mlを血清不含のM₃培地に接種し、３〜４日間誘発
した。該上澄にて測定したgp120の濃度は約１〜2mg/
である。

250ml〜2000mlのスピナーフラスコ中、細胞を懸濁培
養として維持した。培地は300μg/mlのヒグロマイシン
Ｂを補足したM₃であった。培養体を24±１℃にてインキ
ュベートし、50〜60rpmで撹拌した。典型的には、ヒグ
ロマイシンＢを補足したM₃培地中、細胞密度を10⁶〜10⁷
細胞/mlに維持した。CuSO₄を500μＭの最終濃度まで加
え、修飾gp120糖蛋白を収集する前に、該培養体を血清
不含培地中にて３〜４日間増殖させた。

この方法に従って得られた蛋白は約100MWであり、発
現水準はいずれかの真核細胞系にて報告されている他の
いずれのgp120/gp160発現よりも高度であった。標準生
物活性検定において、前記のように発現した精製修飾gp
120は、組織培養にてウイルス感染を阻害する能力を有
し、T₄と結合し、gp120に対する抗体に反応する。

pgp120△32にてコードした蛋白フラグメントについて
の前記に例示した系および操作と実質的に同様の系およ
び操作を用いて、他のgp160およびgp120蛋白およびその
フラグメントを発現しうると考えられる。

実施例3.モノクローナル抗体 178.1 新規なモノクローナル抗体を用いるアフィニティー精
製カラムを、前記の変異体gp160/gp120蛋白に適用され
る精製系に用いた。このモノクローナル抗体は、細胞溶
解産生物中に存在する非変性HIV糖蛋白産生物および酵
母培養の上澄中に分泌されるようなマチュアgp120との
反応能を有することで特徴付けられる。非プロセスgp16
0組換体分子およびフルサイズのプロセスgp120蛋白の両
方に含まれるエピトープに対して特異的であるかかるモ
ノクローナル抗体の一つは、マウスモノクローナル抗体
178.1である。

シー・アルビカンス（C.albicans）のグリコアミラー
ゼプロモーターおよびシグナルペプチドを用いる発現系
を用い、部分的に精製した178.1産生用の酵母−組換体g
p160を得た。この酵母誘導gp160の産生は、共同で継続
中の1988年８月25日付けのブルック（Bruck）ら、米国
特許出願第07/236699号に記載されている。この出願を
参考のためにここに挙げる。

８週齢のBalb/cマウスに、４週間間隔で、フロイント
・アジュバント中の部分精製（1.5〜３％純度）酵母組
換体gp160を皮下内および腹腔内に３回注射した。３カ
月の休息期間後、１匹のマウスを殺し、その脾臓細胞と
骨髄腫細胞と融合させた「例えば、アール・ピー・シラ
ガニアン（R.P.Siraganian）ら、メト・エン（Meth.En
z.）,92:17（1983）;EMBO Course on Hybridoma Produ
ction,Basel Inst.for Immunol）（1980）参照］。用い
た骨髄腫細胞は、寒天培地における最適増殖用に予め選
択したSP₂/O−Ag14株のサブクローンである［ジェイ・
ディー・フランセン（J.D.Franssen）ら、Proc.XXIX Co
lloq.Protids Biol.Fluids）,29:645〜649（1981）］。
約10日後、捕獲抗体として市販の単特異性抗gp120試薬
［バイオコルム・セロメド・レフ（Biochorm,Seromed R
ef.D7324］を用い、捕獲ELISA法におけるスクリーニン
グにて摂取した。

