JP3085409B2 - Method for detecting target nucleic acid sequence and reagent kit therefor - Google Patents
Method for detecting target nucleic acid sequence and reagent kit thereforInfo
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Landscapes
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は標的核酸配列の検出方法
およびそのための試薬キットに関する。この発明は特
に、塩基配列が既知の核酸を、その初期に存在する量に
比較して、より大量に生成させることにより検体試料中
から検出する方法に関する。本発明を実施することによ
り遺伝病、癌、感染症などの診断を行うことが容易とな
る。The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid sequence and a reagent kit therefor. In particular, the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid having a known base sequence from a sample by generating a larger amount of the nucleic acid as compared with the amount existing in the initial stage. By practicing the present invention, it is easy to diagnose genetic diseases, cancers, infectious diseases, and the like.
【０００２】[0002]
【従来技術】近年、ハイブリダイゼーションによる核酸
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
のわずかな部分である場合があり、非放射性標識プロー
ブや末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチド
プローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりそ
の検出が困難である。そのため、プローブ検出システム
の感度を向上させるための努力が多くなされている（WO
87/03622など）。また、感度向上の手段として、目的と
する核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法
（特開昭61-274697 号公報；以下「PCR」と略すことが
ある）が開示された。しかしこの方法では、複雑な温度
の調節が必要であり、専用の機器を必要とするという欠
点がある。ＤＮＡリガーゼを用いる増幅法も開示されて
いる（WO89/12696、特開平2-2934号公報など）。しか
し、この方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を連結する
反応（blunt end ligation）により非特異的増幅が起こ
る。これの回避法として、WO89/12696では３組以上のプ
ローブを用いているが、プローブ数が多くコスト高とな
ってしまう欠点がある。また、ＲＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡよりＲＮＡが生成されることは周知であり、
ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸の増幅を行う方法も開
示されている（WO89/01050）。しかしながら、この方法
ではＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは充分な
増幅は困難である。したがって、生成したＲＮＡに再度
逆転写酵素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施し
ている。一方、目的とする核酸にプローブをハイブリダ
イズさせた後、正しくハイブリダイズしたプローブのみ
を増幅する方法（BIO/TECHNOLOGY vol.6, 1197,1988）
も知られている。しかしこの方法では、非特異反応によ
り結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇をき
たすという問題がある。2. Description of the Related Art In recent years, nucleic acid detection by hybridization has been widely used as an effective means for diagnosis of genetic diseases, cancers, infectious diseases and the like. In the nucleic acid detection method, the target base sequence may be a very small part of the nucleic acid of interest, and in the detection method using a non-radioactive labeled probe or an oligonucleotide probe labeled at the end with a radioisotope, Its detection is difficult due to sensitivity problems and the like. Therefore, many efforts have been made to improve the sensitivity of probe detection systems (WO
87/03622). Further, as a means for improving sensitivity, a method of amplifying a target nucleic acid with a DNA polymerase (JP-A-61-274697; sometimes abbreviated as "PCR" hereinafter) has been disclosed. However, this method has a drawback that complicated temperature control is required and a dedicated device is required. An amplification method using DNA ligase has also been disclosed (WO89 / 12696, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-2934, etc.). However, in this method, non-specific amplification occurs by a reaction in which DNA ligase ligates blunt ends (blunt end ligation). As a method for avoiding this, in WO89 / 12696, three or more sets of probes are used, but there is a disadvantage that the number of probes is large and the cost is high. It is well known that RNA is produced from DNA using RNA polymerase,
A method for amplifying a nucleic acid using an RNA polymerase has also been disclosed (WO89 / 01050). However, in this method, it is difficult to perform sufficient amplification only by transcription amplification using RNA polymerase. Therefore, an operation is performed in which reverse transcriptase acts on the generated RNA again to generate DNA. On the other hand, a method in which a probe is hybridized to a target nucleic acid and then only the probe that has hybridized correctly is amplified (BIO / TECHNOLOGY vol. 6, 1197, 1988).
Is also known. However, this method has a problem that a probe bound by a non-specific reaction is also amplified, resulting in an increase in a blank value.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
となる核酸を簡単に増幅させることにより、目的である
核酸配列を検出する方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid sequence by simply amplifying a target nucleic acid.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるにいたった。即ち、本発明は検
体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果として環状
化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌ
クレオチド（Ｂ）と、少なくともこの直鎖状プローブヌ
クレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、標的核酸配列
（Ａ）に直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブリ
ダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環状
化し、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳
型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼと
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、鋳型と相補的
な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成さ
せ、生成した一本鎖核酸を測定することにより、検体試
料中の標的核酸配列を検出することを特徴とする標的核
酸配列の検出方法である。また本発明の核酸を検出する
ための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）
の存在の結果として環状化するように設計された配列を
有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プ
ローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有
するプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポ
リメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸および標識されたモ
ノヌクレオチドもしくは標識された核酸プローブを含む
標的核酸配列検出用試薬キットである。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve these problems, and as a result, by using nucleotides that can be circular only in the presence of a target nucleic acid as probes, the above problems can be solved. It was found that the present invention was completed, and completed the present invention. That is, the present invention provides a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least the linear probe nucleotide (B ), A linear probe nucleotide (B) is hybridized to the target nucleic acid sequence (A) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to Using the generated circular probe nucleotide (B ') as a template, a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C) are used to generate a single-stranded nucleic acid having a sequence repeating the sequence complementary to the template Measuring the generated single-stranded nucleic acid, thereby detecting the target nucleic acid sequence in the sample sample. It is a detection method. Further, the reagent kit for detecting a nucleic acid of the present invention comprises a target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample.
A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of: a primer nucleotide (C) having a sequence that is partially complementary to the linear probe nucleotide (B); This is a reagent kit for detecting a target nucleic acid sequence, comprising a linking means, a nucleic acid polymerase, a nucleotide triphosphate and a labeled mononucleotide or a labeled nucleic acid probe.
【０００５】本発明では、検出したい標的核酸配列とハ
イブリッドを形成することにより、リガーゼを用いて環
状化することが可能となるように設計された核酸分子を
使用し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラ
ーゼ反応により核酸配列を増幅させる。本発明における
標的核酸配列（Ａ）は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較
的純粋な状態であっても、核酸の混合物の一成分であっ
てもよい。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造
等に特に制限されない。[0005] In the present invention, a nucleic acid molecule designed to form a hybrid with a target nucleic acid sequence to be detected so that it can be circularized using ligase is used. As a template, the nucleic acid sequence is amplified by a polymerase reaction. The target nucleic acid sequence (A) in the present invention may be single-stranded or double-stranded, may be in a relatively pure state, or may be a component of a mixture of nucleic acids. The sequence of the target nucleic acid according to the present invention is not particularly limited in length, structure and the like.
【０００６】本発明におけるプローブヌクレオチド
（Ｂ）とは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の
結果として環状化するように設計された配列を有する直
鎖状プローブヌクレオチドである（図１および図２のＢ
参照）。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’
末端は図２に示されるように、標的核酸配列とアニール
する部分を有する。該アニール部分は、それぞれ６〜４
０ヌクレオチド、好ましくは各々１０〜３０ヌクレオチ
ドの長さが使用される。５’末端と３’末端に位置する
上記アニール部分間を結ぶ配列の長さは一般的に１〜１
０００個、好ましくは１０〜１００個のヌクレオチドで
あればよい。また、この領域にＲＮＡポリメラーゼのア
ンチプロモーター配列を含ませることも可能である。こ
のＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター配列を持っ
たプローブヌクレオチドを用いた場合、プライマーヌク
レオチドとしてＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
を持つオリゴヌクレオチドを用いることにより、プロモ
ーターに応じたＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレ
オチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を作用させ
れば、プローブヌクレオチドの相補鎖が繰り返し並んだ
ＲＮＡを合成することが可能である。[0006] The probe nucleotide (B) in the present invention is a linear probe nucleotide having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample (Fig. 1). And B in FIG.
reference). 5 'end and 3' of probe nucleotide (B)
The ends have a portion that anneals to the target nucleic acid sequence, as shown in FIG. The annealed portions are 6 to 4 respectively.
A length of 0 nucleotides, preferably 10-30 nucleotides each, is used. The length of the sequence connecting the above-mentioned annealed portions located at the 5 'end and the 3' end is generally 1-1.
000, preferably 10 to 100 nucleotides. It is also possible to include an RNA polymerase anti-promoter sequence in this region. When a probe nucleotide having an anti-promoter sequence of this RNA polymerase is used, by using an oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase as a primer nucleotide, RNA polymerase and ribonucleotides (ATP, CTP, GTP) corresponding to the promoter can be used. , UTP), it is possible to synthesize RNA in which complementary strands of probe nucleotides are repeatedly arranged.
