[go: up one dir, main page]

JP2898750B2 - 有機リン化合物をイオウ化するための方法およびそのための試薬 - Google Patents

有機リン化合物をイオウ化するための方法およびそのための試薬

Info

Publication number
JP2898750B2
JP2898750B2 JP2504408A JP50440890A JP2898750B2 JP 2898750 B2 JP2898750 B2 JP 2898750B2 JP 2504408 A JP2504408 A JP 2504408A JP 50440890 A JP50440890 A JP 50440890A JP 2898750 B2 JP2898750 B2 JP 2898750B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleoside
sulfur
tertiary amine
nucleotide
phosphite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2504408A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH04503956A (ja
Inventor
バット，ラム・エス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gen Probe Inc
Original Assignee
Gen Probe Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gen Probe Inc filed Critical Gen Probe Inc
Publication of JPH04503956A publication Critical patent/JPH04503956A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2898750B2 publication Critical patent/JP2898750B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/16—Esters of thiophosphoric acids or thiophosphorous acids
    • C07F9/165—Esters of thiophosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はホスホン酸エステルおよびホスフィン酸エス
テルのイオウ化（スルフリゼーション）に関する。本発
明は別に、核酸のホスホロチオエート（phosphorothioa
te）同族体に関する。また、本発明はこのような同族体
の合成方法に関する。さらに、本発明は、ホスホン酸お
よびホスフィン酸エステルのイオウ化、例えば核酸のホ
スホロチオエート同族体の合成に有用である試薬に関す
る。
発明の背景 核酸は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（D
NA）の骨格を形成するそれぞれリボースおよびデオキシ
リボース糖間のホスホジエステル結合によって個々のヌ
クレオチドが相互に連結されているリボヌクレオチドま
たはデオキシリボヌクレオチドいずれかの鎖として天然
に存在している。天然の事象におけるそれらの役割に加
えて、DNAおよびRNA、即ちDNAおよびRNAオリゴヌクレオ
チドは医学的な診断および治療上適用するうえでの役割
がますます重要になると期待されている。例えば、オリ
ゴヌクレオチドはウイルスおよび細菌性の疾患ならびに
遺伝子異常症の検出のための種々の「プローブ」検定に
有用であることが示されている。これらの検定では、
「プローブ」は、検出すべき生物または遺伝子欠損に独
特のRNAまたはDNA配列と相補的であるように選択された
オリゴヌクレオチドであるのが通常である［Matthewsら
Anal.Biochem.,169巻（1988）］。
メッセンジャーRNAと相補的であるオリゴヌクレオチ
ド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は細胞に導入さ
れてそのmRNAの翻訳を阻止することができることも観察
されている。この阻止は、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドとmRNAとのハイブリダイゼーションによるものと考
えられる。例えば、StephensonらのProc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.,75,285（1978）およびZamecnickらのProc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.75,280（1978）を参照のこと。
アンチセンスオリゴヌクレオチドがmRNAの翻訳を抑制
または妨害することができることは、それを抗ウイルス
療法に適用できることを示している。細胞を感染するウ
イルスは、感染された細胞の生物学的機構を利用して自
身の遺伝子情報を複製する。細胞リボソームによる遺伝
子情報の転写および翻訳はウイルスの複製にとって必須
である。従って、ウイルス遺伝子の発現を妨害できるな
らば、ウイルスは複製できなくなるか、あるいは複製速
度が遅くなって感染と戦うためのより良い機会を宿主の
免疫系に与えることができるようになる。
ウイルスの複数が成功したならば翻訳されるに違いな
いウイルスの発現mRNAの配列と相補的であるヌクレオチ
ド配列を有するオリゴヌクレオチドを設計することによ
り、ウイルス療法にオリゴヌクレオチドを使用すること
が提案されている。細胞にアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを導入すれば、ハイブリダイズしてこの必須の翻訳
を妨害でき、あるいは少なくとも抑制することができ
る。
通常のホスホジエステルアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては有意
な欠陥を有することが報告されている。１つの制限は、
それが、核酸を分解してヌクレオチドを再利用させる酵
素であるヌクレアーゼによる分解作用を非常に受け易い
ことである。さらに、ほとんどの細胞が負に帯電してい
る結果、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの骨格の
負電荷密度が高いことにより、そのオリゴヌクレオチド
が細胞膜を通過するのは容易でない。
これらの問題を克服するためにオリゴヌクレオチドを
修飾することが提案されている。このような提案の１つ
は、通常のホスホジエステルオリゴヌクレオチドの非極
性同族体を利用することである。このような同族体は相
補的配列とハイブリダイズできる能力を保持しており、
細胞への侵入が比較的容易であり、またヌクレアーゼ分
解作用に対する感受性が低いと期待されていたようであ
る。有望な結果がメチルホスホン酸同族体を用いて得ら
