JP3014007B2

JP3014007B2 - 組み換えヒト・インターロイキン―１インヒビターの生産

Info

Publication number: JP3014007B2
Application number: JP3501112A
Authority: JP
Inventors: ヘイジマン，ロバート; アイゼンバーグ，ステファン，ピー．; ドリップス，デイビッド; エバンス，ロナルド; カッドニー，ヘンリック; トンプソン，ロバート，シー．
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1990-11-29
Publication date: 2000-02-28
Anticipated expiration: 2015-02-28
Also published as: DK0502956T3; US5453490A; FI104733B; ES2103305T3; FI922434A0; DE69030582D1; GR3024031T3; HU9201777D0; DE69030582T2; BR9007883A; NO922138L; AU6900791A; CA2068320A1; ATE152172T1; EP0502956A4; CA2068320C; EP0502956B1; KR0182819B1; HK1006856A1; HUT64582A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景組み換えDNA分野では、研究目的にかなう量のタンパ
ク質が実験室で多数作られている。しかしながら、たと
え研究量のタンパク質を生産する技術が最適化されてい
たとしても、これらの生産・精製の実験室手法はヒトの
医薬として使用するのに十分な量である商業量の目的タ
ンパク質の生産に適さないことがしばしばある。

適切な品質のタンパク質を商業量で生産するために、
往々にして独特の発酵、単離、精製技術が必要となる。
さらに、これらの技術の組み合わせと実施順序はしばし
ばタンパク質の回収量と最終生成物の純度に影響を与え
る。

係属中の米国特許出願第199,915号、同第238,718号、
同第248,521号および同第266,531号（それぞれ1988年５
月27日、1988年８月31日、1988年９月23日、1988年11月
３日出願）に記載されるように、ヒト・インターロイキ
ン−１インヒビターと名付けられた特異なタンパク質が
単離されている。これらの特許出願（参照によりここに
引用するものとする）はまた、実験室手法において有用
な形質転換生物を使って実験室量の組み換えヒト・イン
ターロイキン−１インヒビター（以後“IL−1i"と略
す）を生産する方法を開示している。しかしながら、こ
れらの方法では、ヒトへの投与に適する品質のIL−1iを
商業量で生産することができなかった。

本発明は、高度に精製されたIL−1iを商業量で生産す
ることができる発酵、単離、精製技術のいくつかの組み
合わせを見いだした。本出願にはこれらの方法が開示さ
れる。本明細書中で用いる“商業量”なる用語は、発酵
ブロス100リットルから高度に精製された生産物が少な
くとも数グラフないし数十グラムないし数百グラム得ら
れることを意味する。“高度に精製された生産物”と
は、ヒトに投与するのに十分な純度の物質を意味する。
好適な態様では、“高度に精製された生産物”は１回の
投与量あたり5E.U.未満の内毒素を含み、E.coliタンパ
ク質による汚染が0.0025％より小である。

発明の要約本発明の目的は、商業量の組み換えヒト・インターロ
イキン−１インヒビターの生産方法を提供することであ
る。この目的はここに記載する方法によって達成され
る。

これらの目的を達成するために、IL−1i生産用の改良
菌株がここに開示される。SGE90と命名されたこの菌株
は、ここに記載する方法で用いたとき、発酵ブロス100
リットルあたり少なくとも50グラムの高度に精製された
IL−1iを生産する能力を有する。

ここに記載する商業量の高度精製IL−1iを生産するの
に適した一つの方法は、次の段階：（１）発酵；（２）（ａ）細胞の回収、（ｂ）溶菌、および（ｃ）溶菌液の清澄化を含む細胞処理；（３）カオチン樹脂を使用する第一のイオン交換段階；（４）アニオン樹脂を使用する第二のイオン交換段階；（５）濃縮および透析を含む最終処理段階；を含んでいる。生産物を純度をさらに高めるために、場
合により第三のイオン交換段階を追加してもよい。

好適な態様では、発酵段階は微生物（特にE.coli）を
使って実施され、一方第一のイオン交換段階はカチオン
交換樹脂Ｓ−Sepharoseを充填したカラムを使って実施
される。また、好適な態様では、第二のイオン交換段階
はアニオン交換樹脂（好ましくはＱ−Sepharose）を充
填したカラムを使って実施される。任意の第三のイオン
交換段階を追加する場合は、カチオン交換樹脂（好まし
くはＳ−Sepharose）を充填したカラムが使用される。

以上の一般的記載および以下の詳細な記載は単に例示
および説明するためのものであって、請求した本発明を
制限するものでないことを理解すべきである。本明細書
に組み込まれてその一部を成す添付図面は本発明の種々
の態様を示しており、記述と合わせて本発明の原理を理
解する上で役立つだろう。

図面の簡単な説明図１は、実施例１で述べるpRJ1およびpRJ2の構築を示
す。

好適な態様の説明本発明の目下好適な態様を記述するが、これらは、以
下の実施例と合わせて、本発明の原理を理解するのに役
立つだろう。

上述したように、本発明は商業量のIL−1iの生産方法
に関する。本明細書中で用いる“商業量”なる用語は、
発酵ブロス100リットルから高度に精製された生産物が
少なくとも数グラムないし数十グラムないし数百グラム
得られることを意味する。