【０００７】本発明のプライマーヌクレオチド（Ｃ）
は、プローブヌクレオチド（Ｂ）と少なくとも部分的に
相補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限さ
れない。長さは一般的には、６〜４０ヌクレオチド、好
ましくは１０〜３０ヌクレオチドが使用される。また、
プローブヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのアンチプ
ロモーター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチ
ドにプロモーター配列を含ませたものを使用することが
可能である。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ）および
（Ｃ）は、例えばＡＢＩ社（Applied Biosystems In
c.）のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホア
ミダイト法により合成できる。他にもリン酸トリエステ
ル法、H-ホスホネート法、チオホスファイト法等いかな
る方法で合成してもよい。また、生物学的起源、例えば
制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離してもよい。プ
ローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端にはリン酸基を付
加しておくことが好ましい。リン酸基の付加は、例えば
ＡＴＰの存在下で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによ
り行うことができる。The primer nucleotide (C) of the present invention
Is not limited in structure, length, etc., as long as it has a sequence at least partially complementary to the probe nucleotide (B). In general, a length of 6 to 40 nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides is used. Also,
When the probe nucleotide contains an RNA polymerase anti-promoter sequence, a primer nucleotide containing a promoter sequence can be used. These oligonucleotides (B) and (C) are available, for example, from ABI (Applied Biosystems In
It can be synthesized by the phosphoramidite method using the DNA synthesizer 391 of c.). Alternatively, it may be synthesized by any method such as the phosphoric acid triester method, the H-phosphonate method, and the thiophosphite method. It may also be isolated from biological sources, such as restriction endonuclease digests. It is preferable to add a phosphate group to the 5 'end of the probe nucleotide (B). The addition of a phosphate group can be performed, for example, by T4 polynucleotide kinase in the presence of ATP.
【０００８】本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、
ヘリカーゼ用活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、Ｄ
ＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である。（J.
Biol. Chem., 264, 8935, 1989）。他にも、Ｍ２ＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼなどが利用できる。[0008] The nucleic acid polymerase used in the present invention comprises:
If the nucleic acid polymerase has helicase activity, D
NA polymerase or RNA polymerase may be used. For example, if φ29 DNA polymerase is used, it is possible to synthesize a nucleic acid in which a sequence complementary to the template is repeatedly arranged using a circular nucleic acid molecule as a template. (J.
Biol. Chem., 264, 8935, 1989). In addition, M2DN
A polymerase, E. coli DNA polymerase, T7R
NA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6R
NA polymerase and the like can be used.
【０００９】本発明の標的核酸検出方法は、標的核酸配
列（Ａ）に上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハ
イブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）
を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ）
を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有す
る一本鎖核酸生成させ、生成した一本鎖核酸を測定する
ことにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。In the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention, the above-mentioned linear probe nucleotide (B) is hybridized to the target nucleic acid sequence (A) to obtain the linear probe nucleotide (B).
And using the generated cyclic probe nucleotide (B ′) as a template, the primer nucleotide (C)
Is used to generate a single-stranded nucleic acid having a repeated sequence of a sequence complementary to the template, and the generated single-stranded nucleic acid is measured to detect a target nucleic acid sequence in the specimen sample.
【００１０】本発明の標的核酸検出法としては、次のよ
うな実施形態が挙げられる。（１）検体試料中の標的核
酸配列（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計
された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）
と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド
（Ｃ）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うこと
を特徴とする標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッドのプローブヌクレオチド
（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。[0010] The method for detecting a target nucleic acid of the present invention includes the following embodiments. (1) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a sample sample
And a primer nucleic acid (C) having a sequence that is at least partially complementary to the linear probe nucleotide (B) and performing the following operations (a) to (f): How to detect the sequence. Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The primer nucleotide (c) is annealed with the hybrid probe nucleotide (B) generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Nucleic acid sequence using nucleic acid polymerase having helicase-like activity and primer nucleotide (C), using cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template in the presence of labeled mononucleotide Is amplified. Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１１】（２）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。(2) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a sample, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (f) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The target nucleic acid sequence (A) in the sample is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): in the presence of a labeled mononucleotide, using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template and a nucleic acid polymerase having a helicase-like activity and a primer nucleotide (c), using a nucleic acid sequence Is amplified. Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１２】（３）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
この直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補
的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。(3) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (e) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
A hybrid is formed with the target nucleic acid sequence (A) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): In the presence of a labeled mononucleotide, using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template and a nucleic acid polymerase having a helicase-like activity and a primer nucleotide (C), a nucleic acid sequence Is amplified. Operation (d): If necessary, the operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (c). Operation (e): Through the operations (a) to (d), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１３】（４）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
と標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。(4) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (f) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
And a target nucleic acid sequence (A) to form a hybrid. Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the adjacent linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): Anneal the primer nucleotide (C) with the cyclic probe nucleotide (B ′) generated in operation (b). Operation (d): Nucleic acid sequence using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C), using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (b) as a template in the presence of a labeled mononucleotide. Is amplified. Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１４】（５）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて環状ヌクレオチド（Ｂ’）にする。操作
（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅する。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回繰
り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(5) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (g) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The primer nucleotide (C) is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through the operations (a) to (e), a hybrid between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe is formed. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the sample is detected by measuring the amount of labeling of the hybridized labeled nucleic acid probe.
【００１５】（６）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(6) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to be circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a sample, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (g) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The target nucleic acid sequence (A) in the sample is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through the operations (a) to (e), a hybrid between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe is formed. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the sample is detected by measuring the amount of labeling of the hybridized labeled nucleic acid probe.
【００１６】（７）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも1回
繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｆ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(7) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to be circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (f) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
A hybrid is formed with the target nucleic acid sequence (A) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (b) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (d): If necessary, the operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (c). Operation (e): Through the operations (a) to (d), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (f): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
【００１７】（８）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(8) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to be circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a sample, and at least the linear probe nucleotide ( A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (g) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
Form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the adjacent linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): Anneal the primer nucleotide (C) with the cyclic probe nucleotide (B ′) generated in operation (b). Operation (d): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through the operations (a) to (e), a hybrid between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe is formed. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the sample is detected by measuring the amount of labeling of the hybridized labeled nucleic acid probe.
【００１８】本発明の上記実施様態（３）の理解のため
に、図２に本発明の原理を模式的に示す。この図２に基
づいて、以下本発明を説明する。尚、図中Ａは標的核
酸、Ｂは直鎖状ブローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化プ
ローブヌクレオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、Ｄ
は核酸ポリメラーゼ、Ｅは標識されたモノヌクレオチド
を示す。FIG. 2 schematically shows the principle of the present invention for understanding the above embodiment (3) of the present invention. The present invention will be described below with reference to FIG. In the figure, A is a target nucleic acid, B is a linear probe nucleotide, B 'is a circularized probe nucleotide, C is a primer nucleotide, D
Indicates a nucleic acid polymerase, and E indicates a labeled mononucleotide.
【００１９】操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド
（Ｂ）中の検出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列との
ハイブリッドを形成させる。同時に、または別々にプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド
（Ｂ）にアニールさせる（図２（ａ）参照）。標的核酸
（Ａ）が二重鎖の場合は加熱、アルカリ処理、酸処理な
どにより変性して一本鎖とする。加熱変性は例えば80〜
105℃で1〜5分間処理することで実施できる。アルカリ
処理は例えば、0.2〜1規定のＮａＯＨ存在下で、1〜30
分間処理し、等量のＨＣｌで中和して用いることができ
る。酸処理は例えば0.01〜1規定のＨＣｌ存在下で、1〜
30分処理しＮａＯＨで中和して用いることができる。他
の方法として酵素的に鎖分解を行なうこともできる。ア
ニールは、好ましくはプローブヌクレオチド（Ｂ）、お
よびプライマーヌクレオチド（Ｃ）について、それぞ
れ、最大のアニール選択性をもたらすように、選択され
た温度において行う。一般的には標的核酸（Ａ）とプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）、およびプローブヌクレオチド
（Ｂ）とプライマーヌクレオチド（Ｃ）がそれぞれ特異
的に結合し、且つミスマッチによる非特異的結合が最小
となるように、昇温させて行われる。Operation (a): A hybrid is formed between the detection sequence in the linear probe nucleotide (B) and the target sequence in the target nucleic acid (A). Simultaneously or separately, the primer nucleotide (C) is annealed to the probe nucleotide (B) (see FIG. 2 (a)). When the target nucleic acid (A) is a double strand, it is denatured by heating, alkali treatment, acid treatment, etc. to make it a single strand. Heat denaturation is 80 ~
It can be carried out by treating at 105 ° C. for 1 to 5 minutes. The alkali treatment is performed, for example, in the presence of 0.2 to 1N NaOH, 1 to 30.
Minutes, and neutralized with an equal amount of HCl. The acid treatment is performed, for example, in the presence of 0.01 to 1N HCl, 1 to 1
It can be used after treating for 30 minutes and neutralizing with NaOH. Alternatively, enzymatic chain degradation can be performed. Annealing is preferably performed at a temperature selected to provide maximum anneal selectivity for the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C), respectively. Generally, the target nucleic acid (A) and the probe nucleotide (B), and the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C) each specifically bind, and non-specific binding due to mismatch is minimized. This is performed by raising the temperature.