れた。AgrisらのBiochemistry 25,1228（1986）を参照
のこと。最近になって、ホスホロチオエート同族体、即
ち各ヌクレオチド間連結における非架橋酸素原子の１つ
が硫黄原子と置き換わっている核酸もmRNA翻訳の阻害能
を有していることが示された。少なくともクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現抑制
という１つの場合に、ホスホロチオエート同族体は、非
修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチドよりも有効で
あることが示されているメチルホスホネート（methyl p
hosphonate）同族体よりも優れていることが示されてい
る。チオホスホレート（thiophosphorate）同族体によ
るHIVウイルス複製の抑制も証明されている。Matsukara
らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.84,1（1987）を参照の
こと。
オリゴヌクレオチドプローブのホスホロチオエート同
族体は診断および治療適用のための通常のプローブに替
わるものとしても有用である。しかし、核酸のホスホロ
チオエート同族体の合成についてはごく僅かしか報告さ
れておらず、それらはすべて繁雑であり、現在市販され
ている自動核酸合成装置を使用する用途に良く適合させ
ることができない。
例えば、１つの報告されている合成法は前もって合成
しておくヌクレオチドダイマー（二量体）を使用するも
のである。この操作に必須な全配列である16個のダイマ
ーを合成することは繁雑でありかつ経費が高い［Connol
yらのBiochem.,23,3443（1984）］。
より好ましい操作によれば、核酸合成装置によって普
通に使用される高い反応性を示す市販のヌクレオシド−
ホスホルアミダイトモノマーが使用できるようになるだ
ろう。このようなモノマーはホスホロチオエート同族体
を製造するための方法に実際使用されている。しかし、
ホスホン酸エステル中間体のリンのイオウ化は非常に厄
介である。例えば、第１図に示しているヌクレオチド間
ホスホロチオエートトリエステル（internucleotide ph
osphorothioate triester）12を製造するには、室温に
おけるピリジン中、イオウ元素が16時間までを用する
［P.S.NelsonらのJ.Org.Chem.,49,2316（1984）;P.M.S.
BurgersらのTet.Lett.,40,3835（1978）］。イオウ元
素、ピリジンおよび二硫化炭素を使用する同様の操作に
より、室温において２時間以内でイオウ化が行えた［B.
A.ConnollyらのBiochem.,23,3443（1984）］。得られた
トリエステルは塩基触媒による置換分「Ｒ」の除去によ
ってホスホロチオエートに変換することができる。
化合物11からホスホチオエートを自動固相合成するに
当たっては、2,6−ルチジン中、60℃においてイオウ化
を行うのに15分を要する［W.J.StecらのJ.Am.Chem.So
c.,106,6077（1984）］。しかし、ほとんどの自動合成
装置は、上昇温度でイオウ化を行うために必要なカラム
の加熱を行うための装置を有しておらず、また60℃で溶
媒を蒸発させることは供給ライン上に気泡を生成させる
と予想され、それは流速を低下させ、かつまた合成不良
さえも招きかねない。さらに、各ヌクレオチドの添加
後、イオウ化のために15分間反応させることは最適な操
作とは程遠い。
このように、通常のDNA合成装置への使用に役立ち、
かつ迅速であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
同族体の合成方法の要求は、依然満たされていない。
用語 本明細書および請求の範囲では以下の用語を使用して
いる： ヌクレオチド：リン酸基、五炭糖環および窒素含有プリ
ンまたはピリミジン環から構成されるヌクレオチド酸の
サブユニット。RNAでは、五炭糖はリボースである。DNA
では、２−デオキシリボースである。この用語は、この
ようなサブユニットの同族体をも包含している。
ヌクレオチドマルチマー（nucleotide multimer）：ホ
スホロジエステルまたはホスホノジエステル結合によっ
て連結されている２つまたはそれ以上のヌクレオチドの
鎖、またはその同族体。
オリゴヌクレオチド：一般に約10から125ヌクレオチド
長のヌクレオチドマルチマーであるが、125ヌクレオチ
ド長よりも大きい場合もある。これらは通常、ヌクレオ
チドモノマーからの合成により得られるが、酵素的な手
段によっても入手することができる。
ヌクレオチドマルチマープローブ：通常はポリヌクレオ
チドである別のヌクレオチドマルチマー内に含有されて
いる標的ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド
配列を有するヌクレオチドマルチマー。通常、プローブ
は標的配列の対応塩基と完全に相補的であるように選択
する。しかし、ある場合には、プローブ内の１つまたは
それ以上のヌクレオチドが標的配列の対応塩基と相補的
でないもの、あるいは合成により得られる（合成起源
の）種々の部分をプローブ内のヌクレオチドと置換し、
またはそれをプローブ塩基の間に挿入しているものも適
切であり、またはそれらが望ましい場合さえもあり得
る。プローブを診断目的のために使用する場合は標識す
るのが普通である。
オリゴヌクレオチドプローブ：通常は約125ヌクレオチ
ドよりも少ないが、200を越えたヌクレオチドを含有し
ている場合もある合成または酵素起源のプローブ。
ハイブリダイゼーション：相補的な塩基間のワトソン−
クリック塩基対合によって２つのヌクレオチドマルチマ
ー間に形成されるコンプレックスである雑種（ハイブリ
ド）の生成。
本発明の要約 本発明は別に、有機ホスホン酸エステル（organic ph
osphites（有機亜リン酸の塩またはエステル））（即
ち、３つのオキシ基に結合した３価のリンであって少な
くとも１つのオキシ基は有機オキシ基であるもの）およ
び有機ホスフィン酸エステル（organic phosphonousest
ers）（即ち、２つのオキシ基とのみ結合している３価
のリン）を簡便かつ効率的にイオウ化し、対応するチオ
リンの酸誘導体（具体的には、それぞれホスホロチオエ
ートまたはホスホノノチオエート）を製造するのに適当
である試薬を提供するものである。本発明は、ホスホチ
オエートオリゴヌクレオチドを手作業でまたは自動的に
合成するために、溶液内または固相上のオリゴヌクレオ
チドおよびリボヌクレオチドマルチマーに含有されてい
る、適切に保護されたヌクレオチド間３′−５′または
２′−５′ホスホン酸またはホスフィン酸連結部のいず
れかをイオウ化するのに特に適している。
従って、本発明は１つの態様として、化合物11（幾つ
かの好ましい置換分を例示している第１図を参照のこ
と）などのホスホン酸またはホスフィン酸中間体に「イ
オウ」を付加し、化合物12（第１図参照）のホスホロチ
オエートまたはホスホノチオエートを製造するのに適し
