JP2915919B2 - レーザ走査蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、収束レーザ光により蛍光試料を走査する
とともに励起された蛍光試料からの蛍光を検出して試料
の顕微画像を得るレーザ走査蛍光顕微鏡に関し、特に、
試料の厚み方向の画像を採取するための改良された手法
および蛍光のエネルギー収集効率の改良に関する。

（従来の技術とその問題点） 蛍光顕微鏡は現在、生物学、医学、半導体産業等多く
の分野で一般的に使用されており、分解能が高く、コン
トラストがよいこと及び定量測定に適していることなど
から、これまでの透過型の生物顕微鏡や電子顕微鏡に置
き替わり、あるいはまたこれらを補う測定装置として多
用されつつある。又、試料の照明において、コヒーレン
ト光であるレーザ光のコヒーレンシイの欠点を走査とい
う概念で打破し、逆にレーザ光の利点を生かして散乱光
の影響がない高コントラスト、高分解能を実現するレー
ザ走査蛍光顕微鏡が最近、顕微測定に用いられようとし
ている。

第１図には一般に使用されている一様照明落射型蛍光
顕微鏡の光学系の原理図を示す。蛍光顕微鏡は、特に微
小な構造を観察することが多いため、通常の生物顕微鏡
に比べて、より高い分解能が求められ、また、励起され
た蛍光（１）の微弱光測定になるので、これの高いエネ
ルギー収集効率をもつことが望まれている。

蛍光顕微鏡の分解能は、対物レンズ（２）の開口数
（Numerical Aperture;以下、NAと記載することがあ
る）と蛍光（１）の波長で決まる回折限界によって制限
される。すなわち、より高い空間分解能を得る（より細
かい構造を結像する）ためには、対物レンズ（２）の
開口数をより大きくするか、より短い波長の蛍光を利
用しなければならない。しかしながら、蛍光波長は、被
測定対象・試料（３）の物質によって決定され、装置側
では選択はできない。他方、対物レンズ（２）の開口数
は、乾燥系レンズでは無限に大きいレンズを用いても１
が最大であり、たとえ油浸系レンズを用いても高々1.5
程度である。

しかも、問題となるのは、回折限界が分解能を決定す
るという従来からの公式は、試料がある特定の面内にの
み分布している場合に限られているということである。
試料（３）に厚みがある場合は、分解能は回折限界より
はるかに劣る。これは、フォーカス面近傍の面の試料の
構造のデフォーカス像がフォーカス像に重畳するためで
ある。

より高い分解を求めるためには、より大きい開口数を
もつ対物レンズを使用することが考えられるが、しかし
これにより焦点深度はより浅くなり、フォーカス面以外
のディフォーカスの影響は大きくなり、結果として像の
分解能を低下させてしまう。すなわち、分解能を上げる
ために対物レンズの開口数を大きくすると、フォーカス
面以外からのボケが入り、分解能が低下するという相反
した問題が生じる。

結局、デフォーカスの影響を受けないためには、試料
の厚さ以上の焦点深度をもつ対物レンズを用いる必要が
あり、その対物レンズの開口数で分解能は決定される。
しかし、焦点深度を深くするためには対物レンズの開口
数は小さくする必要があり、試料が厚くなると、分解能
は低下することになる。高分解能と長焦点深度とは相矛
盾する要求であることは、よく知られたことである。無
限に薄い試料に対してのみ、上述の回折限界が分解能を
決定する。しかし、総ての試料は厚みをもっているの
で、分解能はこれより小さくなる。

蛍光顕微鏡に要求されるもうひとつの重要な点は蛍光
のエネルギー収集効率である。このエネルギー収集効率
は、対物レンズの開口数によって決まり、それが大きけ
れば大きいほど、高いエネルギー収集効率が得られ、SN
比のよい良質な蛍光画像を得ることができる。しかし、
厚みのある試料を観察するためには、上に述べたよう
に、深い焦点深度が必要であり、開口数を小さくしなけ
ればならず、結局、エネルギー収集効率を犠牲にするこ
とになる。

