JP3038433B2

JP3038433B2 - ヤマノイモえそモザイクウイルスの精製法及びその遺伝子

Info

Publication number: JP3038433B2
Application number: JP10275498A
Authority: JP
Inventors: 亨近藤
Original assignee: 青森県
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2000-05-08
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: JP2000102386A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヤマノイモえそモ
ザイクウイルスの精製法、そのウイルス由来のDNA 及び
タンパク質、並びにヤマノイモ属植物のえそモザイク病
の診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ナガイモは栄養繁殖性作物であり、現在
でも多くの株がウイルスに感染しており、収量の著しい
低下を示している。現状では、他の植物ウイルス病と同
様に、その感染ウイルスの排除に有効な薬剤がない。こ
の対策として、ナガイモでは茎頂培養によるウイルスフ
リー株の生産が行われているが、圃場での再感染が問題
となっている。

【０００３】えそモザイク病は、ナガイモに発症するウ
イルス病の一つであり、その原因ウイルスは、ヤマノイ
モえそモザイクウイルスであると報告されている。この
ウイルスは、長さ約660nmのひも状粒子であり、アブラ
ムシ伝搬性であることから、現在までのところCarlavir
usと考えられているが、確定していない。

【０００４】えそモザイク病を迅速に診断できる手段が
あれば、このウイルス病による被害を大幅に軽減でき
る。しかしながら、このウイルス粒子に対する抗血清を
用いたウエスタンブロット法による診断は可能となって
いるものの、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等の遺伝子
を利用した診断方法は未だ確立されていない。この原因
の一つとして、このウイルスがヤマノイモ属植物以外に
宿主が見つかっておらず、また、ヤマノイモ属植物特有
の粘質物等の存在のため、罹病葉からのウイルス粒子の
精製が困難であることが挙げられている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、ヤマノ
イモえそモザイクウイルス粒子の精製が困難であること
が、遺伝子を利用した効率的な診断方法を確立するため
の大きな障害となっている。このため、本発明は、ヤマ
ノイモえそモザイクウイルス粒子に対する効率的な精製
方法を確立することを第一の目的とし、さらに、そのウ
イルス粒子よりウイルス遺伝子を単離し、その配列に基
づきえそモザイク病に対する迅速な診断方法を確立する
ことを第二の目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、まず、ヤマノイモ
えそモザイクウイルス粒子を精製する際に、精製がある
程度進んだ段階でドリセラーゼ処理をし、ウイルス精製
の最終段階で有機溶媒処理を行うことにより、効率的に
ウイルス粒子を精製できることを見出し、更に、その精
製したウイルス粒子からウイルス遺伝子を単離し、その
塩基配列を解析した。これらの知見に基づき本発明は完
成されたものである。

【０００７】即ち、本発明の第一は、ヤマノイモえそモ
ザイクウイルス粒子を精製する方法において、ドリセラ
ーゼを遠心分離を行った後に使用すること及び／又は有
機溶媒を塩化セシウム密度勾配遠心を行った後に使用す
ることを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルス粒
子の精製法である。また、本発明の第二は、以下の(a)
〜(c) に示す核酸である。 (a) 配列番号１記載の塩基配列により表されるDNA (b) 配列番号１記載の塩基配列において１若しくは複数
個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列に
より表され、かつ(a) のDNAと同様の機能を有するDNA (c) (a) 又は(b) のDNAと相同なRNA

【０００８】更に、本発明の第三は、以下の(a) 又は
(b) に示すタンパク質である。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたア
ミノ酸配列により表され、かつ(a) のタンパク質と同様
の機能を有するタンパク質

【０００９】更に、本発明の第四は、配列番号１記載の
塩基配列により表されるDNAの一部と同一又は相補的な
塩基配列を有する標識化DNA又はRNAが、ヤマノイモ属植
物から抽出したRNAとハイブリダイズするかどうかによ
りヤマノイモえそモザイクウイルスの感染の有無を判別
することを特徴とするヤマノイモ属植物のえそモザイク
病診断方法、及び配列番号１記載の塩基配列により表さ
れるDNAの一部と同一及び相補的な塩基配列により表さ
れる２種類のオリゴヌクレオチドを作製し、これらのオ
リゴヌクレオチドとヤマノイモ属植物から抽出したRNA
とをPCRの起こり得る条件で混合し、増幅産物が生じた
かどうかによりヤマノイモえそモザイクウイルスの感染
の有無を判別することを特徴とするヤマノイモ属植物の
えそモザイク病の診断方法である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。（１）第一発明（ウイルス粒子の精製法）本発明のウイルス粒子の精製法は、ドリセラーゼ（登録
商標）を遠心分離を行った後に使用すること及び／又は
有機溶媒を塩化セシウム密度勾配遠心を行った後に使用
することを特徴とするものである。ウイルス粒子の精製
にドリセラーゼを利用することは既に試みられてきてい
たが、当時の利用法では良好な効果は認められなかった
(藤田ら、1992）。しかし、本発明のように遠心分離を
行った後の段階というある程度ウイルス精製が進んだ段
階でドリセラーゼ処理することにより、植物由来の粘質
物を効果的に除去することができる。