た試薬、およびその試薬を使用するための方法を提供す
るものである。化合物11のヌクレオチド間ホスホン酸ま
たはホスフィン酸結合（および化合物12のヌクレオチド
間ホスホロチオエートまたはオスホノチオエート結合）
は、１つのヌクレオシドの３′−ヒドロキシと他のヌク
レオシドの５′−ヒドロキシ基との間に示されているこ
とに留意すべきである。しかし、これらの結合は、例え
ば２′および５′ヒドロキシ間など、２つのヌクレオシ
ドのあらゆる２つのヒドロキシ基の間であってもよく、
あるいはヌクレオシドのヒドロキシ基と非ヌクレオシド
部分のそれとの間、または２つの非ヌクレオシド部分の
間の結合であることができる。本発明の試薬は、イオウ
元素、イオウのための溶媒、および３級アルキルアミン
の混合物から構成される。本発明の好ましい試薬は以下
のものである： 50％二硫化炭素および50％ジイソプロピルエチルアミ
ンを含有する混合物中、0.2Mイオウ元素。
本発明の他の試薬には以下のものがある： （ｉ）50％二硫化炭素および50％トリエチルアミンを含
有する混合物中、0.2Mイオウ元素、 （ii）二硫化炭素（25％）、ピリジン（25％）およびト
リエチルアミン（50％）を含有する混合物中、0.2Mイオ
ウ元素。
上記の試薬によれば、化合物15のホスホン酸またはホ
スフィン酸中間体を室温において約45秒で迅速にイオウ
化することができるのであり、イオウ化を室温で行った
場合には必要とされる反応時間延長の選択の必要性、ま
たは従来の方法ではより迅速にイオウ化を行うために必
要とされる上昇温度の使用が排除されている。第３図
は、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート同族体の
合成を具体化するための本発明のイオウ化方法を説明す
るものである。
図面の簡単な説明 第１図は、オリゴヌクレオチドのホスホン酸またはホ
スフィン酸エステルをイオウ化して核酸のホスホロチオ
エートトリエステルまたはホスホノチオエートジエステ
ルを製造する方法を説明するものである（幾つかの好ま
しい置換分も挙げている）。
第２図は、本発明に有用であるオリゴヌクレオチドホ
スホン酸トリエステルまたはホスフィン酸ジエステルの
生成反応を説明するものである（幾つかの好ましい置換
分も挙げている）。
第３図は、本発明の試薬を使用するオリゴヌクレオチ
ドホスホン酸のイオウ化および対応するホスホロチオエ
ートへの変換を包含しているオリゴヌクレオチドホスホ
ロチオエートの組み立てを説明するものである。
好ましい態様の説明 上記のように、本発明の試薬はイオウ元素、イオウの
ための有機溶媒、および非−芳香族３級アミンの混合物
からなるものである。「非−芳香族」アミンとは、芳香
環の種類ではないアミンを意味する。しかし、この用語
は、アミノ基の窒素に結合する芳香族基を排除するもの
ではない。イオウのための溶媒は、二硫化炭素、トルエ
ン、ベンゼンまたはエチルアルコールなどの溶媒の中か
ら選択することができる。二硫化炭素はイオウのための
特に有効な溶媒であるので、好ましい。混合物には他の
物質、例えばピリジンなどの芳香族アミンを含有させる
こともできる。有用な３級アミンには例えば、トリエチ
ルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンがある。ジ
イソプロピルエチルアミンが好ましい。
本発明の試薬の組成は広範に変動でき、最良の結果を
与える具体的な処方はイオウ化されるホスホン酸または
オスフィン酸エステルに応じて変動され得る。しかし、
特定の反応に対する最も有効な試薬製剤は、混合物の成
分を変えることにより決定することができる。さらに、
特定の製剤は取り扱いが実際上困難であることが見いだ
されたものがある。例えば、1,8−ジアザビシクロ［5,
4,0］ウンデカ−７−エンを３級アミンとして使用して
いる製剤では、二硫化炭素溶液からイオウが析出してし
まうことが見いだされた。
本発明試薬はまた、有機ホスホン酸またはホスフィン
酸エステルをイオウ化して対応するホスホロチオエート
を製造するために有用である。出発物質である有機リン
化合物および本発明の方法に基づくその対応するホスホ
ロチオエート生成物は以下の式で示される： 上記の式、R1、R2およびR3は同じかまたは異なってい
てよく、好ましくは置換されていることあるアルキル、
アルコキシ、フェニル、フェノキシおよび３級アミノな
どの有機部分、またはそれらの同族体の中から選ばれる
ものである。具体的には、R1およびR2はリボヌクレオシ
ドおよびデオキシリボヌクレオシドであることができ
る。
本発明の試薬はR1およびR2がヌクレオシド、特に適切
に保護されたヌクレオシドであるホスホン酸またはホス
フォン酸エステルからオリゴヌクレオチドのホスホロチ
オエート同族体を合成するのに特に有用である。ヌクレ
オチドマルチマーのホスホロチオエート同族体を単に合
成したいならば、R3はイオウ化後に選択的に除去（開
裂）され得る基である。このような基の例としては、メ
トキシおよびβ−シアノエトキシがある。しかし、ヌク
レオチドマルチマーのホスホノチオエート同族体（即
ち、ホスフィン酸連結基のＯ＝がＳ＝で置換されている
同族体）を製造したい場合、R3はイオウ化後に選択的に
除去され得る基である必要はない。例えば、R3はメチル
であることができよう。上記のタイプのホスホン酸およ
びホスフィン酸エステルは、米国特許第4,625,677号お
よび米国特許第4,458,066号に記載の方法を使用して容
易に入手される［これら特許、および本明細書に引用し
ている他のすべての文献の開示事項は引用によって本出
願中に包含される］。
第２図は、13型化合物（ホスホルアミダイトまたはホ
スホンアミダイト）および14型化合物（ヌクレオチド）
からのジヌクレオシドホスホン酸またはホスフィン酸エ
ステル15の組み立てを説明するものである。しかし、既
知の操作に従ってホスホルアミダイトを連続して添加す
ることにより、より大きなオリゴマーを得ることができ
るのは理解されよう。イオウ化は各ヌクレオシドを添加
した後に行うのが好ましいが、後に行ってもよく、組み
立てられたオリゴマーに適用することもできる。ホスホ
ン酸またはホスフィン酸エステルを、特にホスホルアミ
ダイト反応により得られるヌクレオチド間をイオウ化す
るための好ましい試薬は、二硫化炭素およびジイソプロ
ピルエチルアミンの等量混合物に溶解させた0.2Mイオウ
元素である。
以下に記載している実施例１および２では、種々のヌ
クレオチドマルチマーのホスホロチオエートを自動的に
合成するために本発明のイオウ化試薬を使用することを
詳細に説明している。実施例３および４では、ヌクレオ
チドマルチマーを自動合成するために種々の本発明イオ
ウ化試薬を使用することを説明している。実施例５およ
び６は実施例１から４までと類似しているが、別の試薬
の使用を説明するものである。実施例７では種々のホス
ホロチオエートヌクレオチドマルチマーを自動合成する
ために別の本発明イオウ化剤を使用するものであり、実
施例８はこの実施例７と類似しているが、異なる試薬の
使用を説明するものである。実施例９から実施例11も本
発明のイオウ化試薬を種々のヌクレオチドマルチマーの
