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JP3034969B2 - アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物 - Google Patents

アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物

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JP3034969B2
JP3034969B2 JP3036385A JP3638591A JP3034969B2 JP 3034969 B2 JP3034969 B2 JP 3034969B2 JP 3036385 A JP3036385 A JP 3036385A JP 3638591 A JP3638591 A JP 3638591A JP 3034969 B2 JP3034969 B2 JP 3034969B2
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JP
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nad
dehydrogenase
thio
reduced
amino acid
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成 植田
守 高橋
英生 美崎
茂 生田
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Asahi Kasei Corp
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Asahi Kasei Corp
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Publication date
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Priority to US08/108,736 priority patent/US5780256A/en
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野において重要なアンモニア、α-アミノ酸類、該
α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸、またはこれらのイ
オン体、あるいはこれらを反応生成物とする物質の高感
度定量法および定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に血液中のα-ケト酸を測定するこ
とは臨床検査において、あるいはグルタミン酸等の食品
中のα-アミノ酸類を測定することは食品化学の上、極
めて重要である。例えば、血液化学検査における有機モ
ノカルボン酸の定量検査としてピルビン酸、α-ケトグ
ルタル酸などが測定されている（検査点数早見表，P28
9，社会保険研究所発行，1990年）。特にピルビン酸は
多種にわたる代謝経路の交差点に位置し、種々の病態を
反映することが知られており、一般には乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（日本臨床，第47巻，P496，1989年）やピルベー
トオキシダーゼ（米国特許第4246342号明細書、特公昭6
1-14794号公報）を用いて測定されている。また、血中
のＬ-アラニンは糖尿病のコントロール状態の把握の一
助としての意義が認められており、化学的発光法による
測定法が報告されている（日本臨床化学会年会記録 第
27集，P122，1987年）。
【０００３】さらに、特に血中のアンモニアは、肝機能
障害や尿素サイクルの酵素欠損のある場合などに上昇す
ることが知られており、その測定は、肝硬変、尿毒症な
どの診断に有用である。また、その毒性から、食品や飲
料水等においても測定する意義は大きい。
【０００４】従来、アンモニア、α-ケト酸およびα-ア
ミノ酸類の測定法としては種々の方法が知られており、
大別すると、微量拡散法、イオン交換法、直接比色法、
酵素法等がある。微量拡散法は、密閉した容器内で血液
にアルカリを加え、拡散するアンモニアを酸に捕集して
測定する方法であり、イオン交換法は陽イオン交換樹脂
にアンモニウムイオンを吸着し、アルカリで溶出し、比
色定量する方法であり、直接比色法は、血液を除蛋白
後、アンモニアをインドフェノール反応により比色定量
する方法である。しかし、これらの方法は、いずれも試
料よりアンモニアを分離する操作と、分離したアンモニ
アを定量する操作の二工程よりなるために操作が煩雑で
あるという欠点を有していた。その点、酵素法はその基
質特異性を利用し、生理的なpHと温度条件において反応
を行わせるため、従来の化学的方法に比べてより真の値
に近い定量結果が期待されるばかりでなく、分析操作が
極めて簡単であるという特徴を有している。
【０００５】酵素法によるアンモニア、α-ケト酸また
はα-アミノ酸類の定量は、例えばグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（EC 1.4.1.2,EC 1.4.1.3,EC 1.4.1.4）によ
る下記に示す可逆反応
【０００６】
【化４】
【０００７】により、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ホスフェート）に基づく340nmの吸光度
の変化量として測定されるものである（臨床検査 Vol.
22,No.11,1978,臨時増刊；特公昭57-21995号公報）。し
かしながらこの方法は、血中アンモニアのように含量の
少ないものの測定には感度が不十分であり、また低値で
の精度が悪い等の問題点がある。
【０００８】そこで上記の反応によってアンモニアと等
量に生成したグルタミン酸を更にグルタミン酸オキシダ
-ゼの作用により等量の過酸化水素に転換し、その過酸
化水素を検出することにより、アンモニアを定量する方
法も報告されているが（特開昭60-41500号公報）、これ
も本質的な解決にはなっていない。
【０００９】一方、酵素サイクリング法を用いた高感度
なアンモニアの測定法も報告されている（特開昭62-232
397号公報）。この方法はグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼおよびグルタミン酸オキシダーゼの２つの酵素を使用
し、下記反応
【００１０】
【化５】
【００１１】なる酵素サイクリング反応を形成させ、ア
ンモニアの量に比例して生成する過酸化水素、または消
費される還元型NADPの量を検出するものである。しかし
ながら、グルタミン酸オキシダ-ゼはグルタミン酸以外
にもグルタミン、アスパラギン酸をも基質とするため、
生体試量を被検体とする場合にこれらの影響を受けると
いう欠点を有する（分析化学、Vol.38,P188-192,198
9）。
【００１２】また、他の酵素法として、カルバメートキ
ナーゼ(EC 2.7.2.2)を用いるもの（特開昭59-213399号
公報）、カルバモイルリン酸合成酵素（EC 6.3.4.16）
を用いるもの（特開昭60-47698号公報）が報告されてお
り、これらは高感度測定法としての応用も可能である。
しかし、これらはいずれも上記の酵素によって生成され
たADPを更に他の酵素系を連結させて検出しなければな
らず、煩雑な系になるを免れない。更に、NAD合成酵素
を用いたアンモニアの高感度定量法も報告されているが
（特開昭59-198995号公報、特開昭63-185378号公報）、
これも上記酵素によって生成したNADを更にNADサイクリ
ング反応系と連結する方法であり、同様に煩雑な系であ
った。
