JP2882654B2

JP2882654B2 - Ｈｉｖ‐３レトロウイルスおよびそれの利用

Info

Publication number: JP2882654B2
Application number: JP1506144A
Authority: JP
Inventors: レイズ，ロベルトデ; バルトファンデルボルート; サマン，エリク; ヒューベルスワイン，ヒューゴーファン
Original assignee: INOJENETEIKUSU NV
Current assignee: INOJENETEIKUSU NV
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1989-06-08
Publication date: 1999-04-12
Anticipated expiration: 2014-04-12
Also published as: DE3853422T2; ATE120234T1; DE3853422D1; EP0345375A1; EP0345375B1; CY2051B1; DK176078B1; DK33190A; JPH02504583A; US6265200B1; US5304466A; US20030039954A1; DK33190D0; US5858647A; ES2072853T3; EP1369427A2; EP0657532A1; US6013484A; EP0657532B1; AU625970B2

Description

【発明の詳細な説明】実質的な発展は、後天性免疫不全症候群またはAIDSを
理解することにおいて行われている。主な病因となる物
質は、T4ヘルパー／インデューサーリンパ球に対し向性
を有する非形質転換レトロウイルスであることが証明さ
れており（1,2）、そして世界中の何百万もの人々が既
に感染していると見積もられている。このウイルスでの
感染は、少なくとも症例の相当な割合において、T4リン
パ球集団の進行性低下を導き、それに付随して、この病
気の特徴である日和見感染に対する感受性の増加をもた
らす。

疫学的研究は、AIDSの症例の大部分の原因である病因
物質でありそして現在最も広まっているHIVであるヒト
免疫不全ウイルス１型（HIV−１）が、おそらく中央ア
フリカに起源を有するであろうことを指摘している
（３）。このウイルスの発見は、別の型のヒオ免疫不全
ウイルスの存在を必ずしも暗示するわではなかった。そ
れにもかかわらず、ヒト免疫不全に関連するレトロウイ
ルスの第二にグループ、即ちヒト免疫不全ウイルス２型
（HIV−２）が西アフリカにおいて同定された（4,5）。
HIV−２はEP−Ａ−0 239 425において開示されている。
HIV−１はWO86/12383において開示されている。他の類
似しているが同一ではないレトロウイルスは、アフリカ
ミドリザル（6,7）およびマカク（8,9）のようなシミア
ン起源（シミアン免疫不全ウイルス、SIV）から単離さ
れている。シミアン単離物はHIV−１よりもHIV−２と遺
伝学上密接に関連するが、それにもかかわらず異なる種
類のものであることが示されている（10）。

比較を複雑にするヒト免疫不全ウイルスの１つの特徴
は、それらの遺伝的変異性であり、遺伝的変異は自発的
に且つ高頻度を起こる。様々なHIV−１単離物の比較に
より、ゲノムの或る領域は非常に可変性であり、また或
る領域は適度に良く保存されていることが示された（11
−16）。HIV−２についても同様な多型性が観察されて
いる（17）。最大の遺伝的安定性を有する領域は、おそ
らく構造的または酵素的に不可欠であるウイルスタンパ
ク質の領域をコードしている領域であろう。総体的に最
大の遺伝的安定性を有するウイルス遺伝子はgagおよびp
ol遺伝子であり、一方env遺伝子の或る領域並びに調節
タンパク質をコードする遺伝子、例えばart，tat，sor
および３′orfは、高度の可変性を示す。gagおよびpol
遺伝子産物の主な構造的特徴は、特定のウイルス型の変
異体の全てが明らかに分けもっているだけでなく、少な
くともある程度は、異なるウイルス型間でも保存されて
いる。HIV−１に対して生産された抗血清は、HIV−１の
gagおよびpol遺伝子産物よりも低い親和性であるにもか
かわらず、HIV−２の対応する遺伝子産物と交差反応す
る。しかしながら、証明可能な免疫学的交差反応にもか
かわらず、核酸レベルではほとんど配列相同性がなく、
そしてごく低い緊縮性条件下を除いてこれらの２つのウ
イルス間の有意なハイブリダイゼーションは全く検出で
きない（17）。

SIVagm〔STLV−IIIagm、ヒトリンパ向性ウイルス４型
と殆どまたは完全に同一（15）〕とHIV−２との間で高
度の関連性が証明され得る。免疫学的交差反応はgagお
よびpol遺伝子産物だけに限定されず、env遺伝子産物に
も及ぶ。それにもかかわらず、SIVagmとHIV−２のゲノ
ム分析は、それらが遺伝学的に区別できることを示した
（19）。HIV−２に特異的なDNAプローブは、SIVagm配列
とハイウリダイズできるけれども、HIV−２と優勢的に
ハイブリダイズする（18）。

本発明者らは、カメルーン人女性および彼女の夫から
のヒト免疫不全ウイルスの単離および特徴づけを報告す
る。このウイルスは、地理的には、HIV−２が土地特有
である西アフリカとHIV−１が特有である東−中央アフ
リカとの間に位置するアフリカ地域起源である。この単
離物は、HIV−２よりもHIV−１と遺伝学上密接に関連す
ることが免疫学的に示されるが、gagおよびpol遺伝子産
物の化学的開裂により得られた部分開裂生成物の分析
は、この単離物がHIV−１でもHIV−２でもないことを証
明する。この新規単離物は、HIV−１とHIV−２との間の
進化的結合体（evolutionary link）を意味し得る。こ
の新規ウイルスを以後HIV−３と称することにする。

従って、本発明は、V88060301のもとにEuropean Coll
ection of Animal Cell Culture（ECACC）に寄託された
レトロウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質
を有する、HIV−３レトロウイルスまたはこのウイルス
の変異体に関する。

ウイルスの単離は、汎化したリンパ節疾患を有するHI
V−血清陽性の男性の配偶者である無症候のカメルーン
人女性の血液から行われた。この女性の血清は、エンザ
イムリンクドイムノソルベントアッセイ（EIA,Organon
Teknika）において中程度に陽性であり（O.D./カットオ
フの比が4.5）、そしてHIV−１についての免疫蛍光抗体
アッセイにおいては低い力価（1/40）を有したが、HIV
−１ウエスタンブロットアッセイにおいてp33,p53/55お
よびp64の位置に明確なバンドを有しそしてp24の位置に
ごく弱いバイドを有するという不明瞭な結果を与えた。
この女性のリンパ球と健康な未感染の提供者のPHA刺激
リンパ球とを、20mM HEPES（ヒドロキシエチルピペラジ
ンエタンスルホネート）で緩衝化されそして15％ウシ胎
児血清、5g/mlヒドロコルチゾン、75U/mlインターロイ
キン−２（IL−２）および2g/mlポリブレンが補足され
たRPMI 1640から成る培地中で同時培養することによ
り、ウイルスが単離された。

52日間培養した後、合胞体の存在により、および実験
対照の抗−HIV抗血清を培養物からのアセトン固定化細
胞と共にインキュベートした時に観察される陽性の免疫
蛍光を基にして判断すると、培養物中にウイルスが検出
された。培養上清中の逆転写酵素の存在も検出された
（10⁴cpm/ml、27×バックグラウンド）。無細胞の培養
上清を用いて、新鮮なリンパ球上で該ウイルスを継代培
養した。15日後、CPEが再び観察され、そして上清中に
逆転写酵素が検出された。該ウイルスを、健康な血液提
供者からのPHA−刺激されたリンパ球中で更に増殖さ
せ、そして白血病起源の連続細胞系に転移させた。ウイ
ルス含有上清を、HIV−１を含むことが知られている培
養上清と平行して、下記に詳細に記載される示差的抗原
捕捉においてテストした。この比較結果は、新規単離物
がHIV−１でないことを示した。

次に新規ウイルスをそれのタンパク質抗原および核酸
について特徴づけた。該ウイルスを増殖させるために使
用する細胞系は、場合に応じて、CEM,HUT,Molt−４もし
くはMT4タイプの細胞系、または細胞表面上にT4レセプ
ターを有する他の不死化された細胞系のいずれかである
ことができる。

HIV−３の連続増殖に好ましい細胞系はMolt−４であ
る。HIV−３で感染されたMolt−４細胞は、1988年６月
３日にV88060301号のもとにECACCに寄託された。慢性的
に感染された細胞系の確立は、例えば、次のようにして
行うことができる。

Molt−４細胞（10⁶/ml）、好ましくはMolt−４クロー
ン８細胞（N.山本、山口県、日本から入手）を、20mM H
EPESで緩衝化されておりそして10％ウシ胎児血清を含有
するRPMI 1640培地中で、感染ヒトリンパ球（10⁶/ml）
と共に同時培養する。１〜２週間以内に、培養物におい
て細胞毒性効果が観察され、次いで細胞死が観察され
る。培養中の細胞の一部分は感染から生き残り、そして
ウイルスを連続的に生産する。培養を続けると、それら
の細胞数が増加し、そして継代培養できる。それらの細
胞の上清は、ウイルスの入手源として使用することがで
きる。

更に、本発明は、下記に記載される形態学的および免
疫学的性質を有する精製されたレトロウイルスに関す
る。多くの場合、HIV−３の独特な性質は、他のヒト免
疫不全ウイルスHIV−１およびHIV−２に関する同じタイ
プの性質との比較により、最も正しく評価され得る。

図面の簡単な説明第１図〜第16図において、名称HIV−３（ANT 70）お
よびHIV−３（ANT 70 NA）は、カメルーン人女性と彼女
のパートナーから単離された新規HIV−３ウイルスの２
つの株に相当し、HIV−３（ANT 70）はECACC V88060301
のもとに寄託されている。

第１図は、ウイルスタンパク質の開裂マップを調製す
るための手順を示す。

第２図は、ウイルス含有培養上清に関する示差的抗原
捕捉を示す。

示差的抗原捕捉は下記に記載のようにして行われる。
実線は広域スペクトル抗−HIV−1 IgGを使って得られた
結果を示し、一方点線はHIV−１にかなり特異的であるI
gGを使って得られた結果を示す。パネルＡ−Ｆに示され
る力価曲線はHIV−１に特有である。パネルＦはHIV−３
（ANT 70）含有上清を使って得られた結果を示す。

第３図は、HIV−１およびHIV−３（ANT 70 NA）上清
における示差的抗原捕捉を示す。実線は広域スペクトル
抗−HIV IgGでコーティングされたプレートにおいて得
られた結果を表わし、一方点線はHIV−１以外のHIV型と
ほとんど交差反応性を示さないIgGでコーティングされ
たプレートにおいて得られた結果を表わす。

第４図は、HIV−１およびHIV−２ウエスタンブロット
ストリップ上での抗−HIV血清の反応性を示す。

HIV−１およびHIV−２ウエスタンブロットストリップ
上での３種の異なる血清の反応性を示す。血清:1.抗−H
IV−1;2.抗−HIV−３（ANT 70）;3.抗−HIV−２（単離
物53）。指示した分子量は製造業者（Dupont Biotech）
により与えられたものである。

第５図は、幾つかのHIV−１単離物、HIV−2rodおよび
HIV−３（ANT 70）のgagおよびpolタンパク質の比較に
関する。

タンパク質を電気泳動により分離しそして後記のよう
にしてブロットした。ブロットを広域スペクトル抗−HI
V抗血清と共にインキュベートし次いで（抗−ヒトIgG）
／アルカリホスファターゼラベル化接合体と共にインキ
ュベートし、タンパク質を可視化した。A.HIV−2rod、
B.HIV−１実験単離物、C.HIV−３（ANT 70 NA）、D.HIV
−１実験単離物、E.HIV−１（SF4）。

第６図は、HIV−３（ANT 70）およびHIV−３（ANT 70
NA）タンパク質の比較を示す。

タンパク質を電気泳動により分離し、そして後記のよ
うにしてブロットした。ブロットをBSR抗血清に続いて
（アルカリホスファターゼ）／抗−ヒトIgG接合体と共
にインキュベートし、タンパク質を可視化した。レーン
1:HIV−３（ANT 70 NA）、レーン2:HIV−３（ANT 7
0）、レーン3:HIV−１（SF4）。レーン１と２の間の明
らかな強度の差は、負荷した試料の量の差によるもので
ある。

第７図は、ウイルス抗原を捕捉する種々のヒト抗−HI
V−１血清の能力に関する。

多数のヒト血清を1:1000希釈し、そしてミクロウェル
プレート上に直接コーティングした。HIV−１（SF4）,H
IV−３（ANT 70）,HIV−2rodまたはHIV−２（単離物5
3）を含有する洗剤処理された培養上清をインキュベー
トし、そして広域スペクトル（抗−HIV IgG）／西洋ワ
サビペルオキシダーゼ接合体を使って、結合した抗原を
検出した。血清１−７はアフリカ人のものであり、血清
８−11はヨーロッパ人のものであった。非−HIV−１抗
原を捕捉するアフリカ人血清の能力がより大きいのは、
一部分は、それらの抗−p24力価がより大きいことによ
り説明できる（データは示されていない）。

