JP2856339B2

JP2856339B2 - 酵素免疫測定法

Info

Publication number: JP2856339B2
Application number: JP3027588A
Authority: JP
Inventors: 章夫辻; 昌子前田; 基雄中島
Original assignee: KITSUKOOMAN KK
Current assignee: KITSUKOOMAN KK
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1991-02-21
Publication date: 1999-02-10
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: US5246834A; JPH04265859A; EP0500099A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アデノシン三リン酸
（以下「ＡＴＰ」という）生成酵素を標識酵素として用
いる酵素免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体成分の微量分析法として化学発光や
生物発光を用いる分析法が行われており、特に生物の酵
素系を利用する発光反応の量子収率は高く極めて高感度
な分析法として種々応用されている。一方、発光反応の
酵素免疫測定法（以下「ＥＩＡ」という）への応用は化
学発光に偏っているが、生物発光に関してもＥＩＡにつ
いていくつかの試みがなされて来ている。例えば、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドなどの発光反
応に関与する補酵素の生成酵素を標識し、生物発光の系
と接続することにより間接的にＥＩＡに導入する方法な
どである。この方法は標識酵素の増幅作用が加わり、極
めて高感度なＥＩＡとして有用である。例えば、グルコ
ース脱水素酵素を標識体とする17−α−ヒドロキシプロ
ゲステロンのＥＩＡでは2.5 ×10^-12gの検出が可能とい
う報告がある（分析化学vol.34(1985) ６〜10）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＡＴＰ
を高感度に測定する手段としてホタルルシフェラーゼを
用いる生物発光に着目し、これをＥＩＡに応用すべく種
々検討した結果、本発明を完成した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明のＥＩＡは、標識
酵素としてＡＴＰ生成酵素を用い、生成するＡＴＰをホ
タルルシフェラーゼを用いて生物発光させ、発光量を測
定することを特徴とするものである。以下、本発明を具
体的に説明する。本発明は、標識酵素としてＡＴＰ生成
酵素を用いるところに特徴があり、酵素免疫反応の手法
自体は、既知の方法を適用できる。例えば、測定対象物
質（抗原）を酵素で標識し、対応する抗体との反応を検
体中の抗原と競合させ、次に予め固相化された先の抗体
に対する第２抗体と反応させて固相上の酵素を定量する
方法（競合法）、測定対象とする抗原を、予め固相化さ
れた対応する抗体と反応させ、次いで酵素で標識された
抗原に対応する抗体と反応させて固相上の酵素を定量す
る方法（サンドイッチ法）などが挙げられるが、これら
以外の従来使用されている方法にも適用することができ
る。

【０００５】本発明で標識酵素として用いられるＡＴＰ
生成酵素は、基質アデノシン二リン酸（以下「ＡＤＰ」
という）をリン酸化してＡＴＰを生成する酵素であれば
如何なるものでもよく、その起源は問わない。そして、
その具体例としては酢酸キナーゼ、クレアチンキナー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、アデニル酸キナーゼ、グアニ
ル酸キナーゼ、グアニジノ酢酸キナーゼ等を挙げること
ができ、また酵素による標識は常法によって行われる。
例えばグルタルアルデヒド架橋法、過ヨーソ酸架橋法、
マレイミド架橋法、酸無水物法、カルボジイミド法等で
ある。〔酵素免疫測定法（昭和57年医学書院発行）等参
照〕。次いで、基質としてＡＤＰを加え、固相上のＡＴ
Ｐ生成酵素と反応させてＡＴＰを生成させ、これをホタ
ルルシフェラーゼを用いて発光させ、発光量を測定す
る。

【０００６】ここで用いられるホタルルシフェラーゼと
しては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系によるＡＴＰ
測定に用いられるルシフェラーゼであれば如何なるもの
でもよく、例えばゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリ
カボタル等由来のルシフェラーゼ、あるいはこれらのル
シフェラーゼを遺伝子組み換え法により製造したもの等
が挙げられる。