【００１３】更に、特にアンモニアの測定は、例えばウ
レアーゼによる尿素の測定等、アンモニアを反応生成物
とする反応の共役系としても重要であり、測定対象物が
微量である場合には高感度化が望まれる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】前述のごとく、アンモ
ニア、α-ケト酸およびα-アミノ酸類の測定法は種々報
告されているが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび
グルタミン酸オキシダ-ゼを用いた酵素サイクリング法
以外はいずれも高感度測定法とは言い難く、また酵素サ
イクリング法においても共存物質の影響を受けるため、
普及するに至っていない。
【００１５】また、血中アンモニアの正常値は、微量拡
散法では70-190μg/dl、直接比色法で100-150μg/dl、
イオン交換法で20-70μg/dl、酵素法で12-66μg/dl（日
本臨床、47巻、P390、1989年増刊号）と測定法により大
きく異なる上、少量でもあり、正確で高感度な測定法が
望まれている。
【００１６】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは上記の問題点につき鋭意検討した結果、α-
アミノ酸類を基質としてα-ケト酸およびアンモニアを
生成する酵素反応を実施するに当り、酵素としてアミノ
酸類デヒドロゲナーゼを使用する反応系において、補酵
素として、一方にチオニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下チオNAD類という）およびチオニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下チ
オNADP類という）からなる群より選ばれた１つを使用
し、他方に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
（以下NAD類という）およびニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフェート類（以下NADP類という）から
なる群より選ばれた１つの補酵素の２種類を使用するサ
イクリング反応を見出した。さらにこの反応において、
チオNAD類およびチオNADP類の還元型の吸収波長は400nm
付近であり、NAD類およびNADP類の還元型の吸収波長は3
40nm付近であることから、どちらか一方の補酵素の変化
量のみを、いずれか一方の波長における吸光度を測定す
ることによって定量することにより、吸光度の測定に際
して他物質の吸収波長の混雑が回避できる酵素サイクリ
ング反応が実施でき、高感度なアンモニア、α-ケト酸
またはα-アミノ酸類の定量が可能であることを確認
し、本発明を完成するに至った。
【００１７】すなわち、本発明はアンモニア、α-アミ
ノ酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸、および
これらのイオン体からなる群より選ばれた１種の被検成
分を含有する被検体に、 (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水と
を基質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応する
α-ケト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒド
ロゲナーゼ、 (2) Ａ1 (3) Ｂ1(4) 必要に応じて被検成分として存在する成分
以外の下記サイクリング反応系を 形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式
【００１８】
【化６】
【００１９】（式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NA
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNA
D類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を
示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示す）で表されるサイ
クリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ
2またはＢ1の量を測定することを特徴とするアンモニ
ア、α-アミノ酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケ
ト酸、またはこれらのイオン体からなる群より選ばれた
１種の被検成分の高感度定量法、並びに上記(1)、(2)、
(3)および(4)を含有することを特徴とするアンモニア、
α-アミノ酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト
酸、およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた１
種の被検成分の高感度定量用組成物を提供するものであ
る。
【００２０】本発明において用いられる、アミノ酸類デ
ヒドロゲナーゼとは、少なくとも次の可逆反応
【００２１】
【化７】
【００２２】なる反応を触媒するものであって、チオNA
DP類およびチオNAD類からなる群より選ばれた１つと、N
ADP類およびNAD類からなる群より選ばれた１つとを補酵
素とするものならいずれをも用いることができる。
【００２３】本酵素は、動物組織、植物、バクテリア等
に広く存在する。その具体的例は(チオ)NAD類を補酵素
とするものとしては、Bacillus subtilis（バチルス
ズブチリス）、Bacillus sphaericus（バチルス スフ
ァエリカス）などに存在するアラニンデヒドロゲナーゼ
(EC 1.4.1.１)、エンドウの根、トウモロコシの葉、ダ
イズの子葉、Micrococcus aerogenes（ミクロコッカス
アエロゲネス）などから精製されるグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ(EC 1.4.1.2)、嫌気性細菌Clostridium sp
orogenes（クロストリジウム スポロゲネス）、Clostr
idium saccharobutyricum（クロストリジウム サッカ
ロブチリカム）などに存在するＬ-アミノ酸デヒドロゲ
ナーゼ(EC 1.4.1.5)、ダイズ子葉、コムギ、エンドウの
芽生えなどに存在するセリンデヒドロゲナーゼ(EC 1.4.
1.7)、Corynebacterium sepedonicum（コリネバクテリ
ウム セペドニカム）、Bacillus cereus（バチルス
セレウス）、Bacillus subtilis SJ-2（バチルス ズブ
チリス SJ-2）などに存在するロイシンデヒドロゲナー
ゼ(EC 1.4.1.9)、Mycobacterium tuberculosis（マイコ
バクテリウム トゥベルクロシス）、Myxococcus xanth
us（ミクソコッカス キサンサス）などに存在するグリ
シンデヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.10)、Clostridium SB4
（クロストリジウム SB4）、Clostridium sticklandii
（クロストリジウム スティクランディ）などに存在す
るＬ-エリスロ-３，５-ジアミノヘキサン酸デヒドロゲ
ナーゼ(EC 1.4.1.11)などが挙げられる。また、(チオ)N
ADP類を補酵素とするものとしては、酵母、大腸菌、ク
ロレラ等に由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC
1.4.1.4)、エンドウの芽生えなどに存在するバリンデヒ