第８図は、HIV単離物の結合におけるコーティングIgG
の希釈度の効果を示す。

1:1000の希釈度で始まる４つの異なる血清の連続倍々
希釈液を作製し、これを使ってミクロウェルプレートを
コーティングした。HIV−１（SF4）,HIV−３（ANT 7
0）,HIV−2rodおよびHIV−２（単離物53）の洗剤処理さ
れた上清を、1:1000の希釈率でパネルＢに示される抗血
清でコーティングされたプレート上でのものとほぼ等し
い光学濃度を与えるように希釈した。結合した抗原を、
広域スペクトル（抗−HIV IgG）／西洋ワサビペルオキ
シダーゼ接合体を使って検出した。

第９図は、ヒオポリクローナル抗体およびマウス抗−
HIV−１モノクローナル抗体を使ったウイルス単離物の
抗原捕捉を示す。

明細書中に記載されるようにしてウェルをコーティン
グし、インキュベートした。使用したIgGは次のもので
ある： 1.ヒトポリクローナル抗−HIV IgG;2.MAb CLB 59;3.MAb
CLB 21;4.MAb CLB 64;5.MAb CLB 14;6.MAb CLB 16;7.M
Ab CLB 47;8.MAb CLB 13.6（抗−p18）;9.MAb CLB 19.
7;10.MAb CLB 13.4（抗体−p18）。

第10図は、種々のHIV型に対するヒト抗−HIV抗血清の
反応性の比較である。

HIV−４（SF4）,HIV−３（ANT 70）,HIV−2rodおよび
HIV−２（単離物53）の溶解物をSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル上での電気泳動により分離し、ニトロセルロース
上にブロットし、そして高力価の抗−HIV−１抗血清
（パネルＡ）、低力価の抗−HIV−１抗血清（パネル
Ｂ）、HIV−３（ANT 70）が単離された女性の血清（パ
ネルＣ）、HIV−３（ANT 70 NA）が単離された夫の血清
（パネルＤ）およびHIV−２（単離物53）が単離された
人の抗−HIV−２抗血清（パネルＥ）と共にインキュベ
ートした。

第11図は、エンザイムイムノアッセイによる抗−HIV
血清の力価測定を示す。

ミクロウェルプレートをHIV−１（SF4）,HIV−３（AN
T 70）およびHIV−２（単離物53）の溶解物でコーティ
ングした。HIV−１感染したヨーロッパ人の血清（左の
パネル）およびHIV−２（単離物53）に対する抗血清
（右のパネル）を、３種類のコーティングされたプレー
ト上で1:100の希釈度で始まる倍々希釈液で力価測定し
た。

第12図は、ウイルスのgagおよびpol遺伝子産物におけ
るメチオニンとトリプトファン残基の位置を示す。

p17 gagタンパク質についてのアミノ酸位置は、コー
ド配列中の最初のメチオニンから出発して与えられてい
る。p24 gagタンパク質についてのアミノ酸位置は、p17
/p24タンパク質開裂部位から出発して与えられている。
polタンパク質の位置は、HIV−１配列中の556位と557位
における高度に保存されたトリプトファン対により整列
した後に示されている。保存されたプロテアーゼ配列、
プロテアーゼ／逆転写酵素開裂部位および逆転写酵素／
エンドヌクレアーゼ開裂部位の位置が示されている。こ
の場合、p24およびp17という用語は、遺伝学的意味でそ
れぞれ最大のウイルスコアタンパク質および二番目に大
きいウイルスコアタンパク質について呼称される。“HI
V−２（LAV−２）”という用語は、HIV−2rodと同義で
ある。

第13図は、HIV−１（SF4）〔図中ではHIV−１〕、HIV
−３（ANT 70）〔図中では単離物70）、HIV−2rod〔図
中ではHIV−２（LAV−２）〕およびHIV−２（単離物5
3）〔図中では単離物53〕のgagおよびpol遺伝子産物の
部分開裂生成物の比較である。p24およびp17という用語
は、遺伝学的意味で、それぞれ最大のウイルスコアタン
パク質および二番目に大きいウイルスコアタンパク質を
指すために使われる。

第14図は、ウイルスRNAとcDNAプローブとのハイブリ
ダイゼーションを示す。

材料および方法において記載のようにして、HIV−１
（SF4）,HIV−2rodおよびHIV−３（ANT 70）からのウイ
ルスRNAをメンブランフィルター上にスポットした。非
緊縮（Ａ）または緊縮（Ｂ）条件下で該フィルターをハ
イブリダイズせしめ、そしてオートラジオフィーを行っ
た。

1.形態 HIV−３感染されたMT4細胞の電子顕微鏡検査は、約20
〜40nmの直径を有しそして薄い切片においてHIV−１コ
アの幾分円筒形の外観に比較するとわずかに円錐形であ
るように見える内側の細長いコアを取囲む外側のエンベ
ロープから成り、そして約120nmの直径を有する細胞外
ウイルス粒子の存在を示した。HIV−３はHIV−１やHIV
−２と形態的に非常に類似しているが、他のヒトレトロ
ウイルス、例えばHTLV−ＩやHTLV−IIとは容易に識別さ
れる。

2.タンパク質および糖タンパク質抗原 HIV−３感染されたMolt−４細胞の培養上清中に存在
するウイルスを、ポリエチレングリコール（平均分子量
6000）での沈降に続く遠心により濃縮した。生じたペレ
ットとリン酸塩緩衝化塩溶液中に再懸濁し、20％ショ糖
クッション上に重層させ、そして100,000gにて1.5時間
ペレット化させた。次にペレット化したウイルスを、２
％２−メルカプトエタノール、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムおよび10％グリセロールを含む62.5mMトリス（pH6.
7）中に溶解し、そして主要ウイルス抗原を変性条件下
でのポリアクリルアミドゲル（12.5％）上での電気泳動
により分離した。分子量を評価する基準を提供するため
に同じゲルに分子量マーカーを加えた。分離した後、タ
ンパク質を電気泳動的にニトロセルロース紙に移し（ウ
エスタンブロット）、次いでこれをHIVで感染された人
の抗血清と共にインキュベートした。最初の実験では、
HIV−１で感染された人から誘導されそしてHIV−2 gag
およびpol−由来のタンパク質と交差反応することが前
もって示されている高力価の抗血清を使った。このよう
にして、HIV−3 gagおよびpol遺伝子産物の分子量をHIV
−１およびHIV−２のものと比較することができた。HIV
−３タンパク質について観察された見かけの分子量は、
HIV−１とHIV−２の両者について観察されたものに近似
している。それでも、HIV−３とHIV−１およびHIV−２
との間に小さいが再現可能な分子量の差があることも明
らかである。

タンパク質ブロットは、HIV−３がHIV−１やHIV−２
と同様に３種類のコアタンパク質を有することを示し
た。HIV−３の場合は、これらの３つのタンパク質がそ
れぞれ約12,000,16,500および25,000の分子量を有する
ことがわかった。慣例により、タンパク質はしばしば、
タンパク質については“p"または糖タンパク質について
は“gp"の後に、1,000倍した時にポリペプチドのおよそ
の分子量を示す数を付けて呼称される。HIV−３の３つ
の主要なコアタンパク質を、以後それぞれp12,p16およ
びp25と称することにする。

測定された分子量は、真の値の10％以内で正しいと思
われる。それにもかかわらず、使用する電気泳動装置の
構成および緩衝液成分の入手源は研究室ごとに色々に異
なるので、タンパク室の分子量の値について多くの混乱
が生じる。従って、HIV−１またはHIV−２のものに関し
てHIV−３の抗原タンパク質の見かけの分子量を比較す
る時は、全試料を同一のゲル上において電気泳動にかけ
ることが必要である。そのようなゲルは、例えば、第５
図に見つけることができる。特に、主要コアタンパク質
の場合には、３種のHIVの相同タンパク質の分子量値が
非常に近似しているが、HIV−１由来のタンパク質が最
も小さい。HIV−２の主要コアタンパク質は、以前報告
されているようにHIV−１のものより幾らか大きい。HIV
−３由来の相同タンパク質は、HIV−２の主要コアタン
パク質よりわずかに大きい。これらのタンパク質の計算
平均分子量を第１表に示す。

同様に、ほとんどのHIV−１株においては18,000の分
子量を有する第二のコアタンパク質に関しても、３種の
HIV間に分子量の差が明らかである。しかしながら、こ
のタンパク質の分子量における株間の差は、HIV−１の
場合において実証されており、このタンパク質の分子量
は幾つかの単離物では17,000であろう。HIV−２由来の
相同タンパク質は約16,000の分子量を有する一方、HIV
−３タンパク質は、中間の約16,500の分子量を有する。

HIV−１およびHIV−２との類推により、HIV−３もウ
イルスによりコードされる２つの形の逆転写酵素を有す
る。これらの２つの種は、HIV−１およびHIV−２の対応
する種とはわずかに異なる分子量を有し、そしてHIV−
３に特徴的である。それらの分子量も第１表に要約され
ている。

HIV−３は、31,000の見かけ分子量を有するエンドヌ
クレアーゼでありそしてHIV−１またはHIV−２由来の相
同タンパク質とは分子量の点で異なる、追加のpol遺伝
子由来のポリペプチドを有する。

HIV−３タンパク質を含むタンパク質ブロットを、こ
のウイルスで感染された個体から得られた血清と共にイ
ンキュベートすると、２つの追加のタンパク質が認めら
れ得る。これらのタンパク質はenv遺伝子由来であり、
そしてウイルスエンベロープ糖タンパク質である。膜透
過タンパク質である小さい方のタンパク質は、40,000〜
45,000の間の見かけ分子量を有する幅広いバンドとして
移動する。このタンパク質は、該タンパク質が見かけ分
子量およびポリアクリルアミドゲル上での移動度につい
て幾らかの本質的な不均一性を示すことを理解しなが
ら、gp41と以後称することにする。外膜タンパク質であ
る大きい方のタンパク質も同様に、ポリアクリルアミド
ゲル上で幾らか拡散し、そして約120,000の分子量を有
する。このタンパク質を以後gp120と称することにす
る。ポリアクリルアミドゲル上でのこれら２つの種の見
かけ上不均一な移動は、ポリペプチド鎖における不均一
性のためではなく、むしろ翻訳後グリコシル化における
不均一性のためであることに注目すべきである。特に、
gp120は高度にグリコシル化され、そして観察される見
かけ分子量は、ウイルスを生産せしめるのに使われる細
胞系によりある程度影響される。

ウエスタンブロットに加えて、ウイルスタンパク質抗
原は、放射線免疫沈降アッセイ（RIPA）によっても可視
化され得る。

このためには、HIV−３感染した細胞を、システイン
とメチオニンがなく且つ透析済のウシ胎児血清が補足さ
れたRPMI 1640倍地中で³⁵S−システインと³⁵S−メチオ
ニン（200Ci/ml）の存在下で培養することにより生体内
で代謝的に放射能ラベル化することができる。16時間
後、20％ショ糖クッション上で、100,000gにて1.5時間
遠心することによりラベル化されたウイルスを培養上清
から収得する。得られたペレット化したウイルスを、RI
PA緩衝液（20mMトリエタノールアミン、pH8.0、0.5M Na
Cl、0.5％ Nonidet P40、0.1％デオキシコール酸ナトリ
ウム、および1mMフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド）中に再懸濁する。

あるいは、当業者にとってよく知られている技術によ
りクロラミンＴを使ってウイルスを¹²⁵Iでラベル化する
こともできる。この場合、20％ショ糖クッションを通し
てウイルスをペレット化し、リン酸塩緩衝化塩溶液中に
ウイルスを再懸濁し、そして20〜50％のショ糖勾配上で
の60,000gで12時間の超遠心によりウイルスをバンド状
にすることにより、感染細胞の上清からウイルスを精製
する。バンド状になったウイルスは、逆転写酵素アッセ
イかまたは抗原捕捉アッセイのいずれかにより、分画さ
れた勾配中の位置を突きとめられ得る。ウイルスを含有
する画分をプールし、そしてTriton X−100を0.5％の濃
度に添加る。次いでTriton X−100で溶解されたウイル
スをヨウ素化することができる。

