JP2922247B2 - アンギオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を有するペプチドを有効成分とす
るアンギオテンシン変換酵素阻害剤に関する。

Pro−Ala−Gln−Lys ［従来の技術］ アンギオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮
細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテンシンＩ（As
p−Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe−His−Leu）に
作用して、アンギオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド
（His⁹−Leu¹⁰）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシンIIを生成させる酵素である。ま
た、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを破
壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与して
いる。

従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻害す
れば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療に
有効であると考えられている。

最近ではプロリン誘導体であるカプトプリルが合成さ
れ、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギオテンシ
ン変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであり、又天然物
からの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食品
あるいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高
い降圧剤となることが期待されるからである。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、天然物中に見出されるアンギオテンシ
ン変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産
や日本産蛇毒より得られたテプロタイド（ノナペプチ
ド,SQ20881）等や、ストレプトミセス属に属する放線菌
の代謝産物IS83（特開昭58−177920号公報）が知られて
いるに過ぎない。また、天然物を酵素処理して得られた
アンギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼ
インをトリプシンにより分解して得たペプチド類が知ら
れているに過ぎず（特開昭58−109425号、同59−44323
号、同59−44324号、同61−36226号、同61−36227号）
新規な阻害物質の開発が望まれているところである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質で副
作用の少ないアンギオテンシン変換酵素阻害物質を鋭意
探索した結果、カツオブシの熱水抽出物中にアンギオテ
ンシン変換酵素阻害活性を有する物質の存在をつきと
め、該物質がPro−Ala−Gln−Lysを骨格とするペプチド
であることを知見し、更に該物質は動物の組織中に含有
されるクレアチンカイネース由来であることを見出し本
発明を完成した。

本発明のPro−Ala−Gln−Lysを骨格とするペプチドは
カツオブシやクレアチンカイネース分解物などの天然物
から単離精製することにより、あるいはペプチド合成の
常套手段を適用して合成することによって製造すること
ができる。

上記でいうProはプロリン、Alaはアラニン、Glnはグ
ルタミン、Lysはリジンを意味し、かかるアミノ酸はい
ずれもＬ−体である。

カツオブシ等の天然物から本発明のペプチドを取得す
るには、熱水による抽出が行われる。

具体的にはカツオブシを水に混合し、強力な撹拌下で
沸騰させる。得られる煮汁を冷却後、遠心分離等の公知
の操作で濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用
した後、あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対
する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるい
は溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間における分
配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液から
の析出性あるいは析出速度の差などを利用する手段を適
用して目的物を単離するのが好ましい。これらの方法は
必要に応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組
合せ、また反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方
法、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位
置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反
応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメン
トに相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジ
イミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成す
る縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させ
ることによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基
は、保護基により保護される。アミノ基の保護基として
は、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカル
ボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル等が
挙げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばア
ルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が
挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル
基はクロルメチル樹脂、オキシメイル樹脂、Ｐ−アルコ
キシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあ
るいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活
性エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場
合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断す
る。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製され
る。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口
投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経
口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合
物の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なる
が、通常１回0.001〜1000mg、好ましくは0.01〜10mgを
１日当たり１〜３回である。本発明のペプチドは通常、
製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。
製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ
本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。具体
的には、例えば乳糖、ブトウ糖、マンニット、デキスト
リン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ
酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、
カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプ
ロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウ
ム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、ア
ラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、
ポリビニルアルコール、軟質無水ケイ酸、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビ
ーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウ
リル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエ
ステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベ
ート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、
白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性
剤、プロピレングリコール、水等が挙げられる。剤型と
しては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ
剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付
剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常
法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であっ
てもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティン
グしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを
水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水
あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤
や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを0.01％以上、好
ましくは0.5〜70％の割合で含有することができる。こ
れらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有して
いてもよい。

［作用］ 本発明のペプチドは、優れたアンギオテンシン変換酵
素阻害作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化
抑制作用を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高
血圧などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診
断剤や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心
病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全に
おける病態の改善剤として有用である。