先に述べたように、ここに記載する商業量のIL−1iの
好適な生産方法の一つは、次の段階：（１）IL−1iをコードするDNAを含むプラスミドを保有
するE.coliの発酵；（２）（ａ）細胞の回収、（ｂ）溶菌、および（ｃ）溶菌液の清澄化を含む細胞処理；（３）カオチン樹脂を使用する第一のイオン交換段階；（４）アニオン樹脂を使用する第二のイオン交換段階；（５）濃縮および透析を含む最終処理段階；を含んでいる。

任意の第三のイオン交換段階を実施してもよい。この
ような任意の段階は第二のイオン交換段階直後に行われ
るだろう。

本発明で意図されるE.coliを用いる発酵および細胞処
理段階は当分野で通常の知識を有する者に日常的に知ら
れているものを含む。これらの段階の好適な態様は以下
の実施例で説明する。しかしながら、匹敵する手法はど
れも以下で説明する好適な手法の代わりに導入すること
ができる。

商業量のIL−1iの生産方法は第一のイオン交換カラム
を利用する。先に述べたように、好適なカラム（実施例
２に記載する）はカチオン性Ｓ−Sepharose樹脂が充填
してある。その他の交換可能な樹脂を使用することがで
き、例えばSP−C25 Sephadex、CM Sephadex、CM Sephar
ose、またはCMセルロースのような樹脂が含まれるが、
これに限定されない。その後、IL−1iの更なる精製のた
めに第二のイオン交換カラムが使用される。上で述べた
ように、好適な実施態様では、このカラムのアニオン交
換樹脂としてＱ−Sepharoseを利用する。さらに、DEAE
−Sepharose、Ｑ−Sephadex、またはDEAE−セルロース
のような樹脂を含むが、これらに限定されない他の匹敵
する樹脂を使用することができる。

本発明の一態様において、第三のイオン交換段階は第
二のイオン交換段階直後に行なわれる。この任意の第三
段階では、カチオン交換カラムを使用する。このカラム
は好ましくはＳ−Sepharose樹脂を含むが、他の交換可
能な樹脂を使用できる。このような他の樹脂には、限定
するものではないが、SP−25 Sephadex、CM Sephadex、
CM Sepharose、CMセルロース、またはCM Toyopearlが含
まれる。

これらの段階に続いて、最終処理段階が行われる。こ
れらは濃縮段階と、所望により、IL−1iの透析（diafil
tration）を含む。これらの段階のパラメーターは、以
下の実施例での教示を考慮して、当分野で通常の知識を
有する者に周知である。

この方法の操作にとって、収量と純度を評価するため
の適切な定量分析機器を用意することが大切である。

実施例４の方法において記述するように、これらの目
的のために開発されたアッセイには逆相HPLC（RP−HPL
C）アッセイ、イオン交換HPLC（IE−HPLC）、SDS−PAGE
アッセイ、サイズ排除アッセイ、トリプシンペプチドマ
ップ、および生物学的活性についてのアッセイが含まれ
る。これらのアッセイの最初の４つで試験したとき、本
方法により生産された高度精製IL−1iは90％以上の純度
である。好ましくは、IE−HPLCで試験したとき、高度精
製IL−1iはMono QとMnon Sカラムの両方の場合に98％以
上の純度である。好ましくは、SDS−PAGEアッセイで試
験したとき、高度精製IL−1iは99.5％以上の純度であ
り、サイズ排除アッセイで試験したときは98％以上の純
度である。高度精製IL−1iのトリプシンペプチドマップ
は理論的に期待されるパターンに合致する。高度精製IL
−1iはバイオアッセイにおいてIL−ｌの阻害を示す。

以下の実施例は本発明の好適な実施態様を例示するた
めのものである。これらの実施例は単なる例示であっ
て、本発明の請求の範囲を制限するものではない。これ
らの実施例で示した文献はすべて参照によりここに引用
するものとする。

実施例１ 1.Bluescriptプラスミドクローニングベクターへのラム
ダファージ由来のIL−1i cDNAの移入ラムダファージGT10−IL−1i−2a（ATCC ＃40488）を
EcoR Iで消化し、IL−1i cDNAを保有する1.7kb断片をゲ
ル電気泳動により精製した。断片をEcoR I−消化Blusec
ript SKM13−（Stratagene）に連結し、プラスミドBS−
IL−1i＃２を作製した。

2.“T7"系を用いたIL−1i発現ベクターの構築 A.pT5Tの説明 IL−1i生産のために使用したT7発現ベクターはpT5Tと
呼ばれる。それはpJL1003［Squires,et al.,J.Biol.Che
m.（1988）31:16297−16302］と本質的に同じである、
ただT7プロモーターの５′側の特異なBgl2部位とテトラ
サイクリン耐性遺伝子中のCla1部位の間に短鎖DNAが存
在する。このDNAの配列は：である。