本発明は、厚みのある試料の深さ方向（厚み方向，奥
行き方向）の像の分解能に関する対物レンズの上記問
題、及び対物レンズに関連するエネルギー収集効率の上
記問題を解決することを課題とする。

（問題点を解決するための手段） 本発明に係る第１の発明は、収束レーザ光により蛍光
試料を走査するとともに励起された蛍光試料からの蛍光
を検出して試料の顕微画像を得るレーザ走査蛍光顕微鏡
において、励起光学系の光路中に、レーザ光束を輪帯光
束にする手段を備えたことを基本的な特徴とするもので
ある。

第２の発明は、共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡にお
いて、蛍光を検出する光電検出器の被露光面の面積を可
変する手段を備えたことを基本的な特徴とするものであ
る。

（本発明の理論的背景） 光学系の結像特性を解析する場合、光学的伝達関数
（OTF）を用いる。OTFは、光学系の空間周波数応答を表
し、強度の点像分布関数の２次元フーリエ変換で与えら
れる。この値が大きいほど、周波数応答がよいことを意
味する。

以下では、比較のため、第１図に示した一様照明落射
型蛍光顕微鏡の３次元OTFを示すとともに、第２図のレ
ーザ走査蛍光顕微鏡（共焦点型）の３次元OTFを示し、
次に、共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡（第２図）にお
いて蛍光を検出する検出器面積をパラメータに含む新規
に導出された３次元OTFを示して検討を行い、最後に第
９図に示される，励起光学系に輪帯瞳を用いたレーザ走
査蛍光顕微鏡の３次元結像特性・新規に導出された３次
元OTFを示して検討を行う。

一様照明落射型蛍光顕微鏡 この顕微鏡では、面積をもつ光源（４）からの光束を
ダイクロイックミラー（５）で反射し、対物レンズ
（２）により蛍光試料（３）を一様に照明し、励起され
た蛍光試料（３）からの蛍光発光（１）を対物レンズ
（２）により像検出器（６）で（CCDカメラやアイ・ピ
ースを通して目視するなどして）観測する。試料（３）
での強度分布が一様になるように照明されているので、
照明光の空間分布を考慮する必要はなく、光学系全体と
しては蛍光物体をインコーヒレント発光体とみてこの発
光の結像特性のみを扱えばよい。３次元OTF、Ｈ（ρ，
η）は（１）式で与えられる。

Ｈ（ρ，η）＝（1/λ^２ρＡ）× Re｛［１−（λρＡ＋2|η|A/ρ）^２］^1/2｝ …（１） 共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡 第２図に光学系の原理図を示す。この顕微鏡では、点
光源（24）を試料（23）に結像させ、結像点からの蛍光
（21）を対物レンズ（22）により点検出器（26）で計測
する。画像化のため、点光源（24）と点検出器（26）を
Ｘ−Ｙ走査する。理想的な点検出器を用いると、焦点位
置からの蛍光のみを検出でき、焦点から外れた位置から
の蛍光は検出されない。従って、ピントがはずれた像は
ボケるのではなく、そのコントラストを失って観測され
ない。３次元の試料（33）のｚ方向の一断面のみがシャ
ープに観測される。

ここでは、十分に小さい検出器（26）をもつものとし
て、この顕微鏡の３次元OTFを与える。

この光学系は、一様照明落射型蛍光顕微鏡とは異な
り、試料は一様に照明されない。ただし、結像光学系
は、一様照明落射型蛍光顕微鏡の光学系と等価である。
従って、この光学系による強度の３次元点像分布関数 と、点光源による強度分布の積で与えられる。点光源に
よる強度分布もまた、先の式 で与えられるので、この光学系による強度の３次元点像
分布関数 は次式で与えられる。