【００１１】ウイルス粒子の精製に、有機溶媒を使用す
ることも一般に行われていることである。しかし、これ
までの植物ウイルス精製法では、磨砕後早い段階で有機
溶媒処理するのが通常であったが、ナガイモにこれを適
用するとウイルスの減収が大きく、適当でなかった。塩
化セシウム密度勾配遠心を行った後の段階というウイル
ス精製が最終段階まで進んだ時点で有機溶媒処理をする
と、ウイルスの減収を抑え、ウイルスの精製度を上げる
ことができる。使用する有機溶媒としては、従来からウ
イルス粒子の精製に使用されてきたものでよく、例え
ば、クロロホルム、四塩化炭素などを使用することがで
きる。

【００１２】（２）第二発明（核酸）本発明の核酸は、以下の(a) 〜(c) に示す核酸を包含す
る。 (a) 配列番号１記載の塩基配列により表されるDNA (b) 配列番号１記載の塩基配列において１若しくは複数
個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列に
より表され、かつ(a) のDNAと同様の機能を有するDNA (c) (a) 又は(b) のDNAと相同なRNA

【００１３】ここで、「(a) のDNAと同様の機能を有す
る」とは、例えば、(a) のDNAと同様にウイルス抵抗性
植物の作出に利用できるという意味である。また、
「(a) 又は(b) のDNAと相同なRNA 」とは、(a) 又は(b)
のDNA中のチミンをウラシルに置き換えたRNAを意味す
る。(a) に示すDNAは、ヤマノイモえそモザイクウイル
スのゲノムの3'末端領域の塩基配列に関するもので、こ
の領域はウイルス複製酵素遺伝子（核内封入体ｂ遺伝
子）の一部分とウイルス外被タンパク質遺伝子全体、お
よび3'非翻訳領域を含んでいる。配列番号１に示すよう
に、このDNAの塩基配列は、2〜4番のTTTの読み取り枠で
始まり、1673〜1675番のTAGで終了する不完全ではある
が長大なオープンリーディングフレーム(ORF)を有す
る。

【００１４】(a) に示すDNAは、例えば、以下の方法に
より得ることができる。まず、モザイク症状を呈するナ
ガイモからウイルス粒子を単離し、精製する。ウイルス
粒子の精製は、常法に従って行ってもよいが、上述の本
発明の精製法に従って行うのが好ましい。次に、ウイル
ス粒子からRNAを抽出する。RNAの抽出は常法に従って行
うことができる。抽出したRNAからcDNAを作製し、このc
DNAを鋳型として、3'RACE法に従って、特定のDNA 断片
を増幅する。これにより本発明のDNAを作製することが
できる。また、(a) に示すDNAを含むプラスミドpGEMCYV
は工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17000
として寄託されている（寄託日：平成10年９月21日）。

【００１５】(b) に示すDNAは、例えば、(a) に示すDNA
を鋳型とし、鋳型とするDNAと完全に同一又は相補的で
はないプライマーを用いてPCRを行うことにより作製す
ることができる。(c) に示すRNAは、例えば、(a) 又は
(b) のDNAと相補的なDNAを鋳型として、RNAポリメラー
ゼを用いて合成することができる。これまでに、ウイル
ス外被タンパク質遺伝子、ウイルス複製酵素遺伝子等ウ
イルス由来の遺伝子を植物に導入し、ウイルス抵抗性植
物を作出した例が多数報告されていることから、本発明
のDNAを植物に導入することにより、ヤマノイモ属のえ
そモザイク病の抵抗性植物の育種が可能となる。

【００１６】（３）タンパク質本発明のタンパク質は、以下の(a) 及び(b) に示すタン
パク質を包含する。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタン
パク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたア
ミノ酸配列により表され、かつ(a) のタンパク質と同様
の機能を有するタンパク質ここで、「(a) のタンパク質と同様の機能を有する」と
は、例えば、(a) のタンパク質と同様にウイルス抗体の
作製に利用できるという意味である。

【００１７】(a) のタンパク質は、ヤマノイモえそモザ
イクウイルスのウイルス複製酵素の一部分とウイルス外
被タンパク質を含む。このウイルスのアミノ酸配列は、
ポティウイルス科に属するひも状ウイルスに相同的な部
分を有する。本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子等
を含むベクターを大腸菌等に導入し、発現させることに
より製造することができる。本発明のタンパク質、又は
その一部分を抗原としてウサギ等を免疫することにより
特異性の高いウイルス抗体の作製が可能となり、えそモ
ザイク病の診断に利用できる。