【００２０】操作（ｂ）：上記プローブヌクレオチド
（Ｂ）の５’末端と３’末端を連結させ環状化プローブ
ヌクレオチド（Ｂ’）とする（図２（ｂ）参照）。該プ
ローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハイ
ブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリ
ガーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡリガーゼ等の連
結酵素を使用する方法が好ましい。また互いに隣接して
いない場合、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写
酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結す
ることができる。この場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペア
のみ、またはＣ−Ｇペアのみで構成されるようにプロー
ブヌクレオチドを設計しておけば、添加するモノヌクレ
オチドをそれぞれＡ、ＴまたはＣ、Ｇのみとすることで
ミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチドが間
違って伸長されることを防止する方法もとることができ
る。連結酵素を使用する連結方法については、特開昭63
-22197号公報および WO90/01069に開示の方法等、公知
の手法により行うことができる。本発明において、標的
核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は６〜４０
ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドの長
さのものが使用される。Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the probe nucleotide (B) are linked to form a circularized probe nucleotide (B ′) (see FIG. 2 (b)). When the 5 ′ end and 3 ′ end of the probe nucleotide (B) are adjacent as a result of hybridization, a ligation enzyme such as T4 DNA ligase, T7 DNA ligase, E. coli DNA ligase, and Thermus thermophilus DNA ligase is used. The method is preferred. When they are not adjacent to each other, they can be ligated with a ligation enzyme after filling the gap with DNA polymerase and / or reverse transcriptase. In this case, if the probe nucleotide is designed so that the gap portion is composed of only the AT pair or only the CG pair, the added mononucleotides may be only A, T or C and G, respectively. To prevent the oligonucleotide annealed due to the mismatch from being extended by mistake. A ligation method using a ligation enzyme is described in
It can be carried out by a known method such as the method disclosed in JP-A-22-22197 and WO90 / 01069. In the present invention, the oligonucleotide portion that anneals to the target nucleic acid is 6 to 40.
Nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides in length, are used.
【００２１】操作（ｃ）：標識されたモノヌクレオチド
の存在下、操作（ｂ）で環状化したプローブヌクレオチ
ド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌクレオチド
（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオチド（Ｃ）
を利用して核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用いて核酸合成反
応を行う（図２（ｃ）参照）。該操作は、例えばｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種の
デオキシリボヌクレオチド）およびＤＮＡポリメラーゼ
（例えばφ29ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquaticus Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡポリ
メラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素）を用いて、上記
環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせること
によって行われる。この方法は、例えばジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology;56,341-361,1971.）に記載されている技術
及び条件を用いることができる。これらの酵素は、ＤＮ
Ａの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成
をすすめていくことができるので、当該操作に先だっ
て、必ずしも標的核酸（Ａ）と環状化プローブヌクレオ
チド（Ｂ’）を分離する必要はない。プライマー伸長物
は、標的配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操
作（ａ）における標的核酸（Ａ）と同様にプローブヌク
レオチド（Ｂ）の標的核酸として利用されうる。この一
連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便
に大量に得ることができる。また、プローブヌクレオチ
ド（Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ）にそれぞれア
ンチプロモーター配列、プロモーター配列が含まれてい
る場合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに
応じたＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。当該
操作は、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）の
４種のリボヌクレオチド）およびＲＮＡポリメラーゼ
（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメ
ラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなど）を用いて該環
状ヌクレオチドを鋳型にしてＲＮＡ合成反応を行わせる
ことにより行われる。ＲＮＡポリメラーゼ反応の結果と
して、プローブヌクレオチド（Ｂ）の相補鎖が繰り返し
並んだＲＮＡが合成されるが、このＲＮＡを鋳型として
逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡに
プライマーヌクレオチド（Ｃ）をアニールさせることに
より繰り返しＲＮＡポリメラーゼを作用させて大量にＲ
ＮＡを合成することも可能である。Operation (c): In the presence of a labeled mononucleotide, the probe nucleotide (B ') circularized in operation (b) was used as a template, and a primer nucleotide (C) annealed to the probe nucleotide (B') was used. )
The nucleic acid polymerase (D) is used to perform a nucleic acid synthesis reaction (see FIG. 2 (c)). The operation is performed by, for example, dNT
P (the four deoxyribonucleotides dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) and a DNA polymerase (eg, φ29 DNA polymerase, M2 DNA polymerase, T4 DNA polymerase, Thermus aquaticus D)
An extension reaction is carried out using the above-mentioned cyclic nucleotide as a template, using an enzyme having a high nucleic acid synthesis ability such as NA polymerase and Thermus thermophilus DNA polymerase. This method is described, for example, in Journal of Molecule Biology.
ar Biology; 56, 341-361, 1971.) can be used. These enzymes are DN
It is not necessary to separate the target nucleic acid (A) and the circularized probe nucleotide (B ′) prior to the operation, since the synthesis of the primer extension product can be promoted while removing the double-stranded portion of A. . Since the primer extension has a sequence homologous to the target sequence, the extension can be used as the target nucleic acid for the probe nucleotide (B) in the same manner as the target nucleic acid (A) in the operation (a). By repeating this series of operations, a specific sequence of the nucleic acid can be easily obtained in a large amount. When the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C) contain an antipromoter sequence and a promoter sequence, respectively, an RNA polymerase corresponding to the promoter can be used as the nucleic acid polymerase. This operation is performed by using NTP (ATP, CTP, GTP, UTP), four types of ribonucleotides) and RNA polymerase (eg, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, etc.) and using the cyclic nucleotide as a template to perform an RNA synthesis reaction. Is performed. As a result of the RNA polymerase reaction, RNA in which the complementary strand of the probe nucleotide (B) is repeatedly arranged is synthesized. Using this RNA as a template, cDNA is synthesized using reverse transcriptase, and the primer nucleotide (C) is added to the cDNA. By annealing RNA polymerase repeatedly to produce large amounts of R
It is also possible to synthesize NA.
【００２２】操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生
成した増幅核酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少
なくとも一回繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）の結果、生成した核酸
の標識量を測定する。Operation (d): If necessary, operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (c). Operation (e): The labeling amount of the nucleic acid generated as a result of the operations (a) to (d) is measured.
【００２３】また本発明の上記実施様態（７）の理解の
ために、図３に本発明の原理を模式的に示す。この図３
に基づいて、以下本発明を説明する。尚、図中Ａは標的
核酸、Ｂは直鎖状ブローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化
プローブヌクレオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、
Ｄは核酸ポリメラーゼ、Ｅは標識されたモノヌクレオチ
ドを示す。FIG. 3 schematically shows the principle of the present invention for understanding the above embodiment (7) of the present invention. This figure 3
Hereinafter, the present invention will be described based on. In the figure, A is a target nucleic acid, B is a linear probe nucleotide, B 'is a circularized probe nucleotide, C is a primer nucleotide,
D indicates a nucleic acid polymerase, and E indicates a labeled mononucleotide.
【００２４】操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド
（Ｂ）中の検出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列との
ハイブリッドを形成させる。同時に、または別々にプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド
（Ｂ）にアニールさせる（図３（ａ）参照）。標的核酸
（Ａ）が二重鎖の場合は加熱、アルカリ処理、酸処理な
どにより変性して一本鎖とする。加熱変性は例えば80〜
105℃で1〜5分間処理することで実施できる。アルカリ
処理は例えば、0.2〜1規定のＮａＯＨ存在下で、1〜30
分間処理し、等量のＨＣｌで中和して用いることができ
る。酸処理は例えば0.01〜1規定のＨＣｌ存在下で、1〜
30分処理しＮａＯＨで中和して用いることができる。他
の方法として酵素的に鎖分解を行なうこともできる。ア
ニールは、好ましくはプローブヌクレオチド（Ｂ）、お
よびプライマーヌクレオチド（Ｃ）について、それぞ
れ、最大のアニール選択性をもたらすように、選択され
た温度において行う。一般的には標的核酸（Ａ）とプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）、およびプローブヌクレオチド
（Ｂ）とプライマーヌクレオチド（Ｃ）がそれぞれ特異
的に結合し、且つミスマッチによる非特異的結合が最小
となるように、昇温させて行われる。Operation (a): A hybrid is formed between the detection sequence in the linear probe nucleotide (B) and the target sequence in the target nucleic acid (A). Simultaneously or separately, the primer nucleotide (C) is annealed to the probe nucleotide (B) (see FIG. 3 (a)). When the target nucleic acid (A) is a double strand, it is denatured by heating, alkali treatment, acid treatment, etc. to make it a single strand. Heat denaturation is 80 ~
It can be carried out by treating at 105 ° C. for 1 to 5 minutes. The alkali treatment is performed, for example, in the presence of 0.2 to 1N NaOH, 1 to 30.
