JP3071852B2

JP3071852B2 - 膵リパーゼ測定試薬

Info

Publication number: JP3071852B2
Application number: JP3085040A
Authority: JP
Inventors: 茂行今村
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1991-04-17
Filing date: 1991-04-17
Publication date: 2000-07-31
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: JPH04316500A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、操作が簡便で、かつ精
度の高いドライケミストリー（乾燥系の反応）を利用し
た膵リパーゼ測定試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】膵リパ
ーゼは、トリグリセリドに作用してモノグリセリドを生
成せしめることが知られている（試験例１）。膵リパー
ゼは膵臓の腺房細胞から分泌され、膵管を通じて十二指
腸に送られ、脂肪を消化する酵素である。膵炎や膵癌等
の膵疾患が起こると、膵腺房細胞の破壊、膵管の狭窄、
閉塞等により膵リパーゼが血中に逸脱し、血清中のリパ
ーゼ活性値は上昇する。従って、血中の膵リパーゼ活性
の測定は、膵疾患の診断に有用である。

【０００３】リパーゼの活性測定法としては種々の方法
が知られているが、トリグリセリドを用いる方法として
は現在では乳化オリーブ油を基質として膵リパーゼの作
用により基質であるトリグリセリドがモノグリセリドへ
の酵素作用を受けることによる減少する基質の濁度を測
定する比濁法がよく用いられている。しかしながら、こ
の方法は吸光度の変化がわずかであるため、精度、正確
性に問題がある。

【０００４】また、近年において乾燥系の反応（以下
「ドライケミストリー」という）を用いる分析法が、操
作が簡便であることから注目されている。ドライケミス
トリーを用いる膵リパーゼ活性の測定方法としては、合
成基質として１−オレイル−2,3 −ジアセチルグリセロ
ールを用い、膵リパーゼにより生成した2,3 −ジアセチ
ルグリセロールをエステラーゼで分解し、遊離したグリ
セリンを酵素学的に測定する方法が知られている。しか
しながら、ここで用いられる１−オレイル−2,3−ジア
セチルグリセロールは、合成基質であるため高価であ
り、低級アシル基を含むため不安定であり、天然のリパ
ーゼ基質でないため得られた測定値が天然の基質を用い
た場合と異なるおそれがある等の欠点を有する。従っ
て、この様な欠点がなく、ドライケミストリーを用いた
簡便、かつ正確な膵リパーゼ測定試薬が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かかる実状に鑑み、本発
明者らは鋭意研究を行なったところ、膵リパーゼは、天
然脂質及び天然脂質に近い合成脂質をほとんどモノグリ
セリドにまで分解するために比濁法であるウェットケミ
ストリー法をなし得るが、しかしながら生成物がモノグ
リセリドであることからドライケミストリー法では比濁
法を使用し得なかったもので、そのため好適なドライケ
ミストリー法を研究するに当り、基質としてトリグリセ
リドを用い、これとモノグリセリドリパーゼ及びグリセ
リン測定試薬とを組み合せ、フィルムに保持または含有
せしめてなるドライケミストリー用リパーゼ測定試薬
が、上記欠点がなく、容易に膵リパーゼ活性を測定で
き、しかも正確な測定値が得られることを見出し本発明
を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、(a)トリグリセリ
ド、(b) ジグリセリド及びトリグリセリドに実質的に作
用しないモノグリセリドリパーゼ並びに (c)グリセリン
測定試薬を含有することを特徴とするドライケミストリ
ー用膵リパーゼ測定試薬を提供するものである。

【０００７】本発明に用いる（ａ）成分のトリグリセリ
ドとしては、例えば天然の動植物油又は３つの長鎖脂肪
酸の炭素数が14〜20である合成若しくは半合成長鎖脂肪
酸トリグリセリド等が挙げられるが、入手の容易性より
特にトリオレイン酸グリセリドが好ましい。

【０００８】（ｂ）成分のモノグリセリドリパーゼとし
ては、モノグリセリドに作用し、ジグリセリド及びトリ
グリセリドに実質的に作用しないものが好ましく、具体
的には、バチルスステアロサーモフィラスH-165(微工研
条寄第1673号) が産生するモノグリセリドリパーゼが好
ましい。

【０００９】（ｃ）成分のグリセリン測定試薬として
は、生成されるグリセリンに作用する酵素とを発色試薬
を用いる公知のグリセリン測定系に使用される試薬が用
いられる。ここに用いられる酵素としては、グリセロキ
ナーゼとグリセロリン酸オキサダーゼとの組み合せ、グ
リセロキナーゼとグリセロリン酸デヒドロキナーゼとの
組合せ、グリセロールオキシダーゼ、及びグリセロール
デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。