【００１８】（４）えそモザイク病の診断方法本発明のえそモザイク病の診断方法の一つは、配列番号
１記載の塩基配列により表されるDNAの一部と同一又は
相補的な塩基配列を有する標識化DNA又はRNAが、ヤマノ
イモ属植物から抽出したRNAとハイブリダイズするかど
うかによりヤマノイモえそモザイクウイルスの感染の有
無を判別することを特徴とするものである。

【００１９】ここで、標識化するDNA又はRNAの長さは、
プローブとして機能する限り、特に限定されないが、70
0 〜800 b 程度が好ましい。DNA等を標識化する手段も
特に限定されず、ジコキシゲニン標識など一般的手法を
使用することができる。ヤマノイモ属植物からのRNA抽
出は、常法に従って行うことができる。また、ハイブリ
ダイゼーションも常法に従って行うことができる。

【００２０】本発明のえそモザイク病の診断方法の別の
一つは、配列番号１記載の塩基配列により表されるDNA
の一部と同一及び相補的な塩基配列により表される２種
類のオリゴヌクレオチドを作製し、これらのオリゴヌク
レオチドとヤマノイモ属植物から抽出したRNAとをPCRの
起こり得る条件で混合し、増幅産物が生じたかどうかに
よりヤマノイモえそモザイクウイルスの感染の有無を判
別することを特徴とするものである。

【００２１】ここで、作製するオリゴヌクレオチドの長
さは、PCR用のプライマーとして機能する限り、特に限
定されないが、20〜25b 程度が好ましい。また、「PCR
の起こり得る条件」とは、オリゴヌクレオチドとヤマノ
イモ属植物から抽出したRNAとがハイブリダイズするこ
とができれば、PCR により増幅断片が得られような条件
をいい、例えば、鋳型とするRNAとプライマーとするオ
リゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ、dNTP、塩類などと
共存させ、一定のサイクルで加熱を繰り返すような条件
をいう。

【００２２】

【実施例】〔実施例１〕ナガイモからのウイルス粒子
の精製モザイク症状を呈するナガイモ葉100gに800mlの0.2Mク
エン酸緩衝液(10mM DIECA,5mM EDTA, 0.4% L-アスコル
ビン酸, 0.5%チオグリコール酸, 2% PVP,pH5.8)を加
え、ミキサーで3〜6分間破砕した。破砕液を50℃、7〜8
分間処理、急冷後、二重ガーゼでろ過し、4000g、10分
間、4℃で遠心した。得られた上清に1%（v/v）の1M塩化
カルシウム溶液、5%（v/v）の0.2Mリン酸水素二ナトリ
ウムを加え20分間、4℃で攪拌し、6000g、10分間、4℃
で遠心した。得られた上清に5%（v/v）のTritonX-100を
加え2時間、4℃で攪拌し、90,000g、90分間、4℃で遠心
した。得られた沈殿に100mlの0.1Mリン酸緩衝液（0.1%
チオグリコール酸、pH6.0）を加え、氷冷しながらテフ
ロンホモジナイザーで再懸濁後、1%（w/v）のドリセラ
ーゼを加え28℃で2〜3時間攪拌し、6000g、10分間、4℃
で遠心した。得られた上清を20%（w/v）ショ糖を含む0.
05Mホウ酸緩衝液の上部に重層して、90,000g、2時間、4
℃で遠心した。得られた沈殿に8mlの0.05Mホウ酸緩衝液
を加え、氷冷しながらテフロンホモジナイザーで再懸濁
後、6000g、10分間、4℃で遠心した。得られた上清を、
20%（w/v）ショ糖及び0〜30%（w/v）の密度勾配がある
塩化セシウムを含む0.05Mホウ酸緩衝液の上部に重層し
て、180,000g、3時間、4℃で遠心した。ウイルスを含む
分画を採取し、0.01Mホウ酸緩衝液で一晩透析後、等量
のクロロホルム：四塩化炭素(1：1)を加え15分間攪拌
し、マイクロ遠心機で10,000rpm、5分間遠心した。得ら
れた水層を精製ウイルス液とした。260nmにおける吸光
係数をおおよそE^0.1%=2.5としてウイルス濃度を算出し
たところ、約40μgのウイルス粒子が得られたと見積も
られた。精製ウイルスをウサギに免疫したところ、得ら
れた抗血清は、ウエスタンブロット法、ティシュープリ
ントイムノブロット法、免疫電顕法での診断に使用可能
であった。