免疫沈降については、RIPA緩衝液中の100,000−200,0
00cpmのラベル化ウイルスタンパク質を、５μｌの試験
血清と共に200μｌの容量において４℃にて16時間反応
させる。次いで生じた免疫複合体をプロテインＡ−セフ
ァロール（ファルマシア社）に結合させ、充分に洗浄
し、そして結合したタンパク質を、１％ SDSを含む電気
泳動試料緩衝液で溶出させる。次に電気泳動に続くオー
トラジオグラフィーにより抗原を分析する。

HIV−３のタンパク質抗原は、異なるが関連する２つ
のアプローチを使って、HIV−１およびHIV−２のものに
関して特徴づけることができる。一方では、HIV−１やH
IV−２で感染された人からの血清と交差反応するそれら
の能力に基づいて該抗原を特徴づけることができる。他
方では、HIV−３抗原に応答して産生される抗体を含有
する、HIV−３感染された人の抗血清を使って、HIV−１
およびHIV−２タンパク質との交差反応性をテストする
ことができる。HIV−３とHIV−１およびHIV−２との間
の抗原の関連性は、下記に示される実施例中で説明され
る。

それらの実験結果は、ウイルスのコアタンパク質およ
びpol遺伝子産物についてのみ交差反応性が観察される
ので、HIV−３はHIV−２と遠縁にしか関連しないことを
示す。抗−HIV−２抗血清をHIV−３タンパク質と共にイ
ンキュベートした時にも、抗−HIV−３抗血清をHIV−２
タンパク質と共にインキュベートした時にも、env遺伝
子産物の交差反応性は全く観察されなかった。

これに対して、抗−HIV−３抗血清はHIV−１のgagお
よびpol遺伝子産物と交差反応するだけでなく、たとえ
低親和性でもgp41およびgp120 env遺伝子産物とも幾ら
か交差反応するので、HIV−３はより密接にHIV−１と関
連する。抗−HIV−１抗血清も同様に、HIV−１のタンパ
ク質に対するものよりも低い親和性であるがHIV−３の
抗原タンパク質の全ての交差反応する。

下記の実施例において、１）HIV−１について観察さ
れるものとは異なる抗−HIV−１抗血清との反応性パタ
ーン、２）HIV−１のp24およびp17コアタンパク質に対
して生起したマウスのモノクローナル抗体により認識さ
れる能力のかなりの低下、および３）HIV−３感染した
個体からの抗血清による、HIV−１タンパク質を上回るH
IV−３タンパク質（エンベロープタンパク質を含む）の
優勢的認識；に基づき、HIV−３はHIV−１とは実質上抗
原的に異なることが証明される。

ヒト免疫不全ウイルスの遺伝的可変性にもかかわら
ず、例えば特定の株から誘導されたHIV−１タンパク質
に基づく試験は、他のHIV−１変異体に応答して生起し
た抗体を検出するのに十分に機能するであろう。これは
特に、モノクローナル抗体がHIV−1,HIV−２およびHIV
−３単離物由来の抗原と反応する能力について試験した
実施例においても認識され得る。この場合、モノクロー
ナル抗体はHIV−1 IIIB株からのコアタンパク質に対し
て生起されたが、HIV−1 SF4株由来のタンパク質に対し
ても強く反応する。それに対して、それらの同じモノク
ローナル抗体はHIV−３のコアタンパク質とはごく弱く
しかまたは全く反応しない。このことは、HIV−１とHIV
−３との間の抗原の相違が非常に大きいので、HIV−１
タンパク質を使用する免疫学的アッセイがHIV−３で感
染された個体の血清を試験するのに適当でないだろうと
いうことを示唆している。

最後に、下記に与えられる実施例において、最も高度
に保存されたgagおよびpol遺伝子産物中のメチオニンと
トリプトファン残基の数および／または位置の相違が示
されている。

3.HIV−３核酸 A.HIV−３ウイルスRNA “ドットブロット”技術に従ってHybond−Ｈ（Amersh
am）フィルター上に移した時のHIV−３のRNAは、緊縮条
件下でHIV−1 DNAとハイブリダイズしなかった。

“緊縮条件”または“非緊縮条件”とは、実際のハイ
ブリダイゼーションおよび／またはその後の洗浄段階が
実施されるもとでの条件を意味する。ドットブロットハ
イブリダイゼーションは、HIV−1 SF4株、HIV−2rodお
よびHIV−3 ANT 70株からのウイルスRNAの希釈液をHybo
nd−Ｈフィルター上にスポットすることにより行った。

各ウイルスの希釈液シリーズは、培養上清5,2.5,1.25
および0.62ml相等物からペレット化されたウイルスRNA
に対応した。このRNAを２分間のUV照射によりフィルタ
ーに固定し、そして該フィルターを³²P−ラベル化DNAプ
ローブと接触させることによりハイブリダイゼーション
を行った。選択されたプローブは、ヌクレオチド487−4
652（SacI−EcoRI）に及ぶHIV−１配列に由来し、ベク
ターpUC 13中でサブクローニングされた５′−LTR（lon
g terminal repeat）の一部分、完全なgag領域および大
部分のpol遺伝子を含む。³²P−ラベル化プローブと該フ
ィルターとのハイブリダイゼーションは、３×SSC、0.5
％粉乳、１％SDS、１％硫酸デキストラン、50％ホルム
アミド（容量／容量）中で緊縮条件下で42℃にて18時間
行われた（１×SSCは0.15M MaCl、0.015Mクエン酸ナト
リウムに相当する）。その後の洗浄段階は、0.1×SSCお
よび0.1％SDS中で緊縮条件下で65℃にて行われた（２〜
30分間洗浄する）。次いで該フィルターを乾燥し、そし
て映像強化膜を使って−70℃にてオートラジオグラフィ
ーを行った。オートラジオグラフィー後、HIV−１ウイ
ルスRNAに相当するスポットだけが見えた。HIV−２また
は２種のHIV−３株のいずれかとのハイブリダイゼーシ
ョンは全く観察されなかった。従って、HIV−３はHIV−
１とはただ遠く離れてのみ関連すると思われる。

B.HIV−３由来のcDNAおよびcDNAのサブクローン HIV−３配列に相当するcDNAを合成しそしてクローニ
ングした条件を下記に記載する。１の培養液からHIV
−３（ANT 70株）をポリエチレングリコール6000で沈澱
させ、リン酸塩緩衝化塩溶液中に再懸濁し、そして20％
ショ糖クッションを通してペレット化した。得られたウ
イルスペレットを20mMジチオトレイトールおよび0.5％
Nonidet P−40中の6M塩酸グアニジンに溶解した。２モ
ルの濃度までCsClを添加し、崩壊されたウイルスを含む
溶液を、0.1M EDTAを含有する5.7M CsClのクッション1.
2ml上に重層させた。Beckman SW28ローター中15℃にて2
5,000rpmで20時間遠心することによりウイルスRNAをペ
レット化した。ペレット化されたRNAを再溶解し、フェ
ノールで抽出し、そしてエタノールと2M LiClで沈澱さ
せた。

上記のようにして調製されたウイルスRNAの1/5を、第
一cDNA鎖の合成を開始するために働くオリゴ（dT）プラ
イマーを使ったcDNAの合成の第一段階を指図するのに使
った。

Amersham社により供給される市販のキットをHIV−3 c
DNAの調製に使い、そして外因的に添加された逆転写酵
素を使って第一鎖を合成した。

第二鎖の合成は、RNA/DNAハイブリッドのRNA鎖を消化
した除去するためRNase Hの存在下においてE.コリDNAポ
リメラーゼＩを使って行われた。

第二鎖の合成は、cDNAをラベル化するために³²PdCTP
の存在下で行われた。得られたcDNAをT4 DNAポリメラー
ゼで処理し、平滑末端を作り、cDNAをメチル化して潜在
的な内部EcoRI開裂部位を保護し、次いで同様にAmersha
m社により供給されたEcoRIリンカーと結合させた。次に
EcoRI制限部位を開裂せしめ、そしてcDNAを1.2％アガロ
ースゲル上でサイズ分離した。500〜2000塩基対のcDNA
長さに相当するゲル部分を切り取り、cDNAを溶出せし
め、そしてEcoRIで開裂されそして脱リン酸化されてい
るpUC 13ベクター中でクローニングした。次にこのDNA
を使ってE.コリMC 1016（ラムダ）のコンピテント細胞
を形質転換させた。得られたコロニーをポール膜（Pall
Biodyne）に移し、1.5M NaCl,0.5M NaOHで溶解および
変性させ、そして3M NaOAc（pH5.5）で中和した。HIV−
３の挿入断片を含有するコロニーを、５×SSC、５×Den
hardts溶液、0.2％ SDS、250mg/ml変性サケ精子DNAを含
有する緩衝液中で穏和な緊縮条件下で、前記のHIV−１
のSacI−EcoRI断片を含有する³²Pでラベル化されたプラ
スミドを使って、65℃にて一晩スクリーニングした。ハ
イブリダイゼーション後、フィルターを次の順で洗浄し
た。

1.2×SSC,0.1％ SDS中室温で１時間。

2.0.1×SSC,0.1％ SDS中室温で30分間。

3.2×SSC,0.1％ SDS中42℃で20分間。

4.0.1×SSC,0.1％ SDS中42℃で20分間。

フィルターのオートラジオグラフィー後、幾つかの弱
陽性コロニーを同定し、次いでこれらを分析用に増殖さ
せた。陽性シグナルは、HIV−１のgagまたはpol領域と
の弱い相同性によるか、またはLTRのＲ領域との幾らか
の配列相同性によるかどちらかであろうと予想された。

C.HIV−3 cDNA中に含まれる配列 906塩基対の長さであることがわかりそしてiso 70−1
1と称される最大挿入断片を有するクローンを配列分析
のために選択した。該挿入断片を種々の制限酵素で消化
し、そして得られた断片をpUC 13ベクター中でサブクロ
ーニングすることにより、該挿入断片の多数のサブクロ
ーンを調製した。配列決定は、Sanger（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74:5463−5467,1977）により記載されたジデ
オキシ法に従って、17マーのM13プライマーを使用するB
oehringer社から購入したキットを使って行われた。cDN
Aクローンiso 70−11の配列分析は、該挿入断片が３′
末端にポリ（Ａ）鎖を有するウイルスゲノムの３′末端
に相当することを示した。

HIV−３レトロウイルスは、U3領域とＲ領域から成る
３′LTRを含む。HIV−１の３′LTR領域と同様に、クロ
ーンiso 70−11はＲ領域の３′末端から約23ヌクレオチ
ドに位置するAATAAポリアデニル化シグナルを含む。HIV
−３配列の分析は、HIV−１の対応する３′LTR配列と約
70％の相同性があることおよびHIV−２の対応する配列
と55％未満の相同性があることを示した。

逆に、HIV−3 RNAとの交差ハイブリダイゼーションを
検出するためにラベル化プローブとしてHIV−１のgag−
pol配列を使ったハイブリダイゼーションは、該ハイブ
リダイゼーションを緊縮条件下で行った時、検出可能な
ハイブリダイゼーションが全く起こらなかったことを示
した。これはまた、両ウイルスが遠く離れてのみ関連す
ること、そしてgagおよびpol遺伝子を含んで成るゲノム
領域中に核酸レベルにおいてHIV−１とHIV−３との間に
相違があり得ることを指摘している。しかしながら、こ
の同じラベル化プローブはHIV−1 SF4株由来のRNAとハ
イブリダイズした。

加えて、本発明は、少なくとも１つの抗原、特にHIV
−３レトロウイルスのタンパク質または糖タンパク質を
含んで成る組成物に関する。そのような組成物は、抗体
を検出する方法において、およびそのような方法を実施
するためのキットにおいて使用され得る。

HIV−３ウイルスは、HIV−３と接触した人々において
抗体を検出するための抗原の入手源として有用であるこ
とが証明された。それ自体、該ウイルスは既に記載され
た方法により増殖および濃縮され、そして該ウイルスを
適当な洗剤で処理することにより溶解物が調製され得
る。全ウイルス溶解物を調製するのに好ましい洗剤は、
0.5％の濃度で使用されるTriton X−100である。別の好
ましい洗剤は、0.5％の濃度で使用されるNonidet P−40
（NP−40）である。

あるいは、ウイルスの溶解物からウイルスタンパク質
が精製され得る。これらのタンパク質を精製するための
好ましい方法はアフィニティークロマトグラフィーであ
る。例えば、ウイルス抗原は分取用ポリアクリルアミド
ゲル上で分離され、そして精製された形で個々の抗原が
溶出され得る。さらにそれらを使って、例えばウサギに
おいて、個々のウイルスタンパク質に特異的な抗血清を
生起させることができる。免疫ウサギ血清から誘導され
たIgG画分は、CNBr−活性化セファロース4B（Pharmaci
a）のような固相に連結され、ウイルス溶解物から個々
のウイルス抗原を選択的に取り出すために使用できる。
次いで低pH緩衝液を使ってアフィニティー担体からそれ
らのタンパク質を溶出させ、そして例としてMontelaro
ら、J.of Virology（1982）42:1029−1030により与えら
れるような標準的クロマトグラフィー技術を使って更に
精製することができる。