このベクターをBamH1とSma1制限酵素で線状にする。
プラスミドBS−IL−1i＃２をPf1M1とSca1で消化し、終
結コドンと3bpの３′非翻訳領域を含む成熟IL−1iのア
ミノ酸４−152をコードする配列を保有する453bp断片を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。次の
配列：を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それらの５′末
端をリン酸化してアニーリグした。これらのオリゴヌク
レオチドはIL−1i遺伝子へのT7Φ10遺伝子の翻訳カップ
リングに必要な配列を含んでいる。アニーリングしたオ
リゴヌクレオチド、線状ベクター断片および453 bp IL
−1i遺伝子断片を含む混合物はT4 DNAリガーゼで処理
し、その後これを使ってE.coli JM109株を形質転換した
（図１参照）。

B.IL−1iの突然変異誘発プラスミドを単離して、それが正しい配列をもつと分
かったので、それをpRJ1と名付けた。pRJ1はIL−1iタン
パク質の変異型をコードする配列を保有する。この変異
型のアミノ末端配列は、天然ヒトタンパク質のアミノ末
端配列であるArg−Pro−Ser−…ではなく、Met−Pro−P
ro−Ser−…である。ここでの目的は天然タンパク質に
出来るだけ近いタンパク質を発現させることであるか
ら、IL−1iタンパク質をコードするDNAがMet−Arg−Pro
−Ser−…をコードするように突然変異を起こさせるべ
く次のことを実施した。pRJ1中のIL−1i遺伝子を、この
プラスミドを特異なBamH1とPst1部位で消化することに
より取り出した。1375 bp断片をM13 mp 190のBamH1とPs
t1部位間にクローニングし、これをM13−IL−1i1と命名
した。

オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発は、BoiR
ad Mutagene突然変異誘発キットに記載される手順に従
って、M13−IL−1i1の単離した一本鎖DNAに対して行っ
た。突然変異誘発性オリゴヌクレオチド配列を、突然変
異を起こしたIL−1iの対応するアミノ末端アミノ酸配列
と共に示す：この突然変異誘発はM13−IL−1i2をもたらし、このプラ
スミドはこれによりコードされるIL−1iタンパク質が希
望のアミノ末端配列を有し、かつArgとProのコドンがE.
coliによって好んで使用されるものである点でM13−IL
−1i1と相違している。

C.IL−1iタンパク質の発現突然変異を誘発したIL−1i遺伝子はその後、上で述べ
た方法と同じ方法を使って、pT5Tに移入した。この第二
発現プラスミドはpRJ2と呼ばれる。このpRJ2を発現のた
めにE.coli BL21（DE3）株に形質転換した。この菌株
［Studier and Moffat J.Mol.Biol.（1986）189:113−1
30に記載］は切除できない溶原性ラムダバクテリオファ
ージ上にIPTG誘導可能はlacプロモーターの制御下にあ
るT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含んでいる。rIL−1iの
高レベル発現は、15μg/mlのテトラサイクリンを含むLu
riaブロスで細胞［BL21（DE3）pRJ2］を、細胞密度が0.
8のA₆₀₀になるまで、増殖させることにより達成され
た。IPTGを加えて1.0mMの最終濃度とし、細胞を４時間
増殖させた。遠心により細胞を収穫し、標準的なタンパ
ク質化学の手法を使って可溶性細胞リゼイトから6rIL−
1iを精製した。

3.“tacプロモーター”系を用いたIL−1i発現ベクター
の構築 A.pDD1の作製プラスミド6pJU1003（Squires et al.）をHind3とBam
H1で切断し、次の配列：を有する合成ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター（HP
STI）遺伝子に、HPSTI遺伝子をPvu IとHind3で切断し、
このPvu I/Hind3切断をBamH1−Hind3切断プラスミドへ
次の配列：を有する二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを使って
連結することにより融合させた。この合成HPSTI遺伝子
は成熟HPSTIタンパク質に融合したE.coli ompAタンパク
質のシグナル（またはリーダー）ペプチドから成るタン
パク質をコードする。従って、この遺伝子操作の目的
は、以下で述べる実験のために、pJU1003にompAシグナ
ルペプチドをコードする配列を組み入れることであっ
た。得られたプラスミドがpDD1である。プラスミドpDD1
はBst X1とHind3で消化した。

B.pDD3の構築:IL−1i cDNAへのE.coli翻訳シグナルの付
加プラスミドpT5T（上に記載）をBamH1とSma1で切断し
た。プラスミドBS−IL−1i＃２はPf1M1とSca1で切断
し、IL−1iタンパク質の部分をコードする453bpの長さ
の断片を放出させた（上記参照）。BamH1/Sma1切断pT5
T、453 bp IL−1i断片、および次の配列：を有するオリゴヌクレオチドアダプターを融合させてプ
ラスミドpDD2を作製した。プラスミドpDD2は、Bst X1と
Hind3で切断し、IL−1iタンパク質の全部とompAシグナ
ル配列の部分をコードする499 bp断片を放出させた。こ
の499bp断片をBat X1/Hind3切断pDD1に融合させてプラ
スミドpDD3を得た。