Minutes, and neutralized with an equal amount of HCl. The acid treatment is performed, for example, in the presence of 0.01 to 1N HCl, 1 to 1
It can be used after treating for 30 minutes and neutralizing with NaOH. Alternatively, enzymatic chain degradation can be performed. Annealing is preferably performed at a temperature selected to provide maximum anneal selectivity for the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C), respectively. Generally, the target nucleic acid (A) and the probe nucleotide (B), and the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C) each specifically bind, and non-specific binding due to mismatch is minimized. This is performed by raising the temperature.
【００２５】操作（ｂ）：上記プローブヌクレオチド
（Ｂ）の５’'末端と３’末端を連結させ環状化プロー
ブヌクレオチド（Ｂ’）とする（図３（ｂ）参照）。該
プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハ
イブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli ）ＤＮＡ
リガーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡリガーゼ等の
連結酵素を使用する方法が好ましい。また互いに隣接し
ていない場合、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転
写酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結
することができる。この場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペ
アのみ、またはＣ−Ｇペアのみで構成されるようにプロ
ーブヌクレオチドを設計しておけば、添加するモノヌク
レオチドをそれぞれＡ、ＴまたはＣ、Ｇのみとすること
でミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチドが
間違って伸長されることを防止する方法もとることがで
きる。連結酵素を使用する連結方法については、特開昭
63-22197号公報および WO90/01069 に開示の方法等、公
知の手法により行うことができる。本発明において、標
的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は６〜４
０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドの
長さのものが使用される。Operation (b): The 5 ″ end and the 3 ′ end of the probe nucleotide (B) are linked to form a circularized probe nucleotide (B ′) (see FIG. 3 (b)). When the 5 ′ end and the 3 ′ end of the probe nucleotide (B) are adjacent as a result of hybridization, T4 DNA ligase, T7 DNA ligase, E. coli DNA
A method using a ligase such as ligase or Thermus thermophilus DNA ligase is preferred. When they are not adjacent to each other, they can be ligated with a ligation enzyme after filling the gap with DNA polymerase and / or reverse transcriptase. In this case, if the probe nucleotide is designed so that the gap portion is composed of only the AT pair or only the CG pair, the added mononucleotides may be only A, T or C and G, respectively. To prevent the oligonucleotide annealed due to the mismatch from being extended by mistake. Regarding a ligation method using a ligation enzyme,
It can be performed by a known method such as the method disclosed in JP-A-63-22197 and WO90 / 01069. In the present invention, the oligonucleotide portion that anneals to the target nucleic acid is 6 to 4
Those having a length of 0 nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides, are used.
【００２６】操作（ｃ）：操作（ｂ）で環状化したプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオ
チド（Ｃ）を利用して核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用いて
核酸合成反応を行う（図３（ｃ）参照）。該操作は、例
えばｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐの４種のデオキシリボヌクレオチド）およびＤＮＡポ
リメラーゼ（例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ２Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus
aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus thermophilus
ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素）を
用いて、上記環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を
行わせることによって行われる。この方法は、例えばジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journa
l of Molecular Biology;56,341-361,1971.）に記載さ
れている技術及び条件を用いることができる。これらの
酵素は、ＤＮＡの二重鎖の部分を剥しながらプライマー
伸長物の合成をすすめていくことができるので、当該操
作に先だって、必ずしも標的核酸（Ａ）と環状化プロー
ブヌクレオチド（Ｂ’）を分離する必要はない。プライ
マー伸長物は、標的配列と相同な配列を有するので、該
伸長物は操作（ａ）における標的核酸（Ａ）と同様にプ
ローブヌクレオチド（Ｂ）の標的核酸として利用されう
る。この一連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の
配列を簡便に大量に得ることができる。 また、プロー
ブヌクレオチド（Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ）
にそれぞれアンチプロモーター配列、プロモーター配列
が含まれている場合には、核酸ポリメラーゼとして、プ
ロモーターに応じたＲＮＡポリメラーゼを用いることが
できる。当該操作は、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＵＴＰ）の４種のリボヌクレオチド）およびＲＮＡ
ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３
ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなど）
を用いて該環状ヌクレオチドを鋳型にしてＲＮＡ合成反
応を行わせることにより行われる。ＲＮＡポリメラーゼ
反応の結果として、プローブヌクレオチド（Ｂ）の相補
鎖が繰り返し並んだＲＮＡが合成されるが、このＲＮＡ
を鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、こ
のｃＤＮＡにプライマーヌクレオチド（Ｃ）をアニール
させることにより繰り返しＲＮＡポリメラーゼを作用さ
せて大量にＲＮＡを合成することも可能である。Operation (c): The nucleic acid polymerase (D) is prepared by using the probe nucleotide (B ') circularized in the operation (b) as a template and the primer nucleotide (C) annealed to the probe nucleotide (B'). ) To perform a nucleic acid synthesis reaction (see FIG. 3 (c)). The operation includes, for example, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTT
P 4 deoxyribonucleotides) and a DNA polymerase (eg φ29 DNA polymerase, M2D
NA polymerase, T4 DNA polymerase, Thermus
aquaticus DNA polymerase, Thermus thermophilus
An extension reaction is performed using the above-mentioned cyclic nucleotide as a template by using an enzyme having a high nucleic acid synthesis ability such as DNA polymerase. This method is described, for example, in Journal of Molecular Biology (Journa
l of Molecular Biology; 56, 341-361, 1971.) can be used. Since these enzymes can promote the synthesis of primer extension products while stripping the double-stranded portion of DNA, the target nucleic acid (A) and the circularized probe nucleotide (B ′) are not necessarily converted before the operation. There is no need to separate. Since the primer extension has a sequence homologous to the target sequence, the extension can be used as the target nucleic acid for the probe nucleotide (B) in the same manner as the target nucleic acid (A) in the operation (a). By repeating this series of operations, a specific sequence of the nucleic acid can be easily obtained in a large amount. In addition, a probe nucleotide (B) and a primer nucleotide (C)
Contains an anti-promoter sequence and a promoter sequence, an RNA polymerase corresponding to the promoter can be used as the nucleic acid polymerase. The operation is performed by NTP (ATP, CTP, GT
P, UTP) and RNA
Polymerase (eg, T7 RNA polymerase, T3
RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, etc.)
And performing an RNA synthesis reaction using the cyclic nucleotide as a template. As a result of the RNA polymerase reaction, RNA in which the complementary strand of the probe nucleotide (B) is repeatedly arranged is synthesized.
Can be used as a template to synthesize a cDNA using reverse transcriptase, and by annealing the cDNA with a primer nucleotide (C), RNA polymerase can be repeatedly used to synthesize a large amount of RNA.
【００２７】操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生
成した増幅核酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少
なくとも一回繰り返す。Operation (d): If necessary, the operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (c).
【００２８】操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、
生成した核酸と標識された核酸プローブとのハイブリッ
ドを形成させる。Operation (e): Through operations (a) to (d),
A hybrid is formed between the generated nucleic acid and the labeled nucleic acid probe.
【００２９】操作（ｆ）：ハイブリッドを形成した標識
核酸プローブの標識量を測定する。Operation (f): The amount of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid is measured.
【００３０】標識核酸プローブは、標識物として放射性
同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ハプ
テン等の公知の標識物質を利用することができる。核酸
プローブはプローブヌクレオチド（Ｂ）の相同鎖の配列
を持つように設計し、該核酸プローブと合成された核酸
をハイブリダイズさせれば、該プローブを検出すること
で実施できる。この場合、標識プローブは該プローブヌ
クレオチド（Ｂ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ）
と相補的な配列部分を含まないように設計されているの
で、既に存在しているこれらのヌクレオチドの配列の影
響を受けることなく、該合成核酸を効率よく検出するこ
とができる。したがって、該合成核酸を該プライマーヌ
クレオチド（Ｃ）から分離して測定する必要がない。本
方法は、標的核酸の配列、構造等には特に制限されない
ので、その応用範囲は広い。As the labeled nucleic acid probe, a known labeling substance such as a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin, and a hapten can be used as a labeling substance. The nucleic acid probe is designed to have a sequence of a homologous strand of the probe nucleotide (B), and if the nucleic acid is hybridized with the synthesized nucleic acid, the probe can be detected. In this case, the labeled probe comprises the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C).
The synthetic nucleic acid can be efficiently detected without being affected by the sequence of these nucleotides already existing, since it is designed so as not to include a sequence portion complementary to the synthetic nucleic acid. Therefore, there is no need to separate and measure the synthetic nucleic acid from the primer nucleotide (C). The method of the present invention is not particularly limited to the sequence, structure, and the like of the target nucleic acid, and thus has a wide range of applications.