本発明は、一般的にHIV−３感染の診断のためまたは
予後上価値を有する試験のために利用できるいずれかの
組成物に関する。それらの診断方法には、HIV−３の少
なくとも１つの抗原に対して向けられた、血清または他
の体液中の抗体の検出が含まれる。

好ましい組成物はウイルス溶解物または精製された抗
原であって、ウイルスコアタンパク質p12,p16およびp25
のうちの少なくとも１つ、またはエンベロープタンパク
質gp41もしくは120、またはpol遺伝子由来のタンパク
質、例えばp31を含む。特に好ましい組成物は、例とし
て、次のタンパク質を同時に含むものである。

−p25およっびgp120 −p25およびgp45 −p25,p41およびgp120 −p12,p16およびp25 −p25,p31およびgp120 しかしながら、上記の組成物は、単に例として役立つ
だけの意味を持ち、そして本発明は上記タンパク質また
は糖タンパク質のうちの１つもしくは複数を含有する溶
解物またはタンパク質調製物全てに関することを理解す
べきである。

本発明はまた、HIV−３ウイルス溶解物が、同様に調
製されたHIV−１および／またはHIV−２由来のタンパク
質との組合せにおいて、検出しようとするウイルスの絶
対的同一性を顧慮せずにヒト免疫不全ウイルスでの感染
または接触の一般的診断に使用される、いずれの組成物
にも関する。例えば、そういった組成物はHIV−1,HIV−
２およびHIV−３の溶解物の混合物から成ることができ
るし、または次のものから成ることもできる。

−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のコアタンパク質、
特にHIV−3 p25タンパク質と相同な各ウイルス型の主要
コアタンパク質。

−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のエンベロープ糖タ
ンパク質、特にHIV−3 gp120と相同な各ウイルス型の外
層膜エンベロープ糖タンパク質。

−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のコアタンパク質と
一緒のHIV−1,HIV−２およびHIV−３のエンベロープ糖
タンパク質、特に各ウイルス型の主要コアタンパク質と
一緒のHIV−3 gp120と相同な各ウイルス型の主要外層膜
エンベロープ糖タンパク質。

−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のコアタンパク質と
エンベロープタンパク質との組合せ、特にそれぞれHIV
−3 p25およびgp120タンパク質に相同であるもの、並び
にHIV−1,HIV−２およびHIV−３のpol遺伝子由来のタン
パク質、特にHIV−３のp31エンドヌクレアーゼタンパク
質に相同な各ウイルス型のタンパク質。

更に、本発明は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一バンドを提供する抗原に関し、前記抗原は、
精製されたHIV−３レトロウイルス抗原と共通した、抗
−HIV−３抗体を有する人の血清により認識されるエピ
トープを含んで成る。それらのエピトープに相当するア
ミノ酸配列は、分取用電気泳動またはアフィニティーク
ロマトグラフィーのいずれかにより個々のタンパク質を
単離し、そして完全タンパク質か、またはトリプシンも
しくはキモトリプシン消化により酵素的にまたは下記に
詳細に記載される方法により化学的に製造された断片の
いずれかのアミノ酸配列を決定することにより、容易に
決定され得る。得られたペプチドまたはポリペプチド
は、エドマン分解により連続的に配列決定され得る。従
って、本発明は、ウイルスから直接的に誘導されるか、
あるいは細菌発現ベクター中でまたは哺乳類もしくは昆
虫細胞中に挿入されたDNAの発現のためのウイルス発現
ベクター中でウイルスのcDNA断片をクローニングし、そ
して上記方法により発現されるタンパク質を精製するこ
とにより製造された、いずれかのタンパク質、糖タンパ
ク質またはペプチドに関する。更に、本発明は、メリフ
ィールド合成またはFmoc化学のいずれかにより製造され
た合成ペプチドにも関し、該ペプチドは次いで均質に精
製され得、そして生来のHIV−３抗原と共有するエピト
ープを配列中に含む。

ウイルスタンパク質とエピトープを共有する抗原は、
ウエスタンブロッティングまたは放射性免疫沈降のいず
れかにより、HIV−３で感染された個体の血清中に存在
する抗体との反応により容易に認識することができる。
ニトロセルロースに結合できない小さいペプチドの場合
には、ナイロン膜（Pall BiodyneまたはAmersham）に結
合させそして抗−HIV−３抗血清と該膜とを反応させる
ことにより、それらのペプチドを検出することができ
る。特に、本発明は、HIV−３コアタンパク質p12,p16お
よびp25のいずれかに含まれるかまたはポリペプチド鎖
の一部として該コアタンパク質の組合せに由来するエピ
トープを含有し得るタンパク質中に含まれる、エピトー
プに関する。更に本発明は、２つのHIV−３エンベロー
プ糖タンパク質gp41およびgp120のいずれか一方並びに
ポリペプチド鎖の一部としてHIV−３エンベロープ糖タ
ンパク質の組合せまたはHIV−３エンベロープ糖タンパ
ク質とHIV−３コアタンパク質との組合せに由来するエ
ピトープを含有するいずれかのタンパク質中に含まれる
エピトープに関する。本発明は、HIV−３タンパク質ま
たは糖タンパク質に由来するエピトープと共にHIV−１
および／またはHIV−２のタンパク質もしくは糖タンパ
ク質に由来するエピトープを単一のポリペプチド鎖の中
に組込む組換えDNA法により作製された発現ベクターに
より合成が指図されるようなポリペプチドに関する。そ
のような構成物の調製は、HIV−３並びにHIV−１および
HIV−２のcDNAから関連するコード領域を切り出し、そ
して必要なシグナル配列を有する発現ベクター中に挿入
された時にHIV−3,HIV−１およびHIV−２のエピトープ
を含むハイブリッドタンパク質の合成を指図するコード
配列を形成するように、同位相で該DNAを連結すること
を含んで成る。

更に、本発明は、特にHIV−３レトロウイルスにより
引き起こされる潜在的なまたは現存するARCまたはAIDS
の診断のために、生物学的液体におけるHIV−３レトロ
ウイルスに対する抗体の検出方法に関し、該方法は、診
断しようとする人の体液を、１種もしくは複数のHIV−
３タンパク質または糖タンパク質を含む組成物、該ウイ
ルスの溶解物、またはHIV−３に共通なエピトープを有
する抗原と接触させ、そして抗−HIV−３抗体と使用さ
れる抗原との間で形成される免疫複合体を検出すること
を特徴とする。

好ましい方法は、例えば、免疫蛍光アッセイまたは免
疫酵素アッセイを含む。

典型的には、免疫蛍光アッセイは、例えば、テストし
ようとする人の血清を、HIV−３で感染されそして冷ア
セトンで固定されそして透過性が上げられている細胞と
共にインキュベートすることを含む。形成された免疫複
合体は、ヒト免疫グロブリンと特異的に反応する抗体の
使用を含む、直接法または間接法を使って検出される。
検出は、蛍光標識、例えばフルオレセインまたはローダ
ミンと結合されている抗体を使用することにより達成さ
れる。

免疫酵素アッセイは、例えば次のようにして行うこと
ができる。

−本発明に従って言及される特定の質のHIV−３ウイ
ルス抽出物または組成物を、ミクロタイタープレートの
ウェル中に入れる。

−適当なインキュベーション時間の後、過剰の未結合
物質を洗浄により除去する。

−HIV−３の１種もしくは複数のタンパク質または糖
タンパク質に対して向けられた抗体の存在についてテス
トしようとする血清または他の体液の適当な希釈液を該
ウェルに導入する。

−結合反応が起こるのに必要な時間、ミクロタイター
プレートをインキュベートする。

−該プロートを徹底的に洗浄する。

−無色または殆ど無色の基質を高度に着色した生成物
に変換することができる酵素、限定的ではないが好まし
くは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼまたはβ−ガラクトシダーゼでラベル化されてお
り、そしてヒト免疫グロブリンと特異的に結合する抗体
を使って免疫複合体の存在を検出する。あるいは、検出
系として、適当な基質の存在下で光を放射する酵素を使
用することができる。

−形成される生成物の量を視覚的に、分光光度的にま
たは発光測定的に検出し、そして同様に処理された対照
と比較する。

使用することのできる他の検出系は、スタフィロコッ
カス・アウレウス（Staphylococcus aureus）CowanI株
から誘導されるプロテインＡ、Ｃ群のスタフィロコッカ
ス種（26RP66株）からのプロテインＧの使用に基づく
系、またはビオチン−アビジン結合反応を使用する系を
含む。

１種または複数のHIV−３抗原に対して向けられた抗
体の存在の他の免疫酵素学的検出方法は、ウエスタンブ
ロットである。該ウイルス抗原を電気泳動により分離
し、そしてニトロセルロース膜または他の適当な支持体
に移行させる。次いでテストしようとする体液を該膜と
接触させ、そして形成される免疫複合体の存在を既に記
載した方法により検出する。この方法の変形において
は、精製されたウイルス抗原を膜上に線またはスポット
として適用し、そして結合させる。次に、テストしよう
とする体液を膜とを接触させ、そして前記技術を使っ
て、形成される免疫複合体を検出する。

体液中の抗体の存在は、凝集反応により検出すること
もできる。１種または複数のHIV−３溶解物、本発明に
従って言及される抗原または精製抗原を使って、例えば
均一懸濁液を形成するラテックス粒子をコーティングす
る。存在する抗原に対する抗体を含む血清と混合する
と、該ラテックス粒子が凝集反応を引き起こし、そして
大きな凝集体の存在を視覚的に検出することができる。

本発明は、前記のようなラベル化されたHIV−３抽出
物または組成物にも関する。ラベルは、酵素的、化学
的、蛍光的または放射能的などのいずれのタイプのもの
でもあることができる。

更に、本発明は、体液中のHIV−３抗原の存在を検出
する方法に関する。該方法は、例えば次のようにして達
成され得る。

−HIV−３で感染されたヒトまたは前記のHIV−３溶解
物もしくは組成物で感染された動物のいずれかから誘導
された抗血清のIgG画分をミクロタイタープレートのウ
ェルに入れる。

−吸着させるのに適当な時間の後、過剰の未結合物質
を洗い流す。

−検出しようとする抗原を含む体液を該ウェルに入れ
る。

−結合が起こるのに適当な時間、該ミクロタイタープ
レートをインキュベートする。

−次いで適当な緩衝液で該プレートを徹底的に洗浄す
る。

−例えば、検出しようとする抗原に特異的であり、そ
して好ましくは前述の酵素のうちの１つでラベル化され
ている免疫グロブリンを使うことにより、直接または間
接的に、結合抗原の存在を検出する。

−存在する抗原の量を測定するために、適当な基質を
添加しそして反応の程度を対照と比較する。

また、本発明は、体液中の抗−HIV−３抗体の検出用
キットにも関し、該キットは、上記に言及したHIV−３
溶解物または組成物および形成される免疫複合体を検出
するための手段を含んで成る。

免疫酵素学的方法により特定の抗体を検出するために
考案されたキットの場合、そのようなキットは次のもの
を含むであろう。

−好ましくは精製された形であり、そして好ましくは
ミクロタイタープレートのような固体支持体に付着され
ている、前述のタイプのうちの１つの組成物またはHIV
−３溶解物。

−検出しようとする抗体と結合することができる酵素
と免疫グロブリン画分との接合体、または酵素と細菌性
プロテインＡもしくはプロテインＧとの接合体。

−いずれかのヒト免疫不全ウイルスと共有するエピト
ープを全く有さない対照抗原。

−アッセイを行うのに適当な緩衝液。

−適当な酵素基質。

ラベル化された抗原を使用する特定の抗原の検出のた
めのキットは次のものを含むであろう。

−適当にラベル化された前述の抗原または抗原の組合
せ。

−好ましくは不溶性支持体に結合されたプロテインＡ
または抗−ヒト免疫グロブリン、例えばプロテインＡ−
セファロース4B（Pharmacia）または同等の支持体。

−抗−HIV−３抗血清により認識されない対照抗原。

−アッセイを行うのに適当な緩衝液。

−適当であれば、酵素ラベル化された抗原の検出のた
めの基質。

本発明は更に、生物学的液体中のHIV−３抗原の検出
のために開発されたキットに関し、該キットは次のもの
を含んで成る。

−好ましくはミクロタイタープレートのような固体支
持体に結合された、抗−HIV−３免疫グロブリン。

−酵素と接合された抗−HIV−３免疫グロブリン。

−抗−HIV−３免疫グロブリンにより認識されない負
の対照の抗原。

−前述のHIV−３抗原のうちの１つまたは組成物から
なる正の対照の抗原。

−テストを行うのに適当な緩衝液。

−結合酵素の検出のための適当な基質。

更に、本発明は、HIV−３レトロウイルスのエンベロ
ープ糖タンパク質、特にgp41もしくはgp120、または前
記糖タンパク質の一部分と共に、HIV−３に対して有効
なワクチンの作製に適切な医薬上許容される賦形剤を含
有する免疫学的組成物に関する。加えて本発明は、HIV
−３レトロウイルスの主力のタンパク質の全体または部
分を配列中に含有するいずれかのペプチドまたはポリペ
プチド、並びにペプチドの一般的な免疫学的性質に影響
を及ぼさないようなアミノ酸の付加、置換または欠失か
ら生ずるペプチドにも関する。