ドロゲナーゼ(EC 1.4.1.8)などが挙げられる。更にま
た、(チオ)NAD類および(チオ)NADP類の両者を補酵素と
するものとしては、牛肝やニワトリ肝、Bacillus subti
lis（バチルス ズブチリス）などに存在するグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.3)、その中で牛肝等の
動物由来の酵素はGTPで阻害され、ADPで活性化されるア
ロステリックな酵素である。
【００２４】これらのうちECナンバ-1.4.1.3である牛肝
由来の酵素は例えばベーリンガーマンハイム社、オリエ
ンタル酵母工業社より市販されており、補酵素に対する
相対活性はNADを用いた時を100％とすると、チオNADで4
0.0％、NADPで38.9％、チオNADPで14.8％と報告されて
いる（Biochem.J.,191,299-304,1980）。また、ECナン
バー1.4.1.4であるProteus sp.（プロテウス エスピ
ー）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社
製）については、NADPを用いたときの相対活性を100％
としたときチオNADPに対しては約15％であった。また、
他の起源の酵素についても適宜の系に使用可能である。
【００２５】補酵素NAD(P)類、チオNAD(P)類に対する特
異性は基質であるα−アミノ酸類に対して反応性を有す
るものであればよく、これら補酵素と基質を用い確認で
きるものである。
【００２６】また、本発明において、Ａ1およびＢ2の補
酵素はチオNADP類、チオNAD類、NADP類、NAD類を示す
が、このうちチオNADP類またはチオNAD類としては、例
えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチ
ンジヌクレオチドホスフェート、およびチオニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチ
ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。
また、NADP類またはNAD類としては、例えばニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADP）、ア
セチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート
（アセチルNADP）、アセチルピリジンヒポキサンチンジ
ヌクレオチドホスフェート、ニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチドホスフェート（デアミノNADP）；お
よびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、
アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルNA
D）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デ
アミノNAD）が挙げられる。なおこれら補酵素の還元型
は、各々チオNADPH類、チオNADH類、NADPH類、NADH類と
して表示する。
【００２７】本発明においてはＡ1およびＢ1において例
えばＡ1がチオNAD(P)類である場合、Ｂ1はNAD(P)H類で
あることが必要であり、Ａ1がNAD(P)類である場合、Ｂ1
はチオNAD(P)H類であることが必要である。
【００２８】また定量に用いるアミノ酸類デヒドロゲナ
ーゼが(チオ)NAD類のみを補酵素とする場合は、上述の
チオNAD類とNAD類より、また、用いるアミノ酸類デヒド
ロゲナーゼが(チオ)NADP類のみを補酵素とする場合は、
上述のチオNADP類およびNADP類より、更に用いるアミノ
酸類デヒドロゲナーゼが(チオ)NAD類および(チオ)NADP
類を共に補酵素にする場合は上述のチオNAD類およびチ
オNADP類と上述のNAD類およびNADP類より適宜選択し、
それらの酸化型、還元型を適宜用いればよい。
【００２９】また、本発明の定量法によれば被検体中の
α-アミノ酸類の定量のみならず、α-アミノ酸類にアミ
ノ酸類デヒドロゲナーゼを反応させた場合の反応生成物
であるアンモニアまたはα-ケト酸の定量も可能であ
る。その場合、被検成分がアンモニアであるかα-ケト
酸であるかによって必要に応じ、被検成分として存在す
る成分以外の本発明のサイクリング反応系を形成せしめ
る成分を反応液中に予め存在せしめればよい。すなわち
被検成分がアンモニアである場合は使用するアミノ酸類
デヒドロゲナーゼに対応するα-ケト酸を添加すればよ
く、被検成分がα-ケト酸である場合はアンモニアを添
加すればよい。
【００３０】更に、本発明の定量法によれば被検体中の
アンモニア、α-アミノ酸類、α-ケト酸類のイオン体の
定量も行うことができる。
【００３１】また、本発明の高感度定量法を用いれば、
被検液中にもともと含有されているアンモニアや、Ｌ-
グルタミン酸、Ｌ-ロイシン、Ｌ-アラニン、Ｌ-セリ
ン、Ｌ-バリン、Ｌ-グリシン等のα-アミノ酸類、ある
いはピルビン酸、α-ケトグルタル酸、ハイドロピルビ
ン酸、２-オキソイソ吉草酸、２-オキソイソカプロン
酸、グリオキサル酸等のα-ケト酸類を測定することが
できるが、これらを遊離、生成する酵素系における基質
やその酵素活性を測定することもできる。更に、本発明
の高感度定量法を用いれば、上記のようなアンモニア、
α-アミノ酸類、α-ケト酸類を遊離、生成する酵素系と
連結し得る単一の、もしくは複数の工程からなる酵素系
における基質やその酵素活性をも測定することができ
る。これらの酵素系は、特に限定されるものではない
が、例えば以下に示す種々の反応系が挙げられる。
【００３２】（１）クレアチニンとクレアチニンデイミ
ナーゼ(EC 3.5.4.21)の酵素反応系。この系において、
遊離、生成するアンモニアを定量することにより、クレ
アチニンの定量またはクレアチニンデイミナーゼの活性
測定をすることができる。 クレアチニン ＋ H2O → Ｎ-メチルヒダントイン ＋ NH3
【００３３】（２）尿素とウレア-ゼ(EC 3.5.1.5)の酵
素反応系。この系において、遊離、生成するアンモニア
を定量することにより、尿素の定量またはウレアーゼの
活性測定をすることができる。 尿素 ＋ H2O → 2NH3 ＋ CO2
【００３４】（３）グアニンとグアニンデアミナーゼ(E
C 3.5.4.3)の酵素反応系。この系において、遊離、生成
するアンモニアを定量することにより、グアニンの定量
またはグアニンデアミナーゼの活性測定をすることがで
きる。 グアニン ＋ Ｈ2O → キサンチン ＋ NH3
【００３５】（４）アデノシンとアデノシンデアミナー
ゼ(EC 3.5.4.4またはEC 3.5.4.17)の酵素反応系。この
系において、遊離、生成するアンモニアを定量すること
により、アデノシンの定量またはアデノシンデアミナー
ゼの活性測定をすることができる。 アデノシン ＋ H2O → イノシン ＋ NH3
【００３６】（５）アスパラギンとアスパラギナーゼ(E
C 3.5.1.1)の酵素反応系。この系において、遊離、生成
するアンモニアまたはＬ-アスパラギン酸を定量するこ
とにより、アスパラギンの定量またはアスパラギナーゼ
の活性測定をすることができる。 L-アスパラギン ＋ H2O → L-アスパラギン酸 ＋ NH3
【００３７】（６）種々キナーゼとその基質とATPとの
前酵素反応によって生成したADPとアンモニアキナーゼ
(EC 2.7.3.8)の酵素反応系。この系において、遊離、生
成するアンモニアを定量することにより、ADPの定量ま
たはアンモニアキナーゼの活性測定または前酵素反応に
係る成分の測定をすることができる。 ADP ＋ ホスホラミド → ATP ＋ NH3