【００３１】[0031]
【発明の効果】本発明の検出法によれば、プローブヌク
レオチドの２つの末端が標的核酸にアニールして連結さ
れた場合にのみ増幅反応が行われ、標的核酸の有無が検
出される。従ってオリゴヌクレオチドの塩基配列による
特異性と、２つの末端が連結される条件を満たす特異性
の２つの特異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制
される。従って核酸の特定の配列の有無を特異的に検出
することが可能である。また、ヘリカーゼ様活性を有す
る核酸ポリメラーゼを用いることにより、環状化したプ
ローブヌクレオチド１分子から複数の核酸配列が生成さ
れるので、効率よく検出することが可能である。生成し
た核酸配列を利用して反応をサイクル化することによ
り、より大量に増幅し、検出感度を高めることもまた可
能である。さらに、本発明はプローブを増幅する方法で
はないので、ミスマッチや非特異的ハイブリダイゼーシ
ョンにより残存したプローブの増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Si
gnal/Noise）比を増加させることができる。According to the detection method of the present invention, the amplification reaction is carried out only when the two ends of the probe nucleotide are annealed and linked to the target nucleic acid, and the presence or absence of the target nucleic acid is detected. Therefore, two specificities are required, namely, specificity based on the base sequence of the oligonucleotide and specificity that satisfies the condition for linking the two ends, and the nonspecific reaction is suppressed accordingly. Therefore, the presence or absence of a specific sequence of a nucleic acid can be specifically detected. In addition, by using a nucleic acid polymerase having a helicase-like activity, a plurality of nucleic acid sequences are generated from one molecule of the probe nucleotide that has been circularized, so that the nucleic acid polymerase can be efficiently detected. By cycling the reaction using the generated nucleic acid sequence, it is also possible to amplify a larger amount and increase the detection sensitivity. Furthermore, since the present invention is not a method for amplifying a probe, there is no amplification of a probe remaining due to mismatch or non-specific hybridization, and S / N (Si
gnal / Noise) ratio can be increased.
【００３２】[0032]
【実施例】以下に、本発明の実施例及び比較例を例示す
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されな
い。 （参考例１） 各種オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合
成した。 プローブヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチド
）：本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオＴＤＨ（Th
ermostable Direct Haemolysin）遺伝子の８７番目から
１０４番目、および１０５番目から１２６番目のヌクレ
オチド配列、Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列を有
する（配列表１）。また、５’末端にリン酸基が結合し
ている。 プライマーヌクレオチド（第二オリゴヌクレオチド
）：本オリゴヌクレオチドはＴ７プロモーターの配列
を有する（配列表２）。 腸炎ビブリオＴＤＨ（Thermostable Direct Haemolys
in）遺伝子の９５番目から１１８番目の配列を有するオ
リゴヌクレオチドプローブ（配列表３）。但し５’末端
のリン酸基は32Ｐが標識されている。手法はＡＢＩ社マ
ニュアルに従い、0.2μMスケールで実施した。各種オリ
ゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃で一夜実
施した。精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラムにて
実施した。なお合成したオリゴヌクレオチドは必要によ
り以下の方法で５’末端にリン酸基を結合させた。 オリゴヌクレオチド 5 〜 20 pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製） 10 単位 水を加えて全量を100μlとして、37℃で 1時間反応させ
る。ここで 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液と
は、 0.5M Tris-HCl（pH8.0） 0.1M MgCl2 0.1M 2-メルカプトエタノールを示す。EXAMPLES The effects of the present invention will be further clarified by illustrating examples of the present invention and comparative examples, but the present invention is not limited to these examples. Reference Example 1 Synthesis of Various Oligonucleotides Using ABI DNA Synthesizer Model 391, oligonucleotides having the following sequences were synthesized by the phosphoramidite method. Probe nucleotide (first oligonucleotide): The present oligonucleotide is Vibrio parahaemolyticus TDH (Th
It has a nucleotide sequence from position 87 to position 104 and from position 105 to position 126 of the most accessible Direct Haemolysin gene and a sequence complementary to the T7 promoter sequence (Sequence Table 1). In addition, a phosphate group is bonded to the 5 'end. Primer nucleotide (second oligonucleotide): This oligonucleotide has a T7 promoter sequence (Sequence Table 2). Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haemolys
in) Oligonucleotide probe having the 95th to 118th sequence of the gene (Sequence Table 3). However, the phosphate group at the 5 'end is labeled with 32 P. The procedure was performed on a 0.2 μM scale according to the manual of ABI. Deprotection of various oligonucleotides was performed overnight at 55 ° C. with aqueous ammonia. Purification was carried out on a reverse phase column with Pharmacia FPLC. A phosphate group was bound to the 5 'end of the synthesized oligonucleotide as necessary by the following method. Oligonucleotides 5 to 20 pmoles 10 × T4 polynucleotide kinase buffer 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4 polynucleotide kinase (manufactured by Toyobo) 10 units Add water to bring the total volume to 100 μl, and react at 37 ° C. for 1 hour. Here, 10 × T4 polynucleotide kinase buffer refers to 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 M MgCl 2 0.1 M 2-mercaptoethanol.
【００３３】（参考例２） 標的核酸を検出するためのキット （ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例１の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製）、T7 RNAポリメラー
ゼ（東洋紡製）、ATP、CTP、GTP、UTP(Reference Example 2) Kit for detecting target nucleic acid (a) First oligonucleotide of Example 1 (a) Second oligonucleotide of Example 1 (c) T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo), T7 RNA polymerase (Toyobo), ATP, CTP, GTP, UTP
【００３４】（参考例３） 標的核酸を検出するためのキット （ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例１の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製）、T7 RNAポリメラー
ゼ（東洋紡製）、ATP、CTP、GTP、UTP （エ）実施例１のオリゴヌクレオチドプローブ(Reference Example 3) Kit for detecting target nucleic acid (a) First oligonucleotide of Example 1 (a) Second oligonucleotide of Example 1 (c) T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo), T7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo), ATP, CTP, GTP, UTP (d) Oligonucleotide probe of Example 1
【００３５】（参考例４） 標的核酸を検出するためのキット （ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例１の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製) 、 Tth DNAポリメラ
ーゼ (東洋紡製) 、dATP、 dCTP 、 dTTP （エ）実施例１のオリゴヌクレオチドプローブ(Reference Example 4) Kit for detecting target nucleic acid (a) First oligonucleotide of Example 1 (a) Second oligonucleotide of Example 1 (c) T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo), Tth DNA polymerase (manufactured by Toyobo), dATP, dCTP, dTTP (d) Oligonucleotide probe of Example 1
【００３６】（実施例１） 実施例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（１） 操作（a） 参考例１の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産
性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノ
ム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加え
た。94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニール
させた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を
用意した。 リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl（pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作（ｂ） 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol
を加え、操作（ａ）と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作（ｃ） 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作（ｄ） 上記反応液に水40μl、T7 RNAポリメラーゼ反応液50μ
l、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作
（ｃ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型とし
て、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施し
た。 T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl（pH8.0） 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, GTP, UTP 2 mM 32P-dCTP 操作（ｅ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム
（New AIF RX, 富士写真工業）を密着させ、-80 ℃で1
昼夜感光させた。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液
では、高分子のRNA が合成されていたが、ゲノム核酸を
含まない反応液では高分子のRNA の合成はみられなかっ
た。Example 1 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using Kit of Example 2 (1) Procedure (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide of Reference Example 1 and a culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus 1 μg of the genomic nucleic acid separated and partially purified from the body was added to 10 μl of the ligase reaction solution together. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Reaction solution for ligase 66 mM Tris-HCl (pH 7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM dithiothreitol 66 μM ATP operation (b) To 10 μl of the above reaction solution, add 0.1 nmol of the second oligonucleotide
And annealed to the circularized first oligonucleotide by the same operation as in operation (a). Operation (c) Next, add 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) and add at 37 ° C.
Reaction for 1 hour, 5 'end of the first oligonucleotide and 3'
The ends were ligated. Operation (d) 40 μl of water and 50 μl of T7 RNA polymerase reaction solution
l, and 10 units of T7 RNA polymerase, and the amplification reaction was carried out by keeping the mixture at 37 ° C for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide ligated in operation (c) as a template. T7 RNA polymerase reaction solution 80 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM dithiothreitol 4 mM spermidine 8 mM MgCl 2 50 mM NaCl 160 μg / ml BSA 0.02% Triton X-100 2 mM ATP, GTP, UTP 2 mM 32 P-dCTP operation (e) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
After thoroughly washing the nylon membrane, dry it and attach an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo) at -80 ° C.
It was exposed day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００３７】（実施例２） 参考例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（2） 操作（ａ） 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと第二オ
リゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μlのリガーゼ用反
応液に加えた。94℃に2分間保った後50℃に5分間保温
し、アニールさせた。 操作（ｂ） 上記反応液に、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分
離、部分精製したゲノム核酸1μgを加え第一オリゴヌク
レオチド とアニールさせ、T4 DNAリガーゼ1単位（東
洋紡製）を加え37℃で1時間反応させることにより、第
一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を連結させた。
対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意し
た。 操作（ｃ） 上記反応液10μlに水40μl、T7 RNAポリメラーゼ反応液
50μl、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作
（ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型とし
て、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施し
た。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム
（New AIF RX, 富士写真工業）を密着させ、-80℃で1昼
夜感光させた。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液で
は、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含
まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかっ
た。Example 2 Amplification and Detection of Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 2 (2) Operation (a) 10 μl of 0.1 nmol of the first oligonucleotide and 0.1 nmol of the second oligonucleotide of Reference Example 1 Was added to the reaction solution for ligase. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. Procedure (b) To the above reaction solution, 1 μg of genomic nucleic acid separated and partially purified from a culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus vibrio was added, annealed with the first oligonucleotide, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo), and added at 37 ° C. For 1 hour to link the 5 'end and the 3' end of the first oligonucleotide.