自動合成に使用することを説明している。実施例12はホ
スホロチオエート同族体と相補的RNA配列とのハイブリ
ダイゼーションによって形成されるハイブリッドのTm
（融解温度）を示すものである。
実施例１ TTTTのホスホロチオエート同族体の自動合成 第３図は、TTTTのホスホロチオエート同族体の合成の
反応図を示すものである。
材料：ゴールドラベルのイオウ元素、二硫化炭素および
ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）は、アルドリッチ
・ファイン・ケミカルズ［Aldrich Fine Chemicals,ウ
ィスコンシン，ミルウォーキー］から購入した。ヌクレ
オシドホスホルアミダイト、15μmol T−カラム、テト
ラゾールおよびCapB［テトラヒドロフラン（THF）中、1
0％ジメチルアミノピリジン（DMAP）］は、バイオサー
チ［Biosearch,Inc.,カリホルニア，サン・ラファエ
ル］から購入した。CapA［THF中、10％無水酢酸（AC
2O）］は希釈した無水酢酸（アルドリッチ）から調製し
た。ジクロロメタン中、2.5％トリクロロ酢酸は、ゴー
ルドラベルのトリクロロ酢酸（アルドリッチ）から調製
した。アセトニトリル、ジクロロメタンおよびテトラヒ
ドロフランはベーカー［J.T.Baker］から購入したが、
これらはすべて水分を0.002％以下でしか含有していな
かった。
第３図に示す反応式は、ホスホン酸中間体19の自動的
イオウ化を包含するヌクレオチドテトラマー（４量体）
の自動合成に関する工程の概略を示すものである。合成
は、標準的な合成サイクルの改変法を利用するバイオサ
ーチ［Biosearch］8750DNA合成装置によって行った。こ
の改変は、酸化工程の前に水洗（２％ピリジン−THF
中、10％水）工程を行うものである。この改変は合成全
体における副反応を最小限に抑えるために包含させた。
イオウ化は、50％二硫化炭素/50％ジイソプロピルエチ
ルアミン（すべての％は特に明記しない限り容量％のそ
れである）中、イオウ元素0.2モル濃度溶液中に15秒間
供給し、それを15μmol T−カラム内に30秒間放置する
ことによって行った。イオウ化反応の後、そのカラムと
供給ラインをアセトニトリルで洗浄し、次いで得られた
配列の次の塩基を添加するための次サイクルを開始し
た。
第３図に示しているように、この合成操作の開始は、
例えば米国特許第4,458,066号に記載のように制御孔カ
ラム（CPG,controlled pore glass）に連結した５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン、試薬16を使用して
行う。この５′−ジメトキシトリチル（DMT）保護基
は、酸触媒を用いて除去し、それにより脱保護された中
間体17を製造し、次いでチミジンホスホルアミダイト18
とカップリングしてダイマー（２量体）19を生成させ
る。未反応の17は、無水酢酸およびジメチルアミノピリ
ジンで処理することによりキャップをする。50％CS2/50
％DIEA中、0.2Mイオウからなる同一のイオウ化試薬によ
って、得られたダイマー19をイオウ化し、ホスホロチオ
エートトリエステル20を製造する。次いで、ダイマー12
を製造する前に５′保護基を除去し、チミジンホスホル
アミダイト18を使用してトリマー（３量体）（図示して
いない）を組み立ててイオウ化し、脱保護し、次いでチ
ミジンホスホルアミダイト18を使用してテトラマーを組
み立てる。上記の方法と同じようにしてそのテトラマー
をイオウ化し、５′保護基を除去してテトラマー22を得
る。
テトラマー22を組み立てた後、カラムの樹脂を回転キ
ャップチューブに移し、濃水酸化アンモニウムと共に55
℃に８−10時間加熱して23を製造した。次いで、水酸化
アンモニウムを留去し、生成物300OD単位を得た。得ら
れた粗製の生成物2OD単位を7M尿素を含有する10％アク
リルアルドゲルのゲル電気泳動にかけ、その純度を分析
した。UVシャドウィングによって調べたところ、その生
成物は大きな１つのバンド（約95％）を示した。
「イオウ」がホスホン酸中間体の「リン」に付加され
ている程度を、D2O中、31P核磁気共鳴（NMR）によって
測定した。Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔのホスホロチオエート同族体
のNMRスペクトル（31P、53.866PPM）において2.688PPM
に31P共鳴が存在していないことは、イオウ化の程度が
殆ど定量的であることを示している。
実施例２ 次に、より長いヌクレオチドマルチマーのホスホロチ
オエート同族体を合成するために本発明のイオウ化試薬
を使用した。この長いマルチマーは、ゲル電気泳動（20
％アクリルアミド−7M尿素）で精製する以外は実施例１
に記載の方法と同じ方法により合成し、脱ブロックし
た。得られた生成物はUVシャドウィングにより視覚化
し、ゆっくりと移動するバンドを切除し、0.1M酢酸アン
モニウム（pH7.2）により抽出し、sep−pakにより脱塩
し、次いでファルマシアNap−25カラムにより再度脱塩
した。このようにして脱塩したマルチマーをδ−ATP32
で標識し、ゲル電気泳動にかけて分析純度を測定した。
以下のホスホロチオエートマルチマーを合成した（この
マルチマー配列の５′末端の前に「PS」を付け、すべて
のヌクレオシド連結基のリンがイオウ化されていること
を表している）： マルチマーのホスホロチオエート同族体はゲル電気泳
動では、対応する通常のマルチマーと極めて近接して移
動した。
実施例３ イオウ化試薬として、50％CS2/50％トリエチルアミン
（TEA）中、0.2Mイオウを使用する以外は実施例１に記
載の操作法を繰り返し、PS−TTTTの製造に成功した。
実施例４ イオウ化試薬として、50％CS2/50％TEA中、0.2Mイオ
ウを使用する以外は実施例２に記載の操作法を繰り返し
た。
本実施例および実施例３の両方により、それぞれイオ
ウ化ヌクレオチドマルチマーが得られた。しかし、DIEA
ではなくTEAを３級アミンとして使用した場合、約６時
間後にフラスコ内に褐色の糊状物質が生成し始め、それ
はDIEAを使用した場合には生成しなかったので、本実施
例と実施例３のイオウ化試薬よりも実施例１および２の
イオウ化試薬のほうが好ましい（S/CS2/DIEAは３日後で
さえも不安定性の兆候は認められなかった）。
実施例５ β−シアノエトキシではなくメトキシの式： で示されるヌクレオシドのホスホルアミダイトを使用す
る以外は、実施例１および２の操作法を繰り返し、PS−
TTTTおよびａ（26−mer）の製造に再び成功を収めた。
実施例６ 実施例５に記載するメトキシホスホルアミダイトを使
用する以外は、実施例３および４に記載の操作法を繰り
返し、PS−TTTTおよびａ（26−mer）の製造に再び成功
を収めた。
実施例７ 25％CS2/25％ピリジン/50％TEA中、0.2M Sを含有する
イオウ化試薬を調製した。次いで、そのイオウ化試薬を
使用する以外は実施例１の操作法を繰り返した。同じイ
オウ化試薬を使用して実施例２の操作法も繰り返し、ａ