【００１０】このようなグリセリン測定試薬のうち、Ａ
ＴＰの存在下グリセロキナーゼを用いてグリセリンから
生成されるグリセロ−３−リン酸をグリセロリン酸オキ
シダーゼで酸化させるグリセロキナーゼ・グリセロリン
酸オキシダーゼ法を用いる系、またはグリセロールオキ
シダーゼ法を用いる系が好ましい試薬として挙げられ
る。いずれの系を用いる場合も、グリセリン測定系にお
ける最終生成物である過酸化水素を測定、またはこれら
の系の反応によって生成されるジヒドロキシアセトンリ
ン酸、ジヒドロキシアセトンのいづれを測定してもよ
い。例えば、グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシ
ダーゼ法を用いる場合、トリグリセリドから生成したグ
リセリンに、グリセロキナーゼ0.1 〜20Ｕ／ml、グリセ
ロリン酸オキシダーゼ３〜30Ｕ／ml、ＡＴＰ１〜10mM、
またグリセロキナーゼの酵素活性を高めるための添加剤
としてマグネシウムイオンを放出するイオン放出性塩
類、例えば塩化マグネシウム1〜10mMを各々作用させる
ことにより、酸素を消費して過酸化水素およびジヒドロ
キシアセトンリン酸が生成される。従って生成されるジ
ヒドロキシアセトンリン酸を公知の方法(Method of Enz
ymatic Analysis,３巻，1314〜1319頁) 等に基づいて測
定してもよい。さらに、過酸化水素を測定する方法とし
ては、生成される過酸化水素にパーオキシダーゼおよび
４−アミノアンチピリンと下記一般式(1) で表されるフ
ェノール性化合物、または下記一般式(2) で表されるア
ニリン誘導体の発色試薬を作用させ、生じた発色体を測
定する方法を用いてもよい（特公昭60−3480号）。

【００１１】

【化１】

【００１２】

【化２】

【００１３】上記の発色試薬において、一般式(1) で表
されるフェノール化合物としては、例えば、ｐ−クロル
フェノール、ｐ−ブロムフェノール、2,4 −ジクロルフ
ェノール、2,4 −ジブロムフェノール、2,4 −ジクロル
フェノールスルホネート等が挙げられる。また、一般式
(2) で表されるアニリン誘導体としては、例えばジエチ
ルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジン、ｍ−メ
トキシ−N,N −ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミ
ン、ソジウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）メタトルイジン、ソジウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,5−ジメトキ
シアニリン等が挙げられる。

【００１４】上記過酸化水素の測定方法は例示であり、
通常としては過酸化水素と反応して検出できる生成物に
変化する指示薬を用いて定量すればよく、この指示薬と
して、過酸化水素の存在下で色調変化を受ける１種また
は２種以上の呈色薬組成物、蛍光薬組成物または発光薬
組成物からなる組合せを使用すればよい。呈色薬組成物
としては、通常色調の変化を可視にて生ずるもので、パ
ーオキシダーゼ作用を有する物質と呈色前駆体との含有
物を用いる。このパーオキシダーゼ作用を有する物質と
しては、西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼが通常よく
用いられ、呈色前駆体としては、４−アミノアンチピリ
ンと一般式(1) で表されるフェノール系化合物の組合せ
による方法が通常よく用いられる。また、呈色前駆体と
して、４−アミノアンチピリンと一般式(2) で表される
アニリン誘導体の組合せによる方法でもよく、例えば４
−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼとＮ−エ
チル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）
−メタ−トルイジン（TOOS）との反応によって、生成す
る発色体の量をその呈色の強さによって測定する方法が
挙げられる。さらに、ジエチルアニリンまたはジメチル
アニリンと３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾンを作用させ生じた発色体を呈色の強さによって測定
する方法もあり、また生成する過酸化水素と反応して安
定な赤色体を形成する４価チタン化合物とキシレノール
オレンジによって生成する発色体の量をその呈色の強さ
によって測定する方法もあり、さらに2,6 −ジクロルフ
ェノールインドフェノールとパーオキシダーゼとの組合
せ、グアヤク脂とパーオキシダーゼとの組合せ等による
パーオキシダーゼを用いる種々の組成、方法が挙げられ
る。さらにこれらの指示薬においては溶液として予めそ
の目的に応じて混合使用して調製してもよい。使用量と
しては、例えばこのフェノール誘導体またはアニリン誘
導体、４−アミノアンチピリンおよびバーオキシダーゼ
による反応においては、フェノールあるいはTOOSは全液
量に対し0.01〜0.1 ％程度使用すればよく、４−アミノ
アンチピリンは全液量に対して、0.01〜0.05％、好まし
くは0.03％、さらにパーオキシダーゼは３〜30Ｕ／ml、
好ましくは４〜６Ｕ／ml使用すればよい。さらに上記の
呈色薬組成物の代りに、紫外線照射により蛍光を発する
蛍光薬組成物としてホモバニリン酸などを用いて行って
もよく、さらに発色する発光薬組成物を用いて行う等、
分光光学的手段によりその変化を定量し得る組成物が用
いられる。