【００２３】〔実施例２〕ウイルスゲノムRNAの抽出ウイルス粒子13.2μgを含む精製ウイルス液100μlに2μ
l のProteinase K(14.4mg/ml : Boehringer Mannheim
社) 及び10μlの10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加
え、37℃、1時間反応させた。続いて、滅菌水を加えて2
00μlにメスアップし、TE飽和フェノール：クロロホル
ム（1：1）混液を200μl加えて5分間激しく攪拌後、マ
イクロ遠心機で15,000rpm、5分間遠心した。得られた水
層を新しいマイクロチューブに移し、再び同様にTE飽和
フェノール：クロロホルム処理、遠心という操作を3回
繰り返した。得られた水層に、等量のクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（24：1）を加えて5分間激しく攪拌
後、マイクロ遠心機で15,000rpm、5分間遠心した。得ら
れた水層を新しいマイクロチューブに移し、これに1/10
量の3M酢酸ナトリウム及び2.5倍量のエタノールを加
え、−30℃で一晩静置した後、15,000rpmで10分間遠心
した。得られた沈殿を80%エタノールで洗浄後、風乾
し、10μlの滅菌水に溶解してウイルスゲノムRNA溶液と
した。

【００２４】〔実施例３〕 cDNAの合成及びクローニン
グナガイモえそモザイク病の病原ウイルスとしては、これ
までCarlavirusが予想されていたので、cDNAの合成はCa
rlavirus用に作製されたディジェネレートプライマーを
利用した3'RACE法を試みた。幾つかのプライマーの組み
合わせを試みたが、多くの場合で予想されるサイズのPC
R産物が得られず、ある試験でのみ、予想されるサイズ
のPCR産物が得られた。しかしながら、このPCR産物をク
ローニングして塩基配列を決定したところ、この増幅断
片にはディジェネレートプライマーの配列がみられず、
アダプタープライマーのみによる予想外の増幅産物であ
ることが判明した。後述するが、このcDNAクローンはナ
ガイモに感染するウイルス由来であることが確認され
た。以下に、このクローンの作製について記述する。

【００２５】cDNAの合成には、RNA PCR Kit（TaKaRa
社）及びTaKaRa Ex Taq（TaKaRa社）を用いた。1μlの
ウイルスゲノムRNA、1μlの−鎖プライマー(10μM：ア
ダプター配列付きOligo(dT)プライマー；LIFE TECHNOLO
GIES 社)、2μlの滅菌水を混合し、ミネラルオイルを加
えてから70℃で10分間保温した後、氷上に1分間置い
た。この混合液に4μlのMgCl₂Solution、2μlの10×PC
R Buffer II 、各2μlのdGTP、dATP、dTTP、dCTP、1μl
のRNase Inhibitor、1μlのReverse Transcriptaseを加
え混合した後、42℃で60分間、99℃で5分間、5℃で5分
間保温し、逆転写反応産物とした。次に、5μlの10×Ex
Taq Buffer 、4μlのdNTP Mixture （各2.5mM）、33μ
lの滅菌水、1μlの＋鎖プライマー（10μM：Carlavirus
用ディジェネレートプライマー）、1μlの−鎖プライマ
ー(10μM：アダプター配列のみのプライマー；LIFE TEC
HNOLOGIES 社)、5μlの逆転写反応産物を混合し、ミネ
ラルオイルを加えた後、94℃で1分間保温し、1μlのTaK
aRa Ex Taqを加えPCRを行った。PCRは、変成：98℃、20
秒間；アニーリング及び伸長反応：68℃、5分間の条件
で35サイクル行った。得られたPCR産物は1％アガロース
ゲル電気泳動を行い、約1.9kbpの増幅DNAを切り出してW
izard PCR Preps DNA Purification System（Promega
社）により精製した。精製DNAをプラスミドベクターpGE
M-T（Promega社）に連結した後、大腸菌JM109を形質転
換することによりクローニングした。このクローンをpG
EMCYVと命名した。

【００２６】〔実施例４〕塩基配列の解析 pGEMCYVからプローブを作製し、精製ウイルスから抽出
したゲノムRNA及びえそモザイク病ナガイモ葉のtotal R
NAを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行ったと
ころ、明らかな反応がみられたことから、得られたcDNA
クローンはナガイモに感染するウイルス由来であること
が確認されたので、このcDNAの塩基配列を決定、解析し
た。

【００２７】塩基配列の決定は、ダイデオキシ法によっ
て行った。反応は、Thermo Sequenase fluorescent lab
elled primer cycle sequencing kit（Amersham社）、
プライマーはM13 Reverse Dye Primerあるいは-21M13 D
ye Primer （PERKIN ELMER社）を用いて行い、373 DNA
Sequencer（PERKIN ELMER 社）により塩基配列を決定し
た。

【００２８】このようにして決定した塩基配列からタン
パク質をコードするオープンリーディングフレーム（OR
F）を検索した。次いで、塩基配列及び一般的遺伝コー
ドを用いて翻訳したORFのアミノ酸配列について、DDB
J、GenBank、EMBLに代表される遺伝子データベースに登
録されている遺伝子あるいはタンパク質データとの相同
性の検索、及び遺伝子構造の比較などの解析を行った。
その結果、cDNAクローンpGEMCYVは、ポティウイルス科
の新属候補であるMacluravirusに属するウイルスに由来
するクローンであることが明かとなった。更に、pGEMCY
Vの塩基配列から推定されるウイルス外被タンパク質コ
ア領域のアミノ酸配列が、他のMacluravirusであるNarc
issus latent virus 及びMaclura mosaic virus （現時
点ではこの2種のみがMacluravirusの種候補）の外被タ
ンパク質コア領域のアミノ酸配列とそれぞれ56％、47％
の相同性を示したことから、クローンが由来するウイル
スはMacluravirusの新種であることが明かとなった。