As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Procedure (c) 40 μl of water in 10 μl of the above reaction solution, T7 RNA polymerase reaction solution
An amplification reaction was carried out by adding 50 μl and 10 units of T7 RNA polymerase, and keeping the mixture at 37 ° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in operation (b) as a template. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
After sufficiently washing the nylon film, it was dried, and an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo Co., Ltd.) was adhered to the film and exposed to light at -80 ° C for one day. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００３８】（実施例３） 参考例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（３） 操作（ａ） 参考例１の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと第二オ
リゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH産性腸炎ビブリ
オの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgと
共に10μlのリガーゼ用反応液に加えた。94℃に2分間保
った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。対照とし
て、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 操作（ｂ） 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液10μlに水40μl、下記反応液50μl、およびT
7 RNAポリメラーゼ10単位を加え、操作（ｂ）で連結し
た環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増幅反応を実
施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム
（New AIF RX, 富士写真工業）を密着させ、-80℃で1昼
夜感光させた。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液で
は、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含
まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかっ
た。Example 3 Amplification and Detection of Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 2 (3) Operation (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide and 0.1 nmol of the second oligonucleotide of Reference Example 1 were used. It was added to 10 μl of a ligase reaction solution together with 1 μg of genomic nucleic acid separated and partially purified from a cultured cell of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, add 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) and add at 37 ° C.
Reaction for 1 hour, 5 'end of the first oligonucleotide and 3'
The ends were ligated. Procedure (c) 40 μl of water, 10 μl of the following reaction solution, and T
7 10 units of RNA polymerase were added, and an amplification reaction was performed using the cyclic oligonucleotide linked in operation (b) as a template. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
After sufficiently washing the nylon film, it was dried, and an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo Co., Ltd.) was adhered to the film and exposed to light at -80 ° C for one day. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００３９】（実施例４） 実施例2のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（4） 操作（ａ） 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産
性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノ
ム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加え
た。94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニール
させた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を
用意した。 操作（ｂ） 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol
を加え、操作（ａ）と同様の操作により、環状化した
第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。次に反応
液に水40μl、下記反応液50μl、およびT7 RNAポリメラ
ーゼ 10単位を加え、操作（ｂ）で連結した環状オリゴ
ヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温すること
により増幅反応を実施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム
（New AIF RX, 富士写真工業）を密着させ、-80℃で1昼
夜感光させた。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液で
は、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含
まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかっ
た。Example 4 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using the Kit of Example 2 (4) Procedure (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide of Reference Example 1 and a culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus 1 μg of the genomic nucleic acid separated and partially purified from the body was added to 10 μl of the ligase reaction solution together. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, add 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) and add at 37 ° C.
Reaction for 1 hour, 5 'end of the first oligonucleotide and 3'
The ends were ligated. Procedure (c) 0.1 nmol of the second oligonucleotide was added to 10 μl of the above reaction solution.
And annealed to the circularized first oligonucleotide by the same operation as in operation (a). Next, 40 μl of water, 50 μl of the following reaction solution, and 10 units of T7 RNA polymerase were added to the reaction solution, and an amplification reaction was performed by keeping the mixture at 37 ° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in step (b) as a template. . Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
After sufficiently washing the nylon film, it was dried, and an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo Co., Ltd.) was adhered to the film and exposed to light at -80 ° C for one day. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４０】（実施例５） 参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（１） 操作（ａ） 参考例１の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産
性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノ
ム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加え
た。94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニール
させた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を
用意した。 リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl （pH7.6） 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66μM ATP 操作（ｂ） 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol
を加え、操作（ａ）と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作（ｃ） 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作（ｄ） 上記反応液に水40μl、T7 RNAポリメラーゼ反応液50μ
l、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作
（ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型とし
て、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施し
た。 T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl（pH8.0） 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, GTP, UTP, CTP 操作（ｅ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を6×SSC、5×デーンハート液、1mM EDTA
、10μg の煮沸したサケ精子DNA （平均500 塩基）を
含む液100 μl中で、60℃、1時間、プレハイブリダイズ
した後、上記液に実施例1で調製したオリゴヌクレオチ
ドプローブ を加え、60℃で1時間、ハイブリダイズし
た。60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾
燥させた。X線フィルム（New AIF RX, 富士写真工業）
を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。その結果、ゲノ
ム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されて
いたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNA
の合成はみられなかった。Example 5 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 3 (1) Procedure (a) 0.1 nmol of first oligonucleotide of Reference Example 1 and culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus 1 μg of the genomic nucleic acid separated and partially purified from the body was added to 10 μl of the ligase reaction solution together. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Reaction solution for ligase 66 mM Tris-HCl (pH 7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM dithiothreitol 66 μM ATP operation (b) 0.1 nmol of the second oligonucleotide was added to 10 μl of the above reaction solution.
And annealed to the circularized first oligonucleotide by the same operation as in operation (a). Operation (c) Next, add 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) and add at 37 ° C.
Reaction for 1 hour, 5 'end of the first oligonucleotide and 3'
The ends were ligated. Operation (d) 40 μl of water and 50 μl of T7 RNA polymerase reaction solution
l, and 10 units of T7 RNA polymerase, and the amplification reaction was carried out by keeping the mixture at 37 ° C for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide ligated in operation (b) as a template. T7 RNA polymerase reaction solution 80 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM dithiothreitol 4 mM spermidine 8 mM MgCl 2 50 mM NaCl 160 μg / ml BSA 0.02% Triton X-100 2 mM ATP, GTP, UTP, CTP Operation (e) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) in a conventional manner.
Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1 mM EDTA
After prehybridization in 100 μl of a solution containing 10 μg of boiled salmon sperm DNA (average of 500 bases) at 60 ° C. for 1 hour, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution, and the mixture was added at 60 ° C. For 1 hour. After sufficiently washing the nylon membrane in 6 × SSC at 60 ° C., it was dried. X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industry)
And exposed at -80 ° C for one day. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
Was not synthesized.
【００４１】（実施例６） 参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（２） 操作（ａ） 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol と第二オ
リゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μl のリガーゼ用反
応液に加えた。94℃に２分間保った後50℃に5分間保温
し、アニールさせた。 操作（ｂ） 上記反応液に、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分
離、部分精製したゲノム核酸1 μg を加え、第一オリゴ
ヌクレオチドとアニールさせ、T4 DNAリガーゼ 1単位
（東洋紡製）を加え37℃で１時間反応させることによ
り、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を連結さ
せた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用
意した。 操作（ｃ） 上記反応液10μl に水40μl 、T7 RNAポリメラーゼ反応
液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位を加え、
操作（ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型と
して、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施
した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を6 ×SSC 、5 ×デーンハート液、1mM EDT
A 、10μg の煮沸したサケ精子DNA （平均500 塩基）を
含む液100 μl中で、60℃、1 時間、プレハイブリダイ
ズした後、上記液に実施例１で調製したオリゴヌクレオ
チドプローブ を加え、60℃で１時間、ハイブリダイズ
した。60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、
乾燥させた。Ｘ線フィルム（New AIF RX, 富士写真工
業）を密着させ、-80 ℃で１昼夜感光させた。その結
果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNA が合
成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分
子のRNA の合成はみられなかった。Example 6 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 3 (2) Operation (a) 10 μl of 0.1 nmol of the first oligonucleotide and 0.1 nmol of the second oligonucleotide of Reference Example 1 Was added to the reaction solution for ligase. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. Procedure (b) To the above reaction solution, 1 μg of genomic nucleic acid separated and partially purified from a culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus vibrio was added, annealed with the first oligonucleotide, and 1 unit of T4 DNA ligase (Toyobo) was added. By reacting at 37 ° C. for 1 hour, the 5 ′ end and the 3 ′ end of the first oligonucleotide were linked. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Procedure (c) To 10 μl of the above reaction mixture, add 40 μl of water, 50 μl of T7 RNA polymerase reaction mixture, and 10 units of T7 RNA polymerase,
The amplification reaction was carried out by keeping the temperature at 37 ° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in the operation (b) as a template. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
Nylon membrane 6 x SSC, 5 x Dane Heart solution, 1 mM EDT
A. After prehybridization in 100 µl of a solution containing 10 µg of boiled salmon sperm DNA (average of 500 bases) at 60 ° C for 1 hour, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution. Hybridized at 1 ° C. for 1 hour. After thoroughly washing the nylon membrane in 6 x SSC at 60 ° C,
Let dry. An X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo) was adhered and exposed at -80 ° C for one day. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４２】（実施例７） 参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（３） 操作（ａ） 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol と第二オ
リゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH 産性腸炎ビブリ
オの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1 μg
と共に10μl のリガーゼ用反応液に加えた。94℃に2分
間保った後50℃に5 分間保温し、アニールさせた。対照
として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 操作（ｂ） 次に、T4 DNAリガーゼ１単位（東洋紡製）を加え37℃で
１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液10μlに水40μl、下記反応液50μl、およびT
7 RNAポリメラーゼ10 単位を加え、操作（ｂ）で連結し
た環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増幅反応を実
施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を6×SSC、5×デーンハート液、1mM EDTA、
10μgの煮沸したサケ精子DNA（平均500塩基）を含む液1
00μl中で、60℃、１時間、プレハイブリダイズした
後、上記液に実施例１で調製したオリゴヌクレオチドプ
ローブ を加え、60℃で１時間、ハイブリダイズした。
60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥さ
せた。Ｘ線フィルム（New AIF RX, 富士写真工業）を密
着させ、-80℃で１昼夜感光させた。その結果、ゲノム
核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されてい
たが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの
合成はみられなかった。Example 7 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 3 (3) Procedure (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide and 0.1 nmol of the second oligonucleotide of Reference Example 1 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus
Was added to 10 μl of the reaction solution for ligase. After keeping at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes and annealed. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour.