【００３８】（７）エタノールアミンとエタノールアミ
ンデアミナーゼ(EC4.3.1.7)の酵素反応系。この系にお
いて、遊離、生成するアンモニアを定量することによ
り、エタノールアミンの定量またはエタノールアミンデ
アミナーゼの活性測定をすることができる。 エタノールアミン → アセトアルデヒド ＋ NH3
【００３９】（８）ホスホエノールピルビン酸、ADPと
ピルビン酸キナーゼ(EC 2.7.1.40)の酵素反応系。この
系において、遊離、生成するピルビン酸を定量すること
により、ホスホエノールピルビン酸またはADPの定量あ
るいはピルビン酸キナーゼの活性測定をすることができ
る。 ホスホエノールピルビン酸 ＋ ADP → ピルビン酸 ＋ ATP
【００４０】（９）Ｎ-アセチルノイラミン酸とＮ-アセ
チルノイラミン酸アルドラーゼ(EC 4.1.3.3)の酵素反応
系。この系において、遊離、生成するピルビン酸を定量
することにより、Ｎ-アセチルノイラミン酸の定量また
はＮ-アセチルノイラミン酸アルドラーゼの活性測定を
することができる。 Ｎ-アセチルノイラミン酸 → Ｎ-アセチルマンノサミン ＋ ピルビン酸
【００４１】（10）イソクエン酸、NAD(P)とイソクエン
酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.41またはEC 1.1.1.42)の
酵素反応系。この系において、遊離、生成するα-ケト
グルタル酸を定量することにより、イソクエン酸の定量
またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性測定をする
ことができる。 イソクエン酸 ＋ NAD(P) → α-ケトグルタル酸 ＋ CO2 ＋ NAD(P)H
【００４２】（11）クレアチニンまたはクレアチンから
クレアチニナーゼまたはクレアチナーゼによる前酵素反
応によって生成したザルコシンとザルコシンデヒドロゲ
ナーゼ(EC 1.5.99.1)またはザルコシンオキシダーゼ(EC
1.5.3.1)の酵素反応系。この系において、遊離、生成
するグリシンを定量することにより、ザルコシンの定量
またはザルコシンデヒドロゲナーゼまたはザルコシンオ
キシダーゼの活性測定あるいは前酵素反応に関与する成
分を定量することができる。 ザルコシン ＋ 水素受容体 ＋ H 2 O → グリシン ＋ ホルムアルデヒド ＋ H 2 O 2 または ザルコシン ＋ O 2 ＋ H 2 O → グリシン ＋ ホルムアルデヒド ＋ H 2 O 2
【００４３】本発明における、Ａ1、Ｂ1および被検成分
以外のサイクリング反応系を形成せしめる成分の量は被
検体中のアンモニア、α-ケト酸およびα-アミノ酸類か
らなる群より選ばれた１種の被検成分に比較して過剰量
であること、かつアミノ酸類デヒドロゲナーゼのＡ1、
Ｂ1および被検成分以外のサイクリング反応系を形成せ
しめる成分に対するＫｍ値に比較して過剰量であること
が必要であり、特に被検成分の20〜10000倍モルが好ま
しい。
【００４４】例えば被検成分がアンモニアまたはα-ア
ミノ酸類である場合、サイクリング反応を形成させるた
めのＡ1、Ｂ1およびα-ケト酸の量は被検体中のアンモ
ニア量に比較して過剰量であること、かつアミノ酸類デ
ヒドロゲナーゼのＡ1、Ｂ1およびα-ケト酸それぞれに
対するＫｍ値に比較して過剰量であることが必要であ
り、特にアンモニア量の20〜10000倍モルが好ましい。
【００４５】また被検成分がα-ケト酸またはα-アミノ
酸類である場合、サイクリング反応を形成させるための
Ａ1、Ｂ1およびアンモニアの量は被検体中のα-ケト酸
量に比較して過剰量であること、かつアミノ酸類デヒド
ロゲナーゼのＡ1、Ｂ1およびアンモニアそれぞれに対す
るＫｍ値に比較して過剰量であることが必要であり、特
にα-ケト酸量の20〜10000倍モルが好ましい。
【００４６】本発明の定量用組成物においては、Ａ1お
よびＢ1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好まし
く、サイクリング反応を形成せしめるための成分として
のアンモニアまたはα-ケト酸の濃度は3〜100mM、特に5
〜50mMが好ましく、アミノ酸類デヒドロゲナーゼの量は
5〜1000u/ml、特に20〜400u/mlが好ましいが、その量は
被検体の種類等により適宜決定することができ、これ以
上の量を用いることもできる。
【００４７】また、本発明定量法はアミノ酸類デヒドロ
ゲナーゼが単独でまたは２種以上の組み合わせによって
(チオ)NAD類および(チオ)NADP類を共に補酵素とする場
合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もしくは
NADP類との組合せ、またはチオNADP類とNAD類もしくはN
ADP類との組合せを選んだときには、更に被検体に(5)成
分のアミノ酸類に作用せず、Ｂ2→Ｂ1の反応を形成する
第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二のデヒドロゲナー
ゼの基質を作用せしめることにより、後記反応式（化
８）のごとく、Ｂ1とＢ2の間にＢ1の再生のための反応
系を付与せしめることにより当該サイクリング反応を形
成せしめ得る。
【００４８】この場合、第二のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＡ1に作用しないものである
か、あるいは実質的にＡ1に作用し得ない条件を設定す
ることが好ましく、例えばＡ1を本質的に補酵素として
利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択する組合せ、
Ａ1とＢ2の量的関係により第二のデヒドロゲナーゼが実
質的にＡ1に作用しない条件を選択する組合せ等が例示
される。定量の際には反応により生成したＡ2の量を測
定する。
【００４９】
【化８】
【００５０】（式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NA
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNA
D類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を
示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示し、Ｂ2→Ｂ1はＢ2
を補酵素としてＢ1を生成する酵素反応を示す）
【００５１】すなわち、第二のデヒドロゲナーゼはＢ1
の再生のために補助的に添加するものであり、これによ
ってＢ1の使用量を少なくすることが可能となり、特に
Ｂ1が高価な場合は有効である。また、Ｂ1の代わりにＢ
2あるいはＢ1とＢ2の混合物を用いて反応を行ってもよ
い。この場合、Ｂ1または／およびＢ2の使用量は特に限
定されるものではないが、一般的にはＡ1の１／10モル
以下が好ましい。
【００５２】上記の成分(5)を用いる定量用組成物にお
いて、Ａ1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好ま
しく、Ｂ2または／およびＢ1の濃度は0.05〜5000μM、
特に５〜500μMが好ましく、サイクリング反応を形成せ
しめるための成分としてのアンモニアまたはα-ケト酸
の濃度は３〜100mM、特に５〜50mMが好ましく、アミノ
酸類デヒドロゲナーゼの濃度は５〜1000u/ml、特に20〜
500u/mlが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＢ2に対
するKm値（mM単位）の20倍量（u/ml単位）以上になるよ
うに調製すればよく、例えば１〜100u/mlが好ましく、
また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.
05〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量を用いること
もできる。
【００５３】第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ｂ2がNAD類またはチオNAD類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.1)とエタノ
ール、グリセロールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.6)（E.
coli由来）とグリセロール、グリセロール-３-リン酸デ
ヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.8)（ウサギ筋肉由来）とＬ-
グリセロール-３-リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(E
C 1.1.1.37)（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ-リンゴ
酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.
1.1.12)（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.coli由来）とＤ-
グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、Ｂ2がNADP類また
はチオNADP類のときは、グルコース-６-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(EC 1.1.1.49)（酵母由来）とグルコース-６-
リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.42)
（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオキシル
酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.17)(Pseudomonas oxalat
icus由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸
デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.44)（ラット肝、ビール酵
母、E.coli由来）と６-ホスホ-Ｄ-グルコン酸、グリセ
ロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.13)
（植物葉緑体由来）とＤ-グリセロアルデヒド-３-リン
酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1.
2.1.7)(Pseudomonas fluorescens由来)とベンズアルデ
ヒド等が挙げられる。
【００５４】更にまた、本発明定量法はアミノ酸類デヒ
ドロゲナーゼが単独であるいは２種以上の組み合わせよ
って(チオ)NAD類および(チオ)NADP類を共に補酵素とす
る場合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もし
くはNADP類との組合せ、またはチオNADP類とNAD類もし
くはNADP類との組合せを選んだときには、更に被検体に
(6)成分のα-アミノ酸類に作用せず、Ａ2→Ａ1の反応を
形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三のデヒド
ロゲナーゼの基質を作用せしめる事により、後記反応式
（化９）のごとく、Ａ1とＡ2の間にＡ1の再生の為の反
応系を付与せしめることにより当該サイクリング反応を
形成し得る。
【００５５】この場合、第三のデヒドロゲナーゼには、
この測定系において実質的にＢ1に作用し得ないもので
あるか、あるいは実質的にＢ1に作用し得ない条件を設
定することが好ましく、例えばＢ1を本質的に補酵素と
して利用しない酵素を選択する組合せ、Ｂ1とＡ2の量的
関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的にＢ1に作
用しない条件を選択する組合せ等が例示される。定量の
際にはＢ1の消費量を測定する。
【００５６】
【化９】
【００５７】（式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NA
DP類またはNAD類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示
し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNA
D類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を
示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示し、Ａ2→Ａ1はＡ2
を補酵素としてＡ1を生成する酵素反応を示す）
【００５８】すなわち、第３のデヒドロゲナーゼはＡ1
の再生の為に補助的に添加するものであり、これによっ
てＡ1の使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ1
が高価な場合には有効である。また、Ａ1の代わりにＡ2
あるいはＡ1とＡ2の混合物を用いて反応を行ってもよ
い。この場合、Ａ1または／およびＡ2の使用量は特に限
定されるものではないが、一般的にはＢ1の１／10モル
以下が好ましい。
【００５９】この成分(6)を用いる定量用組成物におい
て、Ｂ1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好まし
く、Ａ2または／およびＡ1の濃度は0.05〜5000μM、特
に５〜500μMが好ましく、サイクリング反応を形成せし
めるための成分としてのアンモニアまたはα-ケト酸の
濃度は３〜100mM、特に５〜50mMが好ましく、アミノ酸
類デヒドロゲナーゼの濃度は５〜1000ｕ／ml、特に20〜
500u/mlが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ2に対
するKm値（mM単位）の20倍量（u/ml単位）以上になるよ
うに調製すればよく、例えば１〜100u/mlが好ましく、
また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.
05〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量をもちいるこ
ともできる。
【００６０】第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ａ1がNAD類またはチオNAD類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.1)とアセト
アルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.
6)（E．coli由来）とジヒドロキシアセトン、グリセロ
ール-３-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.8)（ウサギ
筋肉由来）とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.37)（ブタ心筋、ウシ心筋由
来）とオギザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒド
ロゲナーゼ(EC 1.1.1.12)（ウサギ骨格筋、肝、酵母、
E.coli由来）と1,3-ジホスホ-Ｄ-グリセリン酸、Ａ1がN
ADP類またはチオNADP類のときは、グルコース-６-リン
酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)（酵母由来）とグル
コノラクトン-６-リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.13)（植物葉緑体由来）と1,3
-ジホスホ-Ｄ-グリセリン酸等が挙げられる。
【００６１】かくして、調製された本発明の定量用組成