実領域での積は、周波数領域でのコンボリューション
に対応しているので、共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡
の３次元OTF、Hc（ρ・η）は（３）式で与えられる。
なお、＊はコンボリューションを表し、Hc（ρ・η）は
（１）式での のフーリエ変換で与えられたものである。

Hc（ρ，η）＝［Ｈ（ρ，η）］＊［Ｈ（ρ，η）］ ……（３） （３）式と上記（１）の３次元OTFを計算した結果を
第３図に示す。同図（ａ）は一様照明系、（ｂ）は共焦
点型レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系のものである。

ρは面内方向の空間周波数を表し、ηは奥行方向の空
間周波数を表している。縦軸は各周波数に対する３次元
OTFの値をlogスケールで示しており、各空間周波数に対
する応答を表している。

第３図より、共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡は、一様
照明落射型蛍光顕微鏡に比べて、奥行方向（η方向）の
空間周波数帯域が２倍、面内方向（ρ方向）の空間周波
数帯域が1.7倍になっていることがわかる。また、
（ａ）では、η軸に近づくほど、奥行方向の空間周波数
帯域が狭くなっており、η軸上では原点しか値をもって
いない。従って、一様照明落射型蛍光顕微鏡は、奥行方
向のみに構造の変化をもつ試料に対しては全く分解をも
たない。例えば、面内に構造の変化をもたない薄い膜状
の試料を一様照明落射型蛍光顕微鏡で観察した場合、試
料の位置も（ｚ座標）厚みも知ることはできない。他
方、（ｂ）には（ａ）のような原点付近の欠落は見られ
ない。従って、レーザ走査蛍光顕微鏡は奥行方向のみに
構造の変化をもつ試料に対しても分解をもつことがわか
る。

検出器面積をパラメータのする３次元OTF 共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡では、第４図に示す
ように、光電子増倍管や半導体光電検出器（26d）の前
に、ピンホール（26p）の開口を有するアパーチャ（26a
p）が設けられ、ピンホール（26p）が検出光量を制限し
ている。

ここで、アパーチャ（26ap）をピンホール（26p）以
外の円形開口とする。円形開口の半径をパラメータとし
て、この３次元OTFを導出する。

検出器の面積を変えても、励起光学系は影響を受けな
いため、結像光学系についてのみ考究すればよい。

試料からの蛍光による強度の３次元点像分布関数ｈ
（x,z）は、対物レンズの瞳関数Ｐ（μ）を用いて次式
で与えられる。

レーザ走査顕微鏡では、第５図のように、検出器を走
査することによって像を得ているので、結像光学系にお
ける強度の３次元点像分布関数 は、（４）式と、円形開口の形状を表す関数 とのコンボリューションで与えられる。

ここで、ａは円形開口の半径である。

ここで、検出器の面積が十分に小さいとする（ａ→
０）とΠはデルタ関数になり、（５）式は（６）式で与
えられる。第５図（ｂ）はこの場合の走査（scan）の状
態を模式的に示している。

励起光の強度分布を考慮すると、全体の光学系による
強度の３次元点像分布関数は、先にも述べたように、結
像光学系による強度の３次元点像分布関数h₂と、点光源
による強度分布の積で与えられる。従って全体の光学系
による強度の３次元点像分布関数h₃は、 で与えられる。

（７）式を３次元フーリエ変換することにより、検出
器面積をパラメータとした３次元OTF、H₃（ρ，η）を
得る。ここで のフーリエ変換は（８）式で与えられ、 ただし、J₁は第１種ベッセル関数であり、 として、この３次元OTF,Ha（ρ，η）は（９）式で与え
られることになる。

Ha（ρ，η）＝Ｈ（ρ，η）＊［Ｈ（ρ，η）・ J₁（２πａρ）／πａρ］ …（９） この（９）式に基づいて、検出器面積をパラメータと
して３次元OTFの計算を行った。結果を第６図に示す。
ρは面内方向（ｒ）の空間周波数を表し、ηは奥行方向
（ｚ）の空間周波数を表す。図化した縦軸は、各空間周
波数成分における３次元OTFの値をlogスケールで示して
いる。計算に用いたパラメータは次の通りである。