【００１５】同様に、グリセロールオキシダーゼ法を用
いる系としては、上記の通り、トリグリセリドから生成
されたグリセリンにグリセロールオキシダーゼ１〜50Ｕ
作用させることにより酸素を消費してジヒドロキシアセ
トンおよび過酸化水素を生成するもので、生成されるジ
ヒドロキシアセトンまたは過酸化水素を測定する。好ま
しくは生成された過酸化水素を測定するものであるが、
その場合はグリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダ
ーゼ法における過酸化水素の定量試薬を同様にして用い
ればよい。また生成されるジヒドロキシアセトンを公知
の方法（Methodof Enzymatic Analysis,３巻，1442〜14
45頁）等に基づいて行えばよい。

【００１６】さらにグリセリンの測定手段としては上述
のグリセロリン酸オキシダーゼの代りにグリセロリン酸
デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤを用いて生成する還元型
ＮＡＤを公知の定量試薬、例えばジアホラーゼとニトロ
テトラゾリウムブルーやテトラゾリウムブルー等のテト
ラゾリウム塩とをもちいるホルマザン色素形成用試薬を
用いて分析してもよく、さらに生成されるグリセロール
にＡＴＰおよびグリセロキナーゼを作用させた場合にお
いてＡＴＰから生成するＡＤＰを公知方法（Method of
Enzymatic Analysis,４巻，2127〜2129頁）等に基づく
試薬を用いて測定してもよく、公知の種々のグリセリン
定量系に用いられる試薬が使用可能である。

【００１７】本発明の測定試薬には、上記必須成分の他
に、他の成分を加えることができる。この成分として
は、カルシウム、コ・リパーゼ、デオキシコール酸ナト
リウム等の胆汁酸塩等の膵リパーゼ活性化剤、アラビア
ゴム、ポリビニルアルコール等の乳化剤等が挙げられ
る。

【００１８】本発明の測定試薬への成分（ａ）及び
（ｂ）の配合量は、特に制限されないが、測定時にトリ
グリセリドが0.05〜５mM、モノグリセリドリパーゼが0.
05〜５Ｕ／mlとなるようにするのが好ましい。また、グ
リセリン測定試薬（ｃ）として、グリセロキナーゼ−グ
リセロリン酸オキシダーゼ系を用いた場合の好ましい配
合量に関して、例えば特開昭63-245672 号公報、同59-1
40900 号公報（サイクリング反応系）に記載の各酵素、
試薬等の使用量を参考として調製、使用すればよい。各
酵素、試薬の調製について例示すれば（なお、カッコ内
数値は使用比の好適例を示す）トリグリセリド（リパーゼ基質） 0.05〜20mM（１）モノグリセリドリパーゼ 15〜50Ｕ／ml（0.5 ）グリセロキナーゼ５〜20Ｕ／ml（0.5）グリセロリン酸オキシダーゼ 50〜200Ｕ／ml（0.5）グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ 15〜50Ｕ／ml（１）ＮＡＤ５〜20mM（１）ジアフォラーゼ 20〜80Ｕ／ml（0.5）コ・リパーゼ 200〜800Ｕ／ml（0.5）デオキシコール酸ナトリウム 50〜200mM（１）塩化カルシウム５〜80mM（0.5）塩化マグネシウム 10〜80mM（0.5）トリス−塩酸緩衝液 0.1〜0.5M（２）ＡＴＰ 20〜80mM（0.5）ペルオキシダーゼ 50〜200Ｕ／ml（0.5）４−アミノアンチピリン 10〜40mM（１）フェノール 10〜40mM（１）グリセロールオキシダーゼ 200〜800Ｕ／ml（１）ニトロテトラゾリウムブルー 0.1〜0.5％（１）の適宜な膵リパーゼ測定のための酵素、試薬の調製液の
10〜100 μｌを用いて、１テスト用のドライケミストリ
ー用測定試薬となせばよい。