物によって被検体中のアンモニア、α-アミノ酸類、該
アミノ酸類に対応するα-ケト酸、またはこれらのイオ
ン体を測定するには、上記成分(1)〜(4)、（1)〜(5)、
あるいは(1)〜(4)および(6)を含有する組成物に被検体
0.001〜0.5mlを加え、約37℃の温度にて反応させ、反応
開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば
３分後と４分後の１分間、または３分後と８分後の５分
間における生成されたＡ2の量または消費されたＢ1の量
を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によって
測定すればよい。例えば、Ａ2がチオNADH、Ｂ1がNADHの
場合、Ａ2の生成を400nm付近の吸光度の増加により測定
するか、あるいはＢ1の消費を340nm付近の吸光度の減少
により測定し、既知濃度のアンモニア、α-アミノ酸
類、該アミノ酸類に対応するα-ケト酸、またはこれら
のイオン体を用いて測定したときの値と比較すれば、被
検液中のそれぞれの量をリアルタイムで求めることがで
きる。
【００６２】また、本発明定量法は、被検液中のアンモ
ニア、α-アミノ酸類、該アミノ酸類に対応するα-ケト
酸、またはこれらのイオン体そのものを酵素サイクリン
グ反応に導くものであり、被検液中の共存物質の影響を
受けにくいため、被検液のブランク測定を省略すること
ができ、レイトアッセイによる簡便な測定を成し得る。
【００６３】尚、本発明においてはＡ2またはＢ1の測定
に当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を使
用して定量を行うこともできる。
【００６４】
【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、ま
た、酵素サイクリング反応を組み合わせることによって
感度を増大させることができるため、少量の検体で迅速
かつ正確に被検体中のアンモニア、α-アミノ酸類、該
アミノ酸類に対応するα-ケト酸、またはこれらのイオ
ン体を定量することができる。
【００６５】
【実施例】次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれによって何等限定されるものではな
い。
【００６６】実施例１ アンモニアの定量 ＜試薬＞ 40 mM トリス塩酸緩衝液(pH8.9) 3 mM ADP（オリエンタル酵母社製） 2 mM チオNAD（シグマ社製） 0.2 mM 還元型NAD（オリエンタル酵母社製） 5 mM α-ケトグルタル酸（和光純薬社製） 3 mM EDTA 128 u/ml グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリン
ガー社製：牛肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、40、80、120、1
60、200μMの塩化アンモニウム溶液をそれぞれ50μl添
加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目
と４分目の400nmにおける吸光度を読み取りその差を求
めた。濃度０の値を試薬ブランクとし、40〜200μMのそ
れぞれの塩化アンモニウムの値からこの値を引き、その
結果を図１に示した。図１から明らかなように、塩化ア
ンモニウム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示
した。
【００６７】実施例２ アンモニアの定量 〈試薬〉 100 mM トリス塩酸緩衝液(pH9.5) 1 mM チオNADP（シグマ社製） 0.2 mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） 10 mM α-ケトグルタル酸（和光純薬社製） 5 mM EDTA 250 u/ml グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社
製：プロテウス エスピー由来） ＜操作＞上記試薬１mlをキュベットにとり、０、50、10
0、150、200、250μMの塩化アンモニウム溶液をそれぞ
れ50μl添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開
始後３分目と４分目の400nmにおける吸光度を読み取り
その差を求めた。実施例１と同様試薬ブランクとの差を
求め、その結果を図２に示した。図２から明らかなよう
に、塩化アンモニウム量に対する吸光度変化量は良好な
直線性を示した。
【００６８】実施例３ Ｌ-グルタミン酸の定量 〈試薬〉 100 mM トリス塩酸緩衝液(pH9.5) 1 mM チオNADP（シグマ社製） 0.2 mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） 5 mM 塩化アンモニウム（和光純薬社製） 5 mM EDTA 250 u/ml グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社
製：プロテウス エスピー由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、40、80、120、1
60、200μMのＬ-グルタミン酸ナトリウム（和光純薬社
製）溶液をそれぞれ50μl添加し、３７℃にて反応を開
始させた。反応開始後３分目と４分目の400nmにおける
吸光度を読み取りその差を求めた。実施例２と同様試薬
ブランクとの差を求め、その結果を図３に示した。図３
から明らかなように、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム量に
対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
【００６９】実施例４ クレアチニンの定量 〈試薬〉 250 mM トリス塩酸緩衝液(pH9.5) 2 mM チオNADP（シグマ社製） 0.2 mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） 10 mM α-ケトグルタル酸（和光純薬社製） 5 mM EDTA 20 u/ml クレアチニンデイミナーゼ（東洋紡社製：微
生物由来） 250 u/ml グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社
製：プロテウス エスピー由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、20、40、60、8
0、100μMのクレアチニン（和光純薬社製）溶液をそれ
ぞれ50μl添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応
開始後３分目と８分目の400nmにおける吸光度を読み取
りその差を求めた。実施例３と同様試薬ブランクとの差
を求め、その結果を図４に示した。図４から明らかなよ
うに、クレアチニン量に対する吸光度変化量は良好な直
線性を示した。
【００７０】実施例５ Ｌ-ロイシンの定量 〈試薬〉 40 mM トリス塩酸緩衝液(pH8.9) 2 mM チオNAD（シグマ社製） 0.25 mM 還元型NAD（オリエンタル酵母社製） 100 mM 塩化アンモニウム（和光純薬社製） 100 u/ml ロイシンデヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.9，
バチルス エスピー（Bacillus sp.）由来，東洋紡社
製） ＜操作＞上記試薬１mlをキュベットにとり、０、４、
８、12、16、20μMのＬ-ロイシン溶液をそれぞれ50μl
添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後３分
目と５分目の400nmにおける吸光度を読み取りその差を
求めた。濃度０の値を試薬ブランクとし、４〜20μMの
それぞれのＬ-ロイシンの値からこの値を引き、その結
果を図５に示した。図５から明らかなように、Ｌ-ロイ
シン量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
【００７１】実施例６ ピルビン酸の定量 〈試薬〉 40 mM トリエタノールアミン塩酸-NaOH緩衝液(pH8.