The ends were ligated. Procedure (c) 40 μl of water, 10 μl of the following reaction solution, and T
7 RNA polymerase (10 units) was added, and an amplification reaction was carried out using the cyclic oligonucleotide linked in operation (b) as a template. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1 mM EDTA,
Solution 1 containing 10 μg of boiled salmon sperm DNA (average 500 bases)
After prehybridization in 00 µl at 60 ° C for 1 hour, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution, and the mixture was hybridized at 60 ° C for 1 hour.
After sufficiently washing the nylon membrane in 6 × SSC at 60 ° C., it was dried. An X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo) was adhered and exposed at -80 ° C for 24 hours. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４３】（実施例８） 参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法
（４） 操作（ａ） 参考例１の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産
性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノ
ム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加え
た。94℃に２分間保った後50℃に5分間保温し、アニー
ルさせた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液
を用意した。 操作（ｂ） 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol
を加え、操作（ａ）と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチド にアニールさせた。次に反応液
に水40μl、下記反応液50μl、およびT7 RNAポリメラー
ゼ 10単位を加え、操作（ｂ）で連結した環状オリゴヌ
クレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することに
より増幅反応を実施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜GeneSceen plus（DuPont社製）にブロットした。
ナイロン膜を6×SSC、5×デーンハート液、1mM EDTA、
10μgの煮沸したサケ精子DNA（平均500塩基）を含む液1
00μl中で、60℃、１時間、プレハイブリダイズした
後、上記液に実施例１で調製したオリゴヌクレオチドプ
ローブを加え、60℃で１時間、ハイブリダイズした。
60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥さ
せた。Ｘ線フィルム（New AIF RX, 富士写真工業）を密
着させ、-80℃で１昼夜感光させた。その結果、ゲノム
核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されてい
たが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの
合成はみられなかった。Example 8 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 3 (4) Procedure (a) 0.1 nmol of first oligonucleotide of Reference Example 1 and culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus 1 μg of the genomic nucleic acid separated and partially purified from the body was added to 10 μl of the ligase reaction solution together. After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature was kept at 50 ° C. for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour.
The ends were ligated. Procedure (c) 0.1 nmol of the second oligonucleotide was added to 10 μl of the above reaction solution.
And annealed to the cyclized first oligonucleotide by the same operation as in operation (a). Next, 40 μl of water, 50 μl of the following reaction solution, and 10 units of T7 RNA polymerase were added to the reaction solution, and an amplification reaction was performed by keeping the mixture at 37 ° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in step (b) as a template. . Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on an agarose gel, and blotting was performed on a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) by a conventional method.
Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1 mM EDTA,
Solution 1 containing 10 μg of boiled salmon sperm DNA (average 500 bases)
After prehybridization in 00 μl at 60 ° C. for 1 hour, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution, and the mixture was hybridized at 60 ° C. for 1 hour.
After sufficiently washing the nylon membrane in 6 × SSC at 60 ° C., it was dried. An X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Kogyo) was adhered and exposed at -80 ° C for 24 hours. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing the genomic nucleic acid, but no high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４４】（実施例９） 参考例４のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法 操作（ａ） 参考例１の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol と、TDH
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸１μｇとを10μl のリガーゼ用反応液に加え
た。94℃に２分間保った後、50℃に５分間保温し、アニ
ールさせた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応
液を用意した。 リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl (Ph7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作（ｂ） 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド0.1nmo
lを加え、操作（ａ）と同様の操作により、環状化した
第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作（ｃ） 次に T4 DNA リガーセ 1単位（東洋紡製）を加え、37℃
で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と
3'末端を連結させた。 操作（ｄ） 上記反応液に水40μl 、Tth DNA ポリメラーゼ反応液50
μl 、およびTth DNAポリメラーゼ４単位を加え、操作
（ｃ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型とし
て、75℃で60分間保温することにより増幅反応を実施し
た。 Tth DNA ポリメラーゼ反応液 67 mM Tris-HCl (pH8.8) 16.6mM (NH4)2SO4 6.7mM MgCl2 2 mM dATP, dGTP, dTTP 2 mM 32P-dCTP 操作（ｅ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜 GeneScreenplus (DuPont社製) にブロットし
た。ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、Ｘ線フィ
ルム (New AlF RX,富士写真工業) を密着させ、-80 ℃
で１昼夜感光させた。その結果、ゲノム核酸を加えた反
応液では、高分子のDNA が合成されていたが、ゲノム核
酸を含まない反応液では高分子のDNA の合成は見られな
かった。Example 9 Method for Amplifying and Detecting Target Nucleic Acid Using Kit of Reference Example 4 Operation (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide of Reference Example 1 and TDH
1 μg of genomic nucleic acid separated and partially purified from cultured cells of Vibrio parahaemolyticus was added to 10 μl of a ligase reaction solution. After being kept at 94 ° C. for 2 minutes, it was kept at 50 ° C. for 5 minutes and annealed. As a control, a reaction solution containing no genomic nucleic acid was prepared. Reaction solution for ligase 66 mM Tris-HCl (Ph7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM dithiothreitol 66 μM ATP operation (b) 0.1 μm of the second oligonucleotide was added to 10 μl of the above reaction solution.
l was added, and the mixture was annealed to the circularized first oligonucleotide by the same operation as in operation (a). Operation (c) Next, add 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo),
And react for 1 hour with the 5 'end of the first oligonucleotide.
The 3 'end was ligated. Procedure (d) Add 40 μl of water to the above reaction mixture, and add 50 Tth DNA polymerase reaction mixture
μl and 4 units of Tth DNA polymerase were added, and the mixture was incubated at 75 ° C. for 60 minutes using the cyclic oligonucleotide ligated in operation (c) as a template to carry out an amplification reaction. Tth DNA polymerase reaction solution 67 mM Tris-HCl (pH8.8) 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 6.7 mM MgCl 2 2 mM dATP, dGTP, dTTP 2 mM 32 P-dCTP Procedure (e) Then, run on agarose gel After electrophoresis, blotting was performed on a nylon membrane GeneScreenplus (manufactured by DuPont) by a conventional method. After thoroughly washing the nylon film, dry it and attach an X-ray film (New AlF RX, Fuji Photo Kogyo) at -80 ° C.
For one day. As a result, high-molecular-weight DNA was synthesized in the reaction solution to which genomic nucleic acid was added, but no high-molecular-weight DNA was synthesized in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４５】配列番号：１ 配列の長さ：１１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：32..38 特徴を決定した方法：S 他の特徴：Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列 存在位置：1..18 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin)遺伝子の105番目から126番目の配列 存在位置：92..113 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin)遺伝子の87番目から104番目のヌクレオチド配列 配列 GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113SEQ ID NO: 1 Sequence length: 113 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Characteristic symbol: Promoter location : 32..38 Method for determining characteristics: S Other characteristics: Sequence complementary to T7 promoter sequence Location: 1..18 Other characteristics: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haem)
sequence from position 105 to position 126 of the olysin) gene Location: 92..113 Other features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haem)
olysin) nucleotide sequence from position 87 to position 104 of the gene Sequence GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113
【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..17 特徴を決定した方法：S 他の特徴：Ｔ７プロモーターの配列を有する 配列 TAATACGACT CACTATA 17SEQ ID NO: 2 Sequence length: 17 Sequence type: nucleic acid Topology: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Characteristic symbol: promoter Location: 1..17 Method determined: S Other characteristics: Sequence having the sequence of T7 promoter TAATACGACT CACTATA 17
【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin)遺伝子の95番目から118番目の配列と相補的な配
列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTTT 25SEQ ID NO: 3 Sequence length: 25 Sequence type: nucleic acid Topology: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1..25 Characteristic determination method: S, etc. Features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haem
olysin) has a sequence complementary to the 95th to 118th sequence of the gene. Sequence CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTTT 25
【図１】第一オリゴヌクレオチド（プローブヌクレオチ
ド）の構造を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing the structure of a first oligonucleotide (probe nucleotide).