【００２９】〔実施例５〕ノーザンハイブリダイゼー
ションによるウイルス検出ナガイモの葉片(0.2g)からフェノール／SDSとLiClを用
いた方法(Verwoerdら、1989)によりtotal RNAを抽出し
た。得られたtotalRNAは滅菌水に溶解し、10μgをホル
ムアルデヒド変成1.2%アガロースゲル電気泳動を行っ
た。泳動後、RNAをナイロンメンブレン(Amersham社のHy
bond-N+)に転写しUV架橋によりメンブレンに固定した。
このメンブレンにDIG Easy Hyb（Boehringer Mannheim
社)を加え65℃、1時間のプレハイブリダイゼーションを
行い、その後ウイルスプローブを添加したDIG Easy Hyb
を加え、65℃、一晩ハイブリダイゼーションを行っ
た。ウイルスプローブは、配列番号１の399〜1155番の
塩基配列により表されるDNAを転写ベクターによってジ
ゴキシゲニン(DIG)標識して発現させたRNAを用いた。ハ
イブリダイゼーションの後、メンブレンは0.3M NaCl-0.
03M クエン酸溶液(2×SSC)で2回洗浄し、次いで1μg/ml
RNase A を含む2×SSCで処理し、再び2×SSCで2回洗浄
した。メンブレンを洗浄後、DIG Wash and Block Buffe
r SetおよびDIG Luminescent Detection Kit（Boehring
er Mannheim 社)を用いて発光反応を行い、X線フィルム
に感光させてシグナルを検出した。結果は図１に示され
る通りであった。ウイルスフリー株から抽出したtotal
RNAは、全くシグナルが観察されないのに対し、一般栽
培株から抽出したtotal RNAおよび精製ウイルスから抽
出したゲノムRNAは、約10kbase付近に明らかなシグナル
が観察された。このことから、一般栽培株のウイルス感
染が確認された。

【００３０】〔実施例６〕 RT-PCRによるウイルス検出ナガイモの葉片(0.2g)からフェノール／SDSとLiClを用
いた方法(Verwoerdら、1989)によりtotal RNAを抽出し
た。得られたtolal RNAは30μlの滅菌水に溶かし、これ
を鋳型にして逆転写PCR（RT-PCR）を行った。RT-PCR
は、RNAPCR Kit（TaKaRa社)を用いてを行った。−鎖プ
ライマー及び逆転写酵素を含む反応液にtotal RNA溶液
0.5μlを加え、反応：42℃、15分間；変成：99℃、5分
間；急冷：5℃、5分間行った。得られた反応液に、＋鎖
プライマー及びDNA合成酵素を含むPCR反応液を加え、変
成：95℃、1分間；アニーリング及び伸長反応：58℃、1
分間の条件で35サイクルのPCRを行った。用いたプライ
マー配列は、−鎖プライマーが5'-CCAGAGACACCACGATGTT
A-3'、＋鎖プライマーが5'-CCAACAAAGAAACCATCTGT-3'で
あり、各々配列番号１の1197〜1216番目及び836〜855番
目に相当する配列である。PCR産物は、1.2%アガロース
ゲル電気泳動により分析した。結果は図２に示される通
りであった。ウイルスフリー株から抽出したtotalRNAを
用いて行ったRT-PCRにおいては増幅産物が全く観察され
ないのに対し、一般栽培株から抽出したtotalRNAおよび
精製ウイルスから抽出したゲノムRNAを用いて行ったRT-
PCRにおいては、380bp付近に明瞭な特異的増幅産物が観
察された。この大きさは、ナガイモえそモザイク病ウイ
ルスの遺伝子配列から予想される増幅産物の論理的サイ
ズ（381bp）と非常によく一致しており、このことか
ら、一般栽培株のウイルス感染が確認された。