励起波長:488nm（Arレーザ） 蛍光波長:520nm レンズのＦナンバー:0.5（ドライレンズの場合NA＝0.
7） 第６図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）は下記の条件
による。

（ａ）…ａ→０ （共焦点型） （ｂ）…ａ＝励起光によるエアリディスクの半径（425n
m） （ｃ）…ａ＝励起光によるエアリディスクの半径の２倍
の半径（850nm） （ｄ）…ａ→∞（一様照明落射型蛍光顕微鏡） なお、円形開口の半径ａの値は、円形開口を試料面に
投影したときの値であり、実際では、この円形開口の半
径は（ａ×顕微鏡の倍率）となる。また、エアリディス
クとは、第７図に示すように、励起光によって試料面に
つくられるエアリパターンの最初の暗リングの内側を指
す。

第６図より、検出器の面積を、その半径がエアリディ
スクと同じ、または、エアリディスクの２倍まで広げた
場合、その３次元OTFがη軸上で値をもち、３次元分解
能をもっていることがわかる。このような光学系は、一
様照明落射型蛍光顕微鏡が全く分解をもたなかったｚ方
向のみに構造の変化をもつ試料に対しても分解をもつ。
特に検出器の面積がエアリディスクと同じである場合
は、半径がエアリディスクの２倍である場合と比べて、
２倍の奥行分解能をもち、共焦点型に近い分解能を示し
ている。また、エネルギー収集効率は共焦点型に比べは
るかに高くなる。

また、第６図（ｃ），（ｄ）では、面内方向の空間周
波数成分が低い場合、つまりη軸付近で奥行方向の空間
周波数帯域幅が狭くなっている。すなわち面内の構造に
よって奥行方向の分解能が影響を受けている。しかし、
第６図（ｂ）には、同図（ｃ），（ｄ）に見られるよう
な原点付近の欠落部分は殆ど存在しない。従って、検出
器の大きさがエアリディスクと同じである場合は、面内
の構造によって奥行分解能が影響を受けることはほとん
どない。

励起光学系に輪帯瞳を用いた３次元結像特性 第８図に示すような、輪帯瞳（annular pupil）は、
低い空間周波数成分の光をカットし、一定の空間周波数
以上の光を通すことができる。

第９図に励起光学系にこの輪帯瞳（アパーチャ（98）
で形成）を用いた光学系の原理図を示す。（94）は点光
源（レーザ）、（97）はレンズ、（98）はアパーチャで
レーザ光束を輪帯光束にする。この輪帯光束（99）は、
ダイクロイックミラー（95）により反射され、対物レン
ズ（92）で収束されて、３次元試料（93）上に結像され
る。励起された試料からの蛍光（91）は対物レンズ（9
2）で収集され、検出器（96）により検出される。

この光学系において、点光源による試料面での強度分
布 は、輪帯瞳の瞳関数Pa（μ）を用いて次式で与えられ
る。

ここで、輪帯瞳の瞳関数は次式により定義される。

上記（10）式を３次元フーリエ変換し、瞳関数を代入
すると次式（11）を得る。ただし である。

Hap（ρ，η）＝（1/λ^２ρAmax）rect［4|η｜λA²max ／（１−（Amax/Amin）^２）］×Re｛［１−（λρAmax ＋2|η|Amax/ρ）^２］^1/2−（Amax/Amin）［１−（λρAmin −2|η|Amin/ρ）^２］^1/2｝ …（11） 一方、蛍光物体からの発光による強度の３次元点像分
布関数の３次元フーリエ変換は、先に示した通り、次式
で与えられる。

Ｈ（ρ，η）×J₁（２πａρ）／πａρ …（12） ただし、J₁は第１種ベッセル関数を表し、Ｈ（ρ，
η）は（１）式で与えられる。

従って、励起光学系に輪帯瞳を用いた全体の光学系の
３次元OTF、Hapa（ρ，η）は次の（13）式で与えられ
る。

Hapa（ρ，η）＝Hap（ρ，η）＊［Ｈ（ρ，η）× J₁（２πａρ）／πａρ］ …（13） ρは面内方向の空間周波数を表し、ηは奥行方向の空
間周波数を表す。第10図は各空間周波数成分に対する３
次元OTFの値をlogスケールで表示している。

計算に用いたパラメータは次の通りである。

励起波長:488nm（Arレーザ） 蛍光波長:520nm Amax:0.5 Amin:0.55 第10図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）は下記の条件
による。

（ａ）…ａ→０ （共焦点型） （ｂ）…ａ＝励起光によるエアリディスクの半径（425n
m） （ｃ）…ａ＝励起光によるエアリディスクの半径の２倍
の半径（850nm） （ｄ）…ａ→∞ 尚、実際の円形開口の半径は、先に述べたのと同様
に、ａ×（顕微鏡の倍率）である。

また、表1.に輪帯瞳を励起光学系に用いた場合と用い
ていない場合における面内方向の分解能を示す。即ち、
分解限界を示している。

第10図より、励起光学系に輪帯瞳を用いた光学系は、
η方向の空間周波数帯域幅が一様に狭く、深い焦点深度
をもつことがわかる。検出器の面積を大きくすると、焦
点深度は深くなる。一方、面内方向の空間周波数帯域
は、検出器の面積を大きくしても奥行方向の空間周波数
帯域幅ほど減少しない。従って、励起光学系に輪帯瞳を
用いると、面内方向の分解を高く保ちつつ、かつ焦点深
度を深くできると考えられる。

励起光学系に輪帯瞳を用いた光学系は、輪帯瞳を用い
ていない光学系に比べて検出器の面積によらず高い面内
分解能をもつことが表１よりわかる。ただし、励起光学
系に輪帯瞳を用いると、奥行方向の空間周波数帯域が狭
くなるので、正しくは、η＝０付近においてのみ高い面
方向分解能をもつというべきであろう。つまり奥行方向
に構造の変化をもたない試料に対して、輪帯瞳を用いて
励起を行うと、高い分解が得られることがわかる。即
ち、奥行方向に構造をもたない（ｚ方向に構造が変化し
ない）試料を円形瞳を用いて励起すると、フォーカス面
の分解は高いが、フォーカス面以外の像がボケて残って
いるので、結局フォーカス面の微細な構造は詳細に観測
しえない。他方、同じ試料を、輪帯瞳を用いて励起する
と、フォーカス面の分解は、円形瞳を用いて励起した場
合に比べて若干低くなるが、焦点深度が深いためにデフ
ォーカスが起こらない。従って、奥行方向に構造をもた
ないような試料の観察には、輪帯瞳を用いて励起したほ
うがより高い分解を得ることができる。

第６図（円形瞳による励起法）と第10図（輪帯瞳によ
る励起法）を比較すると、円形瞳励起法では、検出器前
の開口を広げると、３次元OTFが８の字状になってゆく
（焦点はずれ像がボケて広がることに対応）のに帯し、
輪帯瞳励起法では、３次元OTFが棒状であり、ｚ軸方向
の空間周波数帯域が円形瞳励起法の場合より狭いことか
ら、焦点深度が深く、かつ焦点はずれ像はボケるのでは
なく強度を下げてゆく（消える）ことが確認できる。一
様照明落射型蛍光顕微鏡（第６図（ｄ）に対応）や共焦
点型レーザ走査蛍光顕微鏡（第６図（ａ）に対応）にお
いて、焦点深度を深くする（η軸方向に対して３次元OT
Fの幅をせまくする）ためには、対物レンズの開口数を
小さくしようとするが、それはρ軸方向の帯域も例示し
て狭めることとなり、結果的に分解能を低下させてしま
う。また、対物レンズの開口数を小さくすると、対物レ
ンズを通過できる蛍光の光量は減少するので、微弱光測
定においてこの方法は致命的であるが、しかしそれ以外
に方法はない。

ところが、レーザ走査蛍光顕微鏡の励起光学系に輪帯
瞳を設けると、その３次元OTFは、第10図（ｄ）に示さ
れるように、η方向には十分狭いにもかかわらず、ρ方
向に円形瞳励起法（第６図（ｄ））よりむしろ広帯域な
結像特性をもち、高分解でかつ長焦点深度を同時に実現
することができる。

（実施例） 第11図に実施例を示す。落射型蛍光顕微鏡（30）を利
用したものである。光源は、波長488nmのArレーザ（3
1）でSpectra−Physics社製・161Bである。蛍光の検出
は、（株）日本電気製・TI−23AのCCDカメラ（32）によ
り行っている。CCDカメラ（32）を連結できるように、
倍率を１〜2.25に可変できるリレーレンズ（33）を使用
している。試料（34）は中央部に開口のある上下動可能
なステージ台（35）に載置する。試料（34）としては、
スライドガラスに蛍光塗料を一様に塗布したものを用い
ている。

（38）はレーザ光の径を拡大するビームエクスパンダ
ーであり、収束レンズ（38）は、このレーザ光束を顕微
鏡（30）の視野絞りの位置に収束させる。収束光は、ダ
イクロイックミラー（39）に向かい、ここで反射され、
対物レンズ（40）に向かい、対物レンズ（40）によって
試料（34）上に結像する。試料（34）は、この光源の結
像スポットにより励起され、蛍光を発する。試料（34）
からの蛍光は、対物レンズ（40）を通り、510nmのダイ
クロイックミラー（39），吸収フィルタ（41）によって
520nm以下の波長をもつ光波成分をカットされた後、リ
レーレンズ（33）を通り、鏡胴上部の結像位置に取り付
けたCCDカメラ（32）の受光面上に結像される。なお、
対物レンズ（40）は、倍率20倍,NAは0.5のものを用いて
いる。また、レンズ（38）の焦点距離は250mmである。

CCDカメラ（32）の受光面で受光された蛍光パターン
は、このCCDカメラ（32）により読み出され、アナログ
ビデオ信号として、画像取り込み装置（51）に入力さ
れ、ここで６ビットのディジタル信号に変換された後、
フレームメモリに格納される。画像データは、画像取り
込み装置（51）とコンピュータ（52）の間を直結するDM
Aバスを介して、コンピュータ（52）へ転送される。コ
ンピュータ（52）で処理された画像データは、ディスプ
レイモニタ（53）に映出される。実施例においては、画
像取り込み装置（51）は（株）シバソク製・VM01B1フレ
ームグラバーを用い、コンピュータ（52）には（株）DE
C製・ミニコンピュータ・Micro VAX IIを使用してい
る。

実施例において、検出器面積による奥行分解能、及び
エネルギー収集効率への影響は、画像処理に基づいて検
証している。試料（34）をｚ方向に10μｍずつずらしな
がら、７枚の画像（総画像256×256）を収集した。こう
して得られた256×256の２次元データ上に、各面積をも
つ検出器をシミュレートして、面積の異なる各検出器か
らの出力強度を計算した。例えば、ピンホールならば、
画像内で最も強度の大きい１点（１画素）の強度を出力
強度としてとり（第12図（ａ））、ある面積をもつ検出
器からの出力強度は、画像内の対応する領域内の画素の
強度の和をとっている（第12図（ｂ），（ｃ），
（ｄ））。この計算処理等はコンピュータ（52）により
行った。なお、第12図（ａ）はピンホールの場合、
（ｂ）はエアリディスク対応の場合、（ｃ）はその半径
がエアリディスクの半径の２倍の場合、（ｄ）は大面積
とした場合を模式的に示している。

第13図は上記の実験結果をプロットしたもので、ｚ方
向の距離に対する検出器からの出力強度の変化を表して
いる。

第13図（ａ）は、横軸にフォーカス位置を０としたと
きのｚ座標、縦軸に出力強度をプロットしている。検出
器の面積が小さくなると、強度が落ちていることがわか
る。例えば、ピンホールを用いた場合には、検出される
蛍光エネルギーは非常に小さい。

一方、第13図（ｂ）は、横軸にフォーカス位置に対す
る座標、縦軸にそれぞれの検出器面積について、フォー
カス位置における出力強度で規格化した値をプロットし
ている。検出器の面積が小さくなるに従って出力強度は
即やかに減衰している。十分に大きな検出器を仮定した
場合、出力強度はほとんど変化していない。

この例で用いた試料のように奥行方向のみに構造の変
化をもつ試料に対して、一様照明落射型蛍光顕微鏡は全
く分解をもたなかった。上記の結果から、検出器の面積
を十分に大きくすると、このような試料に対する分解は
失われてしまうが、検出器をエアリディスクと同じ大き
さにするか、検出器の半径をエアリディスクの半径の２
倍にした場合、ｚ方向のみに構造の変化をもった試料に
対しても分解をもち、３次元分解能を有していることが
わかる。ピンホールを用いた場合に比べて、エアリディ
スクと同じ大きさの検出器を用いた場合は約30％、検出
器の半径がエアリディスクの半径の２倍のものを用いた
場合は約70％の奥行分解能が減少している。この結果よ
り、検出器の面積をピンホールからエアリディスクと同
じ大きさまで広げても奥行分解能は約30％減少するだけ
であり、しかもピンホールを用いた場合に比べてエネル
ギー収集効率を相当に高くすることができる。

なお、検出器の受光面積を制限するために、実施例の
ようにCCDカメラ（32）をもらい、画像処理を行う以外
に、簡単には、蛍光の結像位置に所定の受光面をもつ光
電検出器を設置し、この前に所定の開口をもつアパーチ
ャを設けるとよい。開口の大きさを可変したい場合、簡
便には、開口径を少しずつ変えた開口を円板の周辺部に
円周に沿って配列したターレット円板アパーチャ（60）
を設ける。

また、第11図では、走査のメカニズムを省略している
が、走査は、ビーム走査またはステージ走査のよく知ら
れたいずれの手法によって行ってよい。ビーム走査の場
合、ガルバノミラー，共振ガルバノミラー，ポリゴンミ
ラー，タービン駆動ポリゴンミラー,AO偏向器，ホログ
ラムスキャナーなどのうちいずれかを用いたものとす
る。また、ステージ走査では、ステッピングモータ，ピ
エゾ素子，ボイスコイル等のいずれかを用いた手法を採
用する。

第11図の実施例において、励起光学系に輪帯瞳を形成
する場合、簡単には、レーザ（31）からダイクロイック
ミラー（39）の間に、レーザ光束を輪帯光束にする輪帯
開口アパーチャ（70）を設置する。ビームエクスパンダ
ー（36）の後でも、レンズ（38）の後ろのいずれでもよ
い。また、ダイクロイックミラー（39）の反射面を輪帯
状にしておいてもよい。さらに、より簡単には、レンズ
（36），（38）に中心を光軸に一致させた遮光円形マス
クを貼付してもよい。

第14図，第15図は輪帯開口アパーチャ（70）を設けた
とき、試料がどのように観測されるかを模式的に示した
ものである。試料の深さ方向（ｚ方向）の焦点深度内に
円形物体、方形物体、三角状物体、があるとした場合で
ある。

第14図において、２の方形物体面に合焦したとき、共
焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡（アパーチャなし）では、
第15図（ａ）のように、その方形物体のみ鮮明な画像を
得ることができ、１の円形物体や３の三角状物体はその
情報が全く欠落する。しかし、輪帯アパーチャ（70）を
用いると、第15図（ｂ）のように、1,2,3すべての断面
における物体の像、しかもコントラストのよい鮮明な像
が同時に観測される。深い焦点深度内の総ての断面像が
ボケの重畳なくシャープに一覧（透視平面図的）に観測
することが可能である。

上記の説明は、レーザ走査蛍光顕微鏡に関し、蛍光試
料を対象とするものであったが、ここに開示したこの発
明に係る各種の手法は、レーザ走査でラマン散乱を利用
する顕微鏡にも全く同様に適用でき、同等の効果を期待
できるものであり、本発明の手法をラマン散乱利用の顕
微鏡に応用することができる。

（発明の効果） 以上のように、励起を輪帯光束で行う第１の発明よれ
ば、面内分解能を高く保持したままで焦点深度を深くす
ることができる。従って、対物レンズのNAを大きくす
る、すなわち大径化することが可能になり、これにより
蛍光のエネルギー収集効率を高くすることができる。ま
た、試料の深さ方向で焦点深度範囲内の明るい像を一覧
的（透視平面図的）に得ることができる。さらに、共焦
点型であると、デフォーカス像の影響がなくなるので、
深い焦点深度の範囲の試料像を、高分解能でかつバック
グラウンドのない高コントラストの状態で一覧的（透視
平面図的）に得ることができる。

蛍光を検出する検出器面積をピンホール以外の所定の
面積にもできる第２の発明によれば、高い奥行き分解能
と合わせて高いエネルギー収集効率を得ることができ、
SN比が高くかつ３次元分解能にも優れた高性能の蛍光顕
微鏡を実現することができる。

【図面の簡単な説明】 第１図は一様照明落射型蛍光顕微鏡の光学系の原理図、
第２図は共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系の原理
図、第３図は（ａ），（ｂ）はそれぞれ３次元OTFを示
す図、第４図は点検出の説明図、第５図（ａ），（ｂ）
は検出器の走査（scan）の説明図、第６図（ａ），
（ｂ），（ｃ），（ｄ）はそれぞれ異なる検出器面積に
よる３次元OTFを示す図、第７図はエアリディスクの説
明図、第８図は輪帯瞳の説明図、第９図は輪帯瞳を用い
た共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系の原理図、第
10図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）はそれぞれ異なる
検出器面積による３次元OTFを示す図、第11図は実施例
を示す図、第12図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）はそ
れぞれシュミレートした検出器面積を模式的に示す図、
第13図（ａ），（ｂ）は実施例を用いて行った結果をプ
ロットした蛍光強度のグラフ、第14図は試料の模式的な
断面を示す図、第15図（ａ），（ｂ）はそれぞれ共焦点
型レーザ走査蛍光顕微鏡と実施例の顕微鏡における観測
される画像の相違を模式的に示した説明図である。 31……レーザ、32……CCDカメラ、34……蛍光試料、40
……対物レンズ、60……開口面積を可変するアパーチ
ャ、70……輪帯開口をもつアパーチャ。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−12615（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−219920（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−298211（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−49514（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−105521（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−267512（ＪＰ，Ａ) 特公 平７−3508（ＪＰ，Ｂ２) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓ ｃｏｐｙ，Ｖｏｌ．149（1988），ｐ. 51−66 ＯＰＴＩＣＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏ ｌ．10（２）（1985），ｐ．53−55 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G02B 21/00 - 21/36

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡におい
   て、 蛍光試料を励起する励起光学系の光路中に、レーザ光束
   を輪帯光束にする手段を備えると共に、 励起により生じた蛍光を検出する光電検出器の被露光面
   に近接させて、ピンホールを含み円形開口の大きさを可
   変して設定可能な手段を設けたことを特徴とするレーザ
   走査蛍光顕微鏡。