（26−mer）を製造した。さらに、そのイオウ化試薬を
使用し、実施例２の操作法に従い、以下に記載のヌクレ
オチドマルチマーの製造にも成功した。
実施例８ ヌクレオチドのメトキシホスホルアミダイトを使用す
る以外は実施例７に記載の操作法に従い、イオウ化オリ
ゴマーａ、ｂ、ｃおよびｄの製造に成功した。
実施例９ β−シアノエトキシではなくメチルの式： で示されるＴ−ヌクレオシドのホスホノアミダイト（ph
osphonamidite）を使用する以外は、実施例１の操作法
を繰り返した。さらに、使用したイオウ化試薬は25％CS
2/25％ピリジン/50％TEA中、0.2Mイオウであった。ま
た、樹脂からPS−ヌクレオチドを開裂させるため、樹脂
を室温でエチレンジアミン／エタノールの1:1（容量）
混液1mlで６時間処理した。
得られた生成物は、ヌクレオシドがメチルホスホノジ
エステル基によって連結されているPS−TTTTであった。
実施例10 メチルホスホノアミダイトを使用し、実施例９に記載
の開裂操作を行うこと以外は実施例２の操作法を実質的
に繰り返し、ｃのイオウ化15−merを製造した。得られ
たオリゴマーは、ヌクレオシドがメチルホスホノチオエ
ートジエステル基によって連結されている配列ｃを有し
ている。
実施例11 50％CS2/50％DIEA（これはTEAを使用する、またはピ
リジンをさらに存在させるよりも好ましいと既に述べた
ものである）中、0.2Mイオウをイオウ化試薬として使用
する以外は実施例９を繰り返した。得られた生成物はこ
れもまた、式： で示されるメチルホスホノチオエートジエステル基によ
ってヌクレオシドが連結されているPS−TTTTオリゴマー
であった。
実施例12 以下の表では、２つのホスホロチオエート同族体と通
常のヌクレオチドマルチマーとのTmを比較している。P
32標識ヌクレオチドマルチマーを、0.48Mリン酸緩衝液
中、大腸菌RNAとハイブリダイズし、得られたハイブリ
ッドをヒドロキシアパタイト樹脂に結合させ、0.1Mリン
酸緩衝液中で温度安定性を測定した。
上記の実施例は本発明の特定の適用例を示しているに
すぎない。これら特定の実施例から発展され得る他の有
用な適用例は当業者には明白であろう。従って、本発明
は上記の実施例に限定されるものではない。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07F 9/655 C07F 9/6561 C07B 47/00 C07H 19/10 C07H 19/207 C07H 21/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (46)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】イオウを溶解させ得る溶媒中に、イオウ、
    第２のヌクレオチドと結合している第１のヌクレオシド
    ホスファイトまたはヌクレオシドホスホナイト、および
    イオウ化を許容し得る非芳香族３級アミンを含有してな
    る、ヌクレオチド間ホスファイトまたはホスホナス基を
    イオウ化するための組成物。
  2. 【請求項２】３級アミンがトリアルキルアミンである請
    求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】溶媒が有機溶媒である請求項２に記載の組
    成物。
  4. 【請求項４】溶媒が二硫化炭素である請求項１または請
    求項２に記載の組成物。
  5. 【請求項５】溶媒が有機溶媒であり、３級アミンがトリ
    エチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンである
    請求項１に記載の組成物。
  6. 【請求項６】イオウ濃度が少なくとも約0.2Mである請求
    項１、請求項２または請求項５に記載の組成物。
  7. 【請求項７】実質的に同重量部のトリアルキルアミン
    と、イオウを溶解させ得る有機溶媒を含む有機溶媒中
    に、イオウ、第２のヌクレオチドと結合している第１の
    ヌクレオシドホスファイトまたはヌクレオシドホスホナ
    イト、およびトリアルキルアミンを含有している溶液を
    含む、ヌクレオチド間ホスファイトまたはホスホナス基
    をイオウ化するための組成物。
  8. 【請求項８】有機溶媒が二硫化炭素であり、トリアルキ
    ルアミンがトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチ
    ルアミンである請求項７に記載の組成物。
  9. 【請求項９】有機リン化合物を、イオウおよび非芳香族
    ３級アミンをイオウを溶解し得る溶媒中に含む溶液と接
    触させてイオウ化させることを特徴とする、第２のヌク
    レオシドと結合している第１のヌクレオシドホスファイ
    トまたはヌクレオシドホスホナイトを含む、ヌクレオシ
    ド間ホスファイトおよびヌクレオシド間ホスホナイトか
    ら選択される有機リン化合物をイオウ化して対応する有
    機チオホスフェートおよび有機チオホスホネート誘導体
    を得るための方法。
  10. 【請求項１０】３級アミンがトリアルキルアミンである
    請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】溶媒が有機溶媒である請求項９または請
    求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】溶媒が二硫化炭素である請求項９または
    請求項10に記載の方法。
  13. 【請求項１３】式： ［式中、R1およびR2はヌクレオシドであり、R3はアルキ
    ル基およびイオウ化後に選択的に開裂することができる
    脱離基の中から選択される基であり、R1、R2およびR3は
    イオウ化を許容し得るものである］ で示される化合物の中から選ばれる３価のリンを含有す
    る有機リン化合物をイオウ化する方法であって、該有機
    リン化合物を、イオウおよび非芳香族３級アミンをイオ
    ウを溶解し得る有機溶媒中に含んでなる溶液を含む組成
    物と接触させ、式： で示される対応する有機リンチオエステルを製造するこ
    とからなる方法。
  14. 【請求項１４】３級アミンがトリアルキルアミンである
    請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】溶媒が二硫化炭素を含有している請求項
    14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】３級アミンがトリエチルアミンまたはジ
    イソプロピルエチルアミンである請求項15に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】イオウ濃度が少なくとも約0.2Mである請
    求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】イオウおよびトリアルキルアミンの溶液