C.pT3XI−２の構築:pKK223−３の修飾この構築のための出発プラスミドはPharmaciaから購
入したプラスミドpKK223−３であった。プラスミドpKK2
23−３はテトラサイクリン耐性のための部分遺伝子をも
っている。この非機能性遺伝子はプラスミドpBR322に担
持された完全なテトラサイクリン耐性遺伝子と置き換え
た。プラスミドpKK223−３をSph1で完全にBamH1で部分
的に消化した。4.4キロ塩基対の断片をゲル精製し次の
配列：を有する合成アダプターおよびpBR322（PL Biochemical
s,27−4891−01）のテトラサイクリン耐性遺伝子のCla1
−Sph1消化物からの539 bp DNA断片と結合させた。得ら
れたプラスミドはpCJ1と命名した。

次に、New England Biolabsから購入したXho1リンカ
ーをプラスミドpCJ1のPvu II部位に挿入してプラスミド
pCJX−１を作製した。この挿入はプラスミドのコピー数
を制御するrop遺伝子を破壊する。lac1遺伝子を含むEco
R I断片をプラスミドpMC9［Calos et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA（1983）,80:3015−3019］から精製し、その
後次の配列：を有するXho1−EcoR1アダプターと共にXho1部位に挿入
した。

次に、プラスミドpKK223−３中のEcoR1とPst1部位間
のポリリンカー配列をここに示したポリリンカー配列：と置き換えた。このようにして得られたプラスミドベク
ターは、pCJXI−１と呼ばれる。

最後に、テトラサイクリン耐性遺伝子は重亜流酸塩突
然変異誘発により破壊された制限酵素Hind3、BamH1、Sa
l1の認識部位を有する類似の遺伝子と置き換えた。pBR3
22のテトラサイクリン耐性遺伝子に突然変異を起こすた
めに次の方法を用いた。プラスミドpBR322をHind3で切
断し、重亜硫酸ナトリウムで突然変異を誘発させた［Sh
ortle and Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1978）5:
2170−2174］。突然異変を起こしたDNAを連結して環状D
NAを形成し、その後Hind3で切断して突然変異を逃れた
プラスミドをすべて線状化した。このプラスミドを使っ
てE.coli JM109［Yanish−Perron et al.,Gene（1985）
33:103−119］を形質転換し、選択培地にまいた。テト
ラサイクリン耐性コロニーからプラスミドを単離し、テ
トラサイクリン耐性遺伝子中のHind3部位の欠失につい
て調べた。突然変異に成功したプラスミドをpT1と名付
けた。同様の方法を使って、pT1中のBamH1部位に突然変
異を起こさせ、プラスミドpT2を作製した。次いで、プ
ラスミドpT2に突然変異を起こさせてSall部位を除き、
プラスミドpT3を得た。突然変異を起こしたテトラサイ
クリン耐性遺伝子を保有するpT3のCla1−BsmH1断片を単
離し、この断片をpCJXI−１の相同な断片と置き換えてp
T3XI−２を作製した。突然変異を起こしたテトラサイク
リン耐性遺伝子を依然として機能タンパク質をコードす
る。

D.pT3XI−２−Φ10TC3FGFsynの構築:IL−1iのためのtac
プロモーターベクターの作製初めに、塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF）の“遺伝
子”を合成した。この“遺伝子”はSommerらによってFG
Fについて報告されたものと同じ配列をコードするが、
E.coliの高度発現遺伝子中に優先的に見いだせるコドン
を使用している。この構造はコード部分が翻訳カップラ
ー配列（Squires et al.,1988を参照）によって先行さ
れ、効率のよい翻訳開始が確実に得られるようにしてあ
る。

FGF合成遺伝子は初めにM13mp18のEcoR1とhHind3部位
間に挿入して、塩基配列を決定した。この遺伝子の構造
は次の通りであった：この遺伝子の関係ある特徴を示してある。

その後、これをBamH1とHind3で消化することにより単
離し、BamH1/Hind3切断pJU1003（Squires et al.,198
8）に挿入してpJU1003−synFGFを作製した。このプラス
ミドをXba1とHind3で切断し、FGF遺伝子を保有するXba1
/Hind3断片を単離した。この断片は、EcoR1−Xba1リン
カー：を使って、EcoR1とHind3で切断したpT3XI−２へ連結さ
せた。この新しいプラスミドをpT3XI−２−Φ10TC3FGFs
ynと命名した。

E.pDD4の構築:tacプロモーターベクターへのIL−1iの挿
入pT3XI−２−Φ10TC3FGFsynをBamH1とHind3で切断し、
これにより7.4kb発現ベクターを線状となし、挿入DNAを
放出させた。このDNAをNco1とSma1で切断して、挿入DNA
をさらに断片化した。pDD3をBamH1とHind3で消化し、54
6 bp IL−1i断片をゲル精製し、BamH1/Hind3切断pT3XI
−２−Φ10TC3FGFsyn7.4kbベクターDNA断片と融合させ
て、プラスミドpDD4を作製した。