本発明は更に、HIV−３抗原または上記に定義された
組成物中に含まれるエピトープを認識する能力により特
徴づけられるモノクローナル抗体、および特に、前記抗
原に対して特異的に生起されそして典型的な技術により
生産されるモノクローナル抗体に関する。本発明は、HI
V−３で感染された人から誘導されたＢ細胞を、例えば
エプスタイン−バー（Epstein−Barr）ウイルスを用い
てＢ細胞を形質転換せしめそして形質転換体をサブクロ
ーニングすることによって不死化することにより、製造
されるヒト起源のモノクローナル抗体にも関する。

本発明は同様に、１種または複数のHIV−３抗原を認
識し、そして精製されたHIV−３またはHIV−３抗原もし
くは抗原の組合せで、特にHIV−３のタンパク質または
糖タンパク質で、動物を感染させることにより製造され
るポリクローナル抗血清の製造方法にも関する。

ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、HIV−
３感染力の中和、生物学的液体または感染細胞中のHIV
−３抗原の検出、およびHIV−３タンパク質または糖タ
ンパク質抗原の精製を含む、広範な目的で使用され得
る。

本発明は、更に、HIV−３レトロウイルスのRNAまたは
このウイルスの変異体のRNAから少なくとも部分的に誘
導され、所望によりラベル化された核酸に関する。

本発明は、cDNAもしくはcDNAの一部またはそれらを含
む組換え体の用途にも関する。それらは、HIV−３レト
ロウイルスの完全ゲノムRNAに対応するcDNAの少なくと
も一部分を含むことを特徴とする。それらのcDNAは、生
物学的液体、組織および細胞におけるHIV−３配列の特
異的検出のためのプローブとして使用することができ
る。該プローブは、好ましくは、放射能的または化学的
にラベル化されるか、あるいは該プローブを検出可能に
する酵素、蛍光または化学発光ラベルを使ってラベル化
される。HIV−３の特異的検出またはHIV−３感染の診断
のための好ましいプローブは、HIV−３ゲノムに相補的
なcDNAの全部または部分を含むプローブである。このよ
うな情況において、特に有利なプローブは、特にクロー
ンiso 70−11中に含まれる核酸配列を含み、そしてウイ
ルスゲノムRNAの５′末端と３′末端の両方および組込
まれるプロウイルスDNAの５′末端と３′末端の両方に
位置するウイルスLTR−Ｒ配列を含むものとして特徴づ
けることができる。

それにもかかわらず、HIV−３感染の診断に利用でき
るプローブが前述のプローブに決して限定されないこ
と、そして本発明が、HIV−３ゲノムまたはそれの天然
に存在する変異体に由来し、そしてウイルスコアタンパ
ク質をコードする配列（gag遺伝子）、２つの形の逆転
写酵素およびエンドヌクレアーゼをコードする配列（po
l遺伝子）、並びに２つのウイルスエンベロープ糖タン
パク質をコードする配列（env遺伝子）を含む、全ての
配列を包含することが理解される。

本発明は、ベクター由来の核酸を含んで成りそして前
記cDNAまたは前記cDNAの部分が挿入される組換え核酸中
に組み込まれている、HIV−３核酸配列にも関する。そ
のような構成物は、診断目的で使用するのに充分な量の
プローブを提供するために、ウイルスcDNAまたはその断
片を天然宿主以外の生物または細胞中で複製するために
使用することができる。

そのような方法で作製されるプローブは、HIV−３の
特異的検出のための診断テストにおいて使用され得、該
診断テストは次のような本質的な段階を含んで成る。

−前述の方法により上記のようにして作製されたプロ
ーブをラベル化する段階。

−一度感染細胞からのDNAまたは感染細胞もしくは生
物学的液体からのウイルスRNAを、好ましくは膜に適用
しそして該プローブに接近しやすくした後、該プローブ
を緊縮ハイブリダイゼーション条件下で前記DNAまたはR
NAと接触させる段階。

−緊縮条件が維持される環境下で該膜を緩衝液で洗浄
する段階。

−該プローブが放射能ラベル化されている場合にはオ
ートラジオグラフィーにより、または該プローブが化学
的にラベル化されている場合には適当な免疫検出技術に
より、ラベル化されたプローブを検出する段階。

本発明は更に、HIV−３レトロウイルスの製造方法に
関し、該方法は、予めHIV−３レトロウイルスの単離物
で感染されているリンパ球または細胞と共に、T4⁺表現
型を有する白血病細胞起源のヒトリンパ球細胞系または
ヒトT4リンパ球を培養し、そして培地から該レトロウイ
ルスを回収しそして精製することを特徴とする。

本発明は、HIV−３レトロウイルスの抗原の製造方法
にも関し、該方法は、好ましくは洗剤により該レトロウ
イルスを溶解し、そして前記抗原を含有する溶解物を回
収することを特徴とする。

加えて本発明は、上記で定義されたHIV−３タンパク
質または糖タンパク質p12,p16,p25,p31,gp41,gp120もし
くは逆転写酵素のいずれか、またはそれらの部分の製造
方法に関し、該方法は、前記タンパク質または糖タンパ
ク質をコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、前記
ベクターを用いて宿主を形質転換せしめ、形質転換され
た宿主を培養し、そして発現されたタンパク質を回収し
そして精製することを特徴とする。この方法は、融合タ
ンパク質の合成を指図してもしなくてもよいベクターを
含み、そして細菌発現ベクター、哺乳類発現ベクター、
例えばワクシニアベクター、および昆虫細胞中でのクロ
ーン化された遺伝子の発現のためのバクロウイルスをベ
ースとしたベクターを含むがこれに限定されない。

実施例材料および方法ウイルスおよび細胞培養 a.ウイルス株および細胞系 J.Levy,サンフランシスコ、U.S.A.（20）により最初
に単離された、ARV−４（HIV−1 SF4）で慢性的に感染
されたHUT−78細胞および未感染のHUT−78細胞は、S.Sp
recher,ブリュッセル、ベルギー、により提供された。
L.Montagnier,パリ、から最初に単離されたLAV−2rod、
およびCEM細胞はJ.De Smeyter,ロービン、ベルギーから
得られた。HIV−２単離物である単離物53は本発明者ら
の研究室において単離された（21）。

b.ウイルスの単離ウイルスの単離は、LevyおよびShimabukuro（22）に
より記載されたものと同様の方法において変更を伴って
行われた。患者および健康な提供者からのリンパ球を、
Lymphoprep（Nyegaard and Co.,オスロ、ノルウェー）
上でヘパリン処理された全血を単離し、そして20mM HEP
ES、15％ウシ胎児血清（Gibco）、5g/mlヒドロコルチゾ
ン（Merck）、75U/ml IL−２および2g/mlポリブレン（A
ldrich）を含むRPMI 1640培地中で培養した。

健康な提供者からのリンパ球を2g/mlのフィトヘマグ
ルチニン（PHA,Wellcome）で使用前の３日間刺激した。
PHAで刺激された新鮮なリンパ球を、３〜４日毎にウイ
ルス単離培養物に添加した。培養物を、細胞変性効果、
広域特異性のポリクローナル対照抗血清（23）を利用し
た免疫蛍光検査法、および細胞上清中の抗原の存在（In
otecto VCA−HIV,Innogenetics）についてモニターし
た。使用する広域特異性の対照（BSR）抗血清は、HIV−
１感染された提供者から誘導され、そして非常に高い力
価（組換えHIV−1 p24タンパク質に基づくエンザイムイ
ムノアッセイにおいて≧1,000,000）を有し、そして他
のHIV型、特にHIV−２のgagおよびpol遺伝子産物と強く
交差反応することが実験的に示された。本質的には（2
4）に記載のようにして逆転写酵素もアッセイされた。

慢性的に感染された永久細胞系を確立するために、ウ
イルスで感染された一次リンパ球を、N.山本、山口県、
日本により提供されたMolt−４クローン８細胞（25）と
共に同時培養し、そして細胞増殖についてモニターし
た。逆転写酵素アッセイおよび抗原捕捉により、ウイル
ス生産をモニターした。

示差的抗原捕捉 HIV−１と他のヒト免疫不全ウイルスとの間に区別を
つけることができることにより、テスト系を開発した。
この系は、１つは特に主要コアタンパク質に対する非常
に高い力価のために広範な抗−HIV特異性を有するもの
であり、もう１つはHIV−１と優勢的に反応する低力価
のものである、２つの異なるポリクローナルIgG調製物
の、培養上清中の洗剤処理ウイルスを捕捉する能力の比
較に基づく、捕捉される抗原の検出は、（広域特異性Ig
G）／西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体を使って達成
される。

該テストは、排他的ではないが主として、p24コアタ
ンパク質を検出する。

HIV−１に対するモノクローナル抗体使用するモノクローナル抗体のパネルは（26）に記載
されている。この抗体は、Triton X−100で破壊されたH
IV−１調製物中の生来のウイルスタンパク質に対して調
製された。

タンパク質分析 a.電気泳動ウイルスタンパク質のポリアクリルアミド電気泳動
は、本質的にはMaizel（27）により記載されたようにし
て行った。

b.タンパク質ブロッティング Dunn（28）により記載された炭酸塩緩衝液を使ってBi
o−Rad社のトランスブロットセル中400mAで４時間ブロ
ッティングを行うか、またはLKB半乾燥ブロッティング
装置を使って48mM Tris、39mMグリシン、0.0375％ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）および20％メタノール中で
0.8mA/cm²で１時間ブロッティングを行った。

c.部分分解生成物の生成第１図に示される技術によりウイルスタンパク質を分
析した。種々の単離物からの対応するタンパク質が類似
した分子量を有するという事実の利点を使った。12.5％
SDS−ポリアクリルアミドゲル上で、ARV−４タンパク質
のマーカーレーンと共にタンパク質を分離し、これを電
気泳動後に切り取り、ブロットし、そして抗−HIV抗血
清と共にインキュベートし、ウイルスタンパク質の位置
を明らかにした。マーカーブロットは、ウイルスタンパ
ク質のゲルのクーマシーブルー染色部分において開裂す
べき適当な位置を決定するために使用した。タンパク質
を含む水平ゲル断片を切り取り、ガラスチューブに移
し、そして化学的開裂にかけた。

1.臭化シアン開裂ゲル切片を、新しく調製した0.3N HCl中のCNBr（Merc
k社）の40mg/ml溶液10mlと共にヒュームフード中で室温
で３時間インキュベートした。インキュベーション後、
二次元電気泳動用のSDS試験緩衝液中でゲル切片を平衡
化した。

2.BNPS−スカトール（Skatole）開裂ゲル切片を、70％酢酸、0.1％フェノール含有30％H₂O
中の２−（２′−ニトロフェニルスルフェニル）−３−
メチル−３′−ブロモインドリニン（BNPS−スカトー
ル、Pierce）の調製したばかりの飽和溶液10mlと共に、
遮光下で室温にて３時間インキュベートした。インキュ
ベーション後、ゲル切片をSDS−電気泳動用試料緩衝液
中で繰返し洗浄することにより平衡化した。

開裂後、個々のレーンをゲル切片から切り取り、90°
回転し、そして10−20％ SDS−ポリアクリルアミド勾配
ゲルの頂部に置いた。電気泳動の終了と同時に、該ゲル
をニトロセルロース（Schleicher and Schuell）上にブ
ロッティングし、そして1mg/mlカゼイン（Merck）を含
むPBSでブロックした。低分子量を有するペプチドはニ
トロセルロースに効率的に結合しないので、10kDを超え
る分子量を有する開裂生成物のみが検出できる。ブロッ
トを広域スペクトル抗−HIV抗血清に続いて抗−ヒトIg
G:アルカリホスファターゼ接合体（Promega）と共にイ
ンキュベートした。次いで５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェートおよびニトロブル−エトラゾ
リウム（Sigma）との反応により、部分的開裂生成物を
可視化した。