    が実質的に同重量部のトリアルキルアミンと有機溶媒と
    を含有している請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】R3が、置換されていることあるアルキ
    ル、アルコキシ、フェノキシ、３級アミノまたはそれら
    の同族体である請求項13、請求項14または請求項18に記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】R3が、メチル、メトキシまたはβ−シア
    ノエトキシである請求項13、請求項14または請求項18に
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】イオウ化の後に遊離基を開裂させること
    をさらに包含している請求項13、請求項14または請求項
    18に記載の方法。
  22. 【請求項２２】ヌクレオシドホスファイトまたはヌクレ
    オシドホスホナイトを第２のヌクレオチドと連結させ、
    次いで得られた連結ヌクレオシドを、イオウ、非芳香族
    ３級アミン、およびイオウを溶解し得る溶媒からなる溶
    液と接触させることにより、ヌクレオチド間ホスファイ
    トまたはホスホナスをイオウ化させて対応するヌクレオ
    チド間ホスホロチオエートまたはホスホノチオエート基
    を生成させることを特徴とする、ヌクレオシドホスファ
    イトまたはヌクレオチドホスホナイトから選択される、
    ３価のイオウ化され得る有機リン化合物をイオウ化して
    イオウ化ホスホロチオエートまたはホスホノチオエート
    結合によって連結されている少なくとも２つのヌクレオ
    シドを有するヌクレオチドマルチマーを製造するための
    方法。
  23. 【請求項２３】最初のヌクレオシドホスファイトまたは
    ヌクレオシドホスホナイトが固形基質に結合している請
    求項７に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】固形基質が調整多孔質ガラスである請求
    項27記載の組成物。
  25. 【請求項２５】ヌクレオチドマルチマーシンセサイザー
    でヌクレオチド間ホスファイトまたはホスホナス基をイ
    オウ化するのに適した組成物であって、イオウ、第２の
    ヌクレオチドと結合した第１のヌクレオシドホスファイ
    トまたはヌクレオシドホスホナイト、ジイソプロピルエ
    チルアミン、およびイオウを溶解し得る有機溶媒からな
    る溶液を含み、第１のヌクレオチドホスファイトまたは
    ヌクレオシドホスホナイトが自動化ヌクレオチドマルチ
    マーシンセサイザーの固形基質に結合しているものであ
    る組成物。
  26. 【請求項２６】有機溶媒が二硫化炭素である請求項25記
    載の組成物。
  27. 【請求項２７】固形基質が調整多孔質ガラスである請求
    項25または26記載の組成物。
  28. 【請求項２８】イオウ化がほとんど定量的である請求項
    ９に記載の方法。
  29. 【請求項２９】イオウ化が約45秒以内に行われる請求項
    ９または28に記載の方法。
  30. 【請求項３０】時間が45秒である請求項28記載の方法。
  31. 【請求項３１】イオウ化を約45秒以内で行い得る温度で
    実施する請求項９または28記載の方法。
  32. 【請求項３２】定量的イオウ化を約45秒以内で行い得る
    温度で実施され、その温度がほぼ室温である請求項９ま
    たは28記載の方法。
  33. 【請求項３３】温度が室温である請求項32記載の方法。
  34. 【請求項３４】３級アミンがジイソプロピルエチルアミ
    ンである請求項９または28記載の方法。
  35. 【請求項３５】イオウ化が約45秒以内に行われる請求項
    13記載の方法。
  36. 【請求項３６】ほぼ室温で行われる請求項13または35記
    載の方法。
  37. 【請求項３７】３級アミンがジイソプロピルエチルアミ
    ンである請求項20記載の方法。
  38. 【請求項３８】リンがほとんど定量的にイオウ化される
    請求項22記載の方法。
  39. 【請求項３９】リンが約45秒以内にイオウ化される請求
    項22または38記載の方法。
  40. 【請求項４０】ほとんど定量的なイオウ化が約45秒以内
    に行われ得る温度で実施され、その温度がほぼ室温であ
    る請求項22又は38記載の方法。
  41. 【請求項４１】有機リン化合物が固形基質に結合してい
    る請求項22または38記載の方法。
  42. 【請求項４２】固形基質が調整多孔質ガラスである請求
    項41記載の方法。
  43. 【請求項４３】非芳香族３級アミンがジイソプロピルエ
    チルアミンである請求項22または38記載の方法。
  44. 【請求項４４】ヌクレオシドホスファイトまたはヌクレ
    オシドホスホナイトから選択される、３価の、イオウ化
    され得る有機化合物をイオウ化して、イオウ化ホスホロ
    チオエートまたはホスホノチオエート結合により連結さ
    れた少なくとも２つのヌクレオシドを有するヌクレオチ
    ドマルチマーを製造する方法であって、固形基質に結合
    している第１のヌクレオシドホスファイトまたはヌクレ
    オシドホスホナイトを第２のヌクレオシドと結合させ、
    得られた結合ヌクレオシドをイオウ、非芳香族３級アミ
    ン、およびイオウを溶解し得る溶媒からなる溶液と接触
    させてヌクレオチド間ホスファイトまたはホスホナス基
    をイオウ化して相当するヌクレオチド間ホスホロチオエ
    ートまたはホスホノチオエート基を製造することからな
    り、イオウ化がヌクレオチドマルチマーシンセサイザー
    で行われ、そしてイオウ化がほぼ室温で、約45秒以内に
    行われることを特徴とする方法。
  45. 【請求項４５】非芳香族３級アミンがジイソプロピルエ
    チルアミンである請求項44に記載の方法。
  46. 【請求項４６】固形基質が調整多孔質ガラスである請求
    項44または45に記載の方法。
JP2504408A 1989-03-06 1990-03-02 有機リン化合物をイオウ化するための方法およびそのための試薬 Expired - Fee Related JP2898750B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/319,570 US5449769A (en) 1989-03-06 1989-03-06 Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds
US319,570 1989-03-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH04503956A JPH04503956A (ja) 1992-07-16
JP2898750B2 true JP2898750B2 (ja) 1999-06-02