【００１９】また、本発明に用いるドライケミストリー
のために用いるフィルムは、必要な成分を保持または含
浸させることのできるフィルム状であれば合成フィル
ム、半合成フィルム又は天然フィルムのいずれであって
もよく、好ましくは、濾紙、ナイロン、酢酸セルロー
ス、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等が具
体例として挙げられる。

【００２０】本発明の膵リパーゼ測定試薬を製造するに
は、トリグリセリド（ａ）をアラビアゴム等で乳化せし
めるか、ゼラチン、変性ゼラチン、ポリビニルアルコー
ルやポリビニルピロリドン等の親水性コロイドを媒体と
して用いてこれと他の必要な成分を混合し、フィルムに
保持または含浸せしめ、乾燥すればよく、前記した過酸
化水素を測定するための好ましい態様として、例えば特
開昭49-53888号公報、同50-137192 号公報、同51-40191
号公報、同55-90859号公報、同55-16436号公報、同57-6
6359号公報、同57-128846 号公報、同57-128849 号公報
等に記載されているような水不透過性光透過性のフィル
ム（またはシート）の支持体上に、上記の酵素、試薬層
や多孔性展開層等を適宜形成せしめたドライケミストリ
ー用としての多層一体型フィルム状（またはシート状）
のリパーゼ測定試薬となし得る。このようにして得られ
るドライケミストリー用フィルム、例えばグリセロキナ
ーゼ−グリセロリン酸オキシダーゼ系を用いた場合、約
１cm²当りの各々の絶対量としては、好ましくはトリス
−塩酸120 〜400 μｇ、トリオレイン15〜50μｇ、アラ
ビアゴム0.2 〜１mg、塩化カルシウム５〜40μｇ、塩化
マグネシウム５〜40μｇ、ＡＴＰ30〜100 μｇ、デオキ
シコール酸ナトリウム100 〜500 μｇ、４−アミノアン
チピリン５〜50μｇ、フェノール５〜50μｇ、グリセロ
キナーゼ0.01〜0.05Ｕ、グリセロリン酸オキシダーゼ0.
1 〜0.5 Ｕ、ペルオキシダーゼ0.1 〜0.5 Ｕ、モノグリ
セリドリパーゼ0.03〜0.15Ｕである。

【００２１】本発明の測定試薬を用いて膵リパーゼ活性
を測定するには、例えば本発明ドライケミストリー用フ
ィルム状測定試薬上に検体、例えば血清５〜20μｌを載
せて反応させ、発色する色素等を肉眼又は分光光度計を
用いて測定すればよい。

【００２２】

【発明の効果】本発明の膵リパーゼ測定試験を用いれ
ば、精度良くリパーゼ活性が測定でき、しかも操作は簡
単である。

【００２３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２４】試験例１トリグリセリドを基質にし、膵リパーゼを作用させたと
きの生成物はグリセリンでなく、モノグリセリドである
ことの試験：トリオレイン（10mMになるように10％アラ
ビアゴム溶液で超音波処理したもの）0.1ml 、0.2 Ｍト
リス−塩酸緩衝液（pH8.6）0.2ml、40mM塩化カルシウム
0.05ml、40mM ＡＴＰ0.05ml、40mM塩化マグネシウム0.0
5ml、0.1 Ｍデオキシコール酸ナトリウム0.1 ml、コ・
リパーゼ（400Ｕ／ml）0.05ml、グリセロキナーゼ（10
Ｕ／ml）0.05ml、グリセロリン酸オキシダーゼ（100Ｕ
／ml）0.05ml、ペルオキシダーゼ（100Ｕ／ml）0.05m
l、20mM４−アミノアンチピリン0.1ml 、及び20mMフェ
ノール0.1ml にモノグリセリドリパーゼ（30Ｕ／ml）0.
05mlを添加した反応液（Ａ）、並びに（Ａ）のモノグリ
セリドリパーゼの代りに精製水0.05mlを加えた反応液
（Ｂ）を各々ナイロン製膜にしみ込ませ、風乾した後、
膵リパーゼ（250Ｕ／Ｌ）20μｌを加え37℃で10分間反
応を行ない２％ＳＤＳ20μｌで反応を止め、500nm の吸
光度をスポットスキャナーＣＳ−9000で測定した。表１
にその結果を示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】表１からわかるようにトリグリセリドに膵
リパーゼが作用しても遊離のグリセリンは殆んど検出さ
れなかったか、モノグリセリドリパーゼ添加ではじめて
発色がみられた。この結果から、トリグリセリド膵リパ
ーゼが作用した場合、その生成物のほとんどはモノグリ
セリドである。