F.pDD5の構築:E.coliに好適なコドンの使用プラスミドpDD4はompAシグナル配列と全長IL−1iタン
パク質（もとのcDNA由来）をコードするDNAを保有す
る。このプラスミドpDD4をBamH1とSpe1で切断して、omp
Aシグナルペプチドの配列とIL−1iタンパク質の最初の2
9アミノ酸残基のコドンを保有する小さい（170 bp）断
片、および大きい（7.8kb）ベクター断片を放出させ
た。大きいBamH1/Spe1ベクター断片は合成オリゴヌクレ
オチドから構築した２つの小さいDNA断片を融合させ
た。これらの断片の配列は次の通りである：これらの断片はE.coliに好適なコドン［deBoer and Kas
telein in From Gene to Protein:Steps Dictating the
Maximal Level for Gene Expression（1986）Davis an
d Reznikoff,eds.pp.225−283,Butterworths,NY］を用
いて、IL−1iタンパク質の最初の29アミノ酸残基をコー
ドする配列と、IL−1iの６番目のコドンの後に特異なSa
c1部位を保有する。得られたプラスミドはpDD5と呼ばれ
る。

G.pDD6の構築:mRNAの二次構造を除くための変更プラスミドpDD5をBamH1とSac1で消化した。この消化
より得られる大きい（7.8kb）ベクター断片を、IL−1i
タンパク質の最初の６残基をコードするが、mRNAの５′
末端近傍でのヘアピンループの形成を妨げるコドン（特
に“シャイン・ダルガーノ”配列またはIL−1iの開始コ
ドンを含む）を利用する次の合成DNA断片：に連結させた。これによりIL−1i生産用の発現ベクター
pDD6が構築された。プラスミドpDD6はJM107に形質転換
して生産菌SGE90を得た。

実施例２ 1.E.coli SGE90種菌増殖からのIL−1iの生産種菌として使用するために、SGE90の培養物のアンプ
ルを次のように作製する。15mg/lのテトラサイクリンHC
lを補給したLuria寒天培地に37℃に培養ストリークを増
殖させる。単一コロニーを取り、15mg/lテトラサイクリ
ンHCl補給Luriaブロスに37℃で増殖させる。増殖は660n
mでの吸光度（以後ODと記す）により監視する。培養物
が約1 ODに達したら、無菌的に遠心し、20％グリセロー
ル:Luriaブロス（1:1）に再懸濁する。その後、アンプ
ルに分配し（アンプルあたり1.5ml）、−70℃で貯蔵す
る。１本のアンプルを15mg/lテトラサイクリンHCl補給L
uriaブロスで約1 ODへ増殖させ、その後上記のようにア
ンプルを作製することにより、この細胞バンクから作業
用ストックを作る。

アンプルを40℃水道水で解凍し、アンプルから1mlを
0.5リットルの種菌用培地（処方１）を含む２リットル
フラスコ２本のそれぞれに接種して、発酵槽を用意す
る。このフラスコを振とう器上、37℃、350rpmで約８時
間インキュベートする。この時までに種菌ODは約３−４
に達する。

500mlの種菌培養物を用いて、10リットルの発酵用培
地（処方２）に接種する。この種菌タンクはその後pH7.
0に調整しながらODが約５に達するまで37℃で５−６時
間増殖させる。次いで種菌タンクを用いて、発酵槽に接
種する。

2.発酵発酵は1600リットルの発酵用培地（処方２）で行う。
温度を37℃に制御する。溶存酸素を30％（3psigで空気
飽和）に保つ。必要に応じてHC1とNaOHを加えてpHを7.0
に調整する。

増殖をODで監視する。約10 ODで、イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を150μＭの最終濃度
の添加してIL−1iの合成を誘導する。培養物が約40 OD
に達するまで発酵を続ける。細胞の収量は発酵用培地16
00リットルあたり固形分約150kgである。

3.細胞の回収および洗浄細胞はスラッジ除去用遠心機（例えばAlfa Laval BTU
X 510）を使って回収し、150mM NaClで洗う。細胞を150
mM NaCl中に再懸濁して約16％の固形分となし、凍結後
−20℃で貯蔵した。

4.細胞破砕および破砕物の除去 14kgの再懸濁細胞（約2.2kg固形分）を解凍する。EDT
Aを5mMになるまで加え、細胞を高圧ホモジナイザーに２
回通して溶解する。pHを1 M酢酸で5.5に調整する。リゼ
イトは水で20±２リットルに希釈し、14,000 x Gで20分
遠心して清澄化する。

5.第一のイオン交換（ａ）カラム規格：使用したカラムは7.5リットルの
Ｓ−Sepharose樹脂（Pharmacia）を充填したAmicon G30
0x250である。溶液はすべて500ml/分でカラムへポンプ
輸送する。

（ｂ）カラム操作：カラムで各サイクルに対して次の
緩衝液を使用する。緩衝液の処方は実施例４に示す。溶液処方番号体積平衡化 3 20 l 清澄化細胞リゼイト 15−25 l 平衡化 3 20 1 塩勾配溶離＊ 3/4 40 l NaOH洗浄 5 10 l 酢酸洗浄 6 5 l 貯蔵 7 20 l ＊塩勾配は150−400mM NaClである。