【図２】本発明の原理を模式的に示した図である。FIG. 2 is a diagram schematically illustrating the principle of the present invention.
【図３】本発明の原理を模式的に示した図である。FIG. 3 is a diagram schematically illustrating the principle of the present invention.
【図４】実施例１〜８において合成されたＲＮＡの検出
の結果を示す。FIG. 4 shows the results of detection of RNA synthesized in Examples 1 to 8.
【図５】実施例９において合成されたＤＮＡの検出の結
果を示す。FIG. 5 shows the results of detection of DNA synthesized in Example 9.
図２中、Ａは標的核酸、Ｂは第一オリゴヌクレオチド
（プローブヌクレオチド）、Ｂ’は環状化した第一オリ
ゴヌクレオチド、Ｃは第二オリゴヌクレオチド（プライ
マーヌクレオチド）、Ｄは核酸ポリメラーゼ、Ｅは標識
されたモノヌクレオチドを示す。図３中、Ａは標的核
酸、Ｂは第一オリゴヌクレオチド（プローブヌクレオチ
ド）、Ｂ’は環状化した第一オリゴヌクレオチド、Ｃは
第二オリゴヌクレオチド（プライマーヌクレオチド）、
Ｄは核酸ポリメラーゼ、Ｅはオリゴヌクレオチドプロー
ブを示す。図４中、１、２、３、４、５、６、７、８は
それぞれ実施例１、２、３、４、５、６、７、８の結果
に対応している。矢印は鋳型として用いたプローブヌク
レオチド（Ｂ；１１３ｍｅｒ）の位置を示す。また、図
中、＋は反応液中にゲノム核酸を加えた場合、−は加え
なかった場合を示す。図５中、１のレーンは反応液中に
ゲノム核酸を加えた場合、２のレーンは加えなかった場
合を示す。In FIG. 2, A is a target nucleic acid, B is a first oligonucleotide (probe nucleotide), B 'is a circularized first oligonucleotide, C is a second oligonucleotide (primer nucleotide), D is a nucleic acid polymerase, and E is a label. 3 shows the resulting mononucleotide. In FIG. 3, A is a target nucleic acid, B is a first oligonucleotide (probe nucleotide), B ′ is a circularized first oligonucleotide, C is a second oligonucleotide (primer nucleotide),
D indicates a nucleic acid polymerase, and E indicates an oligonucleotide probe. 4, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 correspond to the results of Examples 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8, respectively. The arrow indicates the position of the probe nucleotide (B; 113mer) used as a template. In the figure, + indicates the case where the genomic nucleic acid was added to the reaction solution, and-indicates the case where it was not added. In FIG. 5, lane 1 shows the case where genomic nucleic acid was added to the reaction solution, and lane 2 shows the case where it was not added.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing from the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C12Q 1/68 BIOSIS (DIALOG) JICST file (JOIS) WPI (DIALOG)
Claims (11)
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくともこの
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
標的核酸配列（Ａ）に直鎖状プローブヌクレオチド
（Ｂ）をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオ
チド（Ｂ）を環状化し、生成した環状プローブヌクレオ
チド（Ｂ’）を鋳型として、プライマーヌクレオチド
（Ｃ）を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列
を有する一本鎖核酸を生成させ、得られた一本鎖核酸を
測定することにより、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）
を検出することを特徴とする標的核酸配列の検出方法。Claims 1. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a sample sample, and at least the linear probe nucleotide (B ) Using a primer nucleotide (C) having a sequence that is partially complementary to
A linear probe nucleotide (B) is hybridized to the target nucleic acid sequence (A), the linear probe nucleotide (B) is circularized, and the generated cyclic probe nucleotide (B ′) is used as a template to prepare a primer nucleotide (C). Is used to generate a single-stranded nucleic acid having a repeated sequence of a sequence complementary to the template, and the resulting single-stranded nucleic acid is measured, whereby the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample is measured.
A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising: detecting a target nucleic acid sequence.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッドのプローブヌクレオチド
（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。2. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least the linear probe nucleotide (B ), The following operations (a) to (f) are performed using a primer nucleotide (C) having a sequence which is partially complementary to the target nucleic acid sequence. Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The primer nucleotide (C) is annealed with the hybrid probe nucleotide (B) generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Nucleic acid sequence using nucleic acid polymerase having helicase-like activity and primer nucleotide (C), using cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template in the presence of labeled mononucleotide Is amplified. Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。3. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a sample, and at least the linear probe nucleotide (B ), The following operations (a) to (f) are performed using a primer nucleotide (C) having a sequence which is partially complementary to the target nucleic acid sequence. Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The target nucleic acid sequence (A) in the sample is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Nucleic acid sequence using nucleic acid polymerase having helicase-like activity and primer nucleotide (C), using cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template in the presence of labeled mononucleotide Is amplified. Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくともこの
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。4. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least the linear probe nucleotide (B ) Using a primer nucleotide (C) having a sequence that is partially complementary to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (e). Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
A hybrid is formed with the target nucleic acid sequence (A) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): In the presence of a labeled mononucleotide, using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template and a nucleic acid polymerase having a helicase-like activity and a primer nucleotide (C), a nucleic acid sequence Is amplified. Operation (d): If necessary, the operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (c). Operation (e): Through the operations (a) to (d), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
と標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。5. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a sample, and at least the linear probe nucleotide (B ), The following operations (a) to (f) are performed using a primer nucleotide (C) having a sequence which is partially complementary to the target nucleic acid sequence. Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
And a target nucleic acid sequence (A) to form a hybrid. Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the adjacent linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): Anneal the primer nucleotide (C) with the cyclic probe nucleotide (B ′) generated in operation (b). Operation (d): Nucleic acid sequence using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C), using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (b) as a template in the presence of a labeled mononucleotide. Is amplified. Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the generated nucleic acid sequence.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて環状ヌクレオチド（Ｂ’）にする。操作
（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅する。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回繰
り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。6. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least said linear probe nucleotide (B A) to (g), using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to that of the target nucleic acid sequence. Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The primer nucleotide (C) is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through the operations (a) to (e), a hybrid between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe is formed. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the sample is detected by measuring the amount of labeling of the hybridized labeled nucleic acid probe.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。7. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least the linear probe nucleotide (B A) to (g), using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to that of the target nucleic acid sequence. Operation (a): A hybrid is formed between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The target nucleic acid sequence (A) in the sample is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product generated in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (d): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through the operations (a) to (e), a hybrid between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe is formed. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the sample is detected by measuring the amount of labeling of the hybridized labeled nucleic acid probe.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも1回
繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｆ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。8. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a sample sample, and at least the linear probe nucleotide (B ), The following operations (a) to (f) are performed using a primer nucleotide (C) having a sequence which is partially complementary to the target nucleic acid sequence. Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
A hybrid is formed with the target nucleic acid sequence (A) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (b) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (d): If necessary, the operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (c). Operation (e): Through the operations (a) to (d), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (f): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeling amount of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標的核
酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。9. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in a sample sample, and at least said linear probe nucleotide (B A) to (g), using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to that of the target nucleic acid sequence. Operation (a): the above-mentioned linear probe nucleotide (B),
Form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The 5 ′ end and 3 ′ end of the adjacent linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B ′). Operation (c): Anneal the primer nucleotide (C) with the cyclic probe nucleotide (B ′) generated in operation (b). Operation (d): Using the cyclic nucleotide (B ′) generated in operation (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, the operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in the operation (d). Operation (f): Through the operations (a) to (e), a hybrid between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe is formed. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the sample is detected by measuring the amount of labeling of the hybridized labeled nucleic acid probe.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プロー
ブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有する
プライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリメ
ラーゼ、ヌクレオチド三リン酸および標識モノヌクレオ
チドを含む標的核酸配列検出用試薬キット。10. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in an analyte sample, said linear probe nucleotide (B) A reagent kit for detecting a target nucleic acid sequence, comprising a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence, a ligation means, a nucleic acid polymerase, a nucleotide triphosphate and a labeled mononucleotide.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プロー
ブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有する
プライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリメ
ラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、および標識された核酸
プローブを含む標的核酸配列検出用試薬キット。11. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in an analyte sample, said linear probe nucleotide (B) A reagent kit for detecting a target nucleic acid sequence, comprising a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence, a ligation means, a nucleic acid polymerase, a nucleotide triphosphate, and a labeled nucleic acid probe.
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| JP4989493B2 (en) * | 2006-01-20 | 2012-08-01 | オリンパス株式会社 | Method for detecting nucleic acid sequence by intramolecular probe |
| US8236498B2 (en) | 2006-01-20 | 2012-08-07 | Olympus Corporation | Method of detecting nucleotide sequence with an intramolecular probe |
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|---|---|
| JPH04304900A (en) | 1992-10-28 |
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