ウイルス核酸 a.ウイルスRNAへのハイブリダイゼーション４℃にて26,500rpmでの1.5時間の遠心により20％ショ
糖クッションを通してペレット化することにより、培養
上清からウイルスを収得し、そして0.5％ドデシル硫酸
ナトリウムを含む10mMトリス（pH7.4）、10mM NaCl、10
mM EDTA中で破壊した。破壊されたウイルスのアリコー
トを、もとの培養上清5,2.5,1.25および0.62mlに相当す
る量でHybond H（Amersham）膜上にスポットした。紫外
線光での２時間の照射により、フィルター上に置かれた
RNAを膜に固定した。次いで該フィルターに結合されたR
NAを³²P−dCTPを用いたニックトランスレーションによ
りラベル化されているHIV−1cDNAプローブとハイブリダ
イズせしめた。ハイブリダイゼーションは、緊縮条件下
において３×SSC、0.5％粉乳、１％SDS、10％硫酸デキ
ストランおよび50％ホルムアミド中で42℃にて18時間行
った。ハイブリダイゼーション後、フィルターを緊縮条
件下0.1×SSCおよび0.1％ SDS中で30分間洗浄した。映
像強化膜を用いた−70℃でのオートラジオグラフィーに
よりハイブリダイゼーションを検出した。ハイブリダイ
ゼーションは、HIV−２のenv領域から誘導されたプロー
ブを使って同様に行われた。

また、非緊縮条件下で５×SSC、25％ホルムアミド、
５×Denhardts溶液、10％硫酸デキストランおよび100mg
/ml変性サケ精子DNA中で37℃にて一晩ハイブリダイゼー
ションを行った。フィルターを５×SSC、0.1％ SDS中で
室温にて15分間４回連続して洗浄し、そしてオートラジ
オグラフィーを行った。

b.ANT 70 cDNAの調製ポリエチレングリコール6000を使って培養上清１か
らウイルスをペレット化し、PBS中に再溶解し、そして2
0％ショ糖クッションを通してペレット化した。得られ
たウイルスのペレットを、20mMジチオトレイトールおよ
び0.5％ NP−40を含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
6.5）中の6M塩酸グアニジン中で破壊した。固体のCsCl
を２モルの濃度に添加した。破壊されたウイルスを含む
溶液を、0.1M EDTAを含む5.7M CsClのクッション上に重
層して、そしてBeckman SW28ローター中15℃にて25,000
rpmで20分間遠心することによりウイルスRNAをペレット
化した。遠心後、該RNAを再溶解し、フェノールで抽出
し、そしてエタノールと2M LiClで沈澱させた。

調製したウイルスRNAの1/5を、Amersham社により提供
されたキットを使用するcDNAの合成を第一段階を指図す
るのに使った。cDNA合成はオリゴ（dT）を使って開始さ
れた。合成は、該キットにより供給される逆転写酵素を
使って行われた。第二鎖の合成は、RNA/DNAハイブリッ
ドのRNA鎖を消化して除去するためにRNase Hの存在下に
おいてE.コリDNAポリメラーゼＩを使って行われた。第
二鎖の合成は、cDNAをラベル化するために³²P−dCTPの
存在下で行われた。得られたcDNAをT4 DNAポリメラーゼ
で処理して平滑末端を作製し、cDNAをメチル化して潜在
的な内部のEcoRI開裂部位を保護し、次いでEcoRIリンカ
ーと連結せしめた。該リンカー中のEcoRI部位を開裂せ
しめ、そしてcDNAを1.2％アガロースゲル上でサイズ分
離した。500〜2000塩基対のcDNA長さに相当するゲルの
部分を切り取り、cDNAを溶出させ、そして予めEcoRIで
開裂されそして脱リン酸化されているpUC 13ベクター中
でクローニングした。連結後、該DNAを使ってE.コリMC
1016（ラムダ）のコンピテント細胞を形質転換せしめ
た。生成したコロニーをPall膜フィルター（Pall Biody
ne）に移行せしめ、1.5M NaCl,0.5M NaOHで溶解および
変性せしめ、そして3M NaOAc（pH5.5）で中和した。HIV
−３の挿入断片を含有しているコロニーのスクリーニン
グは、適度な緊縮条件下で５×SSC、５×Denhardts溶
液、0.2％ SDS、250mg/ml変性サケ精子DNA中65℃での一
晩のハイブリダイゼーションにより行った。ハイブリダ
イゼーションはHIV−１のSacI−EcoRI断片を使って行っ
た。ハイブリダイゼーション後、フィルターを次の順序
で洗浄した。

1.2×SSC,0.1％ SDS中室温で１時間。

2.0.1×SSC,0.1％ SDS中室温で30分間。

3.2×SSC,0.1 SDS中42℃で20分間。

4.0.1×SSC,0.1％ SDS中42℃で20分間。

洗浄後、映像強化膜を使って−70℃にて該フィルター
をオートラジオグラフィー処理した。

HIV−１およびHIV−２プローブの非緊縮ハイブリダイ
ゼーションに使われた非緊縮条件下においてもハイブリ
ダイゼーションを行った。

c.cDNAクローンの分析陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与えるコロ
ニーを分析のために増殖させた。プラスミドを単離し、
EcoRIで開裂せしめ、そしてアガロースゲル電気泳動に
かけ、挿入断片の存在を確認しそしてそのサイズを決定
した。分析した96のコロニーのうち17個が挿入断片を含
むことがわかった。更なる分析のために５個のコロニー
を取り、そして約800〜1600塩基対の長さでサイズが異
なっていた。

d.配列決定ヌクレオチド配列決定は、Sangerのジデオキシヌクレ
オチド法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467,197
7）に従って、Boehringer社により供給されたキットを
使って行われた。配列決定は17−マーのM13プライマー
を使って行われた。

e.HIV−１およびHIV−２ウイルスRNAへのANT 70 cDNAの
ハイブリダイゼーション最大の挿入断片（iso 70−11）を含むANT 70 cDNAク
ローンを、ウイルスRNAが置かれているフィルターへの
ハイブリダイゼーションに使用した。

ハイブリダイゼーションは緊縮条件下３×SSC、0.5％
粉乳、１％ SDS、10％硫酸デキストランおよび50％ホル
ムアミド中で42℃にて18時間行った。ハイブリダイゼー
ション後、フィルターを0.1×SSC,0.1％ SDS中で65℃に
て洗浄し（２−30分間洗浄）、その後映像強化膜を用い
て、−70℃にて該フィルターをオートラジオグラフィー
処理した。

結果ウイルスの単離 HIVの異性間伝染に関する継続研究の一部として、カ
メルーン人女性と彼女の夫の血液からウイルスの単離を
行った。前記のように、単離された２つの株をそれぞれ
HIV−３（ANT 70）（女性）およびHIV−３（ANT 70 N
A）（男性）と命名する。便宜上、短縮された名称ANT 7
0およびANT 70 NAも使用される。この女性は、全身性リ
ンパ節疾患を有するHIV−血清陽性の男性の配偶者であ
る。この女性の血清は、エンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイ（EIA,Organon Teknika）において中程
度に陽性（O.D./カットオフの比が4.5）であり、HIV−
１についての免疫蛍光抗体アッセイにおいては低い力価
（1/40）を有していたが、HIV−１ウエスタンブロット
アッセイにおいてp33,p53/55およびp64の所に明確なバ
ンドを有し、p24,gp41およびgp120の所にごく弱いバン
ドを有するという不明瞭な結果を与えた。この女性は、
上昇した血清IgGおよびIgMレベル並びに0.46のCD4/CD8
比を有していた。この女性のリンパ球と健康な未感染の
提供社からのPHAで刺激されたリンパ球との同時培養に
よりウイルスが単離された。培養52日後、融合細胞の存
在により、および実験対照抗−HIV抗血清を培養液から
のアセトン固定化細胞と共にインキュベートした時に観
察される陽性の免疫蛍光を基にして、培養液中のウイル
スが検出された。培養上清中の逆転写酵素の存在も検出
された（10⁴cpm/ml、27×バックグラウンド）。無細胞
の培養上清を使ってウイルスを新鮮なリンパ球において
継代培養した。15日後、再びCPEが観察されそして上清
中の逆転写酵素が検出された。しかしながら、この単離
物（ANT 70）の洗剤処理された培養上清と別の単離物と
の示差的抗原捕捉による比較は、この単離物が、HIV−
１ではないことを示した。

それらの結果は第２図に例証される。単離物（ANT 7
0）は、別の単離物と異なり、HIV−１特異的IgGにより
ほとんど認識されないが、別の単離物と同様に、広域特
異性IgG（パネルＦ）により容易に認識されたことが低
いO.D.値により明白である。HIV−１特異的MAb（CLB MA
b 14）を使ってHIV−１株であることがその後示された
別の単離物は全て、広域特異性対照IgGでコーティング
されたプレートよりも、特異的IgGでコーティングされ
たプレートにおいて高いO.D.値を与えた。

単離物（ANT 70）で感染された一次リンパ球とMolt−
４クローン８細胞とを同時培養することによる永久細胞
系に該ウイルスを転移させる試みを行った。感染の初期
において、融合細胞形成および細胞死を伴う大規模な細
胞変性効果が観察された。数週間以内に細胞増殖が検出
された。該細胞は、広域スペクトル抗−HIV抗血清を使
ってテストすると陽性の免疫蛍光を与え、培養上清にお
いて抗原および逆転写酵素の存在が容易に検出可能であ
った。

単離物（ANT 70）が単離された女性の夫からも同様に
ウイルスが単離された（ANT 70 NA株）。この男性はリ
ンパ節疾患にかかっており、そしてCDC分類方式に従っ
てクラス３として分類された。この男性も、上昇した血
清IgMおよびIgGレベル並びに0.4のCD4/CD8比を有してい
た。18日目の培養の上清にウイルスが検出された。この
ウイルスを含む洗剤処理された上清を示差的抗原捕捉に
より分析すると、単離物（ANT 70）と同様な形式で反応
することがわかった（第３図）この単離物から誘導され
た抗原の結合は、同様に、広域特異性IgGよりもHIV−１
特異的IgGの方がより少なかった。

単離物（ANT 70 NA）が得られた人の血清を、HIV−１
およびHIV−２ウエスタンブロットストリップ（Biotec
h）と共にインキュベートした。更にHIV−２（単離物5
3）が単離された人の血清とおよびHIV−１で感染された
提供者の血清とストリップをインキュベートした。その
結果は第４図に示される。ANT 70 NAで感染された人の
血清は、エンベロープタンパク質を含む実質上全てのタ
ンパク質と有意な程度に交差反応した。対して、HIV−
２で感染された個体の血清は、gag p24タンパク質、p34
エンドヌクレアーゼおよびp68逆転写酵素とのみ交差反
応した。抗−HIV−１血清はHIV−２のp26 gagタンパク
質のみを認識するが、一方ANT 70 NA保持者の血清はこ
のタンパク質とHIV−２の逆転写酵素を認識する。

ウイルスタンパク質の特徴づけ培養上清中のウイルスをポリエチレングリコール6000
（Merck）で沈澱させ、そして得られた材料を再び溶解
し、15％ショ糖クッションを通してペレット化した。ペ
レット化されたウイルスをSDS−試料緩衝液中に溶解
し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動に続きタン
パク質ブロッティングにより分析した。第５図に示され
るようなブロットを広域特異性抗−HIV血清と共にイン
キュベートし、ウイルスタンパク質を明らかにした。

HIV−１ウイルスタンパク質の全てと反応することに
加えて、BSR抗血清はHIV−２のgagおよびpol遺伝子産物
とも交差反応する。この抗血清は、その上ANT 70のgag
およびpol遺伝子産物を明らかに認識する。ANT 70の遺
伝子産物の分子量がHIV−１またはHIV−２のいずれのも
のとも異なることは明らかである。種々のウイルスタン
パク質の分子量は第１表に要約される。HIV−１のp17/p
18タンパク質における変動性は、幾つかの株においてHI
V−1 HXB2配列中の120位と121位との間に存在する６ア
ミノ酸の挿入のためである。ANT 70およびANT 70 NAの
全てのタンパク質の分子量がANT 70のものに等しい。