5) 4 mM チオNAD（シグマ社製） 0.1 mM 還元型NAD（オリエンタル酵母社製） 50 mM 塩化アンモニウム（和光純薬社製） 1250 u/ml アラニンデヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.1，
スポロラクトバチルスエスピー（Sporolactobacillus s
p.）由来，東洋醸造社製） ＜操作＞上記試薬１mlを試験管にとり、０、50、100、1
50、200、250μMのピルビン酸溶液をそれぞれ20μl添加
し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後10分目後
に２％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液１mlを加え
反応を停止させた。400nmにおける吸光度を読み取り、
その結果を図６に示した。図６から明らかなように、ピ
ルビン酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
【００７２】実施例７ アンモニアの定量 ＜試薬＞ 40 mM グリシン-NaOH緩衝液(pH10.0) 3 mM チオNAD（シグマ社製） 50 μM NADP（オリエンタル酵母社製） 8 mM Ｌ-リンゴ酸 30 u/ml リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37，
ブタ心臓由来，ベーリンガー社製） 3 mM ADP（オリエンタル酵母社製） 5 mM α-ケトグルタル酸（和光純薬社製） 3 mM EDTA160 u/ml グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ（ベーリンガー社製：牛肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、20、40、60、8
0、100μMの塩化アンモニウム溶液をそれぞれ50μl添加
し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と
８分目の400nmにおける吸光度を読み取りその差を求め
た。濃度０の値を試薬ブランクとし、20〜100μMのそれ
ぞれの塩化アンモニウムの値からこの値を引き、その結
果を図７に示した。図７から明らかなように、塩化アン
モニウム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
【００７３】実施例８ アンモニアの定量 ＜試薬＞ 40 mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 0.25 mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） 50 μM チオNAD（シグマ社製） 5 mM ジヒドロキシアセトンリン酸 10 u/ml グリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.1.1.8，ベーリンガー社製；ウサギ筋肉由来） 3 mM ADP（オリエンタル酵母社製） 5 mM α-ケトグルタル酸（和光純薬社製） 3 mM EDTA 200 u/ml グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリン
ガー社製：牛肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１mlをキュベットにとり、０、50、100、150、
200、250μMの塩化アンモニウム溶液をそれぞれ50μl添
加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目
と８分目の340nmにおける吸光度を読み取りその差を求
めた。実施例７と同様試薬ブランクとの差を求め、その
結果を図８に示した。図８から明らかなように、塩化ア
ンモニウム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示
した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における、塩化アンモニウム量に対す
る400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
【図２】実施例２における、塩化アンモニウム量に対す
る400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
【図３】実施例３における、Ｌ-グルタミン酸量に対す
る400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
【図４】実施例４における、クレアチニン量に対する40
0nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。
【図５】実施例５における、Ｌ-ロイシン量に対する400
nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。
【図６】実施例６における、ピルビン酸量に対する400n
mにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。
【図７】実施例７における、塩化アンモニウム量に対す
る400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
【図８】実施例８における、塩化アンモニウム量に対す
る340nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/59 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アンモニア、α-アミノ酸類、該α-アミ
    ノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこれらのイオン体
    からなる群より選ばれた１種の被検成分を含有する被検
    体に、(1) チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
    ホスフェート類（以下チオNADP類という）およびチオニ
    コチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオNAD
    類という）からなる群より選ばれる１つと、ニコチンア
    ミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下NADP
    類という）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
    ド類（以下NAD類という）からなる群より選ばれる１つ
    とを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水とを基
    質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応するα-ケ
    ト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒドロゲナ
    ーゼ、 (2) Ａ1 (3) Ｂ1 (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下
    記サイクリング反応系を形成せしめる成分 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 【化１】 （式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNA
    D類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示し、Ｂ1はＡ1
    がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元型NADP類ま
    たは還元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNAD類のときは
    還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を示し、Ｂ2は
    Ｂ1の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反
    応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ2またはＢ1
    の量を測定することを特徴とするアンモニア、α-アミ
    ノ酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸、および
    これらのイオン体からなる群より選ばれた１種の被検成
    分の高感度定量法。
  2. 【請求項２】 α-アミノ酸類がＬ-グルタミン酸であ
    り、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸がα-ケトグ
    ルタル酸であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタ
    ミン酸デヒドロゲナーゼである請求項１記載の高感度定
    量法。
  3. 【請求項３】 α-アミノ酸類がアラニンであり、該α-
    アミノ酸類に対応するα-ケト酸がピルビン酸であり、
    アミノ酸類デヒドロゲナーゼがアラニンデヒドロゲナー
    ゼであり、Ａ1がチオNAD類またはNAD類であり、Ｂ1がＡ
    1がチオNAD類であるときは還元型NAD類であり、Ａ1がNA
    D類であるときは還元型チオNAD類である請求項１記載の
    高感度定量法。
  4. 【請求項４】 α-アミノ酸類がロイシンであり、該α-
    アミノ酸類に対応するα-ケト酸が２-オキソイソカプロ
    ン酸であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがロイシンデ
    ヒドロゲナーゼであり、Ａ1がチオNAD類またはNAD類で
    あり、Ｂ1がＡ 1 がチオNAD類であるときは還元型NAD類で
    あり、Ａ1がNAD類であるときは還元型チオNAD類である
    請求項１記載の高感度定量法。
  5. 【請求項５】 被検成分がアンモニアまたはそのイオン
    体であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタミン酸
    デヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシ
    ンデヒドロゲナーゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、バリン
    デヒドロゲナーゼ、グリシンデヒドロゲナーゼまたはア
    ミノ酸デヒドロゲナーゼであり、被検成分として存在す
    る成分以外のサイクリング反応系を形成せしめる成分が
    各酵素の基質となる当該アミノ酸類に対応するα-ケト
    酸類である請求項１記載の高感度定量法。
  6. 【請求項６】 アンモニア、α-アミノ酸類、該α-アミ
    ノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこれらのイオン体
    からなる群より選ばれた１種の被検成分を含有する被検
    体に、 (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
    る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水と
    を基質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応する
    α-ケト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒド
    ロゲナーゼ、 (2) Ａ1 (3) Ｂ1または／およびＢ2 (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下
    記サイクリング反応系を形成せしめる成分 (5) α-アミノ酸類に作用せず、Ｂ2からＢ1への反応を
    形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび第二のデヒドロ
    ゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 【化２】 （式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNA
    D類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示し、Ｂ1はＡ1
    がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元型NADP類ま
    たは還元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNAD類のときは
    還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を示し、Ｂ2は
    Ｂ1の酸化型生成物を示し、Ｂ2→Ｂ1はＢ2を補酵素とし
    てＢ1を生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリ
    ング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ2の
    量を測定することを特徴とするアンモニア、α-アミノ
    酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこ
    れらのイオン体からなる群より選ばれた１種の被検成分
    の高感度定量法。
  7. 【請求項７】 α-アミノ酸類がＬ-グルタミン酸であ
    り、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸がα-ケトグ
    ルタル酸であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタ
    ミン酸デヒドロゲナーゼである請求項６記載の高感度定
    量法。
  8. 【請求項８】 α-アミノ酸類がアラニンであり、該α-
    アミノ酸類に対応するα-ケト酸がピルビン酸であり、
    アミノ酸類デヒドロゲナーゼがアラニンデヒドロゲナー
    ゼであり、Ａ1がチオNAD類またはNAD類であり、Ｂ1がＡ
    1がチオNAD類であるときは還元型NAD類であり、Ａ1がNA
    D類であるときは還元型チオNAD類である請求項６記載の
    高感度定量法。
  9. 【請求項９】 α-アミノ酸類がロイシンであり、該α-
    アミノ酸類に対応するα-ケト酸が２-オキソイソカプロ
    ン酸であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがロイシンデ
    ヒドロゲナーゼであり、Ａ1がチオNAD類またはNAD類で
    あり、Ｂ1がＡ 1 がチオNAD類であるときは還元型NAD類で
    あり、Ａ1がNAD類であるときは還元型チオNAD類である
    請求項６記載の高感度定量法。
  10. 【請求項１０】 被検成分がアンモニアまたはそのイオ
    ン体であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタミン
    酸デヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ロイ
    シンデヒドロゲナーゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、バリ
    ンデヒドロゲナーゼ、グリシンデヒドロゲナーゼまたは
    アミノ酸デヒドロゲナーゼであり、被検成分として存在
    する成分以外のサイクリング反応系を形成せしめる成分
    が各酵素の基質となる当該アミノ酸類に対応するα-ケ
    ト酸類である請求項６記載の高感度定量法。
  11. 【請求項１１】 アンモニア、α-アミノ酸類、該α-ア
    ミノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこれらのイオン
    体からなる群より選ばれた１種の被検成分を含有する被
    検体に、 (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
    る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水と
    を基質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応する
    α-ケト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒド
    ロゲナーゼ、 (2) Ａ1または／およびＡ2 (3) Ｂ1 (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下
    記サイクリング反応系を形成せしめる成分 (6) α-アミノ酸類に作用せず、Ａ2からＡ1への反応を
    形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび第三のデヒドロ
    ゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 【化３】 （式中、Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNA
    D類を示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示し、Ｂ1はＡ1
    がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元型NADP類ま
    たは還元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNAD類のときは
    還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を示し、Ｂ2は
    Ｂ1の酸化型生成物を示し、Ａ2→Ａ1はＡ2を補酵素とし
    てＡ1を生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリ
    ング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＢ1の
    量を測定することを特徴とするアンモニア、α-アミノ
    酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこ
    れらのイオン体からなる群より選ばれた１種の被検成分
    の高感度定量法。
  12. 【請求項１２】 α-アミノ酸類がＬ-グルタミン酸であ
    り、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸がα-ケトグ
    ルタル酸であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタ
    ミン酸デヒドロゲナーゼである請求項１１記載の高感度
    定量法。
  13. 【請求項１３】 α-アミノ酸類がアラニンであり、該
    α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸がピルビン酸であ
    り、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがアラニンデヒドロゲ
    ナーゼであり、Ａ1がチオNAD類またはNAD類であり、Ｂ1
    がＡ1がチオNAD類であるときは還元型NAD類であり、Ａ1
    がNAD類であるときは還元型チオNAD類である請求項１１
    記載の高感度定量法。
  14. 【請求項１４】 α-アミノ酸類がロイシンであり、該
    α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸が２-オキソイソカ
    プロン酸であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがロイシ
    ンデヒドロゲナーゼであり、Ａ1がチオNAD類またはNAD
    類であり、Ｂ1がＡ1がチオNAD類であるときは還元型NAD
    類であり、Ａ1がNAD類であるときは還元型チオNAD類で
    ある請求項１１記載の高感度定量法。
  15. 【請求項１５】 被検成分がアンモニアまたはそのイオ
    ン体であり、アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタミン
    酸デヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ロイ
    シンデヒドロゲナーゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、バリ
    ンデヒドロゲナーゼ、グリシンデヒドロゲナーゼまたは
    アミノ酸デヒドロゲナーゼであり、被検成分として存在
    する成分以外の下記サイクリング反応系を形成せしめる
    成分が各酵素の基質となる当該アミノ酸類に対応するα
    -ケト酸類である請求項１１記載の高感度定量法。
  16. 【請求項１６】 次の成分(1)〜(4) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
    る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水と
    を基質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応する
    α-ケト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒド
    ロゲナーゼ、 (2) Ａ1 (3) Ｂ1 (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下
    記サイクリング反応系を形成せしめる成分 （Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNAD類を
    示し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは
    還元型NADP類または還元型NAD類を、Ａ1がNADP類または
    NAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類
    を示す）を含有することを特徴とするアンモニア、α-
    アミノ酸類、該α-アミノ酸類に対応するα-ケト酸、お
    よびこれらのイオン体からなる群より選ばれた１種の被
    検成分の高感度定量用組成物。
  17. 【請求項１７】 次の成分(1)〜(5) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
    る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水と
    を基質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応する
    α-ケト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒド
    ロゲナーゼ、 (2) Ａ1 (3) Ｂ1または／およびＢ2 (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下
    記サイクリング反応系を形成せしめる成分 (5) α-アミノ酸類に作用せず、Ｂ2からＢ1への反応を
    形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび第二のデヒドロ
    ゲナーゼの基質 （Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNAD類を
    示し、Ｂ1はＡ1がチオNADP類またはチオNAD類のときは
    還元型NADP類または還元型NAD類を、Ａ1がNADP類または
    NAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類
    を示し、Ｂ2はＢ1の酸化型生成物を示す）を含有するこ
    とを特徴とするアンモニア、α-アミノ酸類、該α-アミ
    ノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこれらのイオン体
    からなる群より選ばれた１種の被検成分の高感度定量用
    組成物。
  18. 【請求項１８】 次の成分(1)〜(4)および(6) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
    る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともα-アミノ酸類と水と
    を基質としてアンモニアと該α-アミノ酸類に対応する
    α-ケト酸を生成する可逆反応をなすアミノ酸類デヒド
    ロゲナーゼ、 (2) Ａ1または／およびＡ2 (3) Ｂ1 (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下
    記サイクリング反応系を形成せしめる成分 (5) α-アミノ酸類に作用せず、Ａ2からＡ1への反応を
    形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび第三のデヒドロ
    ゲナーゼの基質 （Ａ1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNAD類を
    示し、Ａ2はＡ1の還元型生成物を示し、Ｂ1はＡ1がチオ
    NADP類またはチオNAD類のときは還元型NADP類または還
    元型NAD類を、Ａ1がNADP類またはNAD類のときは還元型
    チオNADP類または還元型チオNAD類を示す）を含有する
    ことを特徴とするアンモニア、α-アミノ酸類、該α-ア
    ミノ酸類に対応するα-ケト酸、およびこれらのイオン
    体からなる群より選ばれた１種の被検成分の高感度定量
    用組成物。
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