簡単には、Nunc免疫プレートＩ（nr4−39454）を、５
μg/mlのヒツジ抗gp120IgGs/PBS溶液50μｌを用い、４
℃にて一夜コートした。該プレートを洗浄緩衝液（PBS,
0.1％ツウィーン20（Tween20））で洗浄し、37℃にて１
時間、浸潤緩衝液［PBS,4％新生子ウシ血清（Newborn C
alf Serum）、１％子ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1
％ツウィーン20］で浸潤させた。粗Molt₃/HTLV−III_Bま
たはMolt₃細胞溶解産物（PBS1ml当たり10⁷細胞、１％ト
リトンＸ−100）または組換体−酵母gp160の上澄フラク
ション（S2−30）（または同様に処理した陰性対照）50
μl/ウェルを抗原として用い、室温にて３〜５時間、該
プレートにてインキュベートした。該プレートを十分に
洗浄し、雑種細胞上澄50μｌを各ウェルに加え、４℃に
て一夜インキュベートした。洗浄工程後、浸潤緩衝液
中、ビオチニル化（biotinylated）抗マウスイムノグロ
ブリン（Igs）（Amersham Ref.RPN1021）の1/500希釈溶
液50μl/ウェルを、37℃にて１時間、該プレートにてイ
ンキュベートした。該プレートを再度洗浄し、浸潤緩衝
液中、ストレプタビジン（streptavidin）ビオチニル化
ホースラディッシュパーオキシダーゼ複合体（Amersham
Ref.RPN1051）の1/1000希釈溶液50μl/ウェルを各ウェ
ルに加えた。

さらに洗浄工程を行った後、0.4mg/mlのオルトフェニ
レンジアミンジヒドロクロリド（OPD,シグマ（Sigma）P
1526）および0.1％ツウィーン20を補足した１μl/mlのH
₂O₂（30％、クエン酸／クエン酸ナトリウム0.1M、pH5）
の溶液50μｌを各ウェルに加えた。ついで、該プレート
を、暗室中、室温にて20分間インキュベートし、2MH₂SO
₄50μl/ウェルを添加して反応を停止した。λ＝492nmで
の最適密度をモニター観察し、さらに、ピー・ヘリオン
（P.Herion）らのProc.XXIX Colloq.Protids Biol.Flui
ds,29:627（1981）に従って、50の陽性クローンをソフ
トアガロースにおけるサブクローニングで選択した。つ
いで、プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン）を腹腔内注射することにより予め処理したBalb/c
マウスの腹膜腔に、２〜５×10⁶個の雑種細胞を注射す
ることで、クローン化雑種細胞をin vivoにて増殖し
た。

前記操作より選択されたモノクローナル抗体は、ウエ
スタンブロット分析（WB）、ラジオイムノ沈降検定（RI
PA）、精製、ビオチン−標識および競合検定によって特
徴付けられた。得られたモノクローナル抗体はさらに、
種々の組換体および原生抗原に対する反応性を分析する
ことにより特徴付けられた。

高収率の雑種細胞がこの方法によって得られた。200
以上のウェルがスクリーニング検定において陽性であっ
た。しかしながら、それらのうち、50個のウェルのみを
選択し、クローニング後、該細胞は腹水酸（ascitic ac
id）にて発展した。該腹水流体のすべてをWBおよびRIPA
で試験した。試験した39個のモノクローナルのうち、37
個はRIPAにてgp160結合を示した。その同じ検定におい
ていずれもgp120フォームと反応しなかった。WBにてgp1
20に対して明らかに反応性であるが、RIPAにおいてはgp
160認識のみを示すモノクローナル抗体をサブクラスで
分析した。IgG2Aである３種のモノクローナルを蛋白Ａ
−セファロースカラムおよびビチオン標識において精製
した。抗原としてワクシニアgp160を用いる競合検定を
行い、得られた結果により、gp160蛋白で、少なくとも
５種の異なる群のエピトープ認識が明らかとなった。マ
チュアgp120および非プロセス細胞間gp160に存在するエ
ピトープにてモノクローナル178.1を選択した。

ウエスタンブロット（WB）分析を常法に従って行い、
178.1がHTLV−III_B感染のヒト細胞から単離したHIVウイ
ルス［Molt₃/HTLV−III_B］と結合する能力を有すること
を測定した。

ラジオイムノ沈降検定（RIPA）を、アール・ジェイ・
カンキ（R.J.Kanki）らのサイエンス,228:1199（1985）
の記載方法に従って行い、178.1がHTLV−IIIウイルス株
で感染したヒト細胞を免疫沈降させうることを測定し
た。

ラージパネルの抗原に対する非オーバーラップエピト
ープを認識するモノクローナル抗体の反応性を、捕獲試
薬としてヒツジ抗gp120を包含するサンドイッチELISAを
用いて検定した。組換体抗原を用い、RIPA、WBまたはEL
ISAにてHTLV−III_Bについて試験した場合、明らかに陽
性であったが、モノクローナル抗体178.1は、ディバー
ジェントHIV単離体、Molt₃/HTLV−III_B,H9/HTLV−III
^RF1およびHut78/ARV₂でのELISAにて陰性であった。この
モノクローナルは、gp160およびgp120の間で明らかに保
護されているエピトープを認識するため、以下の実施例
４に記載の精製方法を用いた場合、種々の構築のgp160/
gp120糖蛋白の生成において付加的な利点を提供する。