HIV−1,HIV−２およびANT 70の間の抗原の関連性を更
に研究するために、アフリカ人およびヨーロッパ人に抗
−HIV−１血清のシリーズを、1:1000に希釈しそしてこ
れを使って抗原捕捉のためにミクロタイタープレートを
コーティングした。HIV−1,ANT 70,HIV−２（LAV 2ro
d）およびHIV−２（単離物53）を含有する洗剤処理され
た培養上清を希釈し、そして４種の異なる単離物を捕捉
する各抗血清の能力を分析した。代表的な結果は第７図
に示される。この実験から、HIV−１を捕捉する種々の
血清の能力は、HIV−２またはANT 70のいずれかを捕捉
する能力と全く無関係であることが理解できる。対し
て、LAV−2rod、即ち原型HIV−２株を捕捉するそれらの
血清の能力は、同様にHIV−２株であるが独立した単離
物である単離物53を捕捉する血清の能力と非常に相互関
係がある。これらのデータは、ANT 70がHIV−１でもHIV
−２でもないことを示している。一連の関連抗原の捕捉
実験において、IgGを様々な希釈度でコーティングした
時にHIV−1,ANT 70,HIV−２（LAV−2rod）およびHIV−
２（単離物53）を結合する能力に近づくために、４人の
アフリカ人の抗−HIV−１血清を選択した。第８図のパ
ネルＢにおいて使用したIgGでコーティングされたプレ
ート上で捕捉された時とほぼ同じ光学濃度を与えるよう
に、培養上清を希釈した。４つの血清の希釈液をコーテ
ィングし、そしてウイルス含有上清を添加した。同類の
ウイルスは同様な力価曲線を生ずるという仮定がなされ
た。実際、第５図において、LAV−2rodと単離物53は共
に、コーティングされたIgGと同様に反応した。他方、A
NT 70は、HIV−２単離物のいずれよりも高いIgG希釈度
においてより強いシグナルを与え、そしてANT 70につい
て得られた曲線の形状はHIV−１について得られた曲線
と非常によく近似していた。ただし、光学濃度は一貫し
て低かった。

HIV−１のp24コアタンパク質に対して向けられたマウス
モノクローナル抗体の交差反応性 HIV−１のp24コアタンパク質に対して調整されたマウ
スモノクローナル抗体（MAb）のパネルを、ANT 70およ
びHIV−２単離物と交差反応する能力についてテストし
た。理論上は、該シリーズがHIV−1 p24分子上の異なる
エピトープと反応するモノクローナル抗体を含む限り、
いずれのパネルの抗−HIV−1 p24モノクローナル抗体で
も使用できる。該抗体を含有する腹水を希釈し、そして
これを使ってイクロウェルプレートをコーティングし
た。コーティングされたウェルに洗剤処理されたウイル
スを含有上清を添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼ
と接合されたBSR−HIV IgGを使って、結合抗原を検出し
た。結果は第９図に示される。

ポリクローナル広域スペクトルIgGでコーティングさ
れた対照ウェルにおいては、全てのウイルス含有上清が
ミクロタイタープレートリーダーの限界を超える光学濃
度を与えた。しかしながら、種々のモノクローナル抗体
でコーティングされたウェルにおいてテストすると、全
く異なるパターンが現われた。前の研究は、同一エピト
ープを認識することが示されているMAb CLB 59およびCL
B 21を除き、テストされた全てのMAbがp24分子上の異な
るエピトープを認識することを示した。前記２つのMAb
は両方とも予想通りHIV−１と強く反応し、そしてANT 7
0とも測定可能なシグナルを与えるが、２つのHIV−２株
のいずれとも反応しない。他の２つのMAb CLB 64および
CL 14はHIV−１と良好に結合し、そしてANT 70に対して
も２つのHIV−２単離物に対しても弱い親和性を示し
た。特に、MAb CLB 14は全てのHIV−１単離物を良好に
認識することが示された（テストされたものの＞15
0）。従って、このMAbは名残りが他のヒト免疫不全ウイ
ルスにおいても検出され得る非常に高度に保存されたエ
ピトープと結合するに違いない。p24に対する別のMAb
（CLB 16,47および19.7）およびHIV−1 p18タンパク質
に対して生じた別の２つのMAb（CLB 13.4およびCLB 13.
6）は、ANT 70または２つのHIV−２単離物のいずれも認
識できなかったが、対応するHIV−１抗原を捕捉した。

ウイルスタンパク質とヒト抗−HIV抗血清との反応 HIV−１（ARV−４）,ANT 70およびHIV−２（LAV−2ro
d）からのウイルスタンパク質のタンパク質ブロット
を、洗剤で溶解された抽出物の電気泳動後に調製し、そ
して種々のヒト血清と共にインキュベートした（第10
図）。パネルＡは、広域特異性の実験対照血清と３種の
ウイルス単離物との反応を示す。パネルＢでは、該ブロ
ットを抗−HIV−１抗血清と共にインキュベートし、優
勢的にHIV−１タンパク質を認識することを示す。ANT 7
0が単離された女性の血清（パネルＣ）およびANT 70 NA
が単離された彼女の夫の血清（パネルＤ）を、別のウイ
ルス単離物を認識する能力についてテストした。それら
の血清は両方とも、このウイルスのgp120エンベロープ
タンパク質を含むANT 70を優勢的に認識する。彼女の夫
の血清は、ANT 70が単離された女性の血清よりも高い力
価を有しており、HIV−１のgp41を認識する。それらの
血清は両方とも、HIV−１またはHIV−２単離物よりもAN
T 70に対してより高い親和性を有する。対して、HIV−
２単離物53が単離された人の血清はHIV−２タンパク質
を優勢的に結合し、そしてこのウイルスのHIV−2 gp120
エンベロープタンパク質およびgp41膜透過タンパク質を
認識する（パネルＥ）。それはHIV−１またはANT 70の
糖タンパク質とは反応しない。それらの結果は、ANT 70
がHIV−１ともHIV−２とも異なることを更に指摘する。
コートされたウイルスタンパク質を使った抗−HIV−
１、抗−ANT 70および抗−HIV−２血清の力価測定を使
ったエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイは、
HIV−１（ARV−４）,ANT 70およびHIV−２（単離物53）
のウイルス溶解物でコーティングされたミクロタイター
プレート中で行われた。1:100の初期希釈度で始まる各
血清の倍々希釈度を、コーティングされた抗原を結合す
る能力についてテストした。西洋ワサビペルオキシダー
ゼでラベル化されたヤギの抗−ヒトIgG接合体を使っ
て、結合抗体を検出した。それらの結果を第11図に示
す。抗−HIV血清はHIV−１タンパク質を優勢的に認識し
たが、ANT 70タンパク質とも有意な量の交差反応を示し
た。HIV−２タンパク質はわずかに検出された。対し
て、抗−ANT 70血清はANT 70タンパク質を優勢的に認識
し、HIV−１タンパク質に対して交差反応性を示し、そ
して高い光学濃度値が得られたことにより証明されるよ
うに、抗−HIV−１血清よりも抗−ANT 70血清は、HIV−
２でコーティングされたウェルと良好に反応した。抗−
HIV−２血清は非常に低い力価を有するが、それにもか
かわらずHIV−２タンパク質とは最も良く反応した。HIV
−１またはANT 70でコートされたウェルにおいては、全
く検出可能なシグナルが観察されなかった。この場合に
交差反応を検出できないのは、この血清の低い抗−HIV
力価に確実に関連する。

ウイルスタンパク質の部分的化学的開裂生成物の分析化学的開裂のために使用する２つの試薬、臭化シアン
とBNPS−スカトールは、それぞれメチオニン（29）とト
リプトファン（30）に対する高特異性のために選択され
た。これら２つのアミノ酸は疎水性であり、従ってタン
パク質分子の外面上のエピトープにはおそらくないと思
われる（31）。HIV−１（32−36）,HIV−２（19）,SIVa
gm（10）,SIVmac（９）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIA
V,37）およびVisna（38）のgagおよびpol遺伝子産物の
公表されたアミノ酸配列の調査により、幾つかの異なる
単離物間ではほとんどアミノ酸の相同性がないけれど
も、それらのタンパク質中のメチオニン残基の位置の多
く、およびより大部分はトリプトファン残基の位置が、
著しく保存されていることが明らかになった（第12
図）。更に、それらの残基における種間変異は、少なく
ともHIV−１（36）の場合には、最小であるか又は全く
無く、そしておそらくヒトおよびシミアン免疫不全レト
ロウイルスの全てについて当てはまるであろう。

HIV−1,ANT 70,HIV−２（LAV−2rod）およびHIV−２
（単離物53）のgagおよびpol遺伝子産物の部分消化パタ
ーンを第13図に示す。４つの単離物からのp24タンパク
質のCNBr開裂パターンの調査は、HIV−２（LAV−2rod）
およびHIV−２（単離物53）について生じるパターンが
等しいことを示す。しかしながら、HIV−１およびANT 7
0については異なるパターンが観察される。従って、HIV
−1,ANT 70およびHIV−２の主要コアタンパク質中のメ
チオニン残基の位置には有意な差がある。p17コアタン
パク質の場合には、２つのHIV−２単離物の間に相違が
観察される。HIV−2rodの公表された配列の調査は、こ
のタンパク質のカルボキシル末端から18番目のアミノ酸
にメチオニンが位置することを示す。本発明者らは、こ
のメチオニンが単離物53の対応するタンパク質中に欠け
ているに違いないと推断する。開裂パターンから、ANT
70からのp16タンパク質の一端に近いメチオニン（10−1
5番目のアミノ酸）の存在を推論することも可能であ
る。レトロウイルス逆転写酵素のCNBr開裂は、２つのHI
V−２単離物からのタンパク質が同じであり、一方HIV−
１およびANT 70のタンパク質については異なるパターン
が観察されることを示す。pol遺伝子の３′−部分に由
来するp31エンドヌクレアーゼの場合は、幾つかの小さ
い差は明らかであるけれども、単離物全ての間に類似性
が推定され得る。

４つの単離物からのp24タンパク質のBNPS−スカトー
ル開裂は、著しく類似したパターンを生じた。このタン
パク質中のトリプトファンの位置は、特にヒトおよびシ
ミアン起源のレトロウイルスについて非常に高度に保存
されているので、これは予想されることであることが第
８図から明らかである。本発明者らは、ANT 70のp25タ
ンパク質中のトリプトファン位置もこのパターンに従う
と推断する。しかしながら、パターンの調査により、該
パターンの全体の外観においてでなく、むしろ開裂によ
り生じるものの見かけ分子量において小さい差が観察さ
れ得ることがわかる。特に、各パターンの中央のスポッ
トの見かけ分子量において差が検出され、予想通り、HI
V−２（LAV−2rod）とHIV−２（単離物53）についての
パターンは等しい。しかしながら、ANT 70についてのパ
ターンの中央のスポットは大きい見かけ分子量を有する
一方、HIV−１（ARV−４）についての中央のスポットは
より小さい見かけ分子量を有する。p16に関しては、ANT
70タンパク質中のトリプトファンの位置は、HIV−２タ
ンパク質において見つかるトリプトファンの位置とより
密接に似ていると思われる。HIV−1 p17は、該タンパク
質のアミノ末端から16番目のアミノ酸に位置するトリプ
トファンを有し、そしてBNPS−スカトール開裂後のANT
70およびHIV−２のパターンにおいて認められない追加
のスポットを生ずる。HIV−1 p17配列中の36位のものと
対応するトリプトファンは、全ての単離物において保存
されている。

４つの単離物からの逆転写酵素の開裂により生じるパ
ターンは複雑であるが、２つのHIV−２単離物が等しい
ことは明らかである。ANT 70について得られるパターン
HIV−１について得られるパターンともHIV−２のパター
ンとも対応しない。p31エンドヌクレアーゼの開裂生成
物の見かけ分子量の差も観察されるが、HIV−1,ANT 70
およびHIV−２からの対応するタンパク質から生じるパ
ターンもまた、保存された構造を支持する共通の特徴を
有する。

結果ウイルス核酸 a.ウイルスRNAへのHIV−１およびHIV−2 cDNAのハイブ
リダイゼーション HIV−２およびANT 70ウイルスからのRNAとHIV−1 cDN
Aとの間の核酸ハイブリダイゼーションは、pUC 13ベク
ター中に挿入されているSacI−Bg1II HIV−１制限断片
を用いてハイブリダイゼーションを用いて行うことによ
り評価された。この断片は、HIV−１のＲ領域を含む
５′LTRの部分、完全なgag遺伝子、およびpol遺伝子の
大部分を含む。緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
は、このプローブとHIV−１（SF4）由来のRNAとの間に
おいてのみ、ハイブリダイゼーションが観察された。該
プローブとHIV−２またはANT 70との間には全くハイブ
リダイゼーションが観察されなかった（第14図）。これ
は、HIV−２およびANT 70のgagおよびpol領域がHIV−１
の対応領域と有意に異なることを示す。