【００３１】

【発明の効果】本発明は、ヤマノイモ属植物のえそモザ
イク病に対する迅速かつ効率的な診断方法を提供する。

【００３２】

【配列表】 SEQUENCE LISTENING 〈110 〉Aomori prefecture 〈120 〉Yamanoimo-eso-mozaiku-uirus no seiseihou oyobi sonoidenshi 〈130 〉P98-0418 〈130 〉2 〈210 〉1 〈211 〉1906 〈212 〉DNA 〈213 〉unknown 〈400 〉 g ttt gac att tta tac agc ata cgt tcc aat ttc ttt tgc gaa gag 46 Phe Asp Ile Leu Tyr Ser Ile Arg Ser Asn Phe Phe Cys Glu Glu 1 5 10 15 gat agg cag gat gca aaa act gcc atg gca cac atg tat cgc gag ttt 94 Asp Arg Gln Asp Ala Lys Thr Ala Met Ala His Met Tyr Arg Glu Phe 20 25 30 gtt tac aca ccc atc cac acc ata acg ggg cag gtt ctt gtc aag aag 142 Val Tyr Thr Pro Ile His Thr Ile Thr Gly Gln Val Leu Val Lys Lys 35 40 45 ctt gga aat aac agt gga cag cca agc act gtt gtt gat aac acg ctt 190 Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu 50 55 60 atc ctg atg ctg tca ttt cta tac gca tac ata cgg aaa aca aat gat 238 Ile Leu Met Leu Ser Phe Leu Tyr Ala Tyr Ile Arg Lys Thr Asn Asp 65 70 75 aga aca tgt gct caa att aac cag cgt ttc aaa ttt gtg tgt aat ggt 286 Arg Thr Cys Ala Gln Ile Asn Gln Arg Phe Lys Phe Val Cys Asn Gly 80 85 90 95 gat gac aac aag tac tca gtt tca cct gaa ttc cac gaa gaa ttc agc 334 Asp Asp Asn Lys Tyr Ser Val Ser Pro Glu Phe His Glu Glu Phe Ser 100 105 110 gga gat ttt tca agg gag atc gct gaa cta ggt ttg aca tac gaa ttc 382 Gly Asp Phe Ser Arg Glu Ile Ala Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Glu Phe 115 120 125 gat gac ttg aca gct gac ata acg caa aac ccg tac atg agt cta gtg 430 Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ile Thr Gln Asn Pro Tyr Met Ser Leu Val 130 135 140 atg gta cga acg cct ggt ggc att ggt ttc caa ctc aat cct gag aga 478 Met Val Arg Thr Pro Gly Gly Ile Gly Phe Gln Leu Asn Pro Glu Arg 145 150 155 att att gct att gtt cag tgg att aaa cgg ggt gat gtt ctc caa gca 526 Ile Ile Ala Ile Val Gln trp Ile Lys Arg Gly Asp Val Leu Gln Ala 160 165 170 175 tcg caa gca gca ttt gca gct atg atc gaa gca ttc aat gat ccg tgg 574 Ser Gln Ala Ala Phe Ala Ala Met Ile Glu Ala Phe Asn Asp Pro trp 180 185 190 tta ttc gga gtt ttg cac ttg tat ttt gtg tgg cta ctt tgc caa tac 622 Leu Phe Gly Val Leu His Leu Tyr Phe Val trp Leu Leu Cys Gln Tyr 195 200 205 agg gaa gaa att agg tac gct atg gat cat gac ctt gga gct gtt tgt 670 Arg Glu Glu Ile Arg Tyr Ala Met Asp His Asp Leu Gly Ala Val Cys 210 215 220 tac atg gat gcc tac caa gtt tat gct ttg cat tac gac acg agg gat 718 Tyr Met Asp Ala Tyr Gln Val Tyr Ala Leu His Tyr Asp Thr Arg Asp 225 230 235 gac gtt aat gat ttg caa att gat tca gcc agt tgc gag att gag aaa 766 Asp Val Asn Asp Leu Gln Ile Asp Ser Ala Ser Cys Glu Ile Glu Lys 240 245 250 255 act gtg gtt gtt gct ggc tca aca cag cac atc agt ctt caa atg gac 814 Thr Val Val Val Ala Gly Ser Thr Gln His Ile Ser Leu Gln Met Asp 260 265 270 ctg agc act cca gtg caa ttg cca aca aag aaa cca tct gtg gaa gac 862 Leu Ser Thr Pro Val Gln Leu Pro Thr Lys Lys Pro Ser Val Glu Asp 275 280 285 aaa gga aaa gct ctt gcc aca cct tca aca aca gct aca ttg cca gat 910 Lys Gly Lys Ala Leu Ala Thr Pro Ser Thr Thr Ala Thr Leu Pro Asp 290 295 300 tca agc cag ggg cac caa cca gtt gaa gaa cca aac aat aac cca gac 958 Ser Ser Gln Gly His Gln Pro Val Glu Glu Pro Asn Asn Asn Pro Asp 305 310 315 aca gtg gat gaa gag gac att gaa tgg cga atc cca gca ata caa aaa 1006 Thr Val Asp Glu Glu Asp Ile Glu trp Arg Ile Pro Ala Ile Gln Lys 320 325 330 335 ggt ttt ggc cac tac aaa atc cca aag gtc aaa gga aag aga ata tgg 1054 Gly Phe Gly His Tyr Lys Ile Pro Lys Val Lys Gly Lys Arg Ile trp 340 345 350 aac cca aag att ttg aag aaa atc gca cat gag caa ttc acg acg aca 1102 Asn Pro Lys Ile Leu Lys Lys Ile Ala His Glu Gln Phe Thr Thr Thr 355 360 365 tcg cag atg gtg aca aca gat aaa ttg gag aaa tgg act gag gag gtc 1150 Ser Gln Met Val Thr Thr Asp Lys Leu Glu Lys trp Thr Glu Glu Val 370 375 380 aaa aga gat ctt gtg gtg aca aat gaa aca gat ttc cag ata tgc tta 1198 Lys Arg Asp Leu Val Val Thr Asn Glu Thr Asp Phe Gln Ile Cys Leu 385 390 395 aca tcg tgg tgt ctc tgg tgt gct aac aat ggt aca tca tct gag tta 1246 Thr Ser trp Cys Leu trp Cys Ala Asn Asn Gly Thr Ser Ser Glu Leu 400 405 410 415 gac gca tca caa ttt atg gaa gtc cat gca aac gga cag ata atg ggg 1294 Asp Ala Ser Gln Phe Met Glu Val His Ala Asn Gly Gln Ile Met Gly 420 