【００２７】実施例１トリオレイン（10mMになるように１０％アラビアゴムで
超音波処理したもの）0.1ml 、0.2 Ｍトリス−塩酸緩衝
液（pH8.6）0.2ml、40mM塩化カルシウム0.05ml、40mM
ＡＴＰ0.05ml、40mM塩化マグネシウム0.05ml、0.1 Ｍデ
オキシコール酸ナトリウム0.1 ml、コ・リパーゼ（400
Ｕ／ml）0.05ml、グリセロキナーゼ（10Ｕ／ml）0.05m
l、グリセロリン酸オキシダーゼ（100Ｕ／ml）0.05ml、
ペルオキシダーゼ（100Ｕ／ml）0.05ml、20mM４−アミ
ノアンチピリン0.1ml 、20mMフェノール0.1ml 及びモノ
グリセリドリパーゼ（30Ｕ／ml）0.05mlから構成される
反応液20μｌを濾紙にしみ込ませた後、風乾した。この
スポットした濾紙の部分に20μｌのヒト膵リパーゼ（25
0Ｕ／Ｌ）を置き37℃で10分間反応を行ない、２％ＳＤ
Ｓ20μｌで反応を止めた後、スポットスキャナーＣＳ−
9000で500nm における吸光度を測定した。結果を表２に
示した。

【００２８】実施例２オリーブ油（10mMになるように10％アラビアゴムで超音
波処理分散したもの）0.1ml 、0.2 Ｍトリス−塩酸緩衝
液（pH8.6）0.2ml 、40mM塩化カルシウム0.05ml、40mM
ＡＴＰ0.05ml、40mM塩化マグネシウム0.05ml、0.1 Ｍデ
オキシコール酸ナトリウム0.1ml 、コ・リパーゼ（400
Ｕ／ml）0.05ml、グリセロールオキシダーゼ（400Ｕ／m
l）0.1ml 、ペルオキシダーゼ（100Ｕ／ml）0.05ml、20
mM４−アミノアンチピリン0.1ml 、20mMフェノール0.1m
l 、モノグリセリドリパーゼ（30Ｕ／ml）0.05ml及び精
製水0.05mlから成る組成の反応液100 μｌをナイロン製
膜にスポット後、乾燥させた。この部分にリパーゼ活性
の高い血清検体（425Ｕ／Ｌ）20μｌを置き、37℃で10
分間反応後２％ＳＤＳ２０μｌで反応を止めた後、吸光
度（500nm）を測定した。結果を表２に示した。

【００２９】実施例３トリオレイン（実施例１と同じ処理をしたもの）0.1ml
、0.2 Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.6）0.2ml、40mM塩
化カルシウム0.05ml、40mM ＡＴＰ0.05ml、40mM塩化マ
グネシウム0.05ml、0.1 Ｍデオキシコール酸ナトリウム
0.1 ml、コ・リパーゼ（400Ｕ／ml）0.05ml、グリセロ
キナーゼ（10Ｕ／ml）0.05ml、グリセロリン酸デヒドロ
ゲナーゼ（30Ｕ／ml）0.1ml 、10mM ＮＡＤ0.1 ml、ジ
アフォラーゼ（40Ｕ／ml）0.05ml及び0.25％ニトロテト
ラゾリウムブルー0.1mlから成る組成の反応液50μｌを
濾紙にしみ込ませた。乾燥後、実施例２で用いたヒト血
清20μｌを置き、37℃で10分間反応後２０％ＳＤＳ２０
μｌで反応を止め550nm の吸光度を測定した。結果を表
２に示した。

【００３０】

【表２】

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】(a)トリグリセリド、(b)ジグリセリド及び
トリグリセリドに実質的に作用しないモノグリセリドリ
パーゼ並びに(c)グリセリン測定試薬を含有することを
特徴とするドライケミストリー用膵リパーゼ測定試薬。
【請求項２】トリグリセリド（ａ）が、天然の動植物
油又は炭素数14〜20の合成もしくは半合成長鎖脂肪酸ト
リグリセリドである請求項１記載の測定試薬。
【請求項３】モノグリセリドリパーゼ（ｂ）が、バチ
ルス・ステアロサーモフィラスH-165 由来のモノグリセ
リドリパーゼである請求項１記載の測定試薬。
【請求項４】グリセリン測定試薬（ｃ）が、グリセロ
キナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼとの組み合せ、
グリセロキナーゼとグリセロリン酸デヒドロキナーゼと
の組み合せ、グリセロールオキシダーゼ及びグリセロー
ルデヒドロゲナーゼより選ばれた酵素、並びに発色試薬
より構成されるものである請求項１記載の測定試薬。
【請求項５】フィルムが、ナイロンまたは濾紙である
請求項１記載の測定試薬。