【０００７】

【発明の効果】本発明は、ホタルルシフェラーゼを用い
る生物発光を利用するＥＩＡを提供するものであり、種
々の測定対象物質を高感度に測定することができる。

【０００８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより具体的に
説明する。

【０００９】

【実施例１】酢酸キナーゼ（以下「ＡＫ」という）を標
識酵素とした17−α−ヒドロキシプロゲステロン（以下
「17−ＯＨＰ」という）の競合免疫測定法１．17−ＯＨＰ−ＡＫ複合体の調製（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ニ）を調製した。試薬（イ）：17−ＯＨＰ−３ＣＭＯ溶液 17α−ヒドロキシプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキ
シメチル）オキシム（シグマ社製）をジオキサンに0.1
Ｍとなるように溶解し、17−ＯＨＰ−３ＣＭＯ溶液を調
製した。試薬（ロ）：Ｎ−ヒドロキシサクシニミド溶液Ｎ−ヒドロキシサクシニミドをジオキサンに0.14Ｍとな
るように溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド溶液を調
製した。試薬（ハ）：ＤＣＣ溶液ジシクロヘキシルカルボジイミドをジオキサンに、0.14
Ｍとなるように溶解し、ＤＣＣ溶液を調製した。試薬（ニ）：ＡＫ溶液酢酸キナーゼ（ユニチカ（株）製）を50ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ7.4 ）に１ml当たり1.16 mg となるように溶解
し、ＡＫ溶液を調製した。（２）標識反応試薬（イ）、（ロ）および（ハ）をそれぞれ１ml、0.5
mlおよび0.5 ml混合し、室温にて３時間反応させた。不
溶物を遠心除去し、試薬（ニ）0.25 ml に添加し、４℃
にて一晩反応させた。50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4
）に対して透析した後、遠心（2500rpm,10分）上澄を
トヨパールＨＷ−55（東ソー製）を用いたゲル濾過によ
り精製し、17−ＯＨＰ−ＡＫ複合体を調製した。２．17−ＯＨＰの測定（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ヘ）を調製した。試薬（イ）：抗17−ＯＨＰ抗血清 17α−ヒドロキシプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキ
シメチル）オキシム−ＢＳＡ（シグマ社製）を抗原とし
て常法によりウサギに免疫し調製した。（用時適宜希釈
して使用する。）試薬（ロ）：17−ＯＨＰ−ＡＫ複合体溶液前項１．により調製した17−ＯＨＰ−ＡＫ複合体を50ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）50μｌで200 倍に希釈
し、17−ＯＨＰ−ＡＫ複合体溶液を調製した。試薬
（ハ）：17−ＯＨＰ溶液 17α−ヒドロキシプロゲステロン（シグマ社製）0.1 〜
200pg を50ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）50μｌに
溶解し、17−ＯＨＰ溶液を調製した。試薬（ニ）：基質溶液 50ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）にＡＤＰ、アセチ
ルリン酸及び酢酸マグネシウムをそれぞれ10μＭ、１ｍ
Ｍ、30ｍＭとなるように溶解し、基質溶液を調製した。試薬（ホ）：測定用緩衝液 50ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）に酢酸マグネシウ
ム、免疫実験用ブロッキング剤（ブロックエース、大日
本製薬社製）をそれぞれ30ｍＭ、10％となるように溶解
し、測定用緩衝液を調製した。試薬（ヘ）：発光試薬溶液ＡＴＰ測定用キット（キッコーマン（株）製ルシフェー
ル−ＬＵ）の発光試薬１ビンを発光試薬溶解用液１ビン
に溶解し、発光試薬溶液を調製した。（２）測定常法により作製したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化試験
管に試薬（イ）を50μｌ、試薬（ロ）を50μｌ、更に試
薬（ハ）を50μｌ添加し、４℃にて一晩反応させた。50
mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）を用いて３回洗滌し、
洗滌液を除去した後、試薬（ニ）を50μｌ、試薬（ホ）
を100 μｌ添加し、37℃にて１時間反応させた。これに
試薬（ヘ）100 μｌを添加し、生じる発光を発光検出器
（アロカ社製ルミネッセンスリーダーBLR-201 ）により
15秒間積算した。その結果を図１に示す。図１から0.5
×10^-12gの17-OHPまで検出できることがわかる。