溶出液は280nmでの吸光度を監視し、塩勾配で溶離す
るピークを集める。清澄化細胞リゼイン20 lからのプー
ル画分約10 lに対して、約55gのIL−1iが回収される。

6.第二のイオン交換（ａ）透析：プールした溶出液は所望によりYM10メン
ブラン（Amicon）を使って濃縮し、その後４倍容量の第
二イオン交換平衡化緩衝液（処方８）を使って透析によ
り塩を除去する。この段階で形成された沈殿物は３μＭ
および0.22μＭフィルターを通し濾過し、除去する。

（ｂ）カラム規格：使用したカラムは５リットルのＱ
−Sepharose（Pharmacia）を充填したAmicon G180x250
である。溶液はすべて350ml/分でカラムへポンプ輸送す
る。

（ｃ）カラム操作：カラムでの各サイクルに対して次
の緩衝液を使用する。緩衝液の処方は付録Ａに示す。溶液処方番号体積平衡化 8 20 l 透析物５−10 l 平衡化 8 20 l 塩勾配溶離＊ 8/9 40 l NaOH洗浄 5 10 l 酢酸洗浄 6 5 l 貯蔵 7 20 l ＊塩勾配は０−100mM NaClである。

溶出液は280nmでの吸光度を監視し、塩勾配で溶離す
るピークを集める。7 lの透析物１からのプール画分約1
0 lに対して、約45gのIL−1iが回収される。

7.最終処理（ａ）濃縮および透析：第二イオン交換カラムからの
プールした溶出液はYM10メンブラン（Amicon）を使って
約6 lに濃縮する。その後、この物質を５倍容量の透析
用緩衝液（処方10）に対して透析する。約１−2 lへ最
終濃縮を行って、ターゲット濃度を10−30g/lとする。
この段階で形成される沈殿物は３μＭおよび0.22μＭフ
ィルターを通して濾過し、除去する。その後、最終濃縮
物は0.22μＭフィルーターを通して無菌の発熱物質不含
チューブへ濾過し、−70℃で貯蔵する。第二イオン交換
カラムからのプール画分からは約80％が回収される。

実施例３ 1.E.coli生産IL−1iからのＮ−末端メチオニンの除去 E.coliにより生産されたIL−1iは、そのＮ−末端が追
加のメチオニン残基をもつことを除いて、ヒト単球由来
のIL−1i−ｘと同じ配列を有する。この残基はインヒビ
ターをS.cerevisiaeからのエキソプロテアーゼ・アミノ
ペプチダーゼ１とインキュベートすることにより除去で
きる。

10mgの組み換えIL−1i（第一のＳ−Sepharoseまたは
Ｑ−Sepharose精製段階からのもの）を、Change and Sm
ith（J.Biol.Chem.264,6979,（1989））に記載されるよ
うに精製した、1mgの酵母アミノペプチダーゼ１と、50m
M炭酸アンモニウムpH8.0中で６時間インキュベートす
る。デスメチオニルIL−1iは更なるＳ−Sepharoseクロ
マトグラフィーによる反応混合物から精製する。

希望するならば、このデスメチオニル製造段階は、適
当な発現ベクター中に酵母アミノププチダーゼ１酵素の
cDNAを含むE.coliにIL−1iを発現させることにより回避
できる。このE.coliはまたはアミノペプチダーゼＰ（Yo
shimoto et al.,J.Biochem.（Tokyo）104 93（1988））
の遺伝子を発現する能力をもつべきでない。なぜなら
ば、Ｎ−末端メチオニンの除去がＮ−末端アルギニンの
除去へ導くからである。

当分野で習熟した者には、本発明の方法において種々
の修飾および変更が可能であることが明らかであるだろ
う。従って、本発明は、添付の請求の範囲およびそれら
の均等物に含まれる限り、これらの方法の修飾および変
更を包含するものである。

実施例４ A.培地およびその処方 B.IL−1iの逆相HPLC−非還元条件 IL−1iの逆相HPLC−非還元条件 HPLCシステム：ベックマン114溶媒デリバリーモジュールベックマン165可変波長検知器ベックマンシステムゴームドアナログインターフェー
スモジュール406 ベックマンシステムゴールド、パーソナルクロマトグ
ラフソフトウェアカラム：ブラウンリー（Brownlee）RP−300（C8）（220mm x 4.6mm,7ミクロン）検知器セッティング：チャンネルA,215nm チャンネルB.280nm 範囲:0−0.05AUFS 移動相： A:0.1％TFA/水 B:0.1％TFA/アセトニトリル勾配条件：時間（分）Ｂのパーセント継続時間 0 ０５ 5 30 30（勾配開始） 35 50 40 75 100 5（勾配終了） 85 ０ 5 95 ０終了流速： 1.0ml/分試料調製：試料は水で0.1−0.5mg/mlに希釈する。

注入量： 100μｌ化学薬品：化学薬品販売元カタログ番号 TFA Sigma社Ｔ−6508 アセトニトリル、HPLC級 Baker社 9017−03 C.IL−1iのMono Q HPLC HPLCシステム：ベックマンシステムゴールド（Beckman System Gol
d）プログラム作成可能な溶媒モシジュール126 走査検知器モジュール167 リモートインターフェースモジュール HP系列1050オートサンプラーシステムゴールド、パーソナルクロマトグラフソフトウェアカラム：フォルマシア（Pharmacia）Mono Q HR5/5 検知器セッティング： 280nm 移動相： A:20mMトリス,pH7.5 B:20mMトリス,pH7.5＋250mM NaCl 勾配条件： 60分で０から100％Ｂ流速： 0.5ml/分試料調製：なし注入量： 25μｇ D.IL−1iのMono S HPLC HPLCシステム：ベックマンシステムゴールドプログラム作成可能な溶媒モシジュール126 走査検知器モジュール167 リモートインターフェースモジュール HP系列1050オートサンプラーシステムゴールド、パーソナルクロマトグラフソフトウェアカラム：フォルマシア（Pharmacia）Mono S HR5/5 検知器セッティング： 280nm 移動相： A:25mM NaAc,pH5.5＋1mM EDTA B:25mM NaAc,pH5.5＋1mM EDTA＋500mM NaCl 勾配条件： 36分で０％から60％Ｂ流速： 0.5ml/分試料調製：なし注入量： 25μｇ E.IL−1iのサイズ排除HPLC HPLCシステム：ベックマン114溶媒デリバリーモジュールベックマン165可変波長検知器ベックマンシステムゴームドアナログインターフェー
スモジュール406 ベックマンシステムゴールド、パーソナルクロマトグ
ラフソフトウェアカラム： Bio−Sil TSK250（7.5mm x 30cm）検知器セッティング： 280nm 範囲:0−0.2AU 移動相： 25mM酢酸Naおよび0.5M NaCl,pH5.5 流速： 0.5ml/分試料調製： IL−1i溶液は移動相で希釈して、最終濃度を約2mg/ml
とする。

注入量： 50μｌ F.IL−1iの還元SDS PAGE ゲル調製： Lammli in J.Mol.Biol.,80,575−599（1973）に記載
される方法に従う。

分離用ゲル：アクリルアミド 15％トリスpH8.8 375mM SDS 0.1％堆積用ゲル：アルリルアミドpH6.8 ５％ SDS 0.1％試料調製：試料は試料緩衝液で1:1に希釈する。

次いで試料を65℃で15分間加熱し、遠心し、ゲルにの
せる。

試料緩衝液：トリスpH6.8 250mM SDS 2.5％２−メルカプトエタノール５％グリセロール 12.5％電気泳動条件：試料が分離用ゲルに達するまで50V。

ブロモフェノールブルーがゲルから出るまで100V。

染色：エタノール 45.4％酢酸 9.0％水 45.5％クーマシーブリリアントブルー 2.5％穏やかに振とうしながら室温で一晩染色する。

脱色：メタノール 30.0％酢酸 12.5％水 57.5％一晩またはバックグラウンドがはっきりするまで室温
で脱色する。

分子量標準：低分子量範囲（BRL）：タンパク質公表MW インシュリン（ＡおよびＢ） 2,300および3,400 ウシトリプシンインヒビター 5,200 リゾチーム 14,300 β−ラクトグロブリン 18,400 α−キモトリプシン 25,700 卵アルブミン 43,000 タンパク質混合物５μｇをSDS PAGEゲルにのせる。

G.組み換えヒトIL−1iのトリプシンペプチドマップ準備： 1.試薬 1.1 トリプシンシークエンシング級:Boehringer M
annheim GmbH 1.2 尿素超純粋;BRL 1.3 Milli−Ｑ水 1.4 トリフルオロ酢酸:Pierce 1.5 HPLC級アセトニトリル:J.T.Baker 1.6 トリス 1.7 CaCl₂ 2.装置 2.1 HPLCシステムベックマン114溶媒デリバリーモジュールベックマン165可変波長検知器ベックマンシステムゴームドアナログインター
フェースモジュール406 ベックマンシステムゴールド、パーソナルクロ
マトグラフソフトウェア 2.2 カラムブラウンリーRP−300（C8）（220mm x 4.6mm,7ミクロン） 2.3 加熱／冷却水浴 3.溶液 3.1 トリプシン;0.1mlの0.1mM HClに0.1mgを溶解す
る；−20℃で凍結貯蔵し、活性低下を示さずに数カ月安
定である。

3.2 尿素;Milli Q水中の8M尿素、毎日新たに調製す
る。

3.3 2MトリスHCl pH8.0および0.1MトリスHCl pH8.0 3.4 3mM CaCl₂ 4.方法 4.1 IL−1iを6M尿素および0.1MトリスHCl pH8.0中約
3mg/mlタンパク質の最終濃度で37℃、10分変性する。