Family

ID=23242812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2504408A Expired - Fee Related JP2898750B2 (ja) 1989-03-06 1990-03-02 有機リン化合物をイオウ化するための方法およびそのための試薬

Country Status (9)

Country Link
US (2) US5449769A (ja)
EP (1) EP0386987B1 (ja)
JP (1) JP2898750B2 (ja)
AT (1) ATE153343T1 (ja)
CA (1) CA2011430C (ja)
DE (1) DE69030745T2 (ja)
DK (1) DK0386987T3 (ja)
ES (1) ES2101689T3 (ja)
WO (1) WO1990011322A2 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
WO1992018522A1 (en) * 1991-04-18 1992-10-29 The Salk Institute For Biological Studies Oligodeoxynucleotides and oligonucleotides useful as decoys for proteins which selectively bind to defined dna sequences
IT1249732B (it) * 1991-11-26 1995-03-09 Angeletti P Ist Richerche Bio Oligonucleotidi antisenso.
CA2140542A1 (en) * 1992-07-27 1994-02-03 Abeysingle Padmapriya Oligonucleotide alkylphosphonothioates
KR960700262A (ko) * 1993-01-08 1996-01-19 다알렌 반스톤 이합체 블록의 합성 및 그것의 올리고누클레오티드 어셈블리에의 사용 방법(synthesis of dimmer blocks and their use in assembling oligonucleotides)
US6087491A (en) * 1993-01-08 2000-07-11 Hybridon, Inc. Extremely high purity oligonucleotides and methods of synthesizing them using dimer blocks
CN1121721A (zh) * 1993-01-25 1996-05-01 海布里顿公司 寡核苷酸烷基膦酸酯和烷基硫代膦酸酯
US5739309A (en) * 1993-07-19 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens
US5733781A (en) 1994-07-19 1998-03-31 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
ATE194391T1 (de) * 1995-01-19 2000-07-15 Gen Probe Inc Amplifikationsoligonukleotide und sonden für borrelia, die mit lyme kranheit assoziiert sind
US5674995A (en) * 1995-06-07 1997-10-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides specific for cytokine signal transducer gp130 mRNA
US5716846A (en) * 1995-06-07 1998-02-10 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to interleukin-6 receptor mRNA
US5747470A (en) * 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA
US6172217B1 (en) * 1996-12-27 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Method of synthesizing phosphorothioate oligonucleotides
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
US5902881A (en) * 1997-03-03 1999-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Reagent useful for synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5760209A (en) * 1997-03-03 1998-06-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protecting group for synthesizing oligonucleotide analogs
AU738708B2 (en) 1997-05-02 2001-09-27 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6995259B1 (en) 1998-10-23 2006-02-07 Sirna Therapeutics, Inc. Method for the chemical synthesis of oligonucleotides
CN1471537A (zh) * 2000-09-07 2004-01-28 ƽ 用于低聚核苷酸合成的合成子
US7205399B1 (en) * 2001-07-06 2007-04-17 Sirna Therapeutics, Inc. Methods and reagents for oligonucleotide synthesis
EP2292793B1 (en) 2003-05-19 2013-12-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of Trichomonas Vaginalis in a test sample
CA2658105C (en) 2006-08-01 2016-07-05 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
US8309710B2 (en) * 2009-06-29 2012-11-13 Agilent Technologies, Inc. Use of N-alkyl imidazole for sulfurization of oligonucleotides with an acetyl disulfide
WO2018209068A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for isolating target nucleic acids
WO2020033557A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
CA3152309A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
US20220333162A1 (en) 2019-09-05 2022-10-20 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
CN116287111A (zh) 2019-11-14 2023-06-23 简·探针公司 用于捕获靶核酸的组合物和方法
WO2022241291A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human adenovirus nucleic acid
EP4382623A3 (en) 2021-07-27 2024-10-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting stec and at least one of salmonella, c. jejuni, c. coli, and shigella
WO2024137379A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2024192338A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal parasites