【００１０】

【実施例２】ＡＫを標識酵素とした免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）のサンドイッチ免疫測定法１．ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＫ複合体（ＡＫ標識Ｆab'
）の調製（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ホ）を調製した。試薬（イ）：ＡＢＳ 0.1 Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）に塩化ナトリウムを0.9
％となるように溶解し、ＡＢＳを調製した。試薬（ロ）：ＰＢＳ 100 ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）に塩化ナトリウムを
0.9 ％となるように溶解し、ＰＢＳを調製した。試薬（ハ）：還元反応用試薬溶液試薬（ロ）に２−メルカプトエタノールおよびＥＤＴＡ
をそれぞれ0.1M、５ｍＭとなるように溶解し、還元反応
用試薬溶液を調製した。試薬（ニ）：ＡＫ溶液ＡＫ（ユニチカ（株）製）0.66mgを試薬（ロ）１mlに溶
解し、ＡＫ溶液を調製した。試薬（ホ）：マレイミド化試薬溶液Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシル）サクシニミ
ド（同人化学社製）５mgをジメチルホルムアミド１mlに
溶解し、マレイミド化試薬溶液を調製した。（２）標識反応ヤギ抗ウサギＩｇＧ（生化学工業社製）（７mg／ml）２
mlを試薬（イ）に対し一晩透析した後、膜濃縮した。こ
れに0.28mgのペプシンを添加し、37℃にて一晩反応させ
た後、ゲル濾過によりＦ(ab')₂を分離した。これを濃縮
し、試薬（ハ）50μｌと混合して37℃にて90分間反応さ
せた後、ゲル濾過によりＦab' を分離した。一方、試
薬（ニ）１mlに試薬（ホ）を8.4 μｌ加え、37℃にて90
分間反応させた後、ゲル濾過法により、反応生成物（マ
レイミド化ＡＫ）を分取した。これと、上記にて得られ
たＦab' とを混合し、30℃にて２時間反応させた後、ゲ
ル濾過法により、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＫ複合体（Ａ
Ｋ標識Ｆab' ）を得た。２．ウサギＩｇＧの定量（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ヘ）を調製した。試薬（イ）：ＰＢＳ−ＢＳＡ 100 ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）に塩化ナトリウムお
よび子牛血清アルブミンをそれぞれ0.9 ％、0.1 ％とな
るように溶解し、ＰＢＳ−ＢＳＡを調製した。試薬（ロ）：ウサギＩｇＧ溶液ウサギＩｇＧ（生化学工業社製）を試薬（イ）を用いて
希釈し、0.25〜250ng/mlの濃度のウサギＩｇＧ溶液を調
製した。試薬（ハ）：測定用緩衝液 50ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）に酢酸マグネシウ
ムおよびブロックエース（大日本製薬社製）をそれぞれ
30ｍＭ、10％となるように溶解し、測定用緩衝液を調製
した。試薬（ニ）：ＡＫ標識Ｆab' 溶液前項１．で調製したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＫ複合体
（ＡＫ標識Ｆab' ）を試薬（イ）で1000倍に希釈し、Ａ
Ｋ標識Ｆab' 溶液を調製した。試薬（ホ）：基質溶液 50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4 ）にＡＤＰ、アセチル
リン酸をそれぞれ10μM 、１ｍＭとなるように溶解し、
基質溶液を調製した。試薬（ヘ）：発光試薬溶液ＡＴＰ測定用キット（キッコーマン（株）製ルシフェー
ル−ＬＵ）の発光試薬１ビンを発光試薬溶解用液１ビン
に溶解し、発光試薬溶液を調製した。（２）測定常法により作製したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化試験
管に試薬（ロ）を100μｌ添加し、37℃にて１時間反応
させた。試薬（ハ）を用いて３回洗滌し、液を除去した
後、試薬（ニ）を100 μｌ添加し、37℃にて１時間反応
させた。試薬（ハ）を用いて３回洗滌し、液を除去した
後、試薬（ハ）および試薬（ホ）をそれぞれ50μｌずつ
添加し、37℃にて１時間反応させた。これに試薬（ヘ）
100 μｌを添加し、生じる発光を発光検出器（アロカ社
製ルミネッセンスリーダーBLR-201 ）により15秒間積算
した。その結果を図２に示す。