4.2 0.3mM CaCl₂を含む0.1MトリスHCl pH8.0の溶液
へ希釈して（1:2v/v）、2M尿素の最終濃度とする。

4.3 トリプシン溶液（溶液番号3.1）を加えて１重量
％のタンパク質とする。十分に混合する。

4.4 37℃で１時間インキュベートし、追加の１重量
％のトリプシンを加える。

4.5 −20℃で凍結するか、10％トリフルオロ酢酸
（最終濃度0.1％）で酸性化することにより３時間後に
消化を停止させる。

4.6 HPLCカラムに注入する。

5.トリプシン消化により生じたペプチド断片の逆相 5.1 HPLCシステムとカラムはセクション２に記載し
た。

5.2 検知器セッティング：チャンネルA:215nm チャンネルB:200nm 範囲:0−0.5AU 5.3 移動相： A:0.1％TFA/水 B:0.1％TFA/アセトニトリル 5.4 勾配条件：時間（分）Ｂのパーセント継続時間 0 0 0 5 40 80 85 100 5 95 0 5 120 0 終了 5.5 流速： 1.0ml/分 5.6 試料調製：なし 5.7 注入量 50−100μｌ H.IL−1iバイオアッセイ IL−1iインヒビターのアッセイは、S.Nakai,K.Mizun
o,M.KanetaおよびY.Hirai（Biochem.Biophys.Res.Comm.
154:1189−1196,1988）により開発されたIL−１アッセ
イを土台にしている。このアッセイの原理は、IL−１へ
の長期暴露がヒト黒色腫細胞系列A375に対し細胞毒性で
ある、ということである。IL−1iは、IL−１受容対への
結合に関してIL−１と競合することにより、用量依存的
にこの細胞毒性を中和する。毒性レベルは、生細胞をク
リスタルバイオレットで染色し、100％エタノール中で
一晩インキュベートして細胞から色を抽出し、分光光度
計で抽出した色の光学密度を測定することにより、定量
が可能である。A375黒色腫細胞バイオアッセイを用いる
根拠は、それがIL−１とIL−1i活性の両方を測定できる
簡便かつ直接的な方法である点にある。文献に記載され
た他のアッセイは殆どが、他の産物（例えば繊維芽細胞
におけるプロスタグランジンE2と乳酸、またはＴ−細胞
におけるインターロイキン−２）を活性化するIL−１の
能力によるものである。これらの二次産物をその後測定
して、存在するIL−１の濃度を求める。これらのIL−１
活性の全ては受容体によって仲介されるが、これらの代
替アッセイは２段階以上を行う必要があるために煩雑
で、間違った結果がでやすい。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ドリップス，デイビッドアメリカ合衆国コロラド州 80303, ボウルダー，ムーアヘッドアベニュー 3335 (72)発明者エバンス，ロナルドアメリカ合衆国コロラド州 80027, ルイスビル，ダブリュー．アイゼンハウワー 404 (72)発明者カッドニー，ヘンリックアメリカ合衆国コロラド州 80302, ボウルダー，ハミルトンコート 4462 (72)発明者トンプソン，ロバート，シー. アメリカ合衆国コロラド州 80303, ボウルダー，ルハイストリート 1820 (56)参考文献国際公開89／1946（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 1/18 C12N 15/00 - 15/90 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン−１インヒビター（IL−
1i）を生産する方法であって：（１）IL−1iをコードするDNAを含むプラスミドを保有
するE.coliの発酵；（２）（ａ）細胞の回収、（ｂ）溶菌、および（ｃ）溶菌液の清澄化、を含む細胞処理；（３）カチオン樹脂を使用する第一のイオン変換段階；（４）アニオン樹脂を使用する第二のイオン変換段階；（５）濃縮および透析を含む次の処理段階；を含んでなる方法。
【請求項２】プラスミドが、ラムダファージGT10−IL−
1i−2a（ATCC ＃40488）が有するインターロイキン−１
インヒビターをコードするDNAを含むプラスミドpDD6で
ある、請求項１の方法。
【請求項３】カチオン樹脂がＳ−セファロース、SP−C2
5セファデック、CMセファデックス、CMセファロース、C
Mセルロース、またはCMトヨパールより成る群から選ば
れる、請求項１の方法。
【請求項４】カチオン樹脂がＳ−セファロースである、
請求項３の方法。
【請求項５】アニオン樹脂がＱ−セファロース、DEAE−
セファロース、Ｑ−セファデックス、およびDEAEセルロ
ースより成る群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項６】アニオン樹脂がＱ−セファロースである、
請求項５の方法。
【請求項７】次の処理段階の直前に行われる第三のイオ
ン交換段階をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項８】第三のイオン交換段階がカチオン樹脂を使
って行われる、請求項７の方法。
【請求項９】カチオン樹脂がＳ−セファロース、SP−C2
5セファデックス、CMセファデックス、CMセファロー
ス、CMセルロース、またはCMトヨパールより成群から選
ばれる、請求項８の方法。
【請求項１０】カチオン樹脂がＳ−セファロースであ
る、請求項９の方法。
【請求項１１】ラムダファージGT10−IL−1i−2a（ATCC
＃40488）が有するインターロイキン−１インヒビター
をコードするDNAを含むプラスミドpDD6。