使用されるHIV−２プローブは、HIV−２のenv遺伝子
に由来する約1000塩基対の配列を含む。このプローブ
は、緊縮条件下においてHIV−2 RNAとのみハイブリダイ
ズし、そしてHIV−１またはHIV−３とは全くハイブリダ
イズしなかった。

b.ANT 70 cDNAとHIV−１およびHIV−２の配列との間の
相同性挿入断片のサブクローニングをpUC 13中で行い、そし
てジデオキシヌクレオチド法を使って配列決定した。

ポリＡ尾の存在は、iso 70−11挿入断片がウイルスRN
Aの３′末端に由来することを確証する。ポリＡ尾に隣
接して、ウイルス３′LTRのＲ領域に相当する配列が存
在する。ANT 70 cDNA中に含まれる配列およびそれらに
対応するウイルス配列を下記に示す。

考察本発明者らは、カメルーン人女性（ANT 70）および彼
女のの配偶者（ANT 70 NA）から新規ヒト免疫不全関連
レトロウイルスを単離した。最初のウイルス単離を行っ
た時点では、この女性はごくわずかに血清陽性であり、
ウエスタンブロットテストにおいて不明瞭な結果を与
え、そして診断上は無症候であった。その時から、この
女性はAIDS関連症候群（ARC）の幾つかの症候を現わし
始めた。対して、本発明者らが最初の単離物と同じ特徴
を有するウイルスを単離することができた彼女の配偶者
は、リンパ節疾患にかかっており、そしてAIDSの別の症
候を発現していた。従って、この新規単離物はヒト免疫
不全ウイルスであるとみなすことができる。この同じウ
イルスが性的相手からも単離できたという事実は、伝染
の様式がヒトレトロウイルスのものと類似していること
を示唆する。

該ウイルスはまず、示差的抗原捕捉アッセイにおける
異なる捕捉能力に基づいて、HIV−１とは異なるものと
して認識された。これは、HIV−１株と非−HIV−１株と
を識別することができる高信頼性のテストであることが
立証されている。この単離物がHIV−１でないことは、
１）ウイルスタンパク質の分子量の相違、２）HIV−１
とは異なる抗−HIV−１抗血清との交差反応性パター
ン、３）HIV−１のp24およびp17コアタンパク質に対し
て生起されたマウスモノクローナル抗体により認識され
る能力が非常に小さいこと、４）ウイルス感染者の血清
により、HIV−１タンパク質よりも優勢的にANT 70が認
識されること、並びに５）最も高度に保存されている４
つのウイルスタンパク質の部分開裂のパターンが、HIV
−１タンパク質を同じ処理にかけた時に得られるパター
ンと一致しないこと、によりタンパク質レベルで確証さ
れる。それにもかかわらず、このウイルスで感染された
２人の血清はHIV−１のgp41エンベロープタンパク質を
認識する。上記に挙げたのと同じ基準により、ANT 70が
HIV−２でないこともまた明らかである。実際、ANT 70
とHIV−１との間の抗原上の相違は、HIV−２とHIV−１
との間のものよりも小さい。これは特に第８図および第
10図に与えられた結果から明らかである。

ANT 70がHIV−１およびHIV−２とは異なる独特なウイ
ルスであるという更なる強制的証拠は、部分的ペプチド
マップから生ずる。本発明者らは、最も高度に保存され
るウイルスタンパク質において有意な差があることを示
した。比較のために用いた２つおHIV−２単離物は、p17
コアタンパク質のCNBr開裂の場合を除いて、本質的に同
じ開裂パターンを与えた。しかしながら、少なくともHI
V−１株においては、p24タンパク質よりもp17タンパク
質の方が変動性を表わすことに着目すべきである（3
4）。このことがHIV−２についても当てはまるかどうか
は、今までに分析されているものよりも多数の株に関す
る配列決定を待たねばならない。

gp41エンベロープタンパク質にまで及ぶ高度の交差反
応性により証明されるように、ANT 70が抗原的にはHIV
−２よりもHIV−１により密接に関連するという事実を
考慮すれば、ANT 70が単なるHIV−１の遺伝的変異体以
上のものであることを確立することが必須であった。こ
れは、最も少なく遺伝的変異にさらされる多数のウイル
スタンパク質中に最も高度に保存される幾つかのアミノ
酸の位置を調べることにより可能である。開裂パターン
に主要な相違が認められたことは、HIV−1,HIV−２およ
びANT 70が３種の遺伝的に異なるウイルスであることを
指摘する。他方、同じシリーズの実験は、３種のウイル
ス全てが共通の先祖から発生したことを示し得るウイル
ス間の類似性も示した。

ハイブリダイゼーションデータもまた、ANT 70がHIV
−１およびHIV−２のいずれとも根本的に異なるという
概念を支持する。ハイブリダイゼーションが行われる条
件が緊縮である限り、それら３つのウイルス型間に容易
に区別をつけることができる。

cDNA配列の分析は、挿入断片がウイルスゲノムの３′
末端に由来することを示した。それらの配列とHIV−１
およびHIV−２の配列との相同性の分析は、ANT 70が特
にLTR配列（約70％の相同性）において、HIV−１と幾ら
か多く密接に関連することを示した。それにもかかわら
ず、ANT 70が単にHIV−１の遺伝的変異体である可能性
を除外する程大きな相違がある。ANT 70の３′LTRは、
レトロウイルスのLTRに典型的なシグナル配列も含む。

第三の型のヒト免疫不全ウイルスの実在は、即座に疫
学的関係および血液銀行テスト結果をみる必要がある。
既に示したように、このウイルスで感染された人からの
抗体はこのウイルスと優勢的に反応するが、それらの抗
体がHIV−１タンパク質とも交差反応する。HIV−１タン
パク質を基にしたエンザイムイムノアッセイ、免疫蛍光
抗体アッセイおよびウエスタンブロットアッセイにおい
てANT 70 NAの陽性反応を検出することが可能である一
方、陽性シグナルが避けがたい交差反応によるものであ
ったという事実は、そのようなテストの感度がこのウイ
ルスに応答して生産された抗体についてはより小さいで
あろうことを意味する。このことは、エンザイムイムノ
アッセイの結果（第11図）により十分に証明された。更
に、ウエスタンブロットアッセイにおける血清陽性につ
いての１つの基準は、gagおよび／またはpolタンパク質
並びにエンベロープタンパク質の１つの両者に対する検
出可能な抗体の存在である。それぞれANT 70およびANT
70 NAで感染された２個体の場合、HIV−１のp24とエン
ベロープタンパク質の両方に対して交差反応が観察され
たので、それら個体はHIV−１で感染されているが、或
る理由でHIV−１に対する高い力価を発現できないとい
う結論が常に指摘される。従って、このウイルスは現在
理解されているよりもずっと広く普及することが可能で
ある。疫学的見地から、このウイルスを発見し得るアフ
リカの地理的領域の限界を評価するため、およびこのウ
イルスが広まった範囲を評価するため、このウイルスに
特異的な診断テストを開発することが不可欠である。

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ビスナレンチウイルスのヌクレオチド配列:AIDSウイル
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フロントページの続き (72)発明者サマン，エリクベルギー国，ベー‐2680 サンニクラース，ナクステガランラーン 12 (72)発明者ファンヒューベルスワイン，ヒューゴーベルギー国，ベー‐9280 ラールン，コルマンシュトラート 62

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の核酸配列と70％より高い相同性を示す
LTR配列を核酸配列の中に含んで成り：欧州動物細胞培養物寄託機関（European Collection of
Animal Cell Cultures ;ECACC）に第V88060301号のも
とに寄託されたHIV−３（ANT 70）レトロウィルスの本
質的な形態学的および免疫学的性質を有し、ここでこの
本質的な性質が、 −該ウィルスがT4リンパ球に対し向性を示す； −該ウィルスがそれが感染するリンパ球に対し細胞毒性
である； −該ウィルスが約120mmの直径を有する； −該ウィルスがマグネシウム依存性逆転写酵素活性を有
する； −それがT4レセプターを担持している不死化細胞系にお
いて培養され得る； −該ウィルスの溶解物が、ウエスタンブロット分析並び
に部分CNBr−解裂のそれぞれによりHTLV−１のp19タン
パク質並びにHIV−１及びHIV−２のp24タンパク質とは
免疫学的に異なるp25タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物が、ウエスタンブロット分析によ
りHTLV−１のgp110タンパク質、HIV−１のgp120タンパ
ク質及びHIV−２のgp120タンパク質とは免疫学的に異な
るgp120タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物が、40,000−45,000の分子量を有
するgp41糖タンパク質を更に含む； −HIV−３のゲノムRNAが、緊縮ハイブリダイゼーション
条件下においてHIV−１の配列ともHIV−２の配列ともハ
イブリダイズしない； −該ウィルスの溶解物が部分CNBr−解裂によりHIV−１
及びHIV−２のp17とは異なるp16タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物がウェスタンブロット分析により
HIV−１及びHIV−２由来のp12タンパク質とは異なるp12
タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物が部分CNBr−解裂によりHIV−１
及びHIV−２由来のp31エンドヌクレアーゼとは異なるp3
1エンドヌクレアーゼを含む； −該ウィルスの溶解物がウェスタンブロット分析により
HIV−１及びHIV−２由来のものより低分子量である逆転
写酵素タンパク質を含む；ことを特徴とする、HIV−３レトロウィルス株。
【請求項２】該ウィルスRNAが、緊縮条件下において、H
IV−１のenv遺伝子およびそれに隣接したLTRとハイブリ
ダイズせず、且つHIV−１ゲノムのpol領域の配列ともハ
イブリダイズしないことを特徴とする、請求項１記載の
レトロウィルス株。
【請求項３】該ウィルスのRNAが、緊縮条件下におい
て、HIV−１のヌクレオチド配列8352−9538とハイブリ
ダイズしないことを特徴とする、請求項２記載のHIV−
３レトロウィルス株。
【請求項４】ECACC第V88060301号のもとに寄託された名
称ANT 70の請求項１又は２記載のHIV−３レトロウィル
ス株。
【請求項５】名称ANT 70 NAである前記株が、ECACC第V8
8060301号のもとに寄託された株ANT 70の単離された女
性の夫から単離されたものである、請求項１又は２記載
のHIV−３レトロウィルス株。
【請求項６】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV−
３レトロウィルス株の全抽出物又は溶解物。
【請求項７】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV−
３レトロウィルス株の少なくとも一種の抗原であって、内部コアタンパク質；及びエンベロープタンパク質；のタンパク質の群より選ばれる、前記抗原。
【請求項８】前記内部タンパク質が、それぞれ12,000、
16,000及び26,000のオーダーの見かけ分子量を有するp1
2、p16又はp26タンパク質であり、そして前記エンベロ
ープタンパク質が、それぞれ40,000〜45,000及び120,00
0の見かけ分子量を有するgp41又はgp120タンパク質であ
る、請求項７記載の抗原。
【請求項９】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV−
３レトロウィルス株の全タンパク質抽出物を調製電気泳
動又はアフィニティークロマトグラフィーにかけ、周知
の方法で単離することにより得られる、請求項８におい
て定義されている精製抗原。
【請求項１０】生物液体中の請求項１〜５のいづれか１
項記載のHIV−３レトロウィルス株に対する抗体の検出
のための方法であって、検査すべきヒトの体液を、請求
項６において定義されている抽出物もしくは溶解物、又
は請求項７〜９のいづれかにおいて定義されている抗原
と接触させ、そして前記抗−HIV−３株の抗体と使用し
た抗原とで形成された免疫接合体を検出することを特徴
とする方法。
【請求項１１】前記生物液体が血清又は骨髄液であり、
前記方法がHIV−３レトロウィルス株により引き起こさ
れる潜在的又は現存のARC又はAIDSの検査のためであ
る、請求項10記載の方法。
【請求項１２】生物学的液体中のHIV−３レトロウィル
ス株に対する抗体の検出のためのキットであって、 −請求項６において定義された抽出物もしくは溶解物、
又は請求項７〜９のいづれかにおいて定義された抗原、
および −形成される免疫複合体を検出するための手段を含んで成るキット。
【請求項１３】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV
−３レトロウィルス株の製造方法であって、ヒトT4リン
パ球、またはそれから誘導されたT4表現型を有する永久
細胞系を、HIV−３レトロウィルスで予め感染されてい
るリンパ球または細胞系と共に培養し、培地から該レト
ロウィルスを回収しそして精製することを特徴とする方
法。
【請求項１４】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV
−３株の抗原の検出方法であって、HIV−３株に対して
生起された免疫グロブリン画分で表面をコートし、分析
しようとする体液または培養液を該免疫グロブリンと接
触させ、そして該免疫グロブリンと該抗原との間で形成
された複合体を検出することを特徴とする方法。