実施例4.ドロソフィラ−調整細胞培地からのgp120△32
の精製実施例２からの組換体gp120蛋白を以下のように精製
した:gp120△32含有のドロソフィラ−調整培地（CM）30
リットルを、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド
（PMSF）、10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）および
70カリクレイン抑制剤ユニットで調製した。CMをペリコ
ン（Pellicon）（ミリポール（Millipore））装置を用
い、0.45μｍのデュラポール（Durapore）膜を介して濾
過した。濾過したCMを、20mMの２−［Ｎ−モルホリノ］
エタンスルホン酸（MES）（pH6.0）含有の緩衝液Ａにて
平衡にした、Ｓ−セファロース・ファーストフォロー
（ファーマシア（Pharmacia））（5.1リットル;25.2cm
×11cm）に37ml/cm²・時の線状流速（LFR）で加えた。
すべてのCMを加えた後、該カラムを20mMのMES（pH6.
0）、0.4MのNaCl含有の緩衝液Ｂで１工程にて溶出し
た。

セファロース溶出のgp120△32を、10ml/cm²・時のLFR
で抗−gp120マウスモノクローナル−セファロース4Bカ
ラム（60ml;3.2cm×6.5cm）に加えた。このカラムを緩
衝液Ｂで平衡にした。ワン−ハーフＳ−セファロースプ
ールの適用後、該カラムを１カラム容量の緩衝液Ｂ、２
カラム容量の20mM MES（pH6.0）、1.0MのNaCl（緩衝液
Ｃ）、および２カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。gp12
0△32を0.1M酢酸、pH2.8で溶出し、フラクションを直ち
に0.1容量の1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Tris）、pH10.4を加えることにより中和した。

マウス抗−gp120モノクローナル抗体雑種細胞178.1を
前記の実施例３に従って産生した。この雑種細胞を２×
10⁵細胞/mlで接種し、4.5g/のグルコース、２μＭグ
ルタミンおよび10％血清を補足したヅルベッコ修飾イー
グル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）［ハゼ
ルトン・リサーチ・プロダクツ（Hazelton Research Pr
oducts）］にて４日間培養した。178.1抗体含有のCMを
濾過（0.2μｍ膜）し、0.1Mトリス、pH8.2にて平衡の蛋
白Ａ−セファロース（ファーマシア）（17ml;1.5cm×10
cm）に適用する。抗体を0.1Mクエン酸ナトリウム、pH3.
5で溶出し、直ちにトリスで中和した。

精製した抗gp120モノクローナル抗体を、製造業者の
指示に従い、2mg抗体/ml樹脂の密度で、98％のカップリ
ング効率でCNBr−活性化セファロース4B（ファーマシ
ア）に用い、抗−gp120−セファロース−アフィニティ
ー樹脂を得た。このアフィニティー樹脂は、特異的に、
抗体とgp120における独特構造のエピトープとの相互作
用を介してgp120蛋白と結合する。

この精製方法によれば、最終gp120蛋白産生物の純度
は、8.5mg/30リットルの調整培地の概算値で80〜90％で
ある。回収は25〜50％と概算する。

この精製方法およびアフィニティー樹脂はまた、この
エピトープを有する他のHIV蛋白またはそのフラグメン
トでも効果的であると考えられる。

実施例5.検定以下の検定は、gp120またはそのフラグメントの検出
用の酵素および基質を用いる非−同位元素検定であり、
それを本発明の方法および構成によって産生されるgp12
0蛋白の検出に用いる。

該検定において、gp120を検出する判断基準は、抗体
の特異性に依存している。0.1M炭酸ナトリウム緩衝液
（pH9.5）中にて２μg/mlに希釈した抗−gp120モノクロ
ーナル抗体［デュポン（DuPont）、Cat.No.9284］を用
い、gp120蛋白を捕獲する。この抗体希釈溶液100μｌ
を、対照のウェル以外、検定プレートにおける全く同一
の各ウェルに加える。該プレートを４℃にて一夜インキ
ュベートする。該抗体を翌日に洗い流し、PBS中、１％B
SAからなる遮断緩衝液300μｌを各ウェルに加えること
により、該プレートを室温にて１時間遮断した。

ウィルス性gp120標準体を、PBSおよび0.05％ツウィー
ン20からなる洗浄緩衝液中、１μg/ml、0.5μg/ml、0.2
5μg/ml、0.1μg/mlおよび0.2μg/mlに希釈した。該希
釈標準体100μｌを全く同一の各ウェルに加える。該プ
レートを室温にて２時間、プレート振盪器上にてインキ
ュベートし、その後、各プレートを洗浄緩衝液で４回洗
浄した。

各ウェルに、洗浄緩衝液中、1/1000に希釈したウサギ
抗−gp120抗体（デボウク（DeBouck）ら、1987年５月29
日付けの米国特許出願第07/056553号）100μｌを加え、
各々を振盪器上にて１時間インキュベートした。この第
２の抗体はgp120を２つの抗体の間にはさみこむ。その
後、該プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。この複合
体を検出するのに、第３の抗体、アジトを有さない洗浄
緩衝液にて希釈した、パーオキシダーゼ（POD）標識の
ヤギ抗−ウサギ抗体（大部分、IgGおよびIgM抗体）100
μｌを各ウェルに加える。ついで、該プレートを振盪器
上、室温にて２時間インキュベートした。

該プレートを４回洗浄した後、無色基質（緩衝液10ml
中、35％過酸化水素４μｌで、クエン酸塩緩衝液中、1m
g/mlのOPD）100μｌを加えた。基質をウェルに加える直
前に過酸化水素を加えた。このプレートを振盪器上にて
８分間インキュベートとし、0.1Mフッ化ナトリウム100
μｌを各ウェルに加えて反応を停止させた。パーオキシ
ダーゼ結合の存在下、該基質は深黄色に変わる。光学濃
度、または色相強度は捕獲gp120の量に比例し、それを4
50nmにてプレート読み取り機にて読み取り、算定した同
定試料濃度で標準曲線を作成する。上澄培養体における
gp120の量をこの標準曲線と比較することにより決定し
た。

前記記載およに実施例は、その好ましい具体例を含
め、本発明を十分に開示している。記載方法の修飾、例
えば、他の切形のgp160/gp120配列を用いることは、分
子遺伝学および関連科学の分野における当業者にとって
は明らかであり、以下の請求の範囲の範囲内とする意図
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ローゼンバーグ，マーティンアメリカ合衆国ペンシルベニア州19468、ロイヤースフォード、ミンゴ・ロード 241番 (56)参考文献Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．233（1986. Ｊｕｌｙ．11）ｐ．209−212 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ. ３［１］（1984）ｐ．165−173 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ. ２［７］（1983）ｐ．1099−1104 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．25（1983）ｐ. 179−188 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ. 18（1987）ｐ．243−256 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】gp120をコードするDNA配列およびgp160を
コードするDNA配列からなる群より選択されるHIV蛋白に
ついてのDNAコーディング配列と、培養ドロソフィラ細
胞内での該コーディング配列の転写および翻訳に必要な
調節要素を含む遺伝子発現ユニット。
【請求項２】調節要素がアクチン5Cプロモーターまたは
ドロソフィラ・メタロチオネイン・プロモーターを含む
請求項１記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項３】gp160遺伝子のＮ−末端32アミノ酸がセリ
ンで置換されている配列を有するpgp160△32、gp160遺
伝子のＮ−末端32アミノ酸が欠失し、セリンで置換され
ており、そのＣ−末端216アミノ酸が欠失し、６−アミ
ノ酸リンカー配列:AGCTTTGACTGACTGAGCTで置換されてい
るpgp120F△32、gp120の遺伝子の最初の32アミノ酸およ
びＣ−末端gp41コーディング配列が欠失している配列を
有するpgp120△32またはgp120のＮ−末端274アミノ酸が
欠失し、セリンで置換されているgp蛋白をコードする配
列を有するpgp120△274中に存在するHIV DNAコーディン
グ配列を含む請求項１記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項４】請求項１記載の遺伝子発現ユニットを含む
DNAベクター。
【請求項５】請求項４記載のベクターでトランスフェク
ションしたドロソフィラ細胞。
【請求項６】請求項５記載の昆虫細胞の培養にて産生さ
れるHIV gp120またはgp160蛋白。
【請求項７】HIVに対する抗体を刺激する組成物であっ
て、免疫原性であり、非毒性量の請求項６に記載の蛋白
を有してなる組成物。
【請求項８】請求項６記載の蛋白を含むヒト患者におけ
るHIV感染検出用診断薬。
【請求項９】gp120をコードするDNA配列およびgp160を
コードするDNA配列からなる群より選択されるHIV蛋白に
ついてのDNAコーディング配列と、培養ドロソフィラ細
胞内での該コーディング配列の転写および翻訳に必要な
調節要素を含む遺伝子発現ユニットでトランスフェクシ
ョンした、該蛋白を安定に発現可能なドロソフィラ細胞
を適当な培地にて培養することを含むドロソフィラ細胞
におけるHIV蛋白の産生方法。
【請求項１０】細胞を、ヒグロマイシンＢホスホトラン
スフェラーゼについてのコーディング配列を有する第１
のベクター、および遺伝子発現ユニットについてのコー
ディング配列を有する第２のベクターでトランスフェク
ションする請求項９記載の方法。
【請求項１１】第１のベクターが、組込みCOPIA因子か
ら由来の５′LTR、ヒグロマイシンＢホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子およびSV40初期ポルアデニル化領域を有
する、pCOHYGROである請求項10記載の方法。
【請求項１２】第２のベクターが、gp160遺伝子のＮ−
末端32アミノ酸がセリンで置換されている配列を有する
pgp160△32、gp160遺伝子のＮ−末端32アミノ酸が欠失
し、セリンで置換されており、そのＣ−末端216アミノ
酸が欠失し、６−アミノ酸リンカー配列:AGCTTTGACTGAC
TGAGCTで置換されているpgp120F△32、gp120遺伝子の最
初の32アミノ酸およびＣ−末端gp41コーディング配列が
欠失している配列を有するpgp120△32またはgp120のＮ
−末端274アミノ酸が欠失し、セリンで置換されているg
p蛋白をコードする配列を有するpgp120△274中に存在す
るHIV遺伝子発現ユニットを含む請求項10記載の方法。
【請求項１３】ドロソフィラ細胞がディー・メラノガス
ターS₂細胞である請求項９記載の方法。
【請求項１４】S₂細胞を、組込みCOPIA因子から由来の
５′LTR、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
遺伝子およびSV40初期ポリアデニル化領域を有する、ベ
クターpCOHYGROと、gp160遺伝子のＮ−末端32アミノ酸
がセリンで置換されている配列を有するpgp160△32、gp
160遺伝子のＮ−末端32アミノ酸が欠失し、セリンで置
換されており、そのＣ−末端216アミノ酸が欠失し、６
−アミノ酸リンカー配列:AGCTTTGACTGACTGAGCTで置換さ
れているpgp120F△32、gp120遺伝子の最初の32アミノ酸
およびＣ−末端gp41コーディング配列が欠失している配
列を有するpgp120△32またはgp120のＮ−末端274アミノ
酸が欠失し、セリンで置換されているgp蛋白をコードす
る配列を有するpgp120△274中に存在する遺伝子発現ユ
ニットを含むベクターで共トランスフェクションする請
求項13記載の方法。
【請求項１５】HIV結合物質をドロソフィラ細胞の培養
にて産生されるHIV gp120またはgp160蛋白と接触させ、
該物質と該蛋白との間の結合の存在を検定し、かかる結
合がHIVの結合を示すことを含むインビトロでのHIV結合
物質の同定方法。
【請求項１６】非変性gp160蛋白産生物およびマチュアg
p120蛋白に存在するエピトープと反応能を有するモノク
ローナル抗体を含有するアフィニティー樹脂を用いるこ
とを含む請求項６記載のHIV蛋白の精製方法。
【請求項１７】非変性gp160蛋白産生物およびマチュアg
p120蛋白に存在するエピトープと反応能を有するモノク
ローナル抗体を含有するアフィニティー樹脂を用いるこ
とを含む請求項９記載の方法によって産生されるHIV蛋
白の精製方法。