［実施例］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

〔ペプチドの抽出〕

カツオブシ5gに水45mlを加え、ホモジナイズし、フラ
スコに入れて、沸騰水浴中に10分間放置した。冷却後遠
心分離し、上澄液をSep−pakカートリッジ（C18）に注
入し、溶出した画分を濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー（ODS,CNカラム）により精製し、阻害活性画分を得
た。

本品を気相プロテインシーケンサー（アブライド バ
イオシステムズ社製 470 A型）を用いる自動エドマン
分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造を
得た。

プロテインデーターバンクによるホモロジー検索の結
果、本ペプチドは筋肉クレアチンカイネースのＣ末端に
一致した。

〔ペプチドの合成〕

市販のBoc（ブトキシカルボニル）−Lys（クロロベン
ジルオキシカルボニルで保護）−Ｏ−Resin〔ベンジル
樹脂（置換率0.32meq/g〕0.94gをバイオリサーチ社のペ
プチド合成装置SAM2の反応槽に分取し、以下のように合
成を行った。

45％トリフルオロ酢酸、2.5％アニソール及び２％の
1.2−エタンジチオールを含む塩化メチレン中、25分間
の反応により、Boc基を除去したのち、塩化メチレンに
よる洗浄、10％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化
メチレンによる中和、及び塩化メチレンによる洗浄を行
った。

これと5mlの0.4M Boc−Gln（グルタミン）−oBz（ベ
ンジルエステル）のジメチルホルムアミド溶液、5mlの
0.6Mジイソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液
とを混合した後、反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反
応させた。

得られた樹脂をジメチルホルムアミド、塩化メチレ
ン、10％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレ
ン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメチルホルム
アミドとの混合液で洗浄し、Boc−Gln−Lys−樹脂を得
た。

引き続き同様のBoc基の除去、Bocとアミノ酸のカップ
リングを繰り返しAsp（oBzl）−Met−Ile−Pro−Ala−G
ln−Lys（Cl−ｚ）−樹脂を得た。

該樹脂を20mlの10％アニソールを含むフッ化水素中で
０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
フッ化水素を減圧留去し、残渣を30％酢酸で抽出し、凍
結乾燥して粗ペプチドを得た。これをODSカラム（Cosmo
sil 5C/18）による逆相クロマトグラフィーにより精製
し、Ｈ−Asp−Met−Ile−Pro−Ala−Gln−Lys−OH（収
量160mg）を得た。

本品を前記と同一のプロテインシーケンサーにより分
析した結果、上記の組成であることが判明した。

又、目的とするペプチドのアミノ酸種に応じて反応薬
剤を変更した以外は上記の合成例に準じて第１表に示す
各種のペプチドを合成した。

実施例１〜７ （アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定） アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Cheung
とCushmanの方法〔Biochemical Pharamacology 20,1637
（1971）〕に準じて以下の方法で行った。

酵素基質;Bz（ベンジル）−Gly−His−Leu （86mgを水8mlとリン酸緩衝液8mlに溶解した溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （1gを50mモルのリン酸緩衝液10ml中で粉砕した後、
遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を100μｌ、酵素溶液を12μｌ及び本
発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を250μ
ｌとした後、37℃で30分間反応を行った。

反応は1N−HCl 250μｌを用いて終了させた。反応終
了液に酢酸エチル1.5mlを入れVortexで15秒撹拌し、そ
れを遠心分離した。

酢酸エチル層から1.0mlをとり出して、酢酸エチルを
留去し、それに1mlの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽
出された馬尿酸の紫外吸収228nmの値（OD₂₂₈）を測定し
た。

阻害率は阻害剤なしで反応したときのOD₂₂₈を100％と
し、反応時間０分のときのOD₂₂₈を０％として求め阻害
率50％の時の阻害剤（本発明のペプチド）の濃度IC
₅₀（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

又、参考例として本発明以外の阻害剤についても測定
を行ったので、第１表に合わせて示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のペプチド Pro−Ala−Gln−Lys を有効成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