【実施例３】ＡＫを標識酵素とした甲状線刺激ホルモン
(ＴＳＨ）のサンドイッチ免疫測定法１．マウス抗Ｆab'-ＡＫ（ＡＫ標識Ｆab'）の調製（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ホ）を調製した。試薬（イ）:ＡＢＳ 0.1Ｍ酢酸緩衝液(pH4.5)に塩化ナトリウムを0.9％とな
るように溶解し、ＡＢＳを調製した。試薬（ロ）:ＰＢＳ 0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)に塩化ナトリウムを0.9％と
なるように溶解し、ＰＢＳを調製した。試薬（ハ）:還元反応用試薬試薬（ロ）に２―メルカプトエタノール及びＥＤＴＡを
それぞれ0.1Ｍ、５ｍＭとなるように溶解し、還元反応用
試薬溶液を調製した。試薬（ニ）:ＡＫ溶液ＡＫ（ユニチカ（株）製）0.66mgを試薬（ロ）１mlに溶
解し、ＡＫ溶液を調製した。試薬（ホ）:マレイミド化試薬溶液Ｎ−(ε−マレイミドカプロイルオキシル）サクシニミ
ド（同人化学社製）５mgをジメチルホルムアミド１mlに
溶解し、マレイミド化試薬溶液を調製した。 (2)標識反応マウス抗ＴＳＨＩｇＧ（東ソー（株）製）（７mg／ml)
２mlを試薬（イ）に対して一晩透析した後、膜濃縮し
た。これに0.28mgのペプシンを添加し、37℃にて一晩反
応させたのち、ゲル濾過によりＦ(ab')₂を分離した。こ
れを濃縮し、試薬（ハ）50μlと混合して37℃にて90分
間反応させた後、ゲル濾過によりＦab'を分離した。一
方、試薬（ニ）１mlに試薬（ホ）を8.4μl加え、37℃に
て90分間反応させた後、ゲル濾過法により、反応生成物
(マレイミド化ＡＫ）を分取した。これと上記にて得ら
れたＦab'とを混合し、30℃にて２時間反応させた後、
ゲル濾過法により、マウス抗ＴＳＨＦab'―ＡＫ複合
体（ＡＫ標識Ｆab')を得た。２．ＴＳＨの定量 (1)試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ヘ）を調製した。試薬（イ）:ＨＥＰＥＳ−Ｂｌｏｃｋａｃｅ 50ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.0)にブロックエース（大
日本製薬社製）を10％になるように加え、ＨＥＰＥＳ−
Ｂｌｏｃｋａｃｅを調製した。試薬（ロ）：ＴＳＨ（東ソー（株）製）を試薬（イ）を
用いて希釈し、0.001〜10μIU／mlの濃度のＴＳＨ溶液
を調製した。試薬（ハ）：測定用緩衝液 50ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.0)に塩化マグネシウム及
びブロックエース（大日本製薬社製）をそれぞれ30ｍ
Ｍ、10％となるように溶解し、測定用緩衝液を調製し
た。試薬（ニ）：ＡＫ標識Ｆab'溶液前項１．で調製したマウス抗ＴＳＨＦab'-ＡＫ複合体
（ＡＫ標識Ｆab'）を試薬（イ）で5000倍に希釈し、ＡＫ
標識Ｆab'溶液を調製した。試薬（ホ）：基質溶液試薬（ハ）にＡＤＰ、アセチルリン酸をそれぞれ５μ
Ｍ、2.5ｍＭになるように溶解し、基質溶液を調製し
た。試薬（ヘ）：発光試薬ＡＴＰ測定用キット（キッコーマン（株）製ルシフェー
ルＬＵ）の発光試薬１びんを発光試薬溶解用液１びんに
溶解し、発光試薬溶液を調製した。試薬（ト）：洗浄液試薬（イ）にTween20（和光純薬工業（株）製）を0.02
％になるようにくわえ、洗浄液を調製した。（２）測定常法により作製したマウス抗ＴＳＨＩｇＧ固相化マイク
ロタイタープレート（Ｎｕｎｃ製）に試薬（ロ）を100
μl添加し、37℃で１時間反応させた。試薬（ト）を用
いて３回洗浄し、液を除去した後、試薬（ニ）を100μl
添加し、37℃にて１時間反応させた。試薬（ト）を用い
て３回洗浄し、液を除去した後、試薬（ホ）を100μl添
加し、37℃にて１時間反応させた。反応液95μlを試験管
に移し、さらに試薬（ヘ）100μlを添加し、生じる発光
を発光検出器（アロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬ
Ｒ−201）にて20秒間積算した。その結果を図３に示す。
図３から0.01μIU／mlより少量のＴＳＨが測定可能であ
ることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】17−ＯＨＰの検量線を示す図である。

【図２】ウサギＩｇＧの検量線を示す図である。

【図３】甲状線刺激ホルモン（ＴＳＨ）の検量線を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/535 G01N 33/532 G01N 33/543

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】標識酵素としてアデノシン三リン酸生成
酵素を用い、生成するアデノシン三リン酸をホタルルシ
フェラーゼを用いて生物発光させ、発光量を測定するこ
とを特徴とする酵素免疫測定法。