425 430 att cca att caa att ttt gtt gaa ccc gca atc cag cac gga gga ctg 1342 Ile Pro Ile Gln Ile Phe Val Glu Pro Ala Ile Gln His Gly Gly Leu 435 440 445 cgt aaa gtg atg aga cat ttc agt gga atc acg agc aaa atg ttg tct 1390 Arg Lys Val Met Arg His Phe Ser Gly Ile Thr Ser Lys Met Leu Ser 450 455 460 gaa ggg gga aaa atg aca gcg tgg ggc agg aaa agg ggt ttc acc caa 1438 Glu Gly Gly Lys Met Thr Ala trp Gly Arg Lys Arg Gly Phe Thr Gln 465 470 475 aga tca atg ata cca tat gcc ttt gat ttc ttc gtc cca act gat acg 1486 Arg Ser Met Ile Pro Tyr Ala Phe Asp Phe Phe Val Pro Thr Asp Thr 480 485 490 495 acg cca aaa aca atc agg gag cag ctg agt caa agc aag gcc gca gct 1534 Thr Pro Lys Thr Ile Arg Glu Gln Leu Ser Gln Ser Lys Ala Ala Ala 500 505 510 att ggg cgt ggc gtt caa agg gtg atg ctt ctt gat ggg aaa gtt cac 1582 Ile Gly Arg Gly Val Gln Arg Val Met Leu Leu Asp Gly Lys Val His 515 520 525 ggg agc cgc aca agt tac gag aga cac acg gat aac gac cag gac gag 1630 Gly Ser Arg Thr Ser Tyr Glu Arg His Thr Asp Asn Asp Gln Asp Glu 530 535 540 tat gaa cat gga ggg gcg gaa gat cag cgc cca gct tta tat 1672 Tyr Glu His Gly Gly Ala Glu Asp Gln Arg Pro Ala Leu Tyr 545 550 555 tagtaaggtt tgttttgcaa caaccattac tactagtatt agaagaatta agtttaatt 1732 ctttcacaat cttcactttt aacttttgcg tttatgagtt aaatgggagt ttttgtggg 1792 ttttcttcca atgctcagca accctcaacg cactgcattt cgttttcttc tttaagctt 1852 agctggacgc tcagctggtt tcgcatagcg aaacttatcc tgttccatag aagg 1906 〈210 〉2 〈211 〉557 〈212 〉PRT 〈213 〉unknown 〈400 〉 Phe Asp Ile Leu Tyr Ser Ile Arg Ser Asn Phe Phe Cys Glu Glu Asp 1 5 10 15 Arg Gln Asp Ala Lys Thr Ala Met Ala His Met Tyr Arg Glu Phe Val 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile His Thr Ile Thr Gly Gln Val Leu Val Lys Lys Leu 35 40 45 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Ile 50 55 60 Leu Met Leu Ser Phe Leu Tyr Ala Tyr Ile Arg Lys Thr Asn Asp Arg 65 70 75 80 Thr Cys Ala Gln Ile Asn Gln Arg Phe Lys Phe Val Cys Asn Gly Asp 85 90 95 Asp Asn Lys Tyr Ser Val Ser Pro Glu Phe His Glu Glu Phe Ser Gly 100 105 110 Asp Phe Ser Arg Glu Ile Ala Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Glu Phe Asp 115 120 125 Asp Leu Thr Ala Asp Ile Thr Gln Asn Pro Tyr Met Ser Leu Val Met 130 135 140 Val Arg Thr Pro Gly Gly Ile Gly Phe Gln Leu Asn Pro Glu Arg Ile 145 150 155 160 Ile Ala Ile Val Gln trp Ile Lys Arg Gly Asp Val Leu Gln Ala Ser 165 170 175 Gln Ala Ala Phe Ala Ala Met Ile Glu Ala Phe Asn Asp Pro trp Leu 180 185 190 Phe Gly Val Leu His Leu Tyr Phe Val trp Leu Leu Cys Gln Tyr Arg 195 200 205 Glu Glu Ile Arg Tyr Ala Met Asp His Asp Leu Gly Ala Val Cys Tyr 210 215 220 Met Asp Ala Tyr Gln Val Tyr Ala Leu His Tyr Asp Thr Arg Asp Asp 225 230 235 240 Val Asn Asp Leu Gln Ile Asp Ser Ala Ser Cys Glu Ile Glu Lys Thr 245 250 255 Val Val Val Ala Gly Ser Thr Gln His Ile Ser Leu Gln Met Asp Leu 260 265 270 Ser Thr Pro Val Gln Leu Pro Thr Lys Lys Pro Ser Val Glu Asp Lys 275 280 285 Gly Lys Ala Leu Ala Thr Pro Ser Thr Thr Ala Thr Leu Pro Asp Ser 290 295 300 Ser Gln Gly His Gln Pro Val Glu Glu Pro Asn Asn Asn Pro Asp Thr 305 310 315 320 Val Asp Glu Glu Asp Ile Glu trp Arg Ile Pro Ala Ile Gln Lys Gly 325 330 335 Phe Gly His Tyr Lys Ile Pro Lys Val Lys Gly Lys Arg Ile trp Asn 340 345 350 Pro Lys Ile Leu Lys Lys Ile Ala His Glu Gln Phe Thr Thr Thr Ser 355 360 365 Gln Met Val Thr Thr Asp Lys Leu Glu Lys trp Thr Glu Glu Val Lys 370 375 380 Arg Asp Leu Val Val Thr Asn Glu Thr Asp Phe Gln Ile Cys Leu Thr 385 390 395 400 Ser trp Cys Leu trp Cys Ala Asn Asn Gly Thr Ser Ser Glu Leu Asp 405 410 415 Ala Ser Gln Phe Met Glu Val His Ala Asn Gly Gln Ile Met Gly Ile 420 425 430 Pro Ile Gln Ile Phe Val Glu Pro Ala Ile Gln His Gly Gly Leu Arg 435 440 445 Lys Val Met Arg His Phe Ser Gly Ile Thr Ser Lys Met Leu Ser Glu 450 455 460 Gly Gly Lys Met Thr Ala trp Gly Arg Lys Arg Gly Phe Thr Gln Arg 465 470 475 480 Ser Met Ile Pro Tyr Ala Phe Asp Phe Phe Val Pro Thr Asp Thr Thr 485 490 495 Pro Lys Thr Ile Arg Glu Gln Leu Ser Gln Ser Lys Ala Ala Ala Ile 500 505 510 Gly Arg Gly Val Gln Arg Val Met Leu Leu Asp Gly Lys Val His Gly 515 520 525 Ser Arg Thr Ser Tyr Glu Arg His Thr Asp Asn Asp Gln Asp Glu Tyr 530 535 540 Glu His Gly Gly Ala Glu Asp Gln Arg Pro Ala Leu Tyr 545 550 555

【図面の簡単な説明】

【図１】ナガイモ葉片をサンプルとしてノーザンハイブ
リダイゼーションの結果を示す写真である。

【図２】ナガイモ葉片をサンプルとしてＲＴ−ＰＣＲの
結果を示す写真である。

フロントページの続き (56)参考文献日本植物病理学会報，44（１），１− ５（1978) 日本植物病理学会報，61（１），41− 43（1995) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８（４），321−329（1984) 国立予防衛生研究所学友会編「改訂二版ウイルス実験学総論」丸善株式会社（昭和48年６月１日発行）ｐ．379− 382 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/00 - 7/08 C12N 15/00 - 15/90 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)又は(b)に示す核酸。 (a) 配列番号１記載の塩基配列により表されるDNA (b) (a)のDNAと相同なRNA
【請求項２】配列番号１記載の塩基配列により表され
るDNAの一部と同一又は相補的な塩基配列を有する標識
化DNA又はRNAが、ヤマノイモ属植物から抽出したRNAと
ハイブリダイズするかどうかによりヤマノイモえそモザ
イクウイルスの感染の有無を判別することを特徴とする
ヤマノイモ属植物のえそモザイク病診断方法。
【請求項３】配列番号１記載の塩基配列により表され
るDNAの一部と同一及び相補的な塩基配列により表され
る２種類のオリゴヌクレオチドを作製し、これらのオリ
ゴヌクレオチドとヤマノイモ属植物から抽出したRNAと
をポリメラーゼ連鎖反応の起こり得る条件で混合し、増
幅産物が生じたかどうかによりヤマノイモえそモザイク
ウイルスの感染の有無を判別することを特徴とするヤマ
ノイモ属植物のえそモザイク病の診断方法。