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA661668A (en) * 1963-04-23 H. Ford-Moore Arthur Manufacture of organic phosphorus compounds
US2536647A (en) * 1948-03-06 1951-01-02 Monsanto Chemicals Process of preparing bis (beta-chlorethyl)-para-nitrophenyl thiophosphate
US2647140A (en) * 1949-04-16 1953-07-28 Bayer Ag Process for the production of dialkylthiophosphates
US2907787A (en) * 1957-11-13 1959-10-06 Friedrich W Hoffmann Preparation of phosphono-thiono esters of 2-hydroxyethyl sulfides
DE1126382B (de) * 1960-08-17 1962-03-29 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Thiophosphorsaeureestern
NL288076A (ja) * 1962-01-24
US3162570A (en) * 1962-05-21 1964-12-22 Socony Mobil Oil Co Inc Organophosphorus compounds as insecticides and nematocides
GB1346409A (en) * 1962-06-21 1974-02-13 Secr Defence Manufacture of organic phosphorous compounds containing sulphur
US3296221A (en) * 1963-05-13 1967-01-03 Phillips Petroleum Co Mercapto-substituted thio-phosphites and phosphates and polysulfide polymers thereof
DE1210834B (de) * 1964-07-01 1966-02-17 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Thiophosphorverbindungen
US3687808A (en) * 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
SU410021A1 (ja) * 1972-05-30 1974-01-05
US4189453A (en) * 1977-03-10 1980-02-19 Ciba-Geigy Corporation Processes for the production of sulphur-containing esters of phosphoric acid and phosphorous acid
US4625677A (en) * 1985-05-23 1986-12-02 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Apparatus for coating and polishing a micropipette

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ＬｅＨｅｒｓ，Ｎｏ．４５，ｐ．３９４３〜３９４６

Also Published As

Publication number Publication date
DE69030745T2 (de) 1997-09-11
WO1990011322A2 (en) 1990-10-04
WO1990011322A3 (en) 1991-04-04
US5449769A (en) 1995-09-12
DK0386987T3 (da) 1997-10-13
ES2101689T3 (es) 1997-07-16
EP0386987A1 (en) 1990-09-12
EP0386987B1 (en) 1997-05-21
CA2011430C (en) 2000-06-20
ATE153343T1 (de) 1997-06-15
CA2011430A1 (en) 1990-09-06
JPH04503956A (ja) 1992-07-16
DE69030745D1 (de) 1997-06-26
US5252723A (en) 1993-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2898750B2 (ja) 有機リン化合物をイオウ化するための方法およびそのための試薬
JP2552048B2 (ja) ヌクレオチド鎖合成用試薬
US6117992A (en) Reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages
AU739468B2 (en) Activators for oligonucleotide synthesis
MXPA96004355A (en) Oligonucleotides and used modified intermediaries in nucleic acids therapeuti
JPH09511250A (ja) 核酸治療に有用な修飾オリゴヌクレオチド及び中間体
JPH08508513A (ja) リン含有共有結合をつくる方法およびその中間体
EP0766688A1 (en) Synthesis of oligonucleotides
WO1999040101A1 (en) Synthetic process for the preparation of oligonucleotides, nucleoside synthons used therein, and oligonucleotides prepared thereby
KR20080056314A (ko) 포스페이트 모방체를 함유하는 폴리뉴클레오티드
Froehler Oligodeoxynucleotide synthesis: H-phosphonate approach
EP0885237A1 (en) Oligonucleotide analogues
RU2111971C1 (ru) Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды, композиция на их основе и промежуточные соединения
CA2442230A1 (en) Labeled oligonucleotides, methods for making same, and compounds useful therefor
AU642673B2 (en) Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds
Stec et al. Stereospecific Synthesis of P-chiral Analogs of oligonucleotides
Rejman et al. Synthesis and hybridization of oligonucleotides modified at AMP sites with adenine pyrrolidine phosphonate nucleotides
Strömberg et al. Synthesis of oligodeoxyribo‐and oligoribonucleotides according to the H‐phosphonate method
US6103891A (en) Method for the synthesis of nucleotide or oligonucleotide phosphoramidites
Koziolkiewicz et al. Oligodeoxyribonucleotide phosphotriesters
EP0992506A2 (en) Process for the sulfurisation of phosphorus-containing compounds
Nawrot et al. A Novel Class of DNA Analogs Bearing 5′-C-Phosphonothymidine Units: Synthesis and Physicochemical and Biochemical Properties
WO1996023808A1 (en) Improved methods for h-phosphonate synthesis of oligonucleotides
Lesnikowski Wojciech J. Stec and Zbigniew J. Lesnikowski
Bremner Development of methodology for the chemical synthesis of oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080312

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080312

